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标题: 【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖 [打印本页]

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:23 标题: 【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖

有战友询问SDS－PAGE电泳的问题，我想这是实验室比较常用的一个实验，就将战友的部分代表性问题集中起来，结合我的实验经验，整理了这个帖子。其中关于原理的部分主要是参考了郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》一书。水平有限，不妥之处敬请指正。同时希望广大战友在看完后，把贴中未列出的一些其他问题贴出，以备以后集中整理。

Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？
A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？
A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

Q：为什么带出现拖尾现象？
A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

Q：为什么带出现纹理现象？
A：主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

Q：什么是“鬼带”，如何处理？
A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？
A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。

Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
处理办法：按正确的操作方法操作。

请大家多多的顶！

作者: IAM007 时间: 2013-6-27 15:24

注：SDS是离子型去垢剂，不是还原剂。

作者: 阿敏 时间: 2013-6-27 15:24

好贴，顶！
顺便问一下楼主，我的电泳条带为什么呈纺锤形呢？染色后条带呼啦拉一大片，看不清楚？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:25

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原帖由阿敏于 2013-6-27 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
好贴，顶！
顺便问一下楼主，我的电泳条带为什么呈纺锤形呢？染色后条带呼啦拉一大片，看不清楚？

应该是样品过量了，一样的蛋白量在特定位置聚集过多，导致聚丙酰胺凝胶被涨破形成的

作者: damingxia0904 时间: 2013-6-27 15:25

请教楼主我直接将样品放入2* 的上样buffer中，然后挤碎煮沸离心，结果整个条带都很淡却在最下面一条marker以下大约10kDa有大块浓稠厚重的溴酚兰不知为何？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:25

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原帖由 damingxia0904 于 2013-6-27 15:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教楼主我直接将样品放入2* 的上样buffer中，然后挤碎煮沸离心，结果整个条带都很淡却在最下面一条marker以下大约10kDa有大块浓稠厚重的溴酚兰不知为何？ ...

没明白你所说的挤碎是什么意思，不过从你描述的结果来看，还是比较正常的，条带淡主要与你的样品蛋白浓度有关，适当增加上样量试试；溴酚蓝的带应该是所有的孔都连在一起的吧？那可能与你buffer中的溴酚蓝加的过多，或样品处理时buffer加的过多有关。所以，你只需按照既定的比例加就可以了。比如10ul的样品＋5ul的2×buffer即可！

作者: yjf1026 时间: 2013-6-27 15:26

楼主,我做核骨架蛋白，属于难溶性蛋白。我提出样品后总是想让它尽量溶解，但是时间短又溶不了。所以我用2*buffer悬起沉淀后总是放入4度冰箱，一个小时拿出来斡旋震荡一下，尽量溶解后第二天才电泳。这样可行吗？会不会使蛋白降解。还有我直接用2*buffer加一些溴芬兰上样行吗？因为我的蛋白量少，再稀释就显不出带了。
还有我始终想不明白，蛋白加入SDS变性后就不会降解了吗？提取蛋白时始终要在4度进行，最后上样前的沸水浴蛋白就不会降解?

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:26

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楼主,我做核骨架蛋白，属于难溶性蛋白。我提出样品后总是想让它尽量溶解，但是时间短又溶不了。所以我用2*buffer悬起沉淀后总是放入4度冰箱，一个小时拿出来斡旋震荡一下，尽量溶解后第二天才电泳。这样可行吗？会不会使蛋白降 ...

1、你用的2×buffer是什么配方，能否贴出来？我用的是分子克隆上的，溴芬兰都是直接加在里面的。
2、你的蛋白如果是不可溶性蛋白，你可以加一些助溶剂试试。
3、样品稀的话，可改用4×buffer或5×buffer，这样尽可能的在每孔中多加些样品。
4、在buffer中有两样重要的东西，一是sds，非极性去垢剂，主要作用是中和蛋白质分子表面的电荷，打开肽链间的氢键，破坏蛋白分子的高级结构。另一个是dtt或Beta巯基乙醇，破坏肽链间的二硫间，使蛋白分子变成线性肽链。但只是蛋白的天然构象被破坏了，变成了线性结构，并没有降解。在外界环境变化时（比如变性剂消除的时候），蛋白分子还可一定程度的复性；降解是使蛋白质分子变成小肽或氨基酸分子，此时的蛋白是不能再次复性的。所以降解和变性这两个概念是不一样的。
但是在变性的过程中，蛋白质是有一定降解的。比如我们在提取蛋白时的反复冻融、室温放置过久，都会有一定的影响。不过这些都不是主流，主流还是变性。因为蛋白质的降解，归根结底是肽键的断裂，而这一过程不是凭空产生的，要有蛋白水解酶的参与才可快速完成。而4度或沸水，酶的活性都是很低或没有活性！所以不必担心。

作者: zranqi_1 时间: 2013-6-27 15:27

谢谢搂主的精彩整理！从中学到很多东西。

我有一个问题：我们的电泳用的是恒流：20mA，需要大约8个小时，才能结束，正常吗？临近实验室的用恒压，一般都2、3个小时就结束了。

电泳缓冲液是否应当调整pH值？分子克隆上说的是8.3 ，但是我调整之后，电泳速度更慢，需要十个多小时，不知道原因，请楼主帮忙.

作者: IAM007 时间: 2013-6-27 15:27

感谢分享！

"sds，非极性去垢剂"

的说法不妥。应该是离子型去垢剂。

DTT不只破坏肽链间二硫键，也破坏链内二硫键。

蛋白降解在极端pH下也可以发生，不一定非要酶的作用。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:28

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原帖由 zranqi_1 于 2013-6-27 15:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢搂主的精彩整理！从中学到很多东西。

我有一个问题：我们的电泳用的是恒流：20mA，需要大约8个小时，才能结束，正常吗？临近实验室的用恒压，一般都2、3个小时就结束了。

电泳缓冲液是否应当调整pH值？分子克隆上说的是8.3 ，但是 ...

要8个小时确实有点长了，我一般用恒压，浓缩胶50-80v，分离胶100-120v，最多3－4h。
一般pH是要调的，不过我们实验室直接按分子克隆上的配方配过后，直接用效果也挺好的。
不过影响电泳速度主要有两个原因，一个是电压或电流，还有一个是离子浓度，所以你可着重在这两方面找原因。比如你可以增加你的电压或电流试试！若还有问题，可上来跟贴！

作者: 6327555 时间: 2013-6-27 15:30

谢谢楼主，搞这个讨论版。我这段时间长期跑SDS-PAGE，遇到很多问题。想问一下waynepionnet ，恒压和恒流跑出的胶有没有差别。

作者: star#room 时间: 2013-6-27 15:47

非常感谢楼主的帖子，受益匪浅。请教一个关于蛋白质降解的问题，按照您的说法，如果用诱导表达后直接收菌加buffer上样电泳，蛋白质是不是就不会被蛋白酶降解（在保证pH值的情况下）？那么超声破菌之后再煮沸上样会不会降解？因为感觉超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这一过程是否对蛋白有影响？谢谢啦

作者: vera+ 时间: 2013-6-27 15:47

谢谢楼主精彩的总结。但是其中有一个地方不是很妥当。
十二烷基硫酸钠（sod.dodecyl sulfate,简写为SDS）,又称月桂基硫酸钠
（sod.lauryl sulfate,简写为SLS），其分子式为CH3(CH2)10CH2OSONa；分子量为288.38。
十二烷基磺酸钠（sod.dodecyl sulfonate,简写亦为SDS）,分子式为CH3(CH2)10
CH2SONa；分子量为272.38。这两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂，而十二烷基磺酸钠因其制造及性能上的一些缺点，几乎没有在医学、生物学实验室使用。我国的《化学试剂国内外标准手册》以及国外著名试剂公司如Sigma,Aldrich和Fluka等的产品目录也都没有收载。目前常见的错误是，将本该是十二烷基硫酸钠的说成是十二烷基磺酸钠。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:49

我们实验室用的是稳压，用的挺好，也有用稳流的，效果也不错。个人认为这只是习惯问题，就看你个人喜好了，跑电泳这不是主要问题，关键是看它的大小，是不是与你胶的长度相适应。具体可参照分子克隆上关于蛋白质电泳部分的论述。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:49

1、用诱导表达后直接收菌加buffer上样电泳，没有问题的，不会降解。
2、那么超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这个会让蛋白质降解，所以在超声时一般洗脱液中都添加蛋白酶抑制剂，所以不用太担心这个问题。至于煮沸是不会让蛋白降解的。

作者: ritou1985 时间: 2013-6-27 15:50

变性电泳中，蛋白质大小比预测的大的多是怎么回事？预测35kD,跑出来却是50几kD！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:50

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原帖由 ritou1985 于 2013-6-27 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
变性电泳中，蛋白质大小比预测的大的多是怎么回事？预测35kD,跑出来却是50几kD！

你跑的是什么蛋白呢？可以把你的图贴上来看看吗？

作者: ritou1985 时间: 2013-6-27 15:51

1为诱导前，2为诱导后，3为Marker；依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4抗kD。312个aa，不是天然蛋白，是人工蛋白。

图片附件: 33942533.snap.jpg (2013-6-27 15:51, 10.57 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16872

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:51

楼上：
你用什么载体表达的，你有没有把载体蛋白得分子量算上？

作者: ritou1985 时间: 2013-6-27 15:52 标题: 回复 #20 ukonptp 的帖子

载体是pBV220，没有带标签的。测了N端15个aa，结果正确。

作者: uaubc 时间: 2013-6-27 15:52

请问楼主,我用镍柱纯化蛋白后上样,为什么会出现很长时间都不出加样孔的问题

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:53

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原帖由 uaubc 于 2013-6-27 15:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主,我用镍柱纯化蛋白后上样,为什么会出现很长时间都不出加样孔的问题

1。看看电泳槽组装是否正确，比如橡皮条是否去掉，内外槽是否装配正确？
2。没有问题的话，就要看看浓缩胶是否浓度大了（不过应该是可以看到溴芬蓝下来的），或缓冲液的问题（重配一下看看）。

作者: 131415 时间: 2013-6-27 15:53

想请问一下楼主，你说在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）。所说的还原剂是什么呢？

作者: junhun 时间: 2013-6-27 15:54

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

1 .sds-page蛋白空间结构被破坏,这样切下的胶再跑水平电泳回收后直接免疫动物做单抗,它的免疫原性还能存在吗?

2.考马斯亮蓝整个胶染色后切胶带水平电泳,考马斯亮蓝对蛋白活性,抗原性,免疫原性可有影响?

3.想提取蛋白做单抗,可否有更好的方法?

请各位大侠帮帮忙解答,急!

作者: NBA 时间: 2013-6-27 15:54

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原帖由 junhun 于 2013-6-27 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

1 .sds-page蛋白空间结构被破坏,这样切下的胶再跑水平电泳回收后直接免疫动物做单抗,它的免疫原性 ...

1、不错，如果是变性SDS－page电泳，蛋白的构像是被破坏了的，变成了线性构像。这样的蛋白仍然具有免疫原性，不过产生的抗体是针对线性表位的，而不是天然构像的表位。
2、考马斯亮蓝本身对蛋白免疫原性没有影响。
3、不知道你要提取的蛋白是什么蛋白质，如果是表达的蛋白，一般前面可加His或GST标签，用相应的商品化亲和层析柱层析。

作者: www.1 时间: 2013-6-27 15:55

请问配好的胶在室温放置时要不要泡到电泳缓冲液里面？

作者: purrr 时间: 2013-6-27 15:56

请问版主,
质粒转化成功,转化后有单菌落,培养后做电泳没有目标条带.也就是目标蛋白没有表达, 会不会是电泳做的有问题啊?SDS都能将蛋白溶解吗?

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 15:57

请问配好的胶在室温放置时要不要泡到电泳缓冲液里面？

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最好不要这样，因为电泳本身是依靠pH不同而形成的电场强弱不同把蛋白浓缩然后再分开的。把胶直接泡在缓冲液中，可能导致制胶（浓缩胶和分离胶）缓冲液环境与外界电泳缓冲液相互渗透，使内外离子强度和pH趋于一致，而不能形成分离蛋白所需要的电场。
可以用蒸馏水灌满加样孔，放置室温下，1周内没有问题，不过最好不要让你的加样孔的胶干了。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:00

质粒转化成功,转化后有单菌落,培养后做电泳没有目标条带.也就是目标蛋白没有表达, 会不会是电泳做的有问题啊?SDS都能将蛋白溶解吗?

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SDS－page电泳是检测方法，它可以检测有没有相应的目标蛋白。从你的描述来看，如果你的质粒构建和转化都是非常成功的话（比如你转化后的菌液PCR是否有目标条带，你构建的质粒的目的基因序列是否正确），SDS－page电泳检测如果没有目标条带，那么可以判断是你所选的基因片段在当前载体里不表达。
至于你说电泳本身有没有问题，你可以看看你的MARKER跑的是否正常啊，或者再跑个别人的阳性品，看看分子量大小显示是否正确。如果一切正常，那么你的电泳系统应该是正常的。不放心的话，可以贴上来看看。
SDS前面说过是一种离子型去垢剂，它可以使蛋白质分子中的氢键打开，中和蛋白分子所带的电荷，DTT或B巯基乙醇是还原剂，破坏二硫键，也只是破坏蛋白分子的高级结构，所以不存在融解蛋白质的问题。

作者: gogo 时间: 2013-6-27 16:00

求助各位高手，不知有没有人做过5kD以下的小肽的电泳，请问样品的处理有什么好的方法？
我用Tris-Tricine电泳方法，把样品混在2*Tricine样品缓冲液里，40度处理1小时，但是处理后放置室温20度左右，出现沉淀，不知该怎么办，大家有没有什么好方法？
另外电泳结果目的条带有拖尾如下图，有什么好方法解决

图片附件: 51846692.jpg (2013-6-27 16:00, 24.15 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16873

作者: huifeng0516 时间: 2013-6-27 16:01

谢谢楼主，搞这个讨论版。我这段时间长期跑SDS-PAGE，遇到很多问题。想问一下waynepionnet ，恒压和恒流跑出的胶有没有差别。

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原理上讲是没有区别的，但实际应用上个人认为还是有一些区别的。恒压电泳的过程中电流是不断减小的，也就是越跑越慢；而恒流电泳的过程中电压是不断变大的，也就是越跑越快。用恒压的可能分辨更好一些，因为刚开始浓缩的时候快一些不要紧，进分离胶后随着电泳进程电流逐渐下降，可以将蛋白较好的进行分离，减少弥散，而恒流的过程恰好相反(个人猜测，没做过比较)。我们实验室都跑恒压。

作者: NBA 时间: 2013-6-27 16:02

好像不对吧？
恒压下，电场强度不变，迁移速度是不变的，不是越跑越慢！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:03

求助各位高手，不知有没有人做过5kD以下的小肽的电泳，请问样品的处理有什么好的方法？
我用Tris-Tricine电泳方法，把样品混在2*Tricine样品缓冲液里，40度处理1小时，但是处理后放置室温20度左右，出现沉淀，不知该怎么办，大家有没有什么好方法？
另外电泳结果目的条带有拖尾如下图，有什么好方法解决

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对于低分子量的蛋白凝胶电泳，可适当加些尿素（8M），一来可以促进样品的融解，二来也可以提高凝胶的分辨率。
电泳中出现的拖尾现象也主要是由于样品溶解不佳引起的，可在处理后离心取上清上样。

作者: one 时间: 2013-6-27 16:04

谢谢，我的目的蛋白溶解性很好，可能是SDS沉淀，上样BUFFER中8%的SDS
请问降低上样BUFFER中的SDS对电泳有影响吗，我做Tricine-SDS-PAGE电泳。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:04

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原帖由 one 于 2013-6-27 16:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢，我的目的蛋白溶解性很好，可能是SDS沉淀，上样BUFFER中8%的SDS
请问降低上样BUFFER中的SDS对电泳有影响吗，我做Tricine-SDS-PAGE电泳。

没有影响，8%确实有点高，可适当降低点。
如果是SDS结晶的话，对电泳是没有影响的，可以离心后取上清上样即可！

作者: tudou85 时间: 2013-6-27 16:05

请问一下，我是第一天做细菌诱导，第二天做SDS-PAGE电泳，第一天诱导完之后的细菌应该放4度，－20度，还是室温保存？跑完电泳后剩余样品想保存，又应该保存于多少度？温度对蛋白的降解有什么影响？我是新手，望各位大侠指教！感激不尽！

作者: moonlight45 时间: 2013-6-27 16:08

文献上说，一般跑恒压的时候，浓缩胶跑较低的电压（如60V左右），分离胶跑较高的电压（如100V左右）．我这样跑效果不好．后来摸索着反过来，浓缩胶跑100V，分离胶跑60V，反而效果很好，这是为什么？

作者: bring 时间: 2013-6-27 16:08

昨天转膜的时候没有转完全，因为用预染marker了，胶上还有预染marker的条带，条件是以前一样的条件，为什么只转了一部分呢？我用的是biorad的半干转，80mA，2h，在转的过程中，我发现电压好像没有太大变化，我当时还挺纳闷的，是不是短路了？如果这样的话应该应该一点也转不到膜上啊，还是时间不够长，以前都是这个条件，也都转上去了，可这次为什么呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:08

请问一下，我是第一天做细菌诱导，第二天做SDS-PAGE电泳，第一天诱导完之后的细菌应该放4度，－20度，还是室温保存？跑完电泳后剩余样品想保存，又应该保存于多少度？温度对蛋白的降解有什么影响？我是新手，望各位大侠指教！感激不尽！

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细菌诱导完后可放4c就行了，此时细菌几乎不生长。不要放在室温。
电泳多余的样品如果段时间内就用的话，可放4c，时间长的话可放－20c保存。
蛋白的降解与温度没有直接的关系，只不过在适当的温度下，促进蛋白质降解的水解酶活力高，可导致蛋白的降解。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:10

文献上说，一般跑恒压的时候，浓缩胶跑较低的电压（如60V左右），分离胶跑较高的电压（如100V左右）．我这样跑效果不好．后来摸索着反过来，浓缩胶跑100V，分离胶跑60V，反而效果很好，这是为什么？

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不知道你所说的效果很好是指什么？事实上，电压的大小不是一定的，可以根据自己的经验来确定，我有同学用120V浓缩胶和分离胶，效果都挺好。
电压或电流不能太大，我觉得可把握两点就行了：一是防止产热过高；二是防止浓缩胶中蛋白是否很好浓缩，分离胶中是否很好的分开。
在保证这两个前提下，可适当提高电压或电流，加快电泳速度。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:11

昨天转膜的时候没有转完全，因为用预染marker了，胶上还有预染marker的条带，条件是以前一样的条件，为什么只转了一部分呢？我用的是biorad的半干转，80mA，2h，在转的过程中，我发现电压好像没有太大变化，我当时还挺纳闷的，是不是短路了？如果这样的话应该应该一点也转不到膜上啊，还是时间不够长，以前都是这个条件，也都转上去了，可这次为什么呢？

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很可能是偶然事件，再做做看。
如果分子量很大的话，可能转移不完全。另外膜处理的不均匀或气泡没赶尽，都会导致转膜不成功。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-6-27 16:12

楼主：

您好，我现在准备做SDS-PAGE电泳，欲从小鼠脑中提取蛋白，（蛋白位于神经元胞质和树突中，15kD）我现在提取蛋白，在提取液（60mmol/l,tris-cl;25%甘油；2%SDS;14.4mmol/lB-疏基乙酸；0.1%溴酚兰）手动匀浆，然后14000rpm离心25min，取上清.
这样是否可行？

我看到别人的提取液（全细胞裂解液）是（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：PMSF 1 mmoL/L 7：Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml10:1mM PMSF11:1mMNaF)

请问这两种是否相差好大？

可否帮我提供后一种全细胞裂解液的具体配制方法？

还有一个问题：蛋白＋loading buffer 煮沸后离心的转速和时间是多少？

谢谢您，刚做好多问题

非常感谢您

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-27 16:12

跑小分子量蛋白最近比较有心得，有需要建议的朋友请指出

作者: abc816 时间: 2013-6-27 16:13

我现在泡15KD 的蛋白显色时未见显影，但丽春红染色可见蛋白条

这是怎么回事？？？

谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:14

楼主：
您好，我现在准备做SDS-PAGE电泳，欲从小鼠脑中提取蛋白，（蛋白位于神经元胞质和树突中，15kD）我现在提取蛋白，在提取液（60mmol/l,tris-cl;25%甘油；2%SDS;14.4mmol/lB-疏基乙酸；0.1%溴酚兰）手动匀浆，然后14000rpm离心25min，取上清.
这样是否可行？
我看到别人的提取液（全细胞裂解液）是（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：PMSF 1 mmoL/L 7：Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml10:1mM PMSF11:1mMNaF)
请问这两种是否相差好大？
可否帮我提供后一种全细胞裂解液的具体配制方法？
还有一个问题：蛋白＋loading buffer 煮沸后离心的转速和时间是多少？

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你好！提组织蛋白没做过，不敢乱说。
具体的配方就是首先你要确定配的体积，然后算出相应的摩尔数，再算出质量或体积就可以了。
我一般常用6000rpm，1min。

作者: ero11 时间: 2013-6-27 16:14

我的marker最后一带常与溴酚蓝重合,常看不到最后一带,是怎么回事呢

作者: zsxan1990 时间: 2013-6-27 16:14

楼主如果样品酸性太大对跑电泳有影响吗？

作者: zsxan1990 时间: 2013-6-27 16:22

带出现纹理现象是什么现象？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:25

我的marker最后一带常与溴酚蓝重合,常看不到最后一带,是怎么回事呢

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由于两者的分子量大小相近，可能出现重合的现象，这是正常的。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:25

楼主如果样品酸性太大对跑电泳有影响吗？

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有影响，不过要视你的酸性的强弱了。
由于制胶的缓冲液和电极缓冲液都是有一定酸碱度的，而蛋白的浓缩和分离也是要依靠这个酸碱度来实现的。所以酸碱环境的破坏会对实验结果有影响的。不过如果酸性不是很强的话，应该没有问题，可以动手试一下。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:30

带出现纹理现象是什么现象？

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主要是样品中的大分子颗粒未去除造成的，建议离心取上清上样试试。

作者: yueban-1147 时间: 2013-6-27 16:31

在其它条件相同情况下，我用12%分离胶可以跑现蛋白条带，而用6%分离胶却跑不出蛋白条带？　我的目的蛋白分子量为100、120KD，不知可否用12%分离胶？

作者: is2011 时间: 2013-6-27 16:31

回楼上：SDS-PAGE的原理是分子筛的原理，胶浓度高一些分离的效果当然好，一般情况下SDS-PAGE用的多为12％的胶，6％的胶太稀了，分离的效果自然差很多。应该说6％的胶基本没有什么分离能力。如果你想让你的目的蛋白更好的分离，如你所说的100KD和120KD，建议跑梯度胶，10-15%。

作者: 如影随形 时间: 2013-6-27 16:32

回楼上：SDS-PAGE的原理是分子筛的原理，胶浓度高一些分离的效果当然好，一般情况下SDS-PAGE用的多为12％的胶，6％的胶太稀了，分离的效果自然差很多。应该说6％的胶基本没有什么分离能力。如果你想让你的目的蛋白更好的分离，如你所说的100KD和120KD，建议跑梯度胶，10- 15%。

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不准确吧. 胶浓度与欲分离的分子量有关. 比如二三十K的可以选15%的胶, 而五六十K的可以选12%, 或降至10%左右.
不过说老实话, 100K, 120K的没专门跑过, 大概可以考虑用略低于10%的浓度吧.

作者: caihong 时间: 2013-6-27 16:32

楼主你好！
我在跑15%的胶的时候mark的某个分子量条带处（比如在15kd处），本来是单一的条带怎么会出现挨的很进的两条呢？

作者: owanaka 时间: 2013-6-27 16:33

各位群友您们好：

我是一个刚开始做试验的研究生，我现在在做Western blotting 。但是总是做不出结果来。请教您们几个比较急的问题.。

1、我做的蛋白是从小鼠脑组织抽取的，分子量是15－17Kb。

2、但是曝光显影总是没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。

3、下面是我做的试验方法步骤。

非常感谢您们

盼回

第一天：

脑组织蛋白的抽取：

⑴ 取小鼠脑组织～200mg加2ml全细胞裂解液（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：1％蛋白酶抑制剂）手动冰上快速匀浆。
⑵ 14000rpm离心40min
⑶ 上清即为抽取的蛋白，吸出分装，进行定量。（-20℃保存）

电泳

制备聚丙烯酰胺凝胶：

1、 SDS-PAGE 15%胶的配制

30％丙烯酰胺 (ml) 4.0

4 X resolving (ml) 2

ddH2O (ml) 2

10%AP (μl) 40~~~~~~~~~~~~~~80

2、混匀后小心将分离胶注入准备好的玻璃板中，到达第一条横线。

3、封胶

4、待胶凝后将封胶液倒掉。

5、配制5％浓缩胶：插入梳子，室温下放置1小时左右。

5％浓缩胶

30％丙烯酰胺 (ml) 0.35

4 X stacking (ml) 0.75

ddH2O (ml) 1.97

10%AP (μl) 20~~~~~30

6、灌好浓缩胶后1h拔除梳子。

作者: owanaka 时间: 2013-6-27 16:38

7、加样

1）、小心移去梳子，将凝胶电泳板放入电泳槽，用夹子夹紧，然后在上下电泳槽中分别加入电泳缓冲液（running buffer）并使上槽缓冲液浸没胶面。

2）、上样前将胶板下的气泡赶走。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加20μl事先制备好的样品，（对于0.15cm厚的胶最哆加15 μl样品）样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane)。。

3）、电泳：预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。接通电源，电压120－130V，当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
1、电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：剪一块与胶大小一致的Hybond－P 膜，在甲醇中泡10 秒钟，再在转移buffer(transfer buffer)中浸泡10分钟，同时切下的胶也在转移buffer(transfer buffer)中浸泡一会儿然后按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(transfer buffer)。转膜时在冰块中进行。

2、100V恒压转膜2小时左右。

3、膜用塑料盒装好，加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）封好盒子。室温摇床孵育30min。

4、倒掉封闭液，加入一抗4℃过夜。

第二天

1、将膜用Washing buffer洗20分钟X 3。

2、将膜放入塑料盒中，加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：1000）,封好盒子。室温摇床孵育1小时。

3、Washing buffer洗20分钟X 3。

4、PBS洗几次

5、在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上包好显影（避光进行）。

作者: yes4 时间: 2013-6-27 16:38

好贴，顶！
顺便问一下楼主，我的电泳条带为什么呈纺锤形呢？染色后条带呼啦拉一大片，看不清楚？

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我跑PAGE的时候也出现过这种事情，除了跑的时候在浓缩胶和分离胶中的电压要控制好以外，是不是可以再检查一下你的浓缩胶和分离胶中的Buffer的PH值是不是配的相当精确，误差要在0.2之内。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:39

在其它条件相同情况下，我用12%分离胶可以跑现蛋白条带，而用6%分离胶却跑不出蛋白条带？　我的目的蛋白分子量为100、120KD，不知可否用12%分离胶？

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曾跑过大分子量蛋白的电泳，应该不需要6％的胶来做，5％的浓缩胶，10％左右的分离胶应该可以满足要求了。选择多大的胶主要还是要以能否分离出目的蛋白为准，可以在电泳后把分离胶和浓缩胶同时染色，看是否有蛋白留在浓缩胶中。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:39

楼主你好！
我在跑15%的胶的时候mark的某个分子量条带处（比如在15kd处），本来是单一的条带怎么会出现挨的很进的两条呢？

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这种现象是仅出现在marker泳道，还是别的泳道也有？同一批MARker一直都是这样吗？除你说的15kd，在别的分子量上有没有这种现象？
最好把你的图发上来看看，分析起来比较直观一点？

作者: gogo 时间: 2013-6-27 16:43

各位大侠，我有一问：
我跑Tricine-SDS-PAGE电泳，目的蛋白理论上是5kD，但是跑出来却是6-7kD左右，与理论值有一定差距，不知是何原因？
我的目的蛋白有43个AA，酸性和碱性AA20个，听说氨基酸组成对电泳结果有一定影响，但心理还是没底，有没有关于氨基酸组成与电泳结果的文献啊？小弟先谢谢了！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:44

从你的描述来看，操作方法基本没有问题，但有两处不妥：
1、是在转移膜用甲醇处理后，应在蒸馏水中漂洗后再移至buffer中，残留的甲醇可能会使蛋白不能有效转移；
2、转膜后封闭可放在4C过夜，而不是加一抗过夜，抗体反应的过程最好在摇床上进行，静置低温的环境可能导致抗体不能和抗原有效的反应。
提几点排除问题的建议：
1、确定电泳没有问题：先用你的蛋白跑电泳然后染色看看，是否能够出现正常条带，同时确定上样的浓度；
2、确定转膜没有问题：转膜后用丽春红染色，同时把转移后的胶染色（考染或银染），看看是否转移上或是否转移充分。
3、确定免疫反应没有问题：可用电泳的抗原包被膜，做DOT－ELISA，主要摸一下一抗浓度，同时也确定抗原抗体之间是否能够正常反应。
确定上述三个环节都没有问题，再进一步实验。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 16:44

各位大侠，我有一问：
我跑Tricine-SDS-PAGE电泳，目的蛋白理论上是5kD，但是跑出来却是6-7kD左右，与理论值有一定差距，不知是何原因？
我的目的蛋白有43个AA，酸性和碱性AA20个，听说氨基酸组成对电泳结果有一定影响，但心理还是没底，有没有关于氨基酸组成与电泳结果的文献啊？小弟先谢谢了！

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http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2565378_1.html
帮你查了一份以前战友发的帖子，详细的讨论了蛋白质中氨基酸的酸碱性与电泳间的关系，你可参考一下！

作者: 49888 时间: 2013-6-27 16:44

Number of amino acids: 44

Molecular weight: 5012.5

Theoretical pI: 5.34

Amino acid composition:

Ala (A) 2 4.5%
Arg (R) 1 2.3%
Asn (N) 1 2.3%
Asp (D) 2 4.5%
Cys (C) 0 0.0%
Gln (Q) 3 6.8%
Glu (E) 8 18.2%
Gly (G) 2 4.5%
His (H) 0 0.0%
Ile 2 4.5%
Leu (L) 2 4.5%
Lys (K) 8 18.2%
Met (M) 2 4.5%
Phe (F) 1 2.3%
Pro (P) 2 4.5%
Ser (S) 5 11.4%
Thr (T) 3 6.8%
Trp (W) 0 0.0%
Tyr (Y) 0 0.0%
Val (V) 0 0.0%

Asx ( 0 0.0%
Glx (Z) 0 0.0%
Xaa (X) 0 0.0%

Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 10
Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 9

谢谢，你给的连接我看了，还是不能解释我的实验结果啊？
上面是我目的蛋白的氨基酸组成，不明白我的SDS-PAGE 结果为什么会差1kD？

作者: 8princess8 时间: 2013-6-27 17:08

在其它条件相同情况下，我用12%分离胶可以跑现蛋白条带，而用6%分离胶却跑不出蛋白条带？　我的目的蛋白分子量为100、120KD，不知可否用12%分离胶？

曾跑过大分子量蛋白的电泳，应该不需要6％的胶来做，5％的浓缩胶，10％左右的分离胶应该可以满足要求了。选择多大的胶主要还是要以能否分离出目的蛋白为准，可以在电泳后把分离胶和浓缩胶同时染色，看是否有蛋白留在浓缩胶中。

谢谢指点。我用6%、8%、10%、12%分离胶试过。6%分离胶只见一条竖的蛋白痕迹，8%的在一条竖的蛋白痕迹中可见一条横带，10%的在一条竖的蛋白痕迹中可见三条横带，12%可见分离清楚的横条带。不知何原因。

作者: tianmei001 时间: 2013-6-27 17:09

想问一下关于样品缓冲液得问题，请指教。
我看到有好几种不同得样品缓冲液：5x，6x，还有2x的，这些数字指的什么东西的浓度呢？在植物材料上用那种好些？另外，在样品缓冲液中，用巯基乙醇的作用和DTT的作用是完全一样的么？在量上面有什么区别？
我想配一个6x的样品缓冲液，成分是这样的（总体积约36ml）：
1.5 M tris-Hcl（PH6.8） 6ml
β-巯基乙醇 10.8ml
甘油 18ml
10%SDS 3.6g
溴芬蓝少量
这样配出来的好象不是兰色的，是金黄色（偏红），因为以前用人家配好的是兰色的，所以，不知道是否在配的过程中还要注意什么问题了？
PS：这个方法是从同学那边抄来的，所以还不一定正确。

作者: bring 时间: 2013-6-27 17:09

楼上的做柚子的兄弟：所谓5x，6x，还有2x指的是上样缓冲液的倍数，标准是1x的loading buffer，那么5x，6x，还有2x指的是你的loading buffer中的各组分的浓度是标准的1x loading buffer的5倍、6倍、2倍。一般我用都是用2x的loading buffer，这样使用的时候只要和样品1：1混合变性就可以了。比较方便，不要再计算。
1x loading buffer：
62.5mmol/L Tris-HCl pH6.8，2% SDS ，10% v/v甘油，5%β—巯基乙醇或100mmol/L DTT
你可以按这个换算一下。
一般说来溴酚兰加太多的话，颜色是会偏深，出现偏红的颜色，其实溴酚兰也就是起个指示作用，能够清楚的显示颜色就可以了，不用加太多。
用巯基乙醇的作用和DTT的作用是完全一样的，只是DTT相对更稳定一些，不易分解失效。所以loading buffer中建议使用DTT，这样配完可以分装在离心管中－20度保存，要用的时候拿出来化冻就可以用了，而如果加ME就不行了，一定要现加现用。

作者: bring 时间: 2013-6-27 17:10

不准确吧. 胶浓度与欲分离的分子量有关. 比如二三十K的可以选15%的胶, 而五六十K的可以选12%, 或降至10%左右.
不过说老实话, 100K, 120K的没专门跑过, 大概可以考虑用略低于10%的浓度吧.

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可能有些误会，我所说的和你的意思其实是一样的。2、30K的蛋白要跑10％的胶也能跑，只是分离不好，因为胶浓度太稀，分辨率不够，但是SDS-PAGE用的是分子筛原理应该是没错的吧。就像层析，要想分辨小分子量的物质就要用分辨率高的柱子是一样的。

作者: guagua 时间: 2013-6-27 17:10

Number of amino acids: 44

Molecular weight: 5012.5

Theoretical pI: 5.34

Amino acid composition:

Ala (A) 2 4.5%
Arg (R) 1 2.3%
Asn (N) 1 2.3%
Asp (D) 2 4.5%
Cys (C) 0 0.0%
Gln (Q) 3 6.8%
Glu (E) 8 18.2%
Gly (G) 2 4.5%
His (H) 0 0.0%
Ile 2 4.5%
Leu (L) 2 4.5%
Lys (K) 8 18.2%
Met (M) 2 4.5%
Phe (F) 1 2.3%
Pro (P) 2 4.5%
Ser (S) 5 11.4%
Thr (T) 3 6.8%
Trp (W) 0 0.0%
Tyr (Y) 0 0.0%
Val (V) 0 0.0%

Asx ( 0 0.0%
Glx (Z) 0 0.0%
Xaa (X) 0 0.0%

Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 10
Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 9

谢谢，你给的连接我看了，还是不能解释我的实验结果啊？
上面是我目的蛋白的氨基酸组成，不明白我的SDS-PAGE 结果为什么会差1kD？

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我让你看的目的是想说明氨基酸的组成，从理论上来说在SDS－page电泳中对试验结果应该是没有影响的，电泳中条带的位置只与分子量大小相关。由于在样品处理的过程中，加入了大量的SDS和还原剂，使蛋白解离成线性并在SDS的包裹下形成椭球形，由于SDS的存在，其所带的负电荷远远超过了蛋白分子本身的电荷，而使SDS－蛋白复合物在电场的作用下只与蛋白的分子量大小相关。
现在出现这种问题，可建议从两个方面找原因：
1、电泳的样品buffer有没有问题？可建议现配一次，跑跑看。因为现在大多都泳DTT作为还原剂，如果保存不当的话，可能会使其被氧化，而不能充分破坏蛋白分子中的二硫键，而是分子量大小不与蛋白位置呈正相关。
2、回到蛋白质的本身去找问题，比如你的蛋白是天然的还是人工表达的或是合成的，测序了吗？可是你的目标蛋白？可能的话可以作个免疫印迹鉴定一下。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:11

谢谢指点。我用6%、8%、10%、12%分离胶试过。6%分离胶只见一条竖的蛋白痕迹，8%的在一条竖的蛋白痕迹中可见一条横带，10%的在一条竖的蛋白痕迹中可见三条横带，12%可见分离清楚的横条带。不知何原因。

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胶的浓度过低时，其分子筛作用不明显，因而不能有效分离蛋白，会出现类似于拖带的情况。

作者: qqq111 时间: 2013-6-27 17:11

请教各位大侠，小妹正在做WB,以前跑的SDS-PAGE电泳条带非常清晰，而同样的条件只是试剂重配过了，最近的效果却很差，条带总有点模糊感，而且分离胶15％按《分子克隆》上的配方，过硫酸胺(都是现配现用)的量都加倍到0.30ML,TEMED也是0.30ML胶才凝,这么多的催化剂和加速剂是否会影响分辨效率?我的目标蛋白是45KD和30KD,浓缩胶是5%的,请教我怎样解决胶不凝的情况,怎样提高我的分辨效率?

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:12

想问一下关于样品缓冲液得问题，请指教。
我看到有好几种不同得样品缓冲液：5x，6x，还有2x的，这些数字指的什么东西的浓度呢？在植物材料上用那种好些？另外，在样品缓冲液中，用巯基乙醇的作用和DTT的作用是完全一样的么？在量上面有什么区别？
我想配一个6x的样品缓冲液，成分是这样的（总体积约36ml）：
1.5 M tris-Hcl（PH6.8） 6ml
β-巯基乙醇 10.8ml
甘油 18ml
10%SDS 3.6g
溴芬蓝少量
这样配出来的好象不是兰色的，是金黄色（偏红），因为以前用人家配好的是兰色的，所以，不知道是否在配的过程中还要注意什么问题了？
PS：这个方法是从同学那边抄来的，所以还不一定正确。

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5×、6×或者别的比例，主要是指当中的除水外的有效成分与1×sample loading buffer的比例，试验中如果样品中的蛋白浓度不是很低的话，不主张用高倍比的buffer，正如dimocarpus战友所说，计算不方便，常用的有1×、2×，可参考一下dimocarpus战友的配方。
植物材料用这个配方也是没有问题的。
在sample loading buffer中，DTT和B－巯基乙醇的作用是相同的，都是起到还原的作用，就是将蛋白分子的二硫键打开，然后结合自身所带的－SH，使蛋白的高级结构被破坏。
相比较而言，DTT的气味和毒性都要小的多，而在作用上更有效些，一般DTT在比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近（不一定适用于SDS-PAGE），但DTT价格略高一些。
DTT一般放在－20c保存，不能高压。
你所说的溴酚蓝金黄色是由于你的pH没调好导致的，需在没加溴酚蓝之前，将缓冲液的pH调到6.8，必须要准，否则在碱性的情况下会出现你所说的问题。

作者: rxcc33 时间: 2013-6-27 17:12

请教各位大侠，小妹正在做WB,以前跑的SDS-PAGE电泳条带非常清晰，而同样的条件只是试剂重配过了，最近的效果却很差，条带总有点模糊感，而且分离胶15％按《分子克隆》上的配方，过硫酸胺(都是现配现用)的量都加倍到0.30ML,TEMED也是0.30ML胶才凝,这么多的催化剂和加速剂是否会影响分辨效率?我的目标蛋白是45KD和30KD,浓缩胶是5%的,请教我怎样解决胶不凝的情况,怎样提高我的分辨效率?

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单体没有问题的话我个人倾向于认为AP有点问题。我最近也碰到这个问题，AP容易潮解，可能容易变质。配的时候要充分的混匀。AP和TEMED不能加得太多，尤其是TEMED不能加太多。一般胶凝固时间以1h左右为好。加太多胶凝固太快，凝固的不均匀，分辨率会受到很大的影响，而且，胶凝固太快的话，像Marker等可能就会有“鬼带”出现，也就是某些条带下面会多出一两条条带。15％的胶跑30和45KD的蛋白应该可以了，注意跑的时候电压不要太高，不要跑太快，如果还想要提高分辨率的话，推荐跑梯度胶，10－17.5％，但是要小心，浓度太高胶很脆，剥胶的时候别剥破了。

作者: hustwb 时间: 2013-6-27 17:13

我跑的细胞浓缩上清液，可是等跑完之后发现什么都没有，而且样品还严重的影响MARKER的条带，即MARKER都跑斜了还不清楚，请问这是怎么回事啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:13

请教各位大侠，小妹正在做WB,以前跑的SDS-PAGE电泳条带非常清晰，而同样的条件只是试剂重配过了，最近的效果却很差，条带总有点模糊感，而且分离胶15％按《分子克隆》上的配方，过硫酸胺(都是现配现用)的量都加倍到0.30ML,TEMED也是0.30ML胶才凝,这么多的催化剂和加速剂是否会影响分辨效率?我的目标蛋白是45KD和30KD,浓缩胶是5%的,请教我怎样解决胶不凝的情况,怎样提高我的分辨效率?

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不凝的问题可能主要是：1、温度，温度太低，凝固的速度慢或不凝，可放在37C温箱中孵育；2、AP和TEMED，一般情况下，这二者是不太容易出现问题的，虽然说AP容易失效，但我的经验曾用过4C冰箱中保存半年的10%AP,也没有问题。不过可换下试试。3、如果30％丙稀酰铵换过，可能是这个问题，如果丙稀酰铵不纯的话，可能在胶鳌合时，效果不好。
条带模糊可能与你的胶凝固不好有关，可适当降低凝胶浓度看看，用12％凝胶看看。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:13

我跑的细胞浓缩上清液，可是等跑完之后发现什么都没有，而且样品还严重的影响MARKER的条带，即MARKER都跑斜了还不清楚，请问这是怎么回事啊？

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什么都没有，可能是你的样品蛋白浓度太低或根本就没有蛋白。Marker能跑出来，说明你的系统是没有问题的。跑斜了，也不一定是样品蛋白影响的，可能是玻璃板底部的气泡引起的。

作者: pengke1983 时间: 2013-6-27 17:14

请教高手:现近配胶完后,出现凹凸不平的现象（从玻璃外面可见花纹状）,不知什么原因啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:14

什么意思？是胶的上缘不平，还是与玻璃板接触面不平？

作者: applebook=213 时间: 2013-6-27 17:15

我跑的细胞浓缩上清液，可是等跑完之后发现什么都没有，而且样品还严重的影响MARKER的条带，即MARKER都跑斜了还不清楚，请问这是怎么回事啊？

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你的上清液里是不是盐浓度很高啊，如果很高的话是会影响到边上泳道的电泳的。

作者: tieshazhang 时间: 2013-6-27 17:15

请教几个问题：
我买的天为时代的蛋白marker，取10ul直接上样就行，不用再加loading buffer
但我的样品用的上样buffer和它marker的好像不协调，跑浓缩胶的时候，marker的前沿迟迟不动，这样前沿挺难看，后来才渐渐齐了，但跑出来的不好看。不同的buffer是否对电泳有影响？
我是浓缩胶80v，分离胶120v，0.75mm的胶两块，bio-rad的电泳槽
上面两个是我跑的，带总是会变宽或窄，带会不一样宽，很难看
下面两个是我从园子里看别人发的，
怎么才能跑到他们那么漂亮呢？
我觉得自己做胶到上样都挺好。
电极那金属线稍微有一点点弯是否会影响前沿的水平呢？

还有我按1gR250 450ML乙醇 450ml水 100ml醋酸配染液，胶缩得好小好小了

图片附件: 83454875.jpg (2013-6-27 17:15, 41.93 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16875

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-6-27 17:16

想问一下上样量的问题，走SDS-PAGE时必须保证每个上样孔的上样体积（样品加loading buffer)都一样吗？可是每个样品的蛋白浓度都是不同的，如果要保证每个孔的蛋白含量一致（例如100ug），相应的所上样品的体积就不同，再按1：1加loading buffer就很难让每个孔的总体积都一样呀，可不可以用loading buffer补足体积，而不按比例加laoding buffer，我正要做western-blot，没什么经验，希望大侠们多指点，不胜感激！

作者: S6044 时间: 2013-6-27 17:16

请教大侠一个问题：我转膜时蛋白marker总是不清楚，marker是Fermentas的彩虹marker，上样量3微升，电泳时marker跑得很漂亮。转膜用的缓冲液是按分子克隆上的配方（甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，用水定容至1升），转膜电压100V，电流210mA左右。转膜后经常是marker不清楚（别的同学同样的方法效果很好），我一直找不到原因。转好的膜用丽春红染色后蛋白条带还是很清楚的。为什么marker转得不好？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:16

最近我跑sds-page电泳回收某一分子量的蛋白,坛子上有不少人提到对着分子量切胶再跑水平电泳回收蛋白,请教两问题:

(1)为什么会出现两条带

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应该是最底部的两条带吧，这应该是因为你切胶时没有很准确的切下目的条带，而把相邻的条带也切下来的缘故，可以同时多个泳道跑电泳，然后快速染色一个泳道，对照这个位置切余下的胶，不过要十分准确的切胶，这就与你电泳时是否位置一致有关了。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:17

请教几个问题：
我买的天为时代的蛋白marker，取10ul直接上样就行，不用再加loading buffer
但我的样品用的上样buffer和它marker的好像不协调，跑浓缩胶的时候，marker的前沿迟迟不动，这样前沿挺难看，后来才渐渐齐了，但跑出来的不好看。不同的buffer是否对电泳有影响？
我是浓缩胶80v，分离胶120v，0.75mm的胶两块，bio-rad的电泳槽
上面两个是我跑的，带总是会变宽或窄，带会不一样宽，很难看
下面两个是我从园子里看别人发的，
怎么才能跑到他们那么漂亮呢？
我觉得自己做胶到上样都挺好。
电极那金属线稍微有一点点弯是否会影响前沿的水平呢？

还有我按1gR250 450ML乙醇 450ml水 100ml醋酸配染液，胶缩得好小好小了

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不知道你加样的时候是怎么加的？看起来好像是样品扩散造成的，建议检查一下是否是加样时间过长和加样泳道两边的泳道为空泳道（如果是，可以用上样buffer加一下，防止样品对周围扩散）。
上样buffer应该都是大同小异的，不会对电泳产生影响。
金属线弯一点没事的。
染色液也没有问题，胶变得小也是正常的，主要是在染色过程中失水引起的，可在脱色后用水浸泡一下就可以了。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:17

想问一下上样量的问题，走SDS-PAGE时必须保证每个上样孔的上样体积（样品加loading buffer)都一样吗？可是每个样品的蛋白浓度都是不同的，如果要保证每个孔的蛋白含量一致（例如100ug），相应的所上样品的体积就不同，再按1：1加loading buffer就很难让每个孔的总体积都一样呀，可不可以用loading buffer补足体积，而不按比例加laoding buffer，我正要做western-blot，没什么经验，希望大侠们多指点，不胜感激！

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不需要体积都相同，有时为了比较浓度的不同，可以按同样比例稀释样品，然后同样体积的样品，但如果你是为了保证条带的一致性，可计算好同等蛋白量的体积就可以了。loading buffer主要是使蛋白变性的作用，其中的sds和DTT一般都是过量的，肯定可以满足上样蛋白的需要，如果不放心可适当多加点，但最终计算好你加了多少蛋白量就可以了，做weston之前最好摸索一下电泳条件再做。

作者: S6044 时间: 2013-6-27 17:18

不知道你加样的时候是怎么加的？看起来好像是样品扩散造成的，建议检查一下是否是加样时间过长和加样泳道两边的泳道为空泳道（如果是，可以用上样buffer加一下，防止样品对周围扩散）。
上样buffer应该都是大同小异的，不会对电泳产生影响。
金属线弯一点没事的。
染色液也没有问题，胶变得小也是正常的，主要是在染色过程中失水引起的，可在脱色后用水浸泡一下就可以了。

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谢谢你解除我一些疑惑
加样就是用10ul的枪，加完自我感觉挺漂亮，也没串孔，没有很长时间吧，
一个样一枪。空泳道也加了buffer的。
你看我的样品带比marker带宽了好多，真难看阿，都像marker带就好了，
虽然宽，但又好像没超过那个孔的范围，我用的10孔的，只用中间几个孔，
急需跑出漂亮的带要毕业了阿
我也不知道该注意什么了，样品就是TCA沉淀的酵母培养上清，
顺便问一下，DOC-TCA中，0.15%的DOC怎么配，用水么？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:18

谢谢你解除我一些疑惑
加样就是用10ul的枪，加完自我感觉挺漂亮，也没串孔，没有很长时间吧，
一个样一枪。空泳道也加了buffer的。
你看我的样品带比marker带宽了好多，真难看阿，都像marker带就好了，
虽然宽，但又好像没超过那个孔的范围，我用的10孔的，只用中间几个孔，
急需跑出漂亮的带要毕业了阿
我也不知道该注意什么了，样品就是TCA沉淀的酵母培养上清，
顺便问一下，DOC-TCA中，0.15%的DOC怎么配，用水么？

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可在你的上样buffer中加些甘油试试。
doc－tca没做过。

作者: NBA 时间: 2013-6-27 17:19

DOC是用水配

作者: DONT 时间: 2013-6-27 17:19

一群?搞本分子克隆的书不就的了,还哪来那么多的鸟问题

作者: kuaizige 时间: 2013-6-27 17:20

变性电泳中，蛋白质大小比预测的大的多是怎么回事？预测35kD,跑出来却是50几kD?

作者: mimili_901 时间: 2013-6-27 17:20

想问SDS-PAGE的电泳缓冲液可以重复使用吗？另外，如果蛋白质降解了，跑出来的胶会是什么样子？

作者: 8princess8 时间: 2013-6-27 17:20

DOC是用水配

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请问DOC-TCA法是否就不用像TCA法，-20度放置半小时以上拉。
按蛋白质技术手册操作即可？

我的带跑得宽度不同，是否是因为盐浓度的问题？
TCA法能沉淀下盐来么？
我是将沉淀用丙酮洗一下，然后溶于20ul水，不好溶，我加了5ul 2N氢氧化钠就溶了，然后取5ul加5ulbuffer煮了上样。
丙酮为什么要用-20度的？？

作者: lixi559 时间: 2013-6-27 17:21

小妹请教一个问题：
我买了一个蛋白质低分子量的marker，分子量分别为97.2kD、66.4kD、44.2kD、29kD、20.1kD、14.3kD，按照说明书上的上样，一次5微升，结果只有97.2和14.3的带清楚，其余的带模糊不清，而且弥散，特别是20.1的带几乎没有。后来我把上样量提高到10微升，结果还是一样的。从说明书上的图例来看，这些带的亮度差不多，请问这是什么原因，是因为我的操作问题吗？我用的是12％的分离胶。我刚刚做SDS-PAGE电泳，好多问题还需大侠指教。谢谢！

作者: 9900 时间: 2013-6-27 17:21

请问楼主：我做的蛋白是11kd的小蛋白，样品是用8M尿素提取的细胞总蛋白。跑12％的胶常常跑到底端或干脆跑不出来，而跑了几次15％的胶，却总是上半部分条带很清晰，下半部分常常条带模糊，做western根本杂不出11kd的目的蛋白，这是咋回事啊？。谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:21

想问SDS-PAGE的电泳缓冲液可以重复使用吗？另外，如果蛋白质降解了，跑出来的胶会是什么样子？

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可以的，蛋白降解主要会出现明显的拖带现象。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:22

小妹请教一个问题：
我买了一个蛋白质低分子量的marker，分子量分别为97.2kD、66.4kD、44.2kD、29kD、20.1kD、14.3kD，按照说明书上的上样，一次5微升，结果只有97.2和14.3的带清楚，其余的带模糊不清，而且弥散，特别是20.1的带几乎没有。后来我把上样量提高到10微升，结果还是一样的。从说明书上的图例来看，这些带的亮度差不多，请问这是什么原因，是因为我的操作问题吗？我用的是12％的分离胶。我刚刚做SDS-PAGE电泳，好多问题还需大侠指教。谢谢！

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不知道你用的是哪个公司的marker，以前跑的怎样？
可按以下步骤逐一排除：
1、降低分离胶浓度，10％的试试；
2、看看是不是染色液和脱色液的问题，染色液脱色液使用次数过多可能会出现这种情况；
3、看看是不是电极缓冲液的问题；
4、如果可能的话，换用别人成熟的电泳系统来做一下，排除marker处理的问题；
5、如果上述处理后还不能正常，就可能是marker产品自身的原因了。换一家公司的用了。

作者: 8princess8 时间: 2013-6-27 17:22

见到生工主页上有卖一种染色液
不用甲醇和醋酸，是否就是G-250染色液
在染色前他先把胶放水里，微波炉里煮沸，然后再染，也是微波炉煮
R-250 染色后，是否也该先煮一煮？或纯水冲洗一下。
银染也不麻烦，灵敏度又高，为什么倒不常用？除了需要打谱的原因。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:23

请问楼主：我做的蛋白是11kd的小蛋白，样品是用8M尿素提取的细胞总蛋白。跑12％的胶常常跑到底端或干脆跑不出来，而跑了几次15％的胶，却总是上半部分条带很清晰，下半部分常常条带模糊，做western根本杂不出11kd的目的蛋白，这是咋回事啊？。谢谢！

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Marker跑的怎样，看看是不是电泳缓冲液的问题。

作者: wsll 时间: 2013-6-27 17:23

从头看到尾，真是受益匪浅！
在此我想请教一个问题：我用的是晶美（ferments）的marker，每次跑带都会跑丢两条，不知是怎么回事？
还有就是我准备跑一个小分子量的电泳，5000左右，marker说明书上让跑夹层胶，哪位同仁做过，请指导一下，谢谢！

作者: kuaizige 时间: 2013-6-27 17:23

Marker跑的怎样，看看是不是电泳缓冲液的问题。

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谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。

作者: finger 时间: 2013-6-27 17:24

想问SDS-PAGE的电泳缓冲液可以重复使用吗？另外，如果蛋白质降解了，跑出来的胶会是什么样子？

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电泳缓冲液是可以反复使用几次的，不过反复使用的缓冲液对于分辨率会有一些影响，尤其是双向电泳中。如果蛋白降解了，跑出来的胶应该会出现一些本来没有的条带，因为降解的时候是随机的，并不是延着二硫键断裂的。

作者: finger 时间: 2013-6-27 17:24

谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。

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一般认为10K以下的就算是肽了，而肽的话用普通的12.5%的SDS-PAGE分离就不太适合了。建议使用小肽胶，即tricine胶，具体的方法坛子里也有。

作者: xyw5 时间: 2013-6-27 17:25

对于第一个问题，免疫原性应该还在，因为并不破坏抗原决定簇。可以不用考马斯亮蓝染胶，用KCL染就行

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-27 17:25

1为诱导前，2为诱导后，3为Marker；依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4抗kD。312个aa，不是天然蛋白，是人工蛋白。

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你的蛋白确实大了很多，并非正常现象，不知道你做诱导之前做过gene测序没有，有没有排除gene和载体上有突变的可能性。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:26

谢谢!
marker跑的还可以，6条带都能跑出来，也比较清晰，但最小的一条14kd的带比较弱，而其它道中相应于14kd处的蛋白和更小的蛋白就已经是模糊的了，所以根本得不到10kd左右的蛋白。

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同意，可以用tricine胶来试试！

作者: gmjghh 时间: 2013-6-27 17:26

请问楼主,我现在作的western,蛋白分子量是256kd,但是,只查到了有212kd的预染marker,如果用这种marker来推断我的蛋白可不可以呢?如果不行的话,该选择什么样的marker呢?哪里可以买到这么大分子量的marker?毕业在即,实验还没有完成,急切求助!谢谢了!

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:27

见到生工主页上有卖一种染色液
不用甲醇和醋酸，是否就是G-250染色液
在染色前他先把胶放水里，微波炉里煮沸，然后再染，也是微波炉煮
R-250 染色后，是否也该先煮一煮？或纯水冲洗一下。
银染也不麻烦，灵敏度又高，为什么倒不常用？除了需要打谱的原因。

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R-250染色中，适度升高温度是可以加快染色速度的。不知你所说的煮一下或用纯水冲一下是什么意思？
银染和考染都是实验室很常用的蛋白电泳染色方法，应该不存在你说的不常用。不过银染的灵敏度虽然高，但同时也易受干扰，可能会导致背景高。还有银染对组蛋白和一些酸性蛋白的来说非常困难。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:27

从头看到尾，真是受益匪浅！
在此我想请教一个问题：我用的是晶美（ferments）的marker，每次跑带都会跑丢两条，不知是怎么回事？
还有就是我准备跑一个小分子量的电泳，5000左右，marker说明书上让跑夹层胶，哪位同仁做过，请指导一下，谢谢！

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夹层胶就是一般的垂直电泳胶吧！参考一下蛋白质电泳书就可以了，或在园子这样的帖子也很多。
Marker跑丢，前面介绍过排除的方法，可参考一下。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:27

请问楼主,我现在作的western,蛋白分子量是256kd,但是,只查到了有212kd的预染marker,如果用这种marker来推断我的蛋白可不可以呢?如果不行的话,该选择什么样的marker呢?哪里可以买到这么大分子量的marker?毕业在即,实验还没有完成,急切求助!谢谢了!

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没见过那么大的marker，有225KD的预染marker，不过与200KD的没什么区别。我想用200KD的做标准估计一下应该是没什么问题的！

作者: applebook=213 时间: 2013-6-27 17:28

嗯,谢谢楼主了~~那我就先用212kd的试试

作者: 66+77 时间: 2013-6-27 17:28

谢谢楼主的精彩指点！
楼主我做的是胶原蛋白的电泳
蛋白的分子量大概是10KD左右
请问要用多少浓度的分离胶和浓缩胶比较合适？？
我的主要目的是分析纯度，请问需要注意些什么？
我试过用10％的分离胶跑过，结果是出现了三条蛋白带，但是靠得比较近，请问怎么让它们可以拉开一点？？

作者: 66+77 时间: 2013-6-27 17:30

补充问一下，我在一篇资料上看到说胶原蛋白不能用SDS－PAGE测分子量，请问楼主是不是真的？我已经买了标准蛋白样品，不能测的话就哭死了～～

作者: 49888 时间: 2013-6-27 17:30

谢谢楼主的精彩指点！
楼主我做的是胶原蛋白的电泳
蛋白的分子量大概是10KD左右
请问要用多少浓度的分离胶和浓缩胶比较合适？？
我的主要目的是分析纯度，请问需要注意些什么？
我试过用10％的分离胶跑过，结果是出现了三条蛋白带，但是靠得比较近，请问怎么让它们可以拉开一点？？

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用20％左右的分离胶试一下，应该可以放开。如果还有问题，可换电泳缓冲液。我曾经用它分离出3kd的蛋白。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:31

10kd的蛋白应该用tricine电泳缓冲液来跑电泳，可用15％的胶来试试。
胶原蛋白不甚了解，你可具体查一下！sds-page判断蛋白分子量的原理，是利用蛋白在sds和dtt（或B巯基乙醇）的作用下，使蛋白分子高级结构被破坏，同时在sds的包裹下形成椭圆形的球状复合物，屏蔽了蛋白自身的电荷，使所有蛋白的电荷量相近，在电场的作用下，sds－蛋白复合物的迁移率与分子量大小成线性正相关，分子量大的跑的慢，小的跑的快。从而可根据标准分子量拟合出标准曲线，计算出未知蛋白的分子量大小。
糖蛋白虽然存在线性关系，但其结合sds的能力与标准蛋白不同，因而一般不能用该方法来计算其分子量大小。

作者: am10 时间: 2013-6-27 17:31

下面（Attanchment里面）是我走的SDS——PAGE，蛋白的分子量为2800；
走的分离胶的浓度为20%；不知怎么回事，分子量为这么小的蛋白好像很容易扩散，走不出像Marker那样的标准的带！我估计不是蛋白溶解性的的原因，因为marker最下面的那条带也扩散的很厉害，但是上面的几条带有很漂亮，估计这是小肽本身的性质所决定的吧！还有我上的蜂毒标准样品也扩散的很厉害！
小蚂哥，有什么方法可以防止这样的扩散吗？
SOS..........SOS........SOS..........

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:32

多加点甘油试试吧。

作者: kuohao17 时间: 2013-6-27 17:32

加在上样的蛋白里吗？

作者: okhaha 时间: 2013-6-27 17:32

我做的是乳酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，有两个问题：
1，胶凝的太快了，大概几分钟就凝固了。
2，加样后，样品不往凝胶里跑，不可能是正负极弄反了。
请各位高手指教。

作者: birdfish 时间: 2013-6-27 17:33

楼主的总结让人受益匪浅。
我有两个问题想请教：
1 我的电泳跑出来下面的一些条带（就是靠近溴芬兰的那端）总是比较糊，不知道会是什么原因呢？很多试剂都已经重新配过了。
2 电泳缓冲液中的甘氨酸是起什么作用呢？因为我看到两个配方，而其中仅甘氨酸的浓度有些差异
请大侠们指教！

作者: xueyouzhang 时间: 2013-6-27 17:33

我用的是肺磷癌组织标本,上样量为20微克总蛋白,用SANTA CRUZ 的抗兔的针对annexin II 的抗体,1:1000稀释,显影后怎么会有两条带,我用10%和12%的胶都试了一次,都是两条带,是样品的时间久了吗?还会不会有其他原因,希望各位高手指点一下迷津,谢谢!!

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-6-27 17:35

我做的目的蛋白的分子量是55kd,用Bio-Rad的系统,电泳是分离胶80V,浓缩胶120V,转膜是恒压100V,30min,分子量标准是invitrogen公司的预染marker,先说我现在遇到的问题:
1) marker在浓缩胶里面跑的好好的,但是到了分离胶就慢慢向右边扩散(marker加在最左边,它前面有两个孔什么也没加),做了好几次都是这样,而且歪的方向都一样(marker的上样量是6ul,说明书推荐的是5ul)
2) 转膜后丽春红染色, 十分难看,在比木的蛋白小的地方有几条条带,但是在木的蛋白大小的地方什么也没有,我觉得marker跑的距离没拉开,而且歪的厉害,所以很难看出问题,
明天再跑时多跑一会,小分子的蛋白会不会跑没了?
做了好几次都这样,郁闷死了,请各位高手指点,不胜感激!!

作者: jkobn 时间: 2013-6-27 17:35

楼主的总结让人受益匪浅。
我有两个问题想请教：
1 我的电泳跑出来下面的一些条带（就是靠近溴芬兰的那端）总是比较糊，不知道会是什么原因呢？很多试剂都已经重新配过了。
2 电泳缓冲液中的甘氨酸是起什么作用呢？因为我看到两个配方，而其中仅甘氨酸的浓度有些差异
请大侠们指教！

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1. 我想问题可能有两个，一是你的样品制备的问题，另一个是不是你的胶浓度不是很合适。
2.甘氨酸的作用我也不是很清楚，但是它的浓度大应该可以促进蛋白泳动分离的速度吧？我也看到过有两个配方，仅甘氨酸的浓度不同，这两种我都用过，没有什么大的影响，哪个都可以，用甘氨酸少的那个即可。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:36

我做的是乳酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，有两个问题：
1，胶凝的太快了，大概几分钟就凝固了。
2，加样后，样品不往凝胶里跑，不可能是正负极弄反了。
请各位高手指教。

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1.你用的是什么配方，别人做过吗？是否正常？
2。电泳装置配置是否正常，比如带硅胶条的电泳槽是否去掉了硅胶条，内外槽是否正确安装。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:36

楼主的总结让人受益匪浅。
我有两个问题想请教：
1 我的电泳跑出来下面的一些条带（就是靠近溴芬兰的那端）总是比较糊，不知道会是什么原因呢？很多试剂都已经重新配过了。
2 电泳缓冲液中的甘氨酸是起什么作用呢？因为我看到两个配方，而其中仅甘氨酸的浓度有些差异
请大侠们指教！

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1。排除试剂的原因，很可能就是胶的浓度问题，适当降低浓度试试。
2。甘氨酸主要在形成电泳电场形成中起作用。甘氨酸与Tris构成电极缓冲液，在浓缩胶和上样不buffer中都是PH6.8的tris-HCL,而在分离胶中pH8.9的tris-HCL缓冲液，所以，当蛋白质在浓缩胶里的时候，环境偏酸性，甘氨酸的电离较少，这时外在电场电流较小，蛋白质的整体涌动速度慢，而样品中的HCL为强酸，可有效电离，那么其中的电流涌动速度快，会使蛋白质样品内部有效浓缩，而整体缓慢推进。
当蛋白质样品进入分离胶时，环境偏碱性，此时，甘氨酸有效电离，整个电场中电荷增加，电流增大，从而使蛋白质样品随分子量的不同得到有效分离。
配方可采用分子克隆上的。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:36

我用的是肺磷癌组织标本,上样量为20微克总蛋白,用SANTA CRUZ 的抗兔的针对annexin II 的抗体,1:1000稀释,显影后怎么会有两条带,我用10%和12%的胶都试了一次,都是两条带,是样品的时间久了吗?还会不会有其他原因,希望各位高手指点一下迷津,谢谢!!

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我想大致应该有以下两个原因，你可参考以下：
1。蛋白条带的分子量是否正确，会不会出现蛋白质解离得问题。
2。是不是有可能是你的抗体纯度不够。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:37

我做的目的蛋白的分子量是55kd,用Bio-Rad的系统,电泳是分离胶80V,浓缩胶120V,转膜是恒压100V,30min,分子量标准是invitrogen公司的预染marker,先说我现在遇到的问题:
1) marker在浓缩胶里面跑的好好的,但是到了分离胶就慢慢向右边扩散(marker加在最左边,它前面有两个孔什么也没加),做了好几次都是这样,而且歪的方向都一样(marker的上样量是6ul,说明书推荐的是5ul)
2) 转膜后丽春红染色, 十分难看,在比木的蛋白小的地方有几条条带,但是在木的蛋白大小的地方什么也没有,我觉得marker跑的距离没拉开,而且歪的厉害,所以很难看出问题,
明天再跑时多跑一会,小分子的蛋白会不会跑没了?
做了好几次都这样,郁闷死了,请各位高手指点,不胜感激!!

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如果条带正常的话,Marker一般不会有什么问题的，我想你所说的可能是因为样品的缘故导致marker跑斜，另外就是空泳道最好加点上样buffer，防止其他用到的样品扩散过来。
至于条带，只有等你marker正常的时候再讨论了

作者: summerxx 时间: 2013-6-27 17:37

我要做的是分子量小于20kDa的碱性蛋白的western-blot, 一直做不出，免疫组化结果阳性很明显，应该不是抗体的问题，不知是不是western体系有什么不对？目前体系与楼主说的一样，据说碱性蛋白做western比较难，有时小分子，请有经验的人赐教。谢谢！

作者: KGZ564 时间: 2013-6-27 17:41

估计是不行的，除非蛋白质变性后能再复性，要不生物活性肯定受影响的，我做过这方面的实验，也是需要把蛋白提取出做免疫动物做抗体。

作者: xue258 时间: 2013-6-27 17:41

请教楼主一个问题：
做SDS－PAGE，点样后一加上电压开始跑，有的点样孔中的溴酚兰就开始向下漏，一直漏到浓缩胶和分离胶的交界面上，然后横向扩散。当其他孔中的溴酚兰迁移到分离胶和浓缩胶的分界面后，扩散的溴酚兰再同其他孔的溴酚兰一起向下迁移。脱色后发现出现渗漏的孔对其他孔有影响，但不严重。每次大约有1－2个孔出现这种现象。请问这种现象是什么原因造成的，应如何改进？

作者: tangxin_80 时间: 2013-6-27 17:42

我用的是肺磷癌组织标本,上样量为20微克总蛋白,用SANTA CRUZ 的抗兔的针对annexin II 的抗体,1:1000稀释,显影后怎么会有两条带,我用10%和12%的胶都试了一次,都是两条带,是样品的时间久了吗?还会不会有其他原因,希望各位高手指点一下迷津,谢谢!!

你好！我做的蛋白电泳也有这样的现象，而且是阳性对照的纯品！
我看资料解释说：是蛋白在上样处理过程中构象变化，可能出现的结果．
你查看一下蛋白结构和性质，可能会有帮助！

作者: pencil菲 时间: 2013-6-27 17:42

样品处理：我是两毫升菌液离心沉淀后加80ulＰＢＳ加20ul 5乘上样缓冲液，煮沸５分钟，离心　取１５ul 上样的．
我的条带上面是清晰的下面有些糊，因为只有１５ＫＤ左右大小所以用的是１５％的胶．可是请问小蚂哥：
胶的浓度高为什么会糊呢？觉得浓度高应该分得更清楚啊

作者: abc816 时间: 2013-6-27 17:42

请教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:43

请教楼主一个问题：
做SDS－PAGE，点样后一加上电压开始跑，有的点样孔中的溴酚兰就开始向下漏，一直漏到浓缩胶和分离胶的交界面上，然后横向扩散。当其他孔中的溴酚兰迁移到分离胶和浓缩胶的分界面后，扩散的溴酚兰再同其他孔的溴酚兰一起向下迁移。脱色后发现出现渗漏的孔对其他孔有影响，但不严重。每次大约有1－2个孔出现这种现象。请问这种现象是什么原因造成的，应如何改进？

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不知道你所说的漏是什么样的？
我想可能有两个原因会出现这样的情况：
1、胶没有充分凝固；
2、玻璃板与胶结合的不严密，出现空隙。
自己查找一下，看看是那种原因。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:43

样品处理：我是两毫升菌液离心沉淀后加80ulＰＢＳ加20ul 5乘上样缓冲液，煮沸５分钟，离心　取１５ul 上样的．
我的条带上面是清晰的下面有些糊，因为只有１５ＫＤ左右大小所以用的是１５％的胶．可是请问小蚂哥：
胶的浓度高为什么会糊呢？觉得浓度高应该分得更清楚啊

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PAGE电泳受凝胶孔径大小不同影响，有分子筛的效应，不同浓度的分离胶都有特定的分辨率范围，浓度过大过小都不能有效分离。过高浓度的分离胶可能会导致样品在电场的作用下，涨破凝胶，出现不均匀的分布，出现一种类似拖带现象。
样品处理操作看起来没什么问题，你可以改进一下胶的浓度。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:46

请教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？

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你先做个DOT－ELISA摸一下抗体工作浓度，另外就是封闭液有没有问题，最后再看看显影时间的问题，可逐一排除

作者: rxcc33 时间: 2013-6-27 17:46

请教楼主：
我电泳时，溴酚兰指示剂总压不成一条带，并且跑到底端时开始变黄，不再泳动了，这是什么原因啊

作者: viviwang1987 时间: 2013-6-27 17:46

楼主，我想问一下10％分离胶和4％浓缩胶用36mA恒流来跑电泳会不会不适合？是否电流太大了点？
还有，电泳时放把整个电泳槽放在4℃低温下进行电泳是不是合理的？为什么？

作者: DNA 时间: 2013-6-27 17:47

楼主：看了你的帖子，受益非浅！
请教：本人最近在做蛋白纯化，请问各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶，加缓冲液提取。能否请问一下具体方法如何。也请各位高手多多指教。

作者: utt0989 时间: 2013-6-27 17:48

请教搂主：我最近在跑一个分子量约170KD的蛋白，基层胶和分离胶都是5%，用的是恒压，100V，跑的效果不是很理想，丽春红染色后100KD以下条带都很清楚，但100KD以上就很模糊了，杂抗体后显影出来也是如此。请问有什么办法可以解决吗，除了5%，浓一点的分离胶可以吗？另外，在同一块胶上，我还需要跑分子量为42的内参，不知道如何才能把这两个蛋白都跑出来，我已经失败了N次了，急盼回复，谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:49

请教楼主：
我电泳时，溴酚兰指示剂总压不成一条带，并且跑到底端时开始变黄，不再泳动了，这是什么原因啊

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这种情况一般都是缓冲液的问题。
1、电极缓冲液使用次数过多，建议重换；
2、凝胶缓冲液pH不正确，建议调准确。

作者: 00无名指00 时间: 2013-6-27 17:50

请教关于转膜后封闭的问题：用1%BSA封闭1小时，DAB染色较多非特异性条带。后用5%牛奶（脱脂、高钙、高蛋白），其它条件相同，结果未见任何条带。不知何原因，多谢指点！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:50

楼主，我想问一下10％分离胶和4％浓缩胶用36mA恒流来跑电泳会不会不适合？是否电流太大了点？
还有，电泳时放把整个电泳槽放在4℃低温下进行电泳是不是合理的？为什么？

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1、应该没有问题，不过可适当减小点，防止过大产热。
2、没必要放在4C，从理论上来说也没什么妨碍，不过可能回使电极上锈。

作者: kulee 时间: 2013-6-27 17:51

请教一个问题:我在看别人跑SDS－PAGE的时候,发现他们在电泳巢里倒的是阳极缓冲液而在板间却是倒的阴极缓冲液,就是所谓的内阴外阳.请问这样做的目的是什么,是什么原理啊?

作者: 079777chao 时间: 2013-6-27 17:52

各位，我的电泳最近不知出了什么问题，总是在分离胶的中上部每个孔对应的地方出现一大块的蓝色，下面是我的一块电泳的照片
我和人讨论的初步结果是，那块可能不是蛋白质，因为它怎么脱色也不太退色，但是又是什么能跟考马斯亮蓝这样结合，而且又只在每个加样孔有，我们没想出来。

请各位帮我看看吧，我都急死了

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作者: remenb 时间: 2013-6-27 17:54

本人最近在做蛋白纯化，请问各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶，加缓冲液提取。能否请问一下具体方法如何

以下是我收集的从PAGE回收DNA的方法不知对你有用否:
"压碎与浸泡法"1)用刀切下含目的条带的凝胶.2)将凝胶块转移至微量离心管,用一次性使用的吸头对着管壁将凝胶挤碎.3)估计凝胶块的大致体积,在微量离心管中加1-2倍体积的洗脱缓冲液.洗脱缓冲液:0.5mol/L乙酸铵.10mmol/L乙酸镁.1mmol/L EDTA (PH8.0) 0.1%SDS 当洗脱缓冲液的体积不大于0.5ml时,操作更为方便.因为洗脱的DNA片段可在一个微量离心管中用乙醇沉淀.4)盖上离心管盖,旋转平台上37摄氏度温育。小片段DNA（<500bp)的洗脱需3-4小时,更大的片段需12-16小时.5)用微型离心机于4度12000g离心一分钟.将上清液转移至另一微量离心管.6)上清液通过一次性使用的塑料层析去除残留的PAGE凝胶块.7)加两倍体积处于4度的乙醇,冰上放30分钟 ,微量离心机4度12000g离心10分钟以沉淀DNA

作者: remenb 时间: 2013-6-27 17:55

请问一下楼主，我现在的胶浓度是7.5％，浓缩胶是5％的，每次跑电泳的时候在分离胶里面都跑的特别快，我用了100v的电压，每次的电流大概是18mA左右，本来应该要跑5-6个小时的，但是每次跑2-3个小时，溴芬兰就全部到达了底部，我用的是预染的marker，在分离胶上看得到分离出来的条带，有6条的样子，但是为什么总是跑的这么快呢？对实验结果会有什么样的影响呢？

作者: PCR 时间: 2013-6-27 17:56

请教楼主：我要从SDS-PAGE胶中回收蛋白亚基，是考染后再切胶回收吗？
那样考马斯亮蓝能从蛋白上除去吗？还有SDS用不用除去，蛋白亚基用不用复性？我是要回收蛋白亚基，然后制抗体，我认为考马斯亮蓝和SDS可能会影响亚基的抗原性的，所以要从蛋白上除去。
望不吝赐教

作者: bamboo16 时间: 2013-6-27 17:57

硫酸铵沉淀蛋白后，沉淀用水溶解，然后透析出去硫酸铵，最后离心获得的上清和沉淀分别电泳，沉淀用尿素溶解后跑胶条带很清楚，但上清跑出来上宽下窄，连成一片。不知是不是残留的硫酸铵的影响。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:58

请教搂主：我最近在跑一个分子量约170KD的蛋白，基层胶和分离胶都是5%，用的是恒压，100V，跑的效果不是很理想，丽春红染色后100KD以下条带都很清楚，但100KD以上就很模糊了，杂抗体后显影出来也是如此。请问有什么办法可以解决吗，除了5%，浓一点的分离胶可以吗？另外，在同一块胶上，我还需要跑分子量为42的内参，不知道如何才能把这两个蛋白都跑出来，我已经失败了N次了，急盼回复，谢谢

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170KD的分子量不算小，你的积层胶用5％可能有点大，可以适当的调低点，比如3％，分离胶可以适当大点，6－8％，试试看吧。
分子量差异比较大，我没有做过，你可用上面的浓度先做一下电泳，看看能不能把你分子量相近的蛋白有效分开。

作者: remenb 时间: 2013-6-27 17:58

谢谢我去试试看，再请教一个问题，选择3％积层胶是不是为了让大分子量蛋白更好的通过

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:58

请教一个问题:我在看别人跑SDS－PAGE的时候,发现他们在电泳巢里倒的是阳极缓冲液而在板间却是倒的阴极缓冲液,就是所谓的内阴外阳.请问这样做的目的是什么,是什么原理啊?

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在SDS－PAGE电泳中，SDS为阴离子去垢剂，带负电荷，所以电泳中一般内槽为阴极，电荷移动方向从上至下，带动蛋白分子分离。
保存时，可将内外槽电泳液分开保存，避免离子中和，影响电泳效果。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:59

各位，我的电泳最近不知出了什么问题，总是在分离胶的中上部每个孔对应的地方出现一大块的蓝色，下面是我的一块电泳的照片
我和人讨论的初步结果是，那块可能不是蛋白质，因为它怎么脱色也不太退色，但是又是什么能跟考马斯亮蓝这样结合，而且又只在每个加样孔有，我们没想出来。

请各位帮我看看吧，我都急死了

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两个问题，一是背景太高，可能是你的脱色液的问题，换下试试；二是你的上样量太高，你的蛋白条带太浓，建议降低上样量试试。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 17:59

请问一下楼主，我现在的胶浓度是7.5％，浓缩胶是5％的，每次跑电泳的时候在分离胶里面都跑的特别快，我用了100v的电压，每次的电流大概是18mA左右，本来应该要跑5-6个小时的，但是每次跑2-3个小时，溴芬兰就全部到达了底部，我用的是预染的marker，在分离胶上看得到分离出来的条带，有6条的样子，但是为什么总是跑的这么快呢？对实验结果会有什么样的影响呢？

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正常现象，没什么影响。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:00

请教楼主：我要从SDS-PAGE胶中回收蛋白亚基，是考染后再切胶回收吗？
那样考马斯亮蓝能从蛋白上除去吗？还有SDS用不用除去，蛋白亚基用不用复性？我是要回收蛋白亚基，然后制抗体，我认为考马斯亮蓝和SDS可能会影响亚基的抗原性的，所以要从蛋白上除去。
望不吝赐教

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可跑多条泳道后，然后染色当中一个泳道，再对照切除其他泳道的蛋白条带。如果直接免疫考马斯亮蓝没什么太大影响，但SDS肯定有影响，是蛋白变性，可提取后复性试试，不过产量就可能很低了。

作者: zhenxin 时间: 2013-6-27 18:00

请教个问题：我做WB的时候，每次洗出来的片背景都很黑，ACTIN又会好一点，有时候能够做到没有背景。但是做其他蛋白的时候就不行了，打开暗盒的时候多次看到整张膜上都有荧光，洗出来以后虽然能看到条带，但是背景就是不行！暂时还没有找到原因，能帮忙分析一下吗？谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:01

请教个问题：我做WB的时候，每次洗出来的片背景都很黑，ACTIN又会好一点，有时候能够做到没有背景。但是做其他蛋白的时候就不行了，打开暗盒的时候多次看到整张膜上都有荧光，洗出来以后虽然能看到条带，但是背景就是不行！暂时还没有找到原因，能帮忙分析一下吗？谢谢

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是不是抗体的问题，再摸摸条件吧！

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-6-27 18:01

最近我用10%的胶跑蛋白，Marker中的14.4KD的一条总是不见了，而用12%的胶跑的话，Marker却是正常的，开始我以为是跑丢了，所以我二次跑的时候就在指示剂胶还有大约2cm的时候就停下来了，却依然没见14.4KD的条带，这是什么原因造成的呢？谢谢！非常急！

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-6-27 18:01

附上面的图

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作者: PINK 时间: 2013-6-27 18:02

楼主厉害，受益非浅！
有点建议：
在主帖中有这么一段：。。。形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。。。

从这段话中，我总理解为应该大分子带负电荷多，走得快。是否修正一下。

作者: qhyu 时间: 2013-6-27 18:02

本人最近用还原性及非还原性电泳跑胶，结果显示10,24kd，故得出结论为单体和二聚体形式（二聚体由于空间结果影响迁移率）。可是老外说非还原性电泳不能证明二聚体，让我寻找它法“ Other methods are required to demonstrate the degree of
association of the protein. ”还说，没有别的方法就不要得出二聚体的结论“If no other data is available, the conclusion that the protein is a dimer should be removed.”

我的疑问：如果不能得出二聚体的结论，那非还原性电泳怎么会是24kd呢？
如果不用二聚体的结论，那我该怎么解释24kd，就说多聚体？或蛋白发生association（不知怎么翻译）？
谢谢

作者: any333 时间: 2013-6-27 18:02

我的目的蛋白分子量约为32KD，浓缩胶为5%（70V），分离较12%（150V），Bio-Red的电泳系统。但电泳老是出问题，望各位指教，谢谢！

1.小分子量的杂蛋白出现在溴芬兰带的下面；

2.溴芬兰带呈微笑状；

3.marker带太浅或者只跑出其中几条；

4.跑胶时指示剂已到胶的底部，但染色后距底部还有一段距离。

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-6-27 18:03

前一阵子SDS-PAGE跑得挺好的，最近新配了好些溶液，结果胶总跑不好，感觉样品跑不动，但溴芬兰正常，请问可能是什么原因造成的？？谢谢！（附图片）

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作者: 2541 时间: 2013-6-27 18:03

请问斑竹，你所说的还原剂是不是beta-巯基乙醇？你说SDS与还原剂按比例添加，请问比例是多少呢？谢谢

作者: tuomu45 时间: 2013-6-27 18:04

1 .可能是玻璃板上原有的杂蛋白或者是配胶所用的缓冲液里面混入蛋白，不太可能是样品中的蛋白。
2 .散热不均，建议放入冰水浴中，或直接放如冰箱里。
3.marker浅的原因可能是脱色脱过了，也可能是上的太少。如果跑不全可能是跑得时间过短，或分离较做的太短。跑分离胶时，电压大约是在10v-20v/cm，不要太大。您的分离较电压太大了，100v就够了。
4.指示剂为小分子物质，跑得速度要比大分子快很多。所以出现这种情况也正常，建议指示剂跑出胶以后再停止电泳。

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我的目的蛋白分子量约为32KD，浓缩胶为5%（70V），分离较12%（150V），Bio-Red的电泳系统。但电泳老是出问题，望各位指教，谢谢！

1.小分子量的杂蛋白出现在溴芬兰带的下面；

2.溴芬兰带呈微笑状；

3.marker带太浅或者只跑出其中几条；

4.跑胶时指示剂已到胶的底部，但染色后距底部还有一段距离。

作者: tuomu45 时间: 2013-6-27 18:04

问题可能出现在pH值上，能否再校正一下所配缓冲液。

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前一阵子SDS-PAGE跑得挺好的，最近新配了好些溶液，结果胶总跑不好，感觉样品跑不动，但溴芬兰正常，请问可能是什么原因造成的？？谢谢！（附图片）

作者: kswl870 时间: 2013-6-27 18:04

这段时间跑蛋白,速度很慢.听了楼主的建议,更换了缓冲液.跑得相当快啊
楼主万岁

作者: kswl870 时间: 2013-6-27 18:05

附上面的图

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我跑得marker带也是5条 90多的那条带跑不出来郁闷中

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:05

最近我用10%的胶跑蛋白，Marker中的14.4KD的一条总是不见了，而用12%的胶跑的话，Marker却是正常的，开始我以为是跑丢了，所以我二次跑的时候就在指示剂胶还有大约2cm的时候就停下来了，却依然没见14.4KD的条带，这是什么原因造成的呢？谢谢！非常急！

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可换用新的电泳电极液跑跑看。
14.4KD的条带在电泳中确实有时会丢，也可能与你的marker质量有关。
如果你的结果不是以该条带来参照的话，跑不跑的出来无所谓了。
如果是小分子量的蛋白电泳，可提高胶的浓度，再跑跑看。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:05

本人最近用还原性及非还原性电泳跑胶，结果显示10,24kd，故得出结论为单体和二聚体形式（二聚体由于空间结果影响迁移率）。可是老外说非还原性电泳不能证明二聚体，让我寻找它法“ Other methods are required to demonstrate the degree of association of the protein. ”还说，没有别的方法就不要得出二聚体的结论“If no other data is available, the conclusion that the protein is a dimer should be removed.”

我的疑问：如果不能得出二聚体的结论，那非还原性电泳怎么会是24kd呢？
如果不用二聚体的结论，那我该怎么解释24kd，就说多聚体？或蛋白发生association（不知怎么翻译）？
谢谢

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我认为老外的说法也是有道理的，不知你说的10，24kd是什么意思，是两个单体分别位10kd，24kd吗？
在SDS－PAGE电泳中，只有经过变性处理的蛋白分子在电泳中所跑出的条带才有参考价值，而且也不是所有蛋白都可以用sds－page电泳来测定分子量的。
还有一点就是，非变性的蛋白分子结构复杂，在凝胶微孔中可能跑的不一致，因此不能与标准分子量作对照。
你可在园子里搜搜如何鉴定分子量，包括单体和二聚体分子量的测定方法。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:06

我的目的蛋白分子量约为32KD，浓缩胶为5%（70V），分离较12%（150V），Bio-Red的电泳系统。但电泳老是出问题，望各位指教，谢谢！
1.小分子量的杂蛋白出现在溴芬兰带的下面；
2.溴芬兰带呈微笑状；
3.marker带太浅或者只跑出其中几条；
4.跑胶时指示剂已到胶的底部，但染色后距底部还有一段距离。

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1。这个很正常啊，溴芬兰大约670d，如果下面还有带的话，可以不管它；
2。凝胶凝固不均匀或凝胶板底有气泡；
3。可能是MARKER自身的问题，也可能是电泳液与染色液脱色液的问题；
4。你的蛋白分子量与凝胶浓度不相匹配，可适当降低凝胶浓度。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:06

前一阵子SDS-PAGE跑得挺好的，最近新配了好些溶液，结果胶总跑不好，感觉样品跑不动，但溴芬兰正常，请问可能是什么原因造成的？？谢谢！（附图片）

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可能是凝胶浓度大了，降低试试，另外你所跑的样品有的浓度高了，需要进一步稀释。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:06

请问斑竹，你所说的还原剂是不是beta-巯基乙醇？你说SDS与还原剂按比例添加，请问比例是多少呢？谢谢

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是的，可按照配方来配就可以了

作者: 8princess8 时间: 2013-6-27 18:07

我做的是SDS-PAGE，结果总是不好，每次都会有弯曲的条带，而且带不一样宽。请问这是什么原因呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:08

我做的是SDS-PAGE，结果总是不好，每次都会有弯曲的条带，而且带不一样宽。请问这是什么原因呢？

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应该是胶的问题，把丙稀酰铵换下试试

作者: flower-201 时间: 2013-6-27 18:08

我发现不同PAGE的loading bufer配方中中Tris、甘油、SDS等的浓度都不一样，如蛋白质技术手册中
SDS-PAGE 5X样品缓冲液
0.6ml 1mol/LTris-cl(pH6.8) 60mmol/L
5ml 50%甘油 25％(v/v)
2ml 10%SDS 2％(w/v)
0.5ml 2-巯基乙醇 5％(v/v)
1ml 1%溴酚蓝 0.1％(w/v)
0.9ml 蒸馏水
Native-PAGE 5X样品缓冲液
3.1ml 1mol/LTris-cl(pH6.8) 312.5mmol/L
5ml 甘油 50％(v/v)
0.5ml 1%溴酚蓝 0.05%(w/v)
1.4ml 蒸馏水
而tricine体系中2X样品缓冲液为0.1mol/LTris，20％甘油 (v/v)，8％SDS(w/v)（Version 1.5 Tricine-SDS-PAGE for separation of 1-100kDa protein）。
我的理解：Tris是维持样品的pH，甘油是加大样品的密度（以防止上样时上飘），SDS是与蛋白结合。它们应该有一个最低的浓度才能达到应有的效果。特别是SDS，按书上它与蛋白以1.4：1的重量比例结合。如果1mg/mL的蛋白样品上样10 uL，蛋白总量10 ug，则SDS至少需14 ug，则相当1X缓冲液中（10 uL）SDS的浓度为1.4 g/L，即0.14％，则5X缓冲液中其浓度要在0.7％以上，2X缓冲液中其浓度要在0.28％以上。按SDS与蛋白以4：1的重量比例结合计算，5X缓冲液中其浓度为2％，2X缓冲液中其浓度为0.8％。
因此，如果蛋白样品浓度在1mg/mL左右，则样品缓冲液中SDS在2％以上可满足要求。同时Tris在1X缓冲液中在10mmol/L以上可满足要求，甘油则在5％～10％左右。而DTT或巯基乙醇与蛋白质所含的二硫键相比通常是大大过量的，溴酚蓝作指示用，含少量即可。

作者: www.1 时间: 2013-6-27 18:08

请问我想保存最近跑的SDS-PAGE胶，用什么样的保存液比较好啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:09

请问我想保存最近跑的SDS-PAGE胶，用什么样的保存液比较好啊？

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放在水里泡着就行了，一般2－3个月是没问题的！

作者: tuomu45 时间: 2013-6-27 18:09

样品中都含什么成分呢？

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我做的是SDS-PAGE，结果总是不好，每次都会有弯曲的条带，而且带不一样宽。请问这是什么原因呢？

作者: 30moonriver 时间: 2013-6-27 18:10

我的样品是细菌总蛋白，菌液离心后加2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，离心以后取上清点样，没有什么特殊的成分啊。

作者: 30moonriver 时间: 2013-6-27 18:10

另外，我还想问一下，配胶的时候用的Tris-HCl的浓度对电泳影响大吗？谢谢。

作者: vivian4123 时间: 2013-6-27 18:10

太好了,这么精彩!亮堂多了!还有楼主及各位高人,请教一个问题,我最近作sds-page发现过完sphadex G50的样浓缩后与5*样品缓冲液5：1混合后跑电泳时，样不跑，不下沉啊？？我用的是4%浓缩胶，12%分离胶，其他的样和Marker都跑得很好。这种情况会是什么原因呢？谢谢。我是从生防菌中提出的蛋白。非常感谢！！

作者: vivian4123 时间: 2013-6-27 18:11

还有我的样和溴芬兰都不跑！！急死我了！都跑了好多次了，调整了sample buffer的量都不行，是我的样浓度小的原因，跟含盐量有关吗？郁闷中.......

作者: tuomu45 时间: 2013-6-27 18:11

这种情况很少见，我没有碰到过，建议换成2X缓冲液。

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太好了,这么精彩!亮堂多了!还有楼主及各位高人,请教一个问题,我最近作sds-page发现过完sphadex G50的样浓缩后与5*样品缓冲液5：1混合后跑电泳时，样不跑，不下沉啊？？我用的是4%浓缩胶，12%分离胶，其他的样和Marker都跑得很好。这种情况会是什么原因呢？谢谢。我是从生防菌中提出的蛋白。非常感谢！！

作者: tuomu45 时间: 2013-6-27 18:12

最左边的是Marker吗？

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我的样品是细菌总蛋白，菌液离心后加2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，离心以后取上清点样，没有什么特殊的成分啊。

作者: 2541 时间: 2013-6-27 18:12

最左边的是Marker吗？

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先说声谢谢！是Marker，跑的太不清楚了。是不是我上样量太大了？我用的是Tricine-SDS-PAGE。

作者: 98776langtao 时间: 2013-6-27 18:12

我做的蛋白分子量约170kD，但是做过很多次曝光后只有一个带，分子量都在250-300kD左右，不知什么原因？是不是我的蛋白？有什么办法能解决呀？谢谢指教！

作者: 079777chao 时间: 2013-6-27 18:13

我做的蛋白分子量约170kD，但是做过很多次曝光后只有一个带，分子量都在250-300kD左右，不知什么原因？是不是我的蛋白？有什么办法能解决呀？谢谢指教！
请问你是用的多大浓度的胶，电泳条件和转膜条件怎样？我也是在做分子量约170kD的蛋白

作者: windy+++ 时间: 2013-6-27 18:13

可以的，蛋白降解主要会出现明显的拖带现象。

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蛋白降解后分子量变小，应该是“超带”现象。为什么会拖带呢？
想不明白。

作者: mimili_901 时间: 2013-6-27 18:14

我以前也用过Tricine-SDS缓冲液，跑小分子量的蛋白效果确实好，但Trine缓冲液总跑得很慢。以后就改用Tris-GLY缓冲液，效果也很好。您是否可以尝试一下，另外您的上样量确实大了。胶的条带不平整可能为配胶的时候没有混匀，或者是配胶的过程中已经出现了少量凝固。

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先说声谢谢！是Marker，跑的太不清楚了。是不是我上样量太大了？我用的是Tricine-SDS-PAGE。

作者: 00无名指00 时间: 2013-6-27 18:14

我做的蛋白分子量约170kD，但是做过很多次曝光后只有一个带，分子量都在250-300kD左右，不知什么原因？是不是我的蛋白？有什么办法能解决呀？谢谢指教！
请问你是用的多大浓度的胶，电泳条件和转膜条件怎样？我也是在做分子量约170kD的蛋白，

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我用的是7.5的胶，电泳200V约3h，转膜15V，2h semi-dry。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:15

另外，我还想问一下，配胶的时候用的Tris-HCl的浓度对电泳影响大吗？谢谢。

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离子浓度过大会使电泳时产热增高，对电泳不利。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-27 18:15

我还想请教一下，当我点上过完G-50柱子样后不但它不跑，还会把相邻的样品挤跑，怎么回事啊？不会是我的蛋白浓度太大了吧？还是盐的问题？还有磷酸buffer中的磷酸钠算是蛋白中的盐吗？多谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:16

太好了,这么精彩!亮堂多了!还有楼主及各位高人,请教一个问题,我最近作sds-page发现过完sphadex G50的样浓缩后与5*样品缓冲液5：1混合后跑电泳时，样不跑，不下沉啊？？我用的是4%浓缩胶，12%分离胶，其他的样和Marker都跑得很好。这种情况会是什么原因呢？谢谢。我是从生防菌中提出的蛋白。非常感谢！！

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甘油的量少了，可以考虑换用2×或1×buffer，或直接多加点5×buffer，过量一点没事的。

作者: redbutterfly 时间: 2013-6-27 18:16

不过我看有的文献中说，Sample buffer 中的蛋白量如果少的话也会跑不出来啊？我试试，谢谢哦！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:17

我做的蛋白分子量约170kD，但是做过很多次曝光后只有一个带，分子量都在250-300kD左右，不知什么原因？是不是我的蛋白？有什么办法能解决呀？谢谢指教！

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你跑的是什么蛋白，在电泳时，带的位置正常吗？这应与蛋白自身的性质有关。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-27 18:17

不过我看有的文献中说，Sample buffer 中的蛋白量如果少的话也会跑不出来啊？我试试，谢谢哦！

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那你就直接在样品中加些甘油吧，不要太多，只要能使你的样品沉下来就可以了。

作者: pencil菲 时间: 2013-6-27 18:18

你跑的是什么蛋白，在电泳时，带的位置正常吗？这应与蛋白自身的性质有关。

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我跑的是一个离子通道蛋白，就是带的位置不在它应有的分子量位置，胶上的分子量老是比170kD大，我用的胶是4%，7.5%。不知道如何解决？是否会出现糖基化修饰引起分子量增大？

作者: mimili_901 时间: 2013-6-27 18:18

如果条件容许，可以跑一个去糖基化的和不去糖基化的对照。上完样建议立刻就跑电泳。因为不知道您的样品里面除了蛋白还含有什么，建议下一次跑电泳用2Xbuffer。您最好能传一张图上来。

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我跑的是一个离子通道蛋白，就是带的位置不在它应有的分子量位置，胶上的分子量老是比170kD大，我用的胶是4%，7.5%。不知道如何解决？是否会出现糖基化修饰引起分子量增大？

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-27 18:18

看了上面的帖子，实在是十分的好，谢谢各位。
请教几个问题：胶跑到最后的时候下部溴芬兰出现两条，最底下的细色浅，上面一条宽色深，不知道该看那条停止电泳。我用微型电泳仪里面的缓冲液会很热，有什麽好的解决方法吗？

作者: flower-201 时间: 2013-6-27 18:19

大家好，我也有个问题想请教。

我跑SDS-PAGE，配制标准蛋白样品时，发现卵蛋白和胃蛋白酶不溶于SDS样品缓冲液。而牛血清蛋白和溶菌酶都能溶于。

前述两种蛋白不能溶解于样品缓冲液是什么原因呢？

作者: mimili_901 时间: 2013-6-27 18:19

宽色深的，胶中只有溴芬兰的颜色最深。微型电泳仪的缓冲液很热会影响电泳的迁移率，建议下一次直接把电泳槽放入冰水浴中，如果没有冰块，可以用冰袋代替。

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看了上面的帖子，实在是十分的好，谢谢各位。
请教几个问题：胶跑到最后的时候下部溴芬兰出现两条，最底下的细色浅，上面一条宽色深，不知道该看那条停止电泳。我用微型电泳仪里面的缓冲液会很热，有什麽好的解决方法吗？

作者: am10 时间: 2013-6-28 09:41

我的蛋白表达浓度比较低，做蛋白浓缩时候会不会对目的蛋白的免疫原性有影响，有的话，会有多大！如，sds上样处理，三氯乙酸沉淀浓缩，对做western blot 的影响有多大？

作者: 49888 时间: 2013-6-28 09:42

如果条件容许，可以跑一个去糖基化的和不去糖基化的对照。上完样建议立刻就跑电泳。因为不知道您的样品里面除了蛋白还含有什么，建议下一次跑电泳用2Xbuffer。您最好能传一张图上来。

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非常感谢！我的样品是一种内皮细胞株裂解液，您觉得我的这个蛋白用多少比例的胶比较合适（170kD）？我一直是用6Xbuffer做得，可能是您说的问题！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:11

我跑的是一个离子通道蛋白，就是带的位置不在它应有的分子量位置，胶上的分子量老是比170kD大，我用的胶是4%，7.5%。不知道如何解决？是否会出现糖基化修饰引起分子量增大？

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如果是糖基化蛋白是会出现这种情况的，不太适宜用SDS－PAGE来做了。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:14

看了上面的帖子，实在是十分的好，谢谢各位。
请教几个问题：胶跑到最后的时候下部溴芬兰出现两条，最底下的细色浅，上面一条宽色深，不知道该看那条停止电泳。我用微型电泳仪里面的缓冲液会很热，有什麽好的解决方法吗？

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无所谓以哪条线来参考了，溴芬兰的分子量只有670D左右，一般蛋白都比他大（除了小肽）。
电泳发热，可用冰袋孵育，降低电泳电压或电流。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:15

大家好，我也有个问题想请教。

我跑SDS-PAGE，配制标准蛋白样品时，发现卵蛋白和胃蛋白酶不溶于SDS样品缓冲液。而牛血清蛋白和溶菌酶都能溶于。

前述两种蛋白不能溶解于样品缓冲液是什么原因呢？

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不是太明白你说的是什么意思，标准蛋白本身一般不会有问题的，看看是不是你的sample loading buffer的问题，MARKER是新的吗？

作者: any333 时间: 2013-6-28 10:16

我想请教一下关于染色的问题

考染和银染哪个更好一些呢？

谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:16

我的蛋白表达浓度比较低，做蛋白浓缩时候会不会对目的蛋白的免疫原性有影响，有的话，会有多大！如，sds上样处理，三氯乙酸沉淀浓缩，对做western blot 的影响有多大？

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浓缩没有问题的，免疫的蛋白要考虑浓缩试剂是否会对免疫动物产生毒性，对于做电泳没有问题。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:20

我想请教一下关于染色的问题
考染和银染哪个更好一些呢？
谢谢！

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都挺好，各有优劣。银染更敏感些，不过容易产生本底高；考染方便些，但敏感性差些，不过可以满足常规蛋白的染色要求。我前面有两者详细比较的帖子，自己查下！

作者: cwcwcww 时间: 2013-6-28 10:20

请问有时条带跑到一半就不跑了是怎么回事呢？
已经检查过没有什么异常啊
谢谢了

作者: mamamiya 时间: 2013-6-28 10:21

请教：本人最近在做蛋白纯化，请问各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶，加缓冲液提取。能否请问一下具体方法如何。也请各位高手多多指教。

作者: mamamiya 时间: 2013-6-28 10:21

请教楼主：我要从SDS-PAGE胶中回收蛋白亚基，是考染后再切胶回收吗？
那样考马斯亮蓝能从蛋白上除去吗？还有SDS用不用除去，蛋白亚基用不用复性？我是要回收蛋白亚基，然后制抗体，我认为考马斯亮蓝和SDS可能会影响亚基的抗原性的，所以要从蛋白上除去。
望不吝赐教

我是这样做的，先跑胶，然后把Marker和一个孔的蛋白染色（我一般同时跑很多同一蛋白，但分布在不同的孔），确定目的蛋白带的位置，然后把染色的胶和未染色的胶按原位置对齐，切下所有目的蛋白带，切得很小很小块，放入试管里，加水（加水量取决于你的你的蛋白量多少，我喜欢加少量水，可以得到较浓缩蛋白），把试管放在Nutator上，过夜（4度），然后离心，取上清（含有目的蛋白），如果想浓缩，可以过柱。

作者: mamamiya 时间: 2013-6-28 10:21

教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？

有可能是你的抗体浓度太高，我们一般从细胞里得到的蛋白，在western时一抗一般是1：2000在左右，二抗1：5000左右，但具体要取决于你的抗体质量如何。在development film之前，我都用TBST洗几个小时（在摇床上），要试着暴光时间，先从曝光时间短开始，如果背景很黑，但可见条带，要曝光时间更短，如果背景很淡，不见蛋白带，要曝光时间更长。

在准备胶的过程中，要把各种成分充分混匀，然后制胶，有充分的时间让胶凝固，这样跑出来的带才漂亮，要不然，很散的。染色过的胶如果想长期保存，要制干胶，用两块塑料板，一张好的塑料膜，具体做法是：在一块实的塑料板上放胶，然后放塑料膜，把多余的塑料膜反折，然后放一个空心的塑料板，空心的面积比胶要大一些，然后绷紧，用夹子把两块板加紧，室温放2天就好，然后把干胶剪下来，可以扫描或者贴图，此时的干胶就象是一张厚点的纸。

作者: owanaka 时间: 2013-6-28 10:22

请教各位高手一个弱弱的问题，sds-page的灵敏度是多少啊，在a well中多大的蛋白量才能跑出比较清晰的带啊，我做考染！
另外我的目的蛋白160kd，跑10%的分离胶蛋白很靠近分界点。要换成8%的，但是手头没有方子，哪位提供一下啊！
先谢谢了！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 10:22

目的蛋白的量至少要有1微克才能跑出来。胶的配方有公式计算：若需要配16ml的8%的分离胶，设需要30%单体为Vml，那么V X 30%/16=8%。计算出V=4.272ml。另外你用的4X凝胶缓冲液，需加16/4=4ml，剩下的就是水了。

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请教各位高手一个弱弱的问题，sds-page的灵敏度是多少啊，在a well中多大的蛋白量才能跑出比较清晰的带啊，我做考染！
另外我的目的蛋白160kd，跑10%的分离胶蛋白很靠近分界点。要换成8%的，但是手头没有方子，哪位提供一下啊！
先谢谢了！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 10:41

这个专题是uk开创的，我只是他的友情客串。说得不准确的地方，请uk哥指正。很多问题，还是要靠uk哥来回答，我也知道很多电泳高手并不露脸，请你们也来这里交流切磋，共同提高实验水平。
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度

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谢谢居水居善和小蚂哥，世界上有这麽多好人，我真得好好活着：）另外，小蚂哥说的“无所谓以哪条线来参考了，溴芬兰的分子量只有670D左右，一般蛋白都比他‘小’”，是一般蛋白都比它大巴？还有，电泳的迁移率指的是什麽？

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 10:43

这个专题是uk开创的，我只是他的友情客串。说得不准确的地方，请uk哥指正。很多问题，还是要靠uk哥来回答，我也知道很多电泳高手并不露脸，请你们也来这里交流切磋，共同提高实验水平。
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度

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说的“无所谓以哪条线来参考了，溴芬兰的分子量只有670D左右，一般蛋白都比他‘小’”，是一般蛋白都比它大巴？还有，电泳的迁移率指的是什麽？

作者: wmp1234 时间: 2013-6-28 10:44

刚学会发图，请大家帮我看看胶跑成这样是啥原因？(同种蛋白不同浓度）下面咋没带了呢？

图片附件: 30120279.snap.jpg (2013-6-28 10:44, 15.01 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16883

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:45

刚学会发图，请大家帮我看看胶跑成这样是啥原因？(同种蛋白不同浓度）下面咋没带了呢？

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主要存在三个问题，一是左边两泳道的蛋白浓度过大；二是分离胶的浓度可能过大，导致蛋白难以分开；样品收集或处理可能存在问题，条带不清晰。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:46

这个专题是uk哥开创的，我只是他的友情客串。说得不准确的地方，请uk哥指正。很多问题，还是要靠uk哥来回答，我也知道很多电泳高手并不露脸，请你们也来这里交流切磋，共同提高实验水平。
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度

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谢谢您对其他人的热心帮助，对本贴的关注支持。DXY是一个学习讨论交流的地方，我觉得应该把这个宗旨发扬光大，那样每一个战友就会既是付出者，也是受益者。
曾经有段时间蛋白电泳做了很多，感觉有些心得，就整理了这个帖子与大家交流，不过个人水平毕竟有限，所说的只能代表个人观点，未必全都正确。所以如有错误、疏漏，请大家多多指正。
PS：我尽可能的回复每一位在这个帖子上提问的战友，包括可能其它战友已经回复的帖子，这并不是说其它战友说的不对，而是把我的观点谈出来一起交流，希望此举不会影响其它战友参与讨论的积极性。

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 10:46

您目的蛋白分子量为多大，分离胶的浓度是多少，样品是如何处理得到的？请您说得详细一些。另外，电泳时不能跑空道，即使空下道，也要上buffer，从图的结果看，电泳可能跑了空道。

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刚学会发图，请大家帮我看看胶跑成这样是啥原因？(同种蛋白不同浓度）下面咋没带了呢？

作者: vera+ 时间: 2013-6-28 10:47

我的目的蛋白分子量18KD，分离胶12％，浓缩胶5％，样品从－20度融化后有些混浊沉淀，颜色微黄，20ul蛋白＋20ul2×buffer，一二泳道相同；三泳道
10ul蛋白＋10ul去离子水＋20ul2×buffer;100度煮3分加样，（煮后加样大约也就20ul左右）其他泳道各加20ul2×buffer;看到下面一条细浅的到底儿停止电泳。
呵，谢谢。

作者: 49888 时间: 2013-6-28 10:47

请问有时条带跑到一半就不跑了是怎么回事呢？已经检查过没有什么异常啊
谢谢了

再检查一下电泳仪，有时接触不良就会出现电压还正常，但电流早没了，我就遇到过这种情况。

作者: moonlight45 时间: 2013-6-28 10:48

我也有一个问题请教：最近作tricine－sds－page，本来已经查了很多关于这方面的资料，感觉自己对各个步骤和环节也比较清楚，但是最近的问题实在是没有办法解决，希望园子里的朋友们能帮我分析分析，先谢谢大家！
按照所查资料，电泳时需要的电极缓冲液以及凝胶缓冲液都需要调ph，但是每次调了ph之后，电泳时电压都是非常小，电流20mA，电压却只有10v左右，我看好多人都是20mA，120v，但是我无论怎么调电压的变化都很小。而且跑完染色基本上看不到条带，而是成片。如果用不调ph的缓冲液，指示剂就会慢慢跑飞最后没有了，根本起不到指示的作用。好多人都说用1N的HCL调ph，但是我调的时候1N基本上起不到多大的作用，得用6N的调，还要加好多才可以。
不知道这是什么原因，请大家帮忙分析一下！谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:48

十分感谢小蚂哥整理这个帖子，使我们这些电泳新手可以在这里学习经验得到帮助，如有机会，一定不吝帮助其他战友。
我的目的蛋白分子量18KD，分离胶12％，浓缩胶5％，样品从－20度融化后有些混浊沉淀，颜色微黄，20ul蛋白＋20ul2×buffer，一二泳道相同；三泳道
10ul蛋白＋10ul去离子水＋20ul2×buffer;100度煮3分加样，（煮后加样大约也就20ul左右）其他泳道各加20ul2×buffer;看到下面一条细浅的到底儿停止电泳。
呵，谢谢。

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蛋白样品煮沸后需离心上样，5000rpm 1min就差不多了。
稀释样品最好用生理盐水或PBS。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:49

我也有一个问题请教：最近作tricine－sds－page，本来已经查了很多关于这方面的资料，感觉自己对各个步骤和环节也比较清楚，但是最近的问题实在是没有办法解决，希望园子里的朋友们能帮我分析分析，先谢谢大家！
按照所查资料，电泳时需要的电极缓冲液以及凝胶缓冲液都需要调ph，但是每次调了ph之后，电泳时电压都是非常小，电流20mA，电压却只有10v左右，我看好多人都是20mA，120v，但是我无论怎么调电压的变化都很小。而且跑完染色基本上看不到条带，而是成片。如果用不调ph的缓冲液，指示剂就会慢慢跑飞最后没有了，根本起不到指示的作用。好多人都说用1N的HCL调ph，但是我调的时候1N基本上起不到多大的作用，得用6N的调，还要加好多才可以。
不知道这是什么原因，请大家帮忙分析一下！谢谢

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可否把你的电泳图贴上来看看呢?

作者: 98776langtao 时间: 2013-6-28 10:49

以前跑电泳都挺好的，这次的现象很奇怪。到了分离胶以后，溴分篮就散开了，越跑就越分散，慢慢的基本上就看不见了，但是MARKER跑的没什么问题。怎么回事啊，各位大虾帮忙看看啊

作者: wmp1234 时间: 2013-6-28 10:51

大家好我想请教各位高人，我的目的蛋白很粘，应该用什么来打碎呢？有谁遇到过这种情况，粘了就跑不动！谢谢！

作者: 3N4G 时间: 2013-6-28 10:51

请问各位，巯基乙醇和DTT哪种加入上样缓冲更好，自己用的是前者，感觉味道太有刺激性了，还有就是两者是否只要加入一次就行。

作者: 101010 时间: 2013-6-28 10:52

请教一个超傻问题，内外槽的电泳缓冲液不能相通吧？
还有胶底的气泡如何驱赶啊
我怎么总是赶不清？

作者: huifeng0516 时间: 2013-6-28 10:54

大家好！我最近两天的sds-page也总是出现问题，各位帮忙分析以下原因！
1.样品是丙酮浓缩的酵母表达的上清液，可见沉淀，抽真空成粉末，加入buffer后震荡溶解，煮沸5min上样；
2.直接加入未浓缩的上清液，都未见有蛋白条带；阳性的对照有蛋白条带.
3.在胶的底部，芬兰的下方，电泳时有油状的东西，随电泳向下，染色不着色，以前没有见到过这种情况，是未除尽的丙酮么，还是上样液或是酵母培养基被污染？？？？
4.丙希酰胺是新配置的，1.5M Tis 8.8PH是新配置，AP也是；
5.TCA沉淀一定要按照10%的终浓度么，200上清中加入30tca没有看到沉淀，同等的条件下丙酮有可见沉淀，以前TCA可以的呀，明天我重新配置在看看.

明天做蒸发浓缩对照，看看有没有这种情况

作者: huifeng0516 时间: 2013-6-28 10:54

请教一个超傻问题，内外槽的电泳缓冲液不能相通吧？
还有胶底的气泡如何驱赶啊
我怎么总是赶不清？

不可以！
我用的bio装置，你先可以用电泳液将气泡赶尽后，再倾斜着放入电泳槽，让电泳液从一侧浸润上来，就可以搞定，have a try！

作者: huifeng0516 时间: 2013-6-28 10:55

以前跑电泳都挺好的，这次的现象很奇怪。到了分离胶以后，溴分篮就散开了，越跑就越分散，慢慢的基本上就看不见了，但是MARKER跑的没什么问题。怎么回事啊，各位大虾帮忙看看啊

我电泳电压很大时会出现这种情况，跑出来的蛋白带还可以！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:57

大家好我想请教各位高人，我的目的蛋白很粘，应该用什么来打碎呢？有谁遇到过这种情况，粘了就跑不动！谢谢！

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"粘"是什么意思呢？分子量很大吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:58

请问各位，巯基乙醇和DTT哪种加入上样缓冲更好，自己用的是前者，感觉味道太有刺激性了，还有就是两者是否只要加入一次就行。

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只要加一样就行了，用DTT好些，还原性比巯基乙醇强。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 10:58

大家好我想请教各位高人，我的目的蛋白很粘，应该用什么来打碎呢？有谁遇到过这种情况，粘了就跑不动！谢谢！

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"粘"是什么意思呢？分子量很大吗？

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-6-28 10:59

样品的盐浓度对电泳有怎样的的影响？

作者: wood533 时间: 2013-6-28 11:02

我的目的蛋白分子量大约40多kd，不是很大。因为我的菌发酵液就很粘，用肉眼都能看出来的。我的蛋白用pbs溶起来也是粘稠状的，而且我问一个其它实验室的师姐她也说是因为粘，她说少上样也就是让样的浓度尽量大些，体积小点。可是我做了少时能跑下来但没有带，同样的比例多一些就跑得慢跟marker比。怎么办呢？谢谢！！

作者: ending 时间: 2013-6-28 11:02

我的sds又出现了油状条带，不知道他影不影响蛋白电泳！！

作者: 30moonriver 时间: 2013-6-28 11:02

电泳缓冲液的pH值应该是多少呢？

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 11:03

Tris-Gly缓冲液pH值为8.3。

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电泳缓冲液的pH值应该是多少呢？

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 11:04

缓冲液相通了，电流就不会从胶中通过，类似短路。胶底的气泡可以先放外槽缓冲液，然后把内槽倾斜的缓慢放入外槽中。如果胶底有气泡，在左右大幅度轻微晃动，气泡就会跑出来，这时再加内槽缓冲液。屡试不爽。

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请教一个超傻问题，内外槽的电泳缓冲液不能相通吧？
还有胶底的气泡如何驱赶啊
我怎么总是赶不清？

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 11:08

具体描述一下，不知道是怎样情况。

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我的sds又出现了油状条带，不知道他影不影响蛋白电泳！！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 11:11

我认为你现在工作的焦点是怎样解决样品很粘的问题，即使不是电泳，以后要纯化的话，也必须降低粘度。

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to 小蚂哥：我的目的蛋白分子量大约40多kd，不是很大。因为我的菌发酵液就很粘，用肉眼都能看出来的。我的蛋白用pbs溶起来也是粘稠状的，而且我问一个其它实验室的师姐她也说是因为粘，她说少上样也就是让样的浓度尽量大些，体积小点。可是我做了少时能跑下来但没有带，同样的比例多一些就跑得慢跟marker比。怎么办呢？谢谢！！

作者: owanaka 时间: 2013-6-28 11:11

不知道是不是因为浓缩胶没凝好（但是等了近1个小时应该凝固了），拔梳子时会把样品槽拔坏，连续好几次了，很郁闷，请教解决办法

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 13:15

AP是否新鲜配置，如果下次怕拔坏梳子，尽可能早内槽倒满缓冲液再拔梳子。

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不知道是不是因为浓缩胶没凝好（但是等了近1个小时应该凝固了），拔梳子时会把样品槽拔坏，连续好几次了，很郁闷，请教解决办法

作者: guagua 时间: 2013-6-28 13:16

我的蛋白是170kD，老是分子量不对，想换一个marker（以前用的是invitrogen的SeeBlue Plus2 Pre-stained standard），大家能给我一个建议吗？谢谢！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 13:16

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原帖由 guagua 于 2013-6-28 13:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的蛋白是170kD，老是分子量不对，想换一个marker（以前用的是invitrogen的SeeBlue Plus2 Pre-stained standard），大家能给我一个建议吗？谢谢！

根据你的蛋白大小，应该使用高分子量Marker，最大分子量为200KDa的那种，你以前用的是预染Marker吧，我个人使用的感觉预染的marker没有原始的Marker好。上海生工所的还可以，我一直在用。

作者: guagua 时间: 2013-6-28 13:17

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根据你的蛋白大小，应该使用高分子量Marker，最大分子量为200KDa的那种，你以前用的是预染Marker吧，我个人使用的感觉预染的marker没有原始的Marker好。上海生工所的还可以，我一直在用。 ...

谢谢解答！我还没有用过没预染的marker，请问原始marker如何在膜上看到条带呀？能否在这里给我们新手解释一下如何做？非常感谢！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 13:17

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谢谢解答！我还没有用过没预染的marker，请问原始marker如何在膜上看到条带呀？能否在这里给我们新手解释一下如何做？非常感谢！

所谓预染marker就是不需要染色，在电泳的过程中就能看清楚条带迁移，预染marker有个好处就是知道何时可以停电泳，而原始marker(就是非预染的）的只能凭经验停电泳了。

作者: bling 时间: 2013-6-28 13:18

请问楼主，可以将上样缓冲液中的各种成分的作用解释一下吗？还有我提取的蛋白大约1-5ug/ul，楼主建议一下用什么缓冲液上样呢？谢谢！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 13:18

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请问楼主，可以将上样缓冲液中的各种成分的作用解释一下吗？还有我提取的蛋白大约1-5ug/ul，楼主建议一下用什么缓冲液上样呢？谢谢！

SDS：十二烷基磺酸钠，与蛋白结合后使蛋白所带的负电荷远远超过本身所带的电荷，每2个氨基酸结合一个SDS分子。SDS还可以破坏蛋白分子内的氢键。巯基乙醇：还原剂，还原蛋白质分子内的二硫键，和SDS共同作用让蛋白分子变性，成为结构松散的长链状。溴芬兰：指示剂，当电泳时溴芬兰跑到底时，电泳即可结束。甘油：主要作用加大缓冲液的密度，使样品不漂移串道。有些buffer里面用DDT作还原剂，甘油用蔗糖来替代。根据你的蛋白浓度，用2Xbuffer上样就可以了。

作者: bling 时间: 2013-6-28 13:19

我的溴酚蓝好像加得太少，感觉颜色很淡，多加一点没有关系吧？

作者: orangecake 时间: 2013-6-28 13:19

请问普通sds所用的考马斯亮兰染色液以及脱色液可以用在tricine－sds跑的胶吗？我用了一次脱色很困难！

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-28 13:20

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请问普通sds所用的考马斯亮兰染色液以及脱色液可以用在tricine－sds跑的胶吗？我用了一次脱色很困难！

你所说的Tricine-SDS是否就是用Tris—Tricine作缓冲系统的电泳，如果是那和Tris—Gly缓冲系统的染色脱色方法没有区别。

作者: @花开花落@ 时间: 2013-6-28 13:20

我最近跑了两个组织的电泳。其中一个组织条带扭曲，且有杂带，另外一个组织条带很细。这些组织都在-70摄氏度冰箱里放了三个月，会不会是给放坏了啊？

作者: memory 时间: 2013-6-28 13:22

请教
如果样品卡在样品槽上
下来的时间很缓慢
理论上只有几十kDa的东西结果对照marker是两百多
做完western只有极上部的地方看的到条带
有何改善方式呢
是否样品处理程序不对?
样品是培养的细胞
用Peirce的lysis buffer加上protease inhibitor
超音波打30秒加2X loading dye
煮沸五分钟后上样

作者: 966735obeng 时间: 2013-6-28 13:22

一般放－70度冰箱是没有问题的，只要不反复冻融，我的样品放－20度冰箱差不多4个月，结果跑出来的条带还是一样的，比较清晰，重复性也很好。

作者: duoduo 时间: 2013-6-28 13:23

楼主您好：
我现在在做Western blotting 。目的蛋白caspase-3，分子量11－32Kd。曝光显影只有一条带可能是β-actin,没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。
下面是我做的试验方法步骤。
取2*10（6）细胞加200ul细胞裂解液(购自上海元象公司），另加PMSF终浓度1mmol/L, 14000rpm离心4min, 上清即为提取的蛋白

按照《分子克隆〉，制备12%分离胶和5%浓缩胶：
样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加15μl事先制备好的样品

电泳：40V，4-5h当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
剪一块与胶大小一致的PVDF 膜，在甲醇中泡2min钟，按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(参照《分子克隆〉配制。
40V恒压转膜3h。

加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）室温摇床孵育1h。

一抗是兔抗人多克隆抗体1：1000稀释，同时加1：1000稀释的β-actin，4℃过夜。
Washing buffer洗10分钟X 3。
加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：3000）,室温摇床孵育1小时。
Washing buffer洗10分钟X 3。
在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上，曝光盒中曝光1-2min,显影15-30s，定影5min。

作者: vvmmoy 时间: 2013-6-28 13:23

我在跑SDS-PAGE的时候,marker中有几条老是跑不出来，上样量是按照说明书上要求的加了！
另外发现其他人电泳时电压用的分别是在60V和120V左右，但是我的电泳板是大块的，是不是可以增大电压？最后也问一下缓冲液的PH是不是一定要在8.3，若是PH不在8.3会不会对电泳有很大的影响？
恳请各位前辈指教！谢谢！

作者: u76mp 时间: 2013-6-28 13:24

请教楼主一个问题，我个显影的结果一片黑，整个膜在胶片上都是黑色，上面可以看得到条带，但是这么高的背景是什么原因呢？我一抗的稀释倍数是1：200，二抗是1：5000，暴光时间是8分钟，最可能的原因是暴光时间久了还是抗体稀释倍数小了呢？

一抗浓度太高，导致背景太高,暴光时间也太长了,体系好的话,3分钟左右就可以了,推荐一抗浓度1:3000左右.

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:24

我最近跑了两个组织的电泳。其中一个组织条带扭曲，且有杂带，另外一个组织条带很细。这些组织都在-70摄氏度冰箱里放了三个月，会不会是给放坏了啊？

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组织中蛋白成分复杂，有杂带也很正常，关键看看有没有你的目标条带，-70c度保存问题不大。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:24

请教
如果样品卡在样品槽上
下来的时间很缓慢
理论上只有几十kDa的东西结果对照marker是两百多
做完western只有极上部的地方看的到条带
有何改善方式呢
是否样品处理程序不对?
样品是培养的细胞
用Peirce的lysis buffer加上protease inhibitor
超音波打30秒加2X loading dye
煮沸五分钟后上样

谢谢

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最好在处理样品前后都离心一下，防制大分子颗粒被加入。
搞清楚你的200KD的条带来源，先做电泳染色后，确定条件无误后再做weston。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:25

楼主您好：
我现在在做Western blotting 。目的蛋白caspase-3，分子量11－32Kd。曝光显影只有一条带可能是β-actin,没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。
下面是我做的试验方法步骤。
取2*10（6）细胞加200ul细胞裂解液(购自上海元象公司），另加PMSF终浓度1mmol/L, 14000rpm离心4min, 上清即为提取的蛋白

按照《分子克隆〉，制备12%分离胶和5%浓缩胶：
样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加15μl事先制备好的样品

电泳：40V，4-5h当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
剪一块与胶大小一致的PVDF 膜，在甲醇中泡2min钟，按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(参照《分子克隆〉配制。
40V恒压转膜3h。

加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）室温摇床孵育1h。

一抗是兔抗人多克隆抗体1：1000稀释，同时加1：1000稀释的β-actin，4℃过夜。
Washing buffer洗10分钟X 3。
加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：3000）,室温摇床孵育1小时。
Washing buffer洗10分钟X 3。
在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上，曝光盒中曝光1-2min,显影15-30s，定影5min。

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有无做电泳染色对照，电泳条件是否正常？
转移后可用丽春红染色，看看条带是否转上，同时将转移后的凝胶考染，看看是否还有残存的条带。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:25

我在跑SDS-PAGE的时候,marker中有几条老是跑不出来，上样量是按照说明书上要求的加了！
另外发现其他人电泳时电压用的分别是在60V和120V左右，但是我的电泳板是大块的，是不是可以增大电压？最后也问一下缓冲液的PH是不是一定要在8.3，若是PH不在8.3会不会对电泳有很大的影响？
恳请各位前辈指教！谢谢！

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电压可以加，具体可参照一下分子克隆上的条件。
pH与电泳的目的有关，在浓缩胶中，pH偏弱酸性，6.8左右，主要是为了浓缩蛋白质，原理本贴前面已经详述。分离胶中，pH呈碱性，主要是达到分离的目的，一般在8.9左右。从原理上来说，只要在碱性的条件下即可，pH8.9左右是一个最佳的条件，变化肯定对电泳效果有影响，但程度可能有所不同。所以一般建议最好调好pH。

作者: BOSS2011 时间: 2013-6-28 13:26

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作者: kuohao17 时间: 2013-6-28 13:26

感谢楼主帮助，
我做了电泳对照，同时跑两块胶，电泳条件正常，对照组考马斯亮蓝染色后显示条带正常，电转移后显示有残存的条带。
我现在用的电转液配方为：Tris 3g, glycine 14.4g ,甲醇 200ml,10% SDS 2ml/L。
电泳条件：60v,2h
我在别的地方看到另一个电转液配方为：Tris 2.9g, glycine 5.8g ,甲醇 200ml, 10% SDS 3.7ml/L。
请问：
⑴那个电转液配方合适
⑵在湿转恒压条件下，选择多大电压以及多长时间转移11-32kd蛋白较为合适
谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:27

感谢楼主帮助，
我做了电泳对照，同时跑两块胶，电泳条件正常，对照组考马斯亮蓝染色后显示条带正常，电转移后显示有残存的条带。
我现在用的电转液配方为：Tris 3g, glycine 14.4g ,甲醇 200ml,10% SDS 2ml/L。
电泳条件：60v,2h
我在别的地方看到另一个电转液配方为：Tris 2.9g, glycine 5.8g ,甲醇 200ml, 10% SDS 3.7ml/L。
请问：
⑴那个电转液配方合适
⑵在湿转恒压条件下，选择多大电压以及多长时间转移11-32kd蛋白较为合适
谢谢！

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各个实验室在具体的操作中可能略有不同，一般您可按照自己实验室已经建立的条件来作，您提供的配方我也没有试过，所以不知道哪个更好些。
我在作电转的配方主要是参考《常用免疫学实验方法》的做法来作的，用的是恒流，根据转移膜的大小，2mA/cm2。

作者: 8s5g 时间: 2013-6-28 13:27

谢谢楼主受益匪浅
我有一个问题想请教,做10%SDS-PAGE时,近两次MARK条带总是跑歪,不知道是什么原因

作者: xingyi08 时间: 2013-6-28 13:28

请问楼主，您第一张帖子中提到跑非变性SDS-PAGE的样品，还要加1％的SDS 热水煮来处理，这个步骤有什么作用呢，有必要做吗？谢谢！

作者: nut6694 时间: 2013-6-28 13:28

我是新手，诚恳向大家请教一下：
为什么我做SDS-PAGE跑胶的时候，浓缩胶未能将样品浓缩成一条带呢，有时根本就没有起到浓缩的效果?请大家赐教

作者: fei1226com 时间: 2013-6-28 13:29

Marker上在什么位置，最边上吗?如果是，那存在一个边缘效应的问题。最好空出最边上的一道。另外，跑电泳时不能跑空道，即时没有样品也要加满loading buffer。这些只是猜测，若有其他情况再请明示。

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谢谢楼主受益匪浅
我有一个问题想请教,做10%SDS-PAGE时,近两次MARK条带总是跑歪,不知道是什么原因

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:29

请问楼主，您第一张帖子中提到跑非变性SDS-PAGE的样品，还要加1％的SDS 热水煮来处理，这个步骤有什么作用呢，有必要做吗？谢谢！

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非变性是相对变性而言，主要是否加DTT或巯基乙醇等还原剂，将蛋白的二硫键打开，破坏空间结构，形成线性分子。非变性不打开二硫键，只是打开氢键，同时中和蛋白分子表面的电荷，使电泳迁移率与分子量大小呈正相关。非变性电泳主要适合一些需要保持蛋白分子完整性的研究。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:30

我是新手，诚恳向大家请教一下：
为什么我做SDS-PAGE跑胶的时候，浓缩胶未能将样品浓缩成一条带呢，有时根本就没有起到浓缩的效果?请大家赐教

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这个因素很多，把你的电泳条件贴上来分析一下！

作者: ffooll 时间: 2013-6-28 13:33

非变性是相对变性而言，主要是否加DTT或巯基乙醇等还原剂，将蛋白的二硫键打开，破坏空间结构，形成线性分子。非变性不打开二硫键，只是打开氢键，同时中和蛋白分子表面的电荷，使电泳迁移率与分子量大小呈正相关。非变性电泳主要适合一些需要保持蛋白分子完整性的研究。

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sds-page就是变性电泳

作者: 土坷垃 时间: 2013-6-28 13:34

我是新手，诚恳向大家请教一下：
为什么我做SDS-PAGE跑胶的时候，浓缩胶未能将样品浓缩成一条带呢，有时根本就没有起到浓缩的效果?请大家赐教

这个因素很多，把你的电泳条件贴上来分析一下！

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作者: popo520 时间: 2013-6-28 13:34

请教楼主：我的实验预测应该只有一条带，但几次跑浓缩胶的时候就没压成一条带，最后跑出来像apoptosis ladder一样，很多条，而且粗细基本一致。浓缩胶电压60V，电泳液是新配的，上样量25ug

作者: www.1 时间: 2013-6-28 13:35

请问，我想测蛋白质的PI值，用电泳的方法可以做么？如何做，多谢指教！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-28 13:35

看能不能做IEF，就是等电聚焦电泳来测蛋白质的PI。

作者: DDD 时间: 2013-6-28 13:36

为什么我的提取液能够测到蛋白浓度，却跑不出电泳？？？急

作者: NBA 时间: 2013-6-28 13:37

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2013-6-28 13:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
为什么我的提取液能够测到蛋白浓度，却跑不出电泳？？？急

原因有多种。
1. 蛋白虽有，但浓度不够；
2. 蛋白的分子量与跑胶的条件之间不合适；如果不是SDS-PAGE，电荷或分子形状对电泳结果的影响不容忽视；
3. 蛋白比较特殊，个别蛋白SDS处理不能改变其结构；
4. 也有的蛋白对常规的染色剂不着色；
5. 你测蛋白是用什么方法？杂质是不是对结果有干扰？
6. 你的提取液是什么？离子强度、缓冲系统对电泳结果是否有干扰？
等等

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:38

请教楼主：我的实验预测应该只有一条带，但几次跑浓缩胶的时候就没压成一条带，最后跑出来像apoptosis ladder一样，很多条，而且粗细基本一致。浓缩胶电压60V，电泳液是新配的，上样量25ug.

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从您的电泳条带来看，可能样品中有大颗粒物质，建议上样前离心。
条带未浓缩好，可能是您的凝胶缓冲液有问题，建议调整pH试试，浓缩胶pH6.8，分离胶pH8.9

作者: DDD 时间: 2013-6-28 13:38

我是新新手，有很多问题跟大家请教！我要分析的是一种废液里的蛋白，包括蛋白的等电点、蛋白的种类（有哪些）、蛋白的分子量，应该怎样设计试验呢？跑电泳的蛋白样品要很纯才行么？里面有纤维或脂肪、糖之类的东西可以么？
买回来的SDS需要重结晶么？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:39

sds-page就是变性电泳

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不是的，由于还原SDS－PAGE电泳比较常用，大多数情况下，我们可以狭义的认为SDS－PAGE电泳就是指变性电泳，但事实上它还包括非还原SDS－PAGE电泳，就是上样BUFFER中不加还原剂（DTT或巯基乙醇），只加SDS处理，其与还原电泳的区别就是未完全破坏蛋白分子的高级结构，而只是打开了其中的氢键。对于一些大分子物质可以保持蛋白分子的完整性。

作者: zzzz 时间: 2013-6-28 13:39

请问楼主，我前天跑的电泳出现了一个特别怪的事情：我的marker在压线条带之前也出现了一个蓝色条带，不知道为什么？我以前做得都很好，问同学也都没有见过这个现象。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:40

我的marker在压线条带之前也出现了一个蓝色条带，不知道为什么？

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能说的明白点吗？比如带的位置，只marker有吗？是偶然还是每次都这样？影响实验结果吗？

作者: yueban-1147 时间: 2013-6-28 13:41

Smearing can have a variety of causes, but most commonly it is due to an unevenly poured acrylamide mixture or due to gross overloading of protein.

In this example the gel was not properly poured, so that the lower half had begun to polymerize before the upper part was poured. The first gel mix began to polymerize too quickly. Rather than prepare a new gel cassette, the students simply stopped pouring, prepared a new mix, and poured it on top of the old. Obviously, the bond wasn't particularly good.

不知这有无帮助

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16888

作者: 966735obeng 时间: 2013-6-28 13:42

多糖可以做SDS-PAGE吗？我看有做细菌脂多糖的PAGE，染色用银染，那么细菌的荚膜多糖可以做SDS-PAGE吗？
谢谢！

作者: DDD 时间: 2013-6-28 13:42

请问楼主：
在样品提取时加入尿素的目的是什么？加和不加跑出的带有什么不同？
多谢！

作者: fsdd817 时间: 2013-6-28 13:44

不是每次都这样的，我也不知道会不会有影响，只是感觉很奇怪，而且今天做的也很好的。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:44

多糖可以做SDS-PAGE吗？我看有做细菌脂多糖的PAGE，染色用银染，那么细菌的荚膜多糖可以做SDS-PAGE吗？
谢谢！

===================================================

糖蛋白SDS-PAGE电泳中分子量不准确，可能无法判断出蛋白的大小。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:45

请问楼主：
在样品提取时加入尿素的目的是什么？加和不加跑出的带有什么不同？
多谢！

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促进溶解，如果蛋白的融解性很好，可以不加！

作者: idoww 时间: 2013-6-28 13:46

糖蛋白SDS-PAGE电泳中分子量不准确，可能无法判断出蛋白的大小。

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为什么会无法判断大小呢？原理和蛋白质的PAGE有差别吗？能详细讲下吗，谢谢！

作者: youyou99 时间: 2013-6-28 13:46

第一次跑胶，出了问题不知所措，请大家指点一下。

因为是新手，担心配的试剂有问题，买的是碧云天的现成的配胶试剂盒（只要对着加就行了），预染的marker也是碧云天生产的。

每孔加样20ul（2*10^6细胞于100ul裂解液中做western用)，在浓缩胶中问题还不算严重，60V。跑完浓缩胶后样品压成约4mm高（纵向）的条带。

可进入分离胶后，却呈一条比较宽（纵向）且模糊的条带逐渐向下移动，预染的marker也是这样，没有明显的的条带，只留下溴酚兰跑过的痕迹。

我的目的蛋白是45KD，12%的胶（文献上采用的也是12%），

我跟同学同时在一个电泳槽中跑（他配胶的所有试剂是自己配的），他很正常，应该不是电泳液的问题啊？

请大家帮我分析一下，为什么会成一条很宽且模糊的条带（约有1cm宽）往下跑？我是新手，压力很大，不能再拖延时间啦。

作者: DDD 时间: 2013-6-28 13:47

请问楼主：
我看到有试验对大豆种子处理时加入PVP，这个是为啥呢？
谢谢！

作者: BUK 时间: 2013-6-28 13:47

今天跑胶结果不大好，二相SDS－PAGE 用的时间比以前5小时多了3个小时(，看了前面的帖子，不知是否与我新配的Tris-Hcl 的PH值有问题，以前配的分离胶为PH=8.8，这次配好定容后测为PH=8.5，胶在聚合时的温度为27度，但比以前明显增快，且胶面不平。
请教是否我配胶PH值低是影响电流速度的原因
如果是请问如何调高PH值，用tris碱吗？但是浓度又会不准了。

作者: am10 时间: 2013-6-28 13:48

请问加样前样品为什么要离心?离心后蛋白不都沉到底下去了吗?加样时还要不要打匀再加样?
我要跑糖蛋白,可是楼主说SDS-PAGE电泳不行,那我用什么方法跑啊?
老师一定要我跑出来,如果跑不出来另外的实验都不能继续往下做,楼主指点迷津啊!

作者: bs4665 时间: 2013-6-28 13:48

western的高手们帮帮忙，
最近想做一下western，
手头又没有更好的资料，
由于是第一次做，
试验步骤暂时还没有总结出来，
那位过来人可否指点一下啊？
谢谢了！

作者: 小荷尖尖 时间: 2013-6-28 13:48

请各位大虾给分析分析：
这两天我配的胶都很难凝，我自己还以为自己跑胶还是高手，现在栽了。最近两次都要快一个小时才能凝，我把tris的PH 值重新测过了，也没有问题，AP 是新配的，丙西酰胺我以前用得都很好的，SDS 也是一直在用的，TEMED也是新买的。
小弟在这谢过了！

作者: mamamiya 时间: 2013-6-28 13:50

请各位大虾给分析分析：
这两天我配的胶都很难凝，我自己还以为自己跑胶还是高手，现在栽了。最近两次都要快一个小时才能凝，我把tris的PH 值重新测过了，也没有问题，AP 是新配的，丙西酰胺我以前用得都很好的，SDS 也是一直在用的，TEMED也是新买的。
小弟在这谢过了！

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是不是该考虑一下试剂是否失效？譬如TEMED要放在棕色试剂瓶中的，AP最好是分装放在－20度。

作者: mamamiya 时间: 2013-6-28 13:50

今天跑胶结果不大好，二相SDS－PAGE 用的时间比以前5小时多了3个小时(，看了前面的帖子，不知是否与我新配的Tris-Hcl 的PH值有问题，以前配的分离胶为PH=8.8，这次配好定容后测为PH=8.5，胶在聚合时的温度为27度，但比以前明显增快，且胶面不平。
请教是否我配胶PH值低是影响电流速度的原因
如果是请问如何调高PH值，用tris碱吗？但是浓度又会不准了。

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用HCl调pH，灌胶前一定得把玻璃板洗干净。

作者: rxcc33 时间: 2013-6-28 13:51

请教楼主：我同样的蛋白质样品加溴酚蓝煮后，一个立刻跑电泳，一个第二天跑电泳，第二天跑的样品上不到点样孔或从点. 样孔漂出，请问是怎么回事啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:51

第一次跑胶，出了问题不知所措，请大家指点一下。

因为是新手，担心配的试剂有问题，买的是碧云天的现成的配胶试剂盒（只要对着加就行了），预染的marker也是碧云天生产的。

每孔加样20ul（2*10^6细胞于100ul裂解液中做western用)，在浓缩胶中问题还不算严重，60V。跑完浓缩胶后样品压成约4mm高（纵向）的条带。

可进入分离胶后，却呈一条比较宽（纵向）且模糊的条带逐渐向下移动，预染的marker也是这样，没有明显的的条带，只留下溴酚兰跑过的痕迹。

我的目的蛋白是45KD，12%的胶（文献上采用的也是12%），

我跟同学同时在一个电泳槽中跑（他配胶的所有试剂是自己配的），他很正常，应该不是电泳液的问题啊？

请大家帮我分析一下，为什么会成一条很宽且模糊的条带（约有1cm宽）往下跑？我是新手，压力很大，不能再拖延时间啦。

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结果有没有问题，这种现象应该是配分离胶的缓冲液或上样buffer有问题，不过如果结果正常的话，就无所谓了。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:53

请问楼主：
我看到有试验对大豆种子处理时加入PVP，这个是为啥呢？
谢谢！

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植物方面的东东不太了解，帮你搜了一点关于PVP的资料，供参考。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4200466_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2807495_0.html')

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:54

今天跑胶结果不大好，二相SDS－PAGE 用的时间比以前5小时多了3个小时(，看了前面的帖子，不知是否与我新配的Tris-Hcl 的PH值有问题，以前配的分离胶为PH=8.8，这次配好定容后测为PH=8.5，胶在聚合时的温度为27度，但比以前明显增快，且胶面不平。
请教是否我配胶PH值低是影响电流速度的原因
如果是请问如何调高PH值，用tris碱吗？但是浓度又会不准了。

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可以调下pH，用NaOH就行了。
您的胶面用水封了吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:55

请问加样前样品为什么要离心?离心后蛋白不都沉到底下去了吗?加样时还要不要打匀再加样?
我要跑糖蛋白,可是楼主说SDS-PAGE电泳不行,那我用什么方法跑啊?
老师一定要我跑出来,如果跑不出来另外的实验都不能继续往下做,楼主指点迷津啊!

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1.加样离心主要是将蛋白分子中大分子颗粒离下来，防止在电泳时涨破凝胶孔，导致蛋白分子电泳迁移率不均匀。离心不会使所有蛋白都沉下去，只会使大分子颗粒沉下去。加样是取上清加。
2.糖蛋白并非跑SDS－PAGE不行，只是说它在电泳时分子量大小与预期的可能有差别，一般偏大。如果你要鉴定蛋白的话，可做weston啊，证明它是特异性的不就行了吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:56

请各位大虾给分析分析：
这两天我配的胶都很难凝，我自己还以为自己跑胶还是高手，现在栽了。最近两次都要快一个小时才能凝，我把tris的PH 值重新测过了，也没有问题，AP 是新配的，丙西酰胺我以前用得都很好的，SDS 也是一直在用的，TEMED也是新买的。
小弟在这谢过了！

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1个小时应该还是比较正常的吧，我们一般都放1h左右，防止凝结不充分。
可以试试放在温箱里，一般在37C凝固稍微快点。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 13:56

请教楼主：我同样的蛋白质样品加溴酚蓝煮后，一个立刻跑电泳，一个第二天跑电泳，第二天跑的样品上不到点样孔或从点. 样孔漂出，请问是怎么回事啊？

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甘油少了

作者: kswl870 时间: 2013-6-28 13:57

好长时间没做蛋白电泳了，最近做了几次，出现了一些问题，请高手指教

首次12％的分离胶较小分子量蛋白和溴酚蓝基本在同一位置，感觉分离胶浓度过低，所以调整15％分离胶，电泳约2－3小时后，溴酚蓝已经跑出去后继续30min，可是蛋白在15％的分离胶上只大约泳到胶的1/3部位，蛋白条带都在，也很清楚。换回12％的胶大约只1/2的距离，结果同上。

为什么会出现蛋白泳动部分就不走了，或者蛋白为什么跑这么慢？

注：1.电泳巢外的电泳液我用了先用一半，后来加满，效果一样，都不能跑到胶的底部。
2.首次和以后用的所有系统，甚至样品都一样，电泳液都是同一次配好的储液稀释的。
3.1M PH6.8 Tris-HCl 摇动有絮状物，使用定性滤纸过滤了一次，较清亮了。但是估计这个过滤不会有什么影响吧？
4.使用的是恒压，80V约45min，然后120V约2.5h
5. 30%储液配制，亚甲双丙稀酰胺1g溶于约60度的温去离子水后（很快溶解），加入29g丙稀酰胺，迅速溶解，定容至100ml，棕色瓶4度保存。

我觉得不可能是短路,因为溴酚蓝在泳动。所以请问各位们原因可能出在什么地方呢？急

作者: wood533 时间: 2013-6-28 13:57

我做抗体蛋白，活性做完了可是蛋白电泳始终跑不出来。原来有师姐做过抗体，说表达量浓度太小，要用银染。请教，怎样浓缩抗体蛋白？最好用不影响蛋白稳定性的方法浓缩后用考嘛思亮兰能染出来

作者: standbyme 时间: 2013-6-28 13:58

请问，如果想做370Kd的蛋白，该用什么样的凝胶呢

梯度凝胶电泳怎么做呢？

作者: hustwb 时间: 2013-6-28 13:58

我请教一个问题，NC膜在电泳缓冲液中泡多长时间合适？

作者: 33号 时间: 2013-6-28 13:59

我做抗体蛋白，活性做完了可是蛋白电泳始终跑不出来。原来有师姐做过抗体，说表达量浓度太小，要用银染。请教，怎样浓缩抗体蛋白？最好用不影响蛋白稳定性的方法浓缩后用考嘛思亮兰能染出来

作者: yychen 时间: 2013-6-28 13:59

我今天跑了一次,结果和vetchinahrb一样,样品好象跑不动,是什么原因啊?我今天本来开始跑的还好的,后来我看条带有点歪,我就关了电源把玻璃板拿出来看看,内外电泳液好象有所混合, 然后我又继续跑,发现电泳开始变慢了,而且也更歪了,以前是跑的太快,一会就跑完了,到底是什么原因啊?

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:00

好长时间没做蛋白电泳了，最近做了几次，出现了一些问题，请高手指教

首次12％的分离胶较小分子量蛋白和溴酚蓝基本在同一位置，感觉分离胶浓度过低，所以调整15％分离胶，电泳约2－3小时后，溴酚蓝已经跑出去后继续30min，可是蛋白在15％的分离胶上只大约泳到胶的1/3部位，蛋白条带都在，也很清楚。换回12％的胶大约只1/2的距离，结果同上。

为什么会出现蛋白泳动部分就不走了，或者蛋白为什么跑这么慢？

注：1.电泳巢外的电泳液我用了先用一半，后来加满，效果一样，都不能跑到胶的底部。
2.首次和以后用的所有系统，甚至样品都一样，电泳液都是同一次配好的储液稀释的。
3.1M PH6.8 Tris-HCl 摇动有絮状物，使用定性滤纸过滤了一次，较清亮了。但是估计这个过滤不会有什么影响吧？
4.使用的是恒压，80V约45min，然后120V约2.5h
5. 30%储液配制，亚甲双丙稀酰胺1g溶于约60度的温去离子水后（很快溶解），加入29g丙稀酰胺，迅速溶解，定容至100ml，棕色瓶4度保存。

我觉得不可能是短路,因为溴酚蓝在泳动。所以请问各位们原因可能出在什么地方呢？急

谢谢

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溴芬兰和蛋白电泳位置不相适应，最主要的还是分离胶的浓度偏高的缘故，您可以再试试看，30％丙烯酰铵配置后应该过虑一下。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:01

我做抗体蛋白，活性做完了可是蛋白电泳始终跑不出来。原来有师姐做过抗体，说表达量浓度太小，要用银染。请教，怎样浓缩抗体蛋白？最好用不影响蛋白稳定性的方法浓缩后用考嘛思亮兰能染出来

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可用透析袋装蛋白置4C冰箱中，用风扇吹，使水分挥发至适当体积即可。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:01

请问，如果想做370Kd的蛋白，该用什么样的凝胶呢

梯度凝胶电泳怎么做呢？

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370KD确实挺大，可用5-6％分离胶，2.5％的浓缩胶跑跑看，不过浓缩胶可是很稀的，加样时注意点。

剃度胶电泳可以先看看郭尧君的《蛋白质电泳技术》一书，上面有比较详细的说明。

作者: kulee 时间: 2013-6-28 14:02

昨天我重测了Tris -HCL 的PH值，24度时为8.7-8.78，浓度没问题。用的水饱和正丁醇封的胶，一直这样做跑17CM的二相用5小时，但丁配胶时这次减少了AP的量，胶面很平，但是电泳时间还时比以前长3小时为8小时，不知是什么原因造成电泳时间明显延长。大部分试剂是原先都用的，只有Tris-HclJ是新配的。请各位朋友不吝赐教。谢谢!

作者: NBA 时间: 2013-6-28 14:02

我请教一个问题，NC膜在电泳缓冲液中泡多长时间合适？

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做什么用得，可以说得详细点吗?

作者: NBA 时间: 2013-6-28 14:03

我今天跑了一次,结果和vetchinahrb一样,样品好象跑不动,是什么原因啊?我今天本来开始跑的还好的,后来我看条带有点歪,我就关了电源把玻璃板拿出来看看,内外电泳液好象有所混合, 然后我又继续跑,发现电泳开始变慢了,而且也更歪了,以前是跑的太快,一会就跑完了,到底是什么原因啊?

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使用过得电泳液，内槽和外槽离子浓度有所不同，不可混合，建议重配电泳液。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 14:03

多谢有故事的人和小蚂哥的建议，昨天我重测了Tris -HCL 的PH值，24度时为8.7-8.78，浓度没问题。用的水饱和正丁醇封的胶，一直这样做跑17CM的二相用5小时，但丁配胶时这次减少了AP的量，胶面很平，但是电泳时间还时比以前长3小时为8小时，不知是什么原因造成电泳时间明显延长。大部分试剂是原先都用的，只有Tris-HclJ是新配的。请各位朋友不吝赐教。谢谢!

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那你就再看看是不是电泳缓冲液得问题。

作者: xingyi08 时间: 2013-6-28 14:04

我做的是一个磷酸化蛋白的测定，分子量是43KD左右，使用12%的分离胶，5％的浓缩胶，电泳是衡压200V一直跑到底，电转是80V，90min，封闭1小时，一抗4度过夜，二抗孵育1小时，ECL显色。反复做了好几次，都说内参曝光有很明显的条带，但目的蛋白却什么都没有，能请教一下会是什么原因？还有做磷酸化蛋白的时候要注意哪些方面？谢谢

作者: 911 时间: 2013-6-28 14:04

，现在我得到了理想的电泳结果。就我的问题及解决方案做一个说明。

首先，是胶的浓度高了。当时配储液时用的丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺不是一个公司的产品。估计甲叉的浓度高了，因为当时感觉生工的甲叉密度比较小，1g称了好大的一堆。再可能就是把丙烯酰胺作为甲叉作为甲叉使用了，但是后一原因好像不太可能，因为有人只用29％的丙烯酰胺配胶根本就不凝固的。

其次，我重新调了Tris-HCl buffer的PH，尽管仍然用的以前的液体。但是测定PH值均偏高6.8的约为9.2,8.8的约为9.5。不知道这两种溶液保存时间过长是否会发生PH值升高的现象。建议长时间不用的这两种溶液，使用前测PH值。

最后，我重新配了染色液，染色液太老可能会影响着色效果。

作者: 911 时间: 2013-6-28 14:05

我今天跑了一次,结果和vetchinahrb一样,样品好象跑不动,是什么原因啊?我今天本来开始跑的还好的,后来我看条带有点歪,我就关了电源把玻璃板拿出来看看,内外电泳液好象有所混合, 然后我又继续跑,发现电泳开始变慢了,而且也更歪了,以前是跑的太快,一会就跑完了,到底是什么原因啊?

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我觉得内外电泳液可以混和使用。

有时候下边的溴酚蓝条带不平直不影响结果。

你的30％储液浓度怎么样？脱色后感觉一下胶的硬度，如果太硬，基本可以确定储液浓度过高。

作者: 68943512yao 时间: 2013-6-28 14:05

斑竹好，我在做SDS-PAGE时的marker只有最下面的两条带为直线，上面的其他条带像一个个小斑点，但旁边的上清液却跑得很好，跑了好几次marker都是那样，而以前同实验室的用的却很好，很郁闷，帮忙解答一下，谢谢。

作者: eric930 时间: 2013-6-28 14:06

请教斑竹：
我现在在跑WB，同时测B-ACTIN（分子量45KD）和P-P38(分子量38KD）,用15%的胶跑，跑两块，各用一块胶，抗体浓度：一抗、二抗均为1：500稀释，上样量为60ug，结果，B-ACTIN的那张膜上，曝光显示有多条杂带，均较亮，而P-P38的那张膜曝光时，感觉在分子量48KD(MARKER)左右有带，应该不是我想要的带，而其他就无明显带了，一抗均为SANTA CRUZ公司的，二抗为同一抗体，兔抗。请问可能会有什么原因，怎么能解决呢？

作者: 30moonriver 时间: 2013-6-28 14:06

我觉得内外电泳液可以混和使用。

有时候下边的溴酚蓝条带不平直不影响结果。

你的30％储液浓度怎么样？脱色后感觉一下胶的硬度，如果太硬，基本可以确定储液浓度过高。

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30％储液是指30%的丙烯酰胺吧,我是这样做的,比如我配50ml,我先称好了丙烯酰胺,然后把50ml水倒进去,但是发现体积多于50ML,刚开始我还以为我水加错了,后来老师说水中有粉末溶解的话体积会增大的,是这样吗?配好后我就用磁力搅拌器搅拌4-5h,然后滤纸过滤后放在四度.
我的电泳仪器也许和一般的不大一样,我的胶又小又薄,分离胶只要加5ML,浓缩胶只要加2ML就够了,那我怎么感觉胶的硬度呢?
刚开始溴酚蓝条带是不平,可是最后跑到底下的时候又好象比较平了,真是怪了,老师叫我跑了点小牛血清,会不会是血清浓度太高导致带不平,我跑血清时没稀释?今天看了一下结果,加血清的孔颜色狂深,蛋白量太高了,我的样品却不怎么看的出来,不过还没脱色好,等脱色好了再看看

作者: PCR 时间: 2013-6-28 14:07

30％储液是指30%的丙烯酰胺吧,我是这样做的,比如我配50ml,我先称好了丙烯酰胺,然后把50ml水倒进去,但是发现体积多于50ML,刚开始我还以为我水加错了,后来老师说水中有粉末溶解的话体积会增大的,是这样吗我的电泳仪器也许和一般的不大一样,我的胶又小又薄,分离胶只要加5ML,浓缩胶只要加2ML就够了,那我怎么感觉胶的硬度呢?
刚开始溴酚蓝条带是不平,可是最后跑到底下的时候又好象比较平了,真是怪了,老师叫我跑了点小牛血清,会不会是血清浓度太高导致带不平,我跑血清时没稀释?今天看了一下结果,加血清的孔颜色狂深,蛋白量太高了,我的样品却不怎么看的出来,不过还没脱色好,等脱色好了再看看

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“配好后我就用磁力搅拌器搅拌4-5h”，这样子好像不好，因为丙烯酰胺储液最好避光配置，保存。

你可以先量50ml 水，预热到45度，加入1g甲叉丙烯酰胺，然后加入29g丙烯酰胺（液体体积会增大），充分溶解最后定容至100ml。能够迅速溶解。我配好后，基本没有不溶颗粒，所以也没有过滤。

配一块胶基本就是5ml＋1ml, 至于胶的硬度，你脱色后，摸摸就是了。嗯，需要有对比的经验。

作者: zwsyrt 时间: 2013-6-28 14:08

求助：向高手请教跑4％－20％的变性梯度胶的配方，急！

作者: newway 时间: 2013-6-28 14:08

请教楼主：
1.我的目的蛋白很小<14KD，但每次跑到大约最后一个maker那里时，就看不到一条一条的蛋白了，而是一条宽宽的蓝色的带直到底部（见下图），这要怎么办呢？
2. 用塑料膜把pvdf膜封在里面，然后每次加一抗，二抗时又要把它剪开，每次都要费劲的赶气泡，还要小心不能把里面的液体撒出来。有没有更简便的办法呢？

图片附件: 66719663.snap.jpg (2013-6-28 14:08, 36.15 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16890

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-28 14:09

“配好后我就用磁力搅拌器搅拌4-5h”，这样子好像不好，因为丙烯酰胺储液最好避光配置，保存。

你可以先量50ml 水，预热到45度，加入1g甲叉丙烯酰胺，然后加入29g丙烯酰胺（液体体积会增大），充分溶解最后定容至100ml。能够迅速溶解。我配好后，基本没有不溶颗粒，所以也没有过滤。

配一块胶基本就是5ml＋1ml, 至于胶的硬度，你脱色后，摸摸就是了。嗯，需要有对比的经验。

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哦,昨天脱色后看了一下,我跑出来的条带marker有点歪,是什么原因啊?我的marker是加在小牛血清旁边的孔里的,小牛血清倒还好,就是颜色太深了,不脱色就可以看到非常深的条带,而且底下条带好象都没有分开

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-6-28 14:09

好帖子就要大家一起分享了！非常感谢楼主哦！我在跑电泳时也遇到了一个问题，感觉蛋白带特别宽，以前做的时候没出现这种情况啊？不知道什么原因造成的

作者: 969 时间: 2013-6-28 14:09

相关疾病：
头痛
问一个很菜的问题，但是让我很头疼，请教各位高手赐教一下
我跑的很普通的胞浆蛋白的PAGE胶，分离胶是14％，浓缩胶是5％，蛋白质煮沸5min，电泳缓冲液配的也没有问题，整套体系昨天跑的还好好的，今天跑就不知为什么出了问题，跑了将近两个小时蛋白样品就是在上样孔里不动，跑不到浓缩胶里去，平时跑半个小时就跑完了浓缩胶，电压和电流也没问题，蛋白样品也是同一批次，操作也没问题。
想请教一下究竟是哪出了问题，谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2013-6-28 14:10

请问楼主，tricine凝胶系统的具体原理是什么？搜了很多都是讲配方的，有没有系统的原理传授一下？谢谢

作者: ququer787 时间: 2013-6-28 14:10

楼主您好！请教几个问题：（1）我提的蛋白样品加完上样缓冲液煮沸变性后，放入－80度保存，一般可以放多长时间能保证对跑电泳及后续实验无影响；(2)从－80度取出蛋白样品离心后是否需要充分混匀再上样：（3）一般多长时间能使胶充分凝好，我一般是凝两个小时，是否需要延长到3－4个小时使胶充分凝后再跑电泳。
谢谢！

作者: orangecake 时间: 2013-6-28 14:11

问一个很菜的问题，但是让我很头疼，请教各位高手赐教一下
我跑的很普通的胞浆蛋白的PAGE胶，分离胶是14％，浓缩胶是5％，蛋白质煮沸5min，电泳缓冲液配的也没有问题，整套体系昨天跑的还好好的，今天跑就不知为什么出了问题，跑了将近两个小时蛋白样品就是在上样孔里不动，跑不到浓缩胶里去，平时跑半个小时就跑完了浓缩胶，电压和电流也没问题，蛋白样品也是同一批次，操作也没问题。
想请教一下究竟是哪出了问题，谢谢

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你的电源是不是以前的老的呢?
他能不能自动检测电路? 如果是不能的话,那你可能是上槽液有点漏或没有加满

作者: S6044 时间: 2013-6-28 14:12

本人也最近跑了块胶，结果郁闷中．请各位大侠帮忙分析！
我上了Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５，有３个峰，合并后，用ＢＣＡ法测得蛋白浓度最小的为４００ｕｇ／ｍｌ，然后跑了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＴＲＩＣＩＮＥ胶，却没有带．
下面为跑的图．
ＭＡＲＫ　左面是我的带，只有１　２　有点东西．还不清楚！我也不知道原因，请帮忙啊！郁闷啊

图片附件: 21177979.jpg (2013-6-28 14:12, 38.1 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16891

作者: 冰儿0109 时间: 2013-6-28 14:12

我一不小心买了预混合的蛋白质marker,可我不知道该怎么用，想请教大家一下。另外预混合的蛋白质marker和蛋白样品上样电泳后用考马斯亮兰染色后可以直接转膜显色吗？由于是新手，请多关照。

作者: 966735obeng 时间: 2013-6-28 14:12

我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢。

作者: tianmei001 时间: 2013-6-28 14:13

最近正在看郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》一书，里面的内容很详细，很系统，推荐！另外楼主整理的问题针对性很强，受益颇深！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:13

求助：向高手请教跑4％－20％的变性梯度胶的配方，急！

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参考一下分子克隆第二版，上面有SDS－PAGE得配方

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:14

蛋白空间结构被破坏,其抗原决定簇也会不同,sds-page蛋白做抗原或免疫原已原蛋白肯定会不一样

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:14

我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢。

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低分子量蛋白跑得较快,跑在前头就会扩散,使条带不明显.可以选择增加浓缩胶,增加分离胶浓度,或者换换缓冲系统.

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:15

本人也最近跑了块胶，结果郁闷中．请各位大侠帮忙分析！
我上了Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５，有３个峰，合并后，用ＢＣＡ法测得蛋白浓度最小的为４００ｕｇ／ｍｌ，然后跑了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＴＲＩＣＩＮＥ胶，却没有带．
下面为跑的图．
ＭＡＲＫ　左面是我的带，只有１　２　有点东西．还不清楚！我也不知道原因，请帮忙啊！郁闷啊

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检测你上样量,你的浓度并不高,并实际浓度可能比你测得的蛋白浓度要低,有时可能是数量级的差异.
可以尝试西安把蛋白浓缩,离心,取上清叫上样缓冲液去电泳

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:15

我一不小心买了预混合的蛋白质marker,可我不知道该怎么用，想请教大家一下。另外预混合的蛋白质marker和蛋白样品上样电泳后用考马斯亮兰染色后可以直接转膜显色吗？由于是新手，请多关照。

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您按照供应商提供的说明书操作就是了,若有不明处可打电话向对方咨询.电泳后染色再转膜的话染料会对转膜有一定影响,但也能转的上去.

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:16

楼主您好！请教几个问题：（1）我提的蛋白样品加完上样缓冲液煮沸变性后，放入－80度保存，一般可以放多长时间能保证对跑电泳及后续实验无影响；(2)从－80度取出蛋白样品离心后是否需要充分混匀再上样：（3）一般多长时间能使胶充分凝好，我一般是凝两个小时，是否需要延长到3－4个小时使胶充分凝后再跑电泳。
谢谢！

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放入－80度保存的蛋白应小管分装,每次取一管使用,尽量不要反复冻融,从－80度取出融化后可以混匀再离心.凝胶凝好的时间视你配置凝胶的试剂量及新鲜程度,一般情况下30分钟到1小时就可以凝好了,没必要延长那么长时间

作者: qhyu 时间: 2013-6-28 14:16

我做抗体蛋白，活性做完了可是蛋白电泳始终跑不出来。原来有师姐做过抗体，说表达量浓度太小，要用银染。请教，怎样浓缩抗体蛋白？最好用不影响蛋白稳定性的方法浓缩后用考嘛思亮兰能染出来

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真空干燥比较快,冷冻抽干也可以,只是慢点!

作者: loli 时间: 2013-6-28 14:17

请教版主个问题：
我用的是5％浓缩胶，12％分离胶，恒流，25mV浓缩胶,40mV分离胶。5*loading buffer(0.313M Tris-HCl pH 6.8,10% SDS, 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol 0.5M DTT),
Fermentas预染marker。为什么我的marker最后一条11KD带总跑不出来，溴酚兰总和17KD的带在一个水平？？？
望指教，谢谢！！！

作者: flower-201 时间: 2013-6-28 14:17

请教楼主：
我最近跑电泳浓缩胶很好，到分离胶后溴酚蓝在前沿有扩散，是为什么呢？电压小了吗？浓缩胶是60V，分离胶是120V。

作者: birdfish 时间: 2013-6-28 14:18

楼主好啊！
我最近碰到了一个难题，我的胶现在怎么也跑不下来，我的marker 下面有26和20KD的，但是最多能够跑道三分之二左右，就怎么也跑不下来了，我的溴芬兰几乎都快跑出去了，急！！
谢谢了！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:18

请教楼主：
1.我的目的蛋白很小<14KD，但每次跑到大约最后一个maker那里时，就看不到一条一条的蛋白了，而是一条宽宽的蓝色的带直到底部（见下图），这要怎么办呢？
2. 用塑料膜把pvdf膜封在里面，然后每次加一抗，二抗时又要把它剪开，每次都要费劲的赶气泡，还要小心不能把里面的液体撒出来。有没有更简便的办法呢？

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1.检查一下是不是电泳槽下部的电极问题，从图上来看不太象是胶的问题，而且你说一直都是这样。
2。赶气泡最简单的方法就是放在水里或缓冲液里涮一下就可以了

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:18

哦,昨天脱色后看了一下,我跑出来的条带marker有点歪,是什么原因啊?我的marker是加在小牛血清旁边的孔里的,小牛血清倒还好,就是颜色太深了,不脱色就可以看到非常深的条带,而且底下条带好象都没有分开

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血清中的蛋白浓度一般较高，稀释后，如果每孔上样量高的话，可能会涨破凝胶导致两边泳道的蛋白条带扭曲或歪曲，建议降低上样量试试。染色太深，就是蛋白浓度高了，与前面的现象是相符的。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:19

好帖子就要大家一起分享了！非常感谢楼主哦！我在跑电泳时也遇到了一个问题，感觉蛋白带特别宽，以前做的时候没出现这种情况啊？不知道什么原因造成的

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是不是旁边有空泳道，一般有空泳道的话就容易出现这种情况，建议：在空泳道里加些上样buffer

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:19

请问楼主，tricine凝胶系统的具体原理是什么？搜了很多都是讲配方的，有没有系统的原理传授一下？谢谢！

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郭尧君的《蛋白质电泳技术》一书里有介绍，如果你需要的话，可PM我你的邮箱，我给你发份电子档。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:19

楼主您好！请教几个问题：（1）我提的蛋白样品加完上样缓冲液煮沸变性后，放入－80度保存，一般可以放多长时间能保证对跑电泳及后续实验无影响；(2)从－80度取出蛋白样品离心后是否需要充分混匀再上样：（3）一般多长时间能使胶充分凝好，我一般是凝两个小时，是否需要延长到3－4个小时使胶充分凝后再跑电泳。
谢谢！

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1.最长时限没有做过实验证明过，不过在-80C环境下，1年左右应该是没有问题的，蛋白样品在-80C环境下也可不处理直接冻存。
2.离心是取上清加样。
3.不需要，2h足够了！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:20

问一个很菜的问题，但是让我很头疼，请教各位高手赐教一下
我跑的很普通的胞浆蛋白的PAGE胶，分离胶是14％，浓缩胶是5％，蛋白质煮沸5min，电泳缓冲液配的也没有问题，整套体系昨天跑的还好好的，今天跑就不知为什么出了问题，跑了将近两个小时蛋白样品就是在上样孔里不动，跑不到浓缩胶里去，平时跑半个小时就跑完了浓缩胶，电压和电流也没问题，蛋白样品也是同一批次，操作也没问题。
想请教一下究竟是哪出了问题，谢谢

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1检查一下内槽电泳液是否淹没加样孔。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:20

本人也最近跑了块胶，结果郁闷中．请各位大侠帮忙分析！
我上了Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５，有３个峰，合并后，用ＢＣＡ法测得蛋白浓度最小的为４００ｕｇ／ｍｌ，然后跑了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＴＲＩＣＩＮＥ胶，却没有带．
下面为跑的图．
ＭＡＲＫ　左面是我的带，只有１　２　有点东西．还不清楚！我也不知道原因，请帮忙啊！郁闷啊

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你所检测的样品是什么蛋白，分子量是多大？每孔样品量是多少？
看1.2.泳道可能是样品处理有问题，建议离心后取上清上样。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:20

我一不小心买了预混合的蛋白质marker,可我不知道该怎么用，想请教大家一下。另外预混合的蛋白质marker和蛋白样品上样电泳后用考马斯亮兰染色后可以直接转膜显色吗？由于是新手，请多关照。

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使用方法不是写的很清楚吗？
1、使用前将蛋白marker混匀，根据实际需要取出一定量的marker置于单独的试管中。用量：mini-gel加7 µl/每次；full length-gel加15 µl/每次
2、将蛋白marker置于95-100°C 3-5分钟
3、快速离心后将marker直接上样，在每个空孔中加入等体积的 1X SDS Loading Buffer以确保移动的均衡性

预染MARKER可以直接用于转膜显色。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:21

我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢。

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用10~12%分离胶的浓度，跑跑看

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:21

请教版主个问题：
我用的是5％浓缩胶，12％分离胶，恒流，25mV浓缩胶,40mV分离胶。5*loading buffer(0.313M Tris-HCl pH 6.8,10% SDS, 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol 0.5M DTT),
Fermentas预染marker。为什么我的marker最后一条11KD带总跑不出来，溴酚兰总和17KD的带在一个水平？？？
望指教，谢谢！！！

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我们前一阶段也遇到类似的问题，你可以把分离胶调整一下，10-15％之间，看看能不能跑出来。
溴芬兰与17KD在一条线上，说明二者没有完全分开，可以提高胶的浓度。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:21

请教楼主：
我最近跑电泳浓缩胶很好，到分离胶后溴酚蓝在前沿有扩散，是为什么呢？电压小了吗？浓缩胶是60V，分离胶是120V。

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应该是弥散吧？这一般是由于分离胶缓冲液pH不准造成的，建议调整一下！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:22

楼主好啊！
我最近碰到了一个难题，我的胶现在怎么也跑不下来，我的marker 下面有26和20KD的，但是最多能够跑道三分之二左右，就怎么也跑不下来了，我的溴芬兰几乎都快跑出去了，急！
谢谢了！

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分离胶浓度偏大，建议用低浓度的试试

作者: ii077345 时间: 2013-6-28 14:22

我是新手,目前正在做蛋白质,我现在碰到的问题在你的文章里说了,也就是电压高,但电流却很低,我用的是10%的分离胶,5%的浓缩胶,电压为80V,但电流只有5mA,120V跑浓缩胶时,电流也只有5mA,跑了10个多小时,你罗列了那么多的原因,我只符合一条,那就是没有把那跟塑料条拔掉.但我们这里也有其他的人不拔塑料条,但他们的电流却比我的要高

作者: plaa 时间: 2013-6-28 14:23

“我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢"
您建议我用10~12%分离胶的浓度，跑跑看
但是我的Marker建议用15%的分离胶，浓缩胶是5%的。而且我师姐摸的条件，她做出来了。麻烦你。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:25

QUOTE:

原帖由 ii077345 于 2013-6-28 14:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是新手,目前正在做蛋白质,我现在碰到的问题在你的文章里说了,也就是电压高,但电流却很低,我用的是10%的分离胶,5%的浓缩胶,电压为80V,但电流只有5mA,120V跑浓缩胶时,电流也只有5mA,跑了10个多小时,你罗列了那么多的 ...

1.如果你制胶的时候是用硅胶条来封闭的话，是一定要去掉的，否则电流无法形成通路。
2.如果硅胶条已经去掉，电压很高，而电流很低的时候，大多就是电泳液少了，同样不能形成电流通路，或通路不好。检查一下内槽或外槽液，是否分别淹没加样孔或电极。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 14:25

QUOTE:

原帖由 plaa 于 2013-6-28 14:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
“我的Marker是七条带的，最小的分子量是14.4KDa,可是每次第七条带都跑不出来，不知什么原因。我要的目的带约17KDa，我提的蛋白中也出不来，是我提的蛋白的事？请帮我分析一下，谢谢"
您建议我用10~12%分离胶的浓度，跑跑看
但是 ...

没有问题的，试验条件做相应的调整，这是很正常的事，关键是结果是否正常。另外你师姐做的很正常，你也可以和他交流一下，毕竟在论坛上讨论的都是大家比较常见的错误，可能针对性差些。如果再有新的问题再讨论。

作者: 831226 时间: 2013-6-28 15:01

分离胶浓度偏大，建议用低浓度的试试

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我的目的蛋白不是二十几，我的蛋白是五六十KD的，但是我觉得我的二十几的marker 不能跑下来的话，我的蛋白就不能保证完全跑开。
不是分子量越小，应该跑更大浓度的胶吗？

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-6-28 15:02

请教一下

日前做western，66kd的蛋白，用的5%浓缩胶，12%的分离胶，电泳80～120V，2.5小时，转膜是用的半干法，电流＝膜长度（cm）*膜宽度（cm）*1.56
，时间1小时。但是结果不理想，估计是转膜的问题，请问用什么样的转膜条件比较合适呢？

作者: dog002 时间: 2013-6-28 15:02

请教一下

目前我在做目标为5000左右的多肽电泳，采用的是Tricine-SDS-PAGE方法。
我想要的多肽一直都跑不出来，甚至配好的标准品（5mg/ml）都跑不出来。
用该方法跑分子量在1.4KD，2KD的样品，都可以跑出清晰的条带。
因为这个方法尝试了好多次，我怀疑是不是标准品在反复冻融的过程中降解了？
另外还有一个奇怪的现象，我的溴芬兰跑的太快了，往往不到60min中就跑到头了

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-28 15:03

QUOTE:

原帖由 dog002 于 2013-6-28 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下

目前我在做目标为5000左右的多肽电泳，采用的是Tricine-SDS-PAGE方法。
我想要的多肽一直都跑不出来，甚至配好的标准品（5mg/ml）都跑不出来。
用该方法跑分子量在1.4KD，2KD的样品，都可以跑出清晰的条带。
因为这个 ...

5000多的多肽确实不好跑出来，不知道你用的是多大浓度的胶？我建议你用15％的分离胶。反复冻溶使样品降解的可能性也有，但我认为你的样品中的可能存在的蛋白酶对其降解作用更大。溴芬兰跑的太快可能是因为电压过高，电泳速度过快了。

作者: dog002 时间: 2013-6-28 15:03

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-6-28 15:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

5000多的多肽确实不好跑出来，不知道你用的是多大浓度的胶？我建议你用15％的分离胶。反复冻溶使样品降解的可能性也有，但我认为你的样品中的可能存在的蛋白酶对其降解作用更大。溴芬兰跑的太快可能是因为电压过高，电泳速 ...

我用的就是15%的胶阿。我的分离胶上是有跑过的痕迹的，但是就是没有条带。我现在觉得问题就是出在电泳条件和样品上。我每次只跑2h,恒流20mA是否有可能多肽已经跑出去了？
如果真是被降解了，应该加什么样的蛋白酶抑制剂？主要是以前没做过蛋白

作者: cj_mondy 时间: 2013-6-28 15:04

谢谢各位的建议：
1 浓度问题：我想应该不是。我冻干后用500ul的水溶（过去至少5毫升，BCA法测蛋白浓度是400ug/ml），取了30ul上样。
2 样品处理问题：我是煮沸3分钟，加了10ul的上样缓冲液，离心（10000rpm 3分钟）后上样
3 小蚁个问的问题：我是由海洋动物中提取的蛋白，是用50%的丙酮沉淀出来的，然后用PBS 复溶的。然后再上SEPHADEX G-75，分离的不同峰。然后再跑电泳。
我想其中应该有多种蛋白啊，分子量也就无法判断了！
望各位再帮忙！

作者: u234 时间: 2013-6-28 15:05

我以前做的SDS-PAGE都没问题，今天却发现样品在浓缩胶（80V）里不能压缩成窄的条带，而是很宽很宽。直到进入分离胶用100V电压才慢慢压成一条线。请问是什么原因？我的buffer都是按要求配的，浓缩胶pH6.8，分离胶8.8啊。另外，我的loading buffer里没加DTT，可以吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-6-28 15:05

我的目的蛋白不是二十几，我的蛋白是五六十KD的，但是我觉得我的二十几的marker 不能跑下来的话，我的蛋白就不能保证完全跑开。
不是分子量越小，应该跑更大浓度的胶吗？

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不知道你是用多大的分离胶来跑的，从你描述的现象来看，应该是蛋白分子量大小与分离胶的浓度不相适应造成的。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 15:07

请教一下

日前做western，66kd的蛋白，用的5%浓缩胶，12%的分离胶，电泳80～120V，2.5小时，转膜是用的半干法，电流＝膜长度（cm）*膜宽度（cm）*1.56
，时间1小时。但是结果不理想，估计是转膜的问题，请问用什么样的转膜条件比较合适呢？

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转膜出现了什么问题呢？说的详细一点，看看能不能帮上您。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 15:07

我用的就是15%的胶阿。我的分离胶上是有跑过的痕迹的，但是就是没有条带。我现在觉得问题就是出在电泳条件和样品上。我每次只跑2h,恒流20mA是否有可能多肽已经跑出去了？
如果真是被降解了，应该加什么样的蛋白酶抑制剂？主要是以前没做过蛋白

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看看溴芬兰是否跑出去了呢？其分子量要比你的目标蛋白小，保证他没跑出去，应该没有问题的。可能的话，把你图贴上来看看。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 15:08

谢谢各位的建议：
1 浓度问题：我想应该不是。我冻干后用500ul的水溶（过去至少5毫升，BCA法测蛋白浓度是400ug/ml），取了30ul上样。
2 样品处理问题：我是煮沸3分钟，加了10ul的上样缓冲液，离心（10000rpm 3分钟）后上样
3 小蚁个问的问题：我是由海洋动物中提取的蛋白，是用50%的丙酮沉淀出来的，然后用PBS 复溶的。然后再上SEPHADEX G-75，分离的不同峰。然后再跑电泳。
我想其中应该有多种蛋白啊，分子量也就无法判断了！
望各位再帮忙！

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400ug/ml是层析前的浓度还是层析后的浓度？

作者: xue258 时间: 2013-6-28 15:08

层析前为5mg/ml ，400是层析后

作者: tie8 时间: 2013-6-28 15:09

请问：Tricine-SDS-PAGE与SDS-PAGE的区别是否只在二者的电极缓冲体系不同？在胶的配方以及实验方法上则是一样的？
谢谢！

作者: mickeylin 时间: 2013-6-28 15:09

转膜出现了什么问题呢？说的详细一点，看看能不能帮上您。

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转膜不是很成功的样子，我们用的是硝酸纤维素膜，丽春红染色之后，条带颜色非常淡，用清水很容易洗脱，其他组的有出现即使用PBS洗几次都无法洗脱，不知道原因。

不知道是转膜转上的蛋白比较少，还是其他什么原因

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:10

400ug/ml是层析前的浓度还是层析后的浓度？

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两点建议：
1、检查你的电泳系统有没有问题，比如染色液，脱色液有没有问题，这些溶液使用时间过长会导致着色效果差，降低分辨率。
2、400ug/ml，30ul/孔，蛋白量应该是足够了。不知您用的上样buffer是多少倍的，用10ul至少要4X的，否则可能会使电泳蛋白不能充分变性。随着层析收集样品浓度的变化，电泳时会出现条带由深到浅的变化。如果调整后还不能检测到蛋白，那就可能是您的层析有问题了。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-6-28 15:10

注：SDS为阴离子型去垢剂

作者: star#room 时间: 2013-6-28 15:11

这几天的westerblot实验很郁闷。转膜后染色条带极其清晰，但最后显色就是空白。一、二抗体不存在质量问题。不存在快速粹灭的问题（因每次显影后都是立即观察。蛋白是培养的细胞直接用裂解液加loading buffer提取。煮沸后取上清。请教版主出现这种情况的原因会有哪些呢？

作者: jujuba 时间: 2013-6-28 15:11

请教各位高手一个问题：
我老板说，跑电泳的时候尽量的让溴芬兰跑到底，因为在溴芬兰前面的在染色的时候是染不上色的：
请教各位高手，这是为什么？
　　　附：溴酚蓝
英文名称:BromophenoBlue
别名:四溴苯酚磺酞
分子式:C19H10Br4O5S
分子量:669.97
产品性状:近似黄色或浅玫瑰色结晶性粉末，微溶于水及乙醚，溶于乙醇或稀碱液及氨液中呈蓝色。
用途:酸碱指示剂；非水滴定用指示剂，蛋白电泳染色；病毒化验等。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:12

请问：Tricine-SDS-PAGE与SDS-PAGE的区别是否只在二者的电极缓冲体系不同？在胶的配方以及实验方法上则是一样的？
谢谢！

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搜索了一下，有很多相关的帖子，自己看看！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/5858728')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1387944_1.html')

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:12

转膜不是很成功的样子，我们用的是硝酸纤维素膜，丽春红染色之后，条带颜色非常淡，用清水很容易洗脱，其他组的有出现即使用PBS洗几次都无法洗脱，不知道原因。

不知道是转膜转上的蛋白比较少，还是其他什么原因

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建议学习以下两贴：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=319173&sty=1&tpg=1&age=-1')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1609587_1.html')

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:13

这几天的westerblot实验很郁闷。转膜后染色条带极其清晰，但最后显色就是空白。一、二抗体不存在质量问题。不存在快速粹灭的问题（因每次显影后都是立即观察。蛋白是培养的细胞直接用裂解液加loading buffer提取。煮沸后取上清。请教版主出现这种情况的原因会有哪些呢？

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转膜后直接用DAB显色有问题吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:15

请教各位高手一个问题：
我老板说，跑电泳的时候尽量的让溴芬兰跑到底，因为在溴芬兰前面的在染色的时候是染不上色的：
请教各位高手，这是为什么？
　　　附：溴酚蓝
英文名称:BromophenoBlue
别名:四溴苯酚磺酞
分子式:C19H10Br4O5S
分子量:669.97
产品性状:近似黄色或浅玫瑰色结晶性粉末，微溶于水及乙醚，溶于乙醇或稀碱液及氨液中呈蓝色。
用途:酸碱指示剂；非水滴定用指示剂，蛋白电泳染色；病毒化验等。

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溴芬兰前面的是什么意思？

作者: yes4 时间: 2013-6-28 15:19

溴芬兰前面的是什么意思？

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跑电泳时,因溴芬兰有色,多数时候我们常在溴芬兰跑到分离胶快到头时停止.如果当其跑到分离胶一半时就停,这个时候溴芬兰和分离胶的前端有一半"没跑的"分离胶,这个就是我说的"溴芬兰前面".

老板说即便有蛋白也不会染上色,我想问有人知道原因吗?或者说是我们老板错了.
个人理解,因为溴芬兰的分子量约为668,如果有蛋白跑到其前面,那么分子量多会小于668.即是说为小于6个氨基酸的肽,这和肽染色的话会和普通蛋白有差别.不易上色!

所以在跑电泳时尽量的让溴芬兰跑到分离胶的头!
个人理解,仅抛砖引玉之见!

作者: ROSE李 时间: 2013-6-28 15:20

请问楼主：
本人刚开始实验，问些很菜的问题：
40%丙烯酰胺和30%的丙烯酰胺有何差别？
丙烯酰胺和SDS的比例为： 37.5 ：1与19：1 以及29：1时又有何区别?
我的目的蛋白为42、44KD该选何种浓度及何种比例的SDS-PAGE？

作者: junjie05 时间: 2013-6-28 15:20

转膜后直接用DAB显色有问题吗？

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没试过DAB显色，我用的是ECL显影压片。ECL不存在质量问题。

作者: 8s5g 时间: 2013-6-28 15:21

请问跑完SDS-PAGE由于实验室试剂混淆，估计是把乙醇当作甲醇配了脱色液进行了脱色，这样是否会影响结果呢，甲醇在脱色液中起什么作用，误用乙醇会有什么后果？急！！！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:23

我要说的意思是:跑电泳时,因溴芬兰有色,多数时候我们常在溴芬兰跑到分离胶快到头时停止.如果当其跑到分离胶一半时就停,这个时候溴芬兰和分离胶的前端有一半"没跑的"分离胶,这个就是我说的"溴芬兰前面".

老板说即便有蛋白也不会染上色,我想问有人知道原因吗?或者说是我们老板错了.
个人理解,因为溴芬兰的分子量约为668,如果有蛋白跑到其前面,那么分子量多会小于668.即是说为小于6个氨基酸的肽,这和肽染色的话会和普通蛋白有差别.不易上色!

所以在跑电泳时尽量的让溴芬兰跑到分离胶的头!
个人理解,仅抛砖引玉之见!

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两种染色方法的原理：考染是考马斯亮蓝R-250，它含有两个酸性SO3H基团，可与蛋白的碱性基团结合而显色，而银染是蛋白与银离子结合后，在碱性条件下，甲醛将结合在蛋白带上的银离子还原为金属银,沉积在蛋白上。
不存在您所说的肽染色与蛋白质染色的差别。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:24

请问楼主：
本人刚开始实验，问些很菜的问题：
40%丙烯酰胺和30%的丙烯酰胺有何差别？
丙烯酰胺和SDS的比例为： 37.5 ：1与19：1 以及29：1时又有何区别?
我的目的蛋白为42、44KD该选何种浓度及何种比例的SDS-PAGE？

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丙烯酰铵溶液浓度高的话会影响凝胶的硬度和胶孔的大小，从而影响凝胶的分辨率。
丙烯酰铵与SDS比例无必然的关系，前者是与凝胶分辨能力有关，后者是与蛋白线形分子的结合能力有关。
42kd左右选择30％丙烯酰铵、10-12％分离胶、5％浓缩胶浓度就可以满足要求了！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:25

请问跑完SDS-PAGE由于实验室试剂混淆，估计是把乙醇当作甲醇配了脱色液进行了脱色，这样是否会影响结果呢，甲醇在脱色液中起什么作用，误用乙醇会有什么后果？急！！！

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没有找到相关的资料，个人认为，应该问题不大，考马斯亮篮难溶于水，可溶于有机溶剂中，甲醇在其中应该只是起促进水溶解考马斯亮篮的能力，而乙醇也具有这样的能力。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:25

请教:我在做细菌LPS的PAGE,电泳后选择银染.我不知道LPS银染后应该是什么颜色,我的样品跑出来有几种颜色的带,其中样品里面可能有蛋白和核酸,我都不知道哪条是LPS带了.有谁做过LPS的PAGE啊,有图吗?我在网上找了好久都没有找到有彩色的图~

作者: popo520 时间: 2013-6-28 15:26

请教楼主：
　　如何跑小分子量的蛋白，是用用Ｔｒｉｃｉｎｅ胶吗？具体如何做？配方及注意事项是什么？染色及脱色有什么特殊的吗？
　　我想跑小于１５ＫＤ，大约１０ＫＤ左右！
　　如有参考书什么的，请给两篇！
　　　谢谢！

作者: wu11998866 时间: 2013-6-28 15:26

刚做western请教一个电泳得问题,蛋白为30kd,5%浓缩胶,12%分离胶,电压为80v,到分离胶改为100v,一共跑一个半小时溴粉蓝就到底了,考染发现蛋白根本没跑下来,只在胶中部有条带,上部象是蛋白没分开,这次没跑mark,因为前几次这样mark一直很好,原来这样得条件分得很好，不知道现在为什么,请指教!
多谢!

作者: youyou99 时间: 2013-6-28 15:27

请问楼主：
我看郭尧君老师的书上说，在sds－page 时。样品融解后分装。但是使用前还要加适量的巯基乙醇。这个适量的是多少量呢？

作者: youyou99 时间: 2013-6-28 15:33

还要请问楼主：
样品溶解液的体积跟蛋白样品量的关系如何呢？

作者: bling 时间: 2013-6-28 15:34

我最近跑电泳，溴芬兰的带总是很宽，以前从没有出现过这种问题，不知什么原因？但跑出来的带还很好，因为我要转膜切胶时很难办，因为溴芬兰的带太宽，请楼主帮忙！

作者: okhaha 时间: 2013-6-28 15:35

为什么我老师配胶在插梳后等其凝固胶少了一个梳孔的体积?

作者: www.1 时间: 2013-6-28 15:35

小妹刚做WB，做到转膜后用丽春红染色，蛋白条带很清楚，但是用一抗二抗和AB液后，就是不见荧光，也不能显影。
一抗师姐刚用过，二抗和AB液我们用直接在NC膜上加二抗和AB液试过，荧光很明显。
实在不知什么原因，请多指教。

作者: fox_79 时间: 2013-6-28 15:36

最近PAGE时，总是会出现很多横的竖的条带，没有上样的孔也有这种现象出现，不知时是什么原因，请赐教，谢谢!

作者: gmjghh 时间: 2013-6-28 15:36

请问楼主,我最近做了一个SDS-PAGE电泳,有甘氨酸和磷酸盐的样品和没有甘氨酸和磷酸盐的样品作对照,上样量都是5微克,我染色用的是银染,可结果很不理想,没有甘氨酸和磷酸盐的样品的带特别清楚,而有甘氨酸和磷酸盐的样品的带不但模糊而且带形和量只有没有甘氨酸和磷酸盐的样品的带的十分之一.这是什么原因造成的呢?

作者: applebook=213 时间: 2013-6-28 15:37

急!请教楼主,预染的marker应该有六条带,但只出来了分子量大的三条带,小分子量的都和溴芬蓝在一起分不开,怎么办?

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:39

请教楼主：
　　如何跑小分子量的蛋白，是用用Ｔｒｉｃｉｎｅ胶吗？具体如何做？配方及注意事项是什么？染色及脱色有什么特殊的吗？
　　我想跑小于１５ＫＤ，大约１０ＫＤ左右！
　　如有参考书什么的，请给两篇！
　　　谢谢！

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可参考一下郭尧君的蛋白质电泳技术一书

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:40

刚做western请教一个电泳得问题,蛋白为30kd,5%浓缩胶,12%分离胶,电压为80v,到分离胶改为100v,一共跑一个半小时溴粉蓝就到底了,考染发现蛋白根本没跑下来,只在胶中部有条带,上部象是蛋白没分开,这次没跑mark,因为前几次这样mark一直很好,原来这样得条件分得很好，不知道现在为什么,请指教!
多谢!

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应该是分离胶的问题，可检查一下浓度！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:40

请问楼主：
我看郭尧君老师的书上说，在sds－page 时。样品融解后分装。但是使用前还要加适量的巯基乙醇。这个适量的是多少量呢？

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可直接加上样buffer处理后分装，我的配方我记不得了！你需要的话，我回头帮你查查，或直接在园子里search一下！

作者: vera+ 时间: 2013-6-28 15:40

这几天的westerblot实验很郁闷。转膜后染色条带极其清晰，但最后显色就是空白。一、二抗体不存在质量问题。不存在快速粹灭的问题（因每次显影后都是立即观察。蛋白是培养的细胞直接用裂解液加loading buffer提取。煮沸后取上清。请教版主出现这种情况的原因会有哪些呢？

转膜后直接用DAB显色有问题吗？

试一试DAb

作者: 079777chao 时间: 2013-6-28 15:41

western新手，操作2月。
发光试剂盒采用百泰克的，刚开始做的时候，将发光试剂（B液即避光保存的那个，要用双氧水提前活化）倒在膜上肉眼未见荧光，显影是弥漫未见条带。
1星期前，二抗之后又杂三抗，TBS摇床洗10分钟×3次，将发光试剂倒于膜上，压片时可见膜上弥漫荧光，压片2分钟，显影5秒暗室红光下见胶片变黑。日光灯下可见高背景下的条带，较淡。
现在操作，将B液活化时间稍延长，约30秒吧，A液B液混合后30秒左右倒在膜上就可见弥漫的荧光，压片时间一样2分钟，显影5秒后胶片同前，但均匀黑色，无条带。

园子里查相关帖子，提示抗体的浓度太高，今天试了一个最高1：2500，一个最低1：5000的二抗浓度，都是弥漫荧光肉眼可见。我的一抗浓度1：250，santa的
肉眼可见荧光是好还是不好，我应该怎么作，

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:43

还要请问楼主：
样品溶解液的体积跟蛋白样品量的关系如何呢？

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您说的样品溶解液应该是上样buffer吧？没有什么很直接的量化数据可供您参考，一般是按照分子克隆或其它实验指导书上所说的成熟的上样buffer配方配制，然后按照一定的比例添加，由于其中的SDS、DTT等一般是过量的，可以满足实验的要求。如果蛋白浓度太高的话，可能要做稀释，否则太高的浓度也会影响电泳效果！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:58

我最近跑电泳，溴芬兰的带总是很宽，以前从没有出现过这种问题，不知什么原因？但跑出来的带还很好，因为我要转膜切胶时很难办，因为溴芬兰的带太宽，请楼主帮忙！

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缓冲液的问题，重配分离胶的制胶缓冲液，并调整其pH8.9左右。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:58

请问楼主,我最近做了一个SDS-PAGE电泳,有甘氨酸和磷酸盐的样品和没有甘氨酸和磷酸盐的样品作对照,上样量都是5微克,我染色用的是银染,可结果很不理想,没有甘氨酸和磷酸盐的样品的带特别清楚,而有甘氨酸和磷酸盐的样品的带不但模糊而且带形和量只有没有甘氨酸和磷酸盐的样品的带的十分之一.这是什么原因造成的呢?

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主要是破坏了原有pH浓度，导致样品不能很好浓缩。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 15:59

急!请教楼主,预染的marker应该有六条带,但只出来了分子量大的三条带,小分子量的都和溴芬蓝在一起分不开,怎么办?

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调整分离胶的浓度。

作者: eric930 时间: 2013-6-28 16:00

试一试DAb

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请问：为什么要试DAB呢，有什么讲究么？
我的那一批样品就是做不出来，后来同时试了其它的的样品可以做出来。真是有点怪。

作者: DONT 时间: 2013-6-28 16:01

分子克隆上说，用1×loading buffer上样，1×loading buffer怎么用阿？如果是2×，是样品和loading buffer同样体积混合，请问1×的怎么办？
我提取了内皮细胞的总蛋白，方法：lysis buffer加入然后机械匀浆，离心15min,上清即为总蛋白。
想跑胶检测下条带，用了10%的SDS-PAGE，按照分子克隆上的1×loading buffer的剂量加倍做成了2×loading buffer，然后样品和2×loading buffer等量混合100度3min,然后上样。在样品孔的两侧的孔中各加了20ul 2×loading buffer跑胶。。结果在5%浓缩胶中，溴酚兰就变得很宽，看起来各个孔的样品像融合了似的，只加了loading buffer的孔也是同样的情况，为什么会这样呢？浓缩胶的问题还是我配的2×loading buffer的问题？ 2×loading buffer成分：100mMThis-cl, 4%SDS, 0.2%BPB,20%glycerol,200mM b-mercaptoethanol (分子克隆上用的200mMDTT，我改成200mM b-mercaptoethanol 了）
最终只用了一个半小时，溴酚兰就跑到最底部了，电压分别为80v和120v

作者: kulee 时间: 2013-6-28 16:02

请问楼主：
刚刚开始实验，发现浓缩胶和分离胶没有连在一起，浓缩胶：5%，分离胶：10%，分离胶灌好后室温静置30分钟，然后加水封上，4度过夜，次日去水再灌浓缩胶，为什么它们是分开的，没有连在一起？

作者: kulee 时间: 2013-6-28 16:02

再问楼主一个问题：
我提取的蛋白和2*的上样缓冲液混合后，出现絮状沉淀。上样缓冲液没问题，请问是什么原因造成蛋白沉淀呢？
谢谢！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-28 16:03

请问LZ，我做WESTERN BLOTTING，跑出来的beta-actin竟然在marker50kD的位置，而说明书上写应该是42，几次都是这样，我的beta-actin放在最靠边的道上，跟我一起做的，条件和用的marker、beta-actin的一抗都跟我是一样的，可做出来就是42的。
是什么问题？
感谢感谢！万分头大！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 16:03

分子克隆上说，用1×loading buffer上样，1×loading buffer怎么用阿？如果是2×，是样品和loading buffer同样体积混合，请问1×的怎么办？
我提取了内皮细胞的总蛋白，方法：lysis buffer加入然后机械匀浆，离心15min,上清即为总蛋白。
想跑胶检测下条带，用了10%的SDS-PAGE，按照分子克隆上的1×loading buffer的剂量加倍做成了2×loading buffer，然后样品和2×loading buffer等量混合100度3min,然后上样。在样品孔的两侧的孔中各加了20ul 2×loading buffer跑胶。。结果在5%浓缩胶中，溴酚兰就变得很宽，看起来各个孔的样品像融合了似的，只加了loading buffer的孔也是同样的情况，为什么会这样呢？浓缩胶的问题还是我配的2×loading buffer的问题？ 2×loading buffer成分：100mMThis-cl, 4%SDS, 0.2%BPB,20%glycerol,200mM b-mercaptoethanol (分子克隆上用的200mMDTT，我改成200mM b-mercaptoethanol 了）
最终只用了一个半小时，溴酚兰就跑到最底部了，电压分别为80v和120v

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1×的是按样品：buffer＝1：1混合，2×的是buffer为样品的一半体积，即样品：buffer＝2：1。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 16:04

请问楼主：
刚刚开始实验，发现浓缩胶和分离胶没有连在一起，浓缩胶：5%，分离胶：10%，分离胶灌好后室温静置30分钟，然后加水封上，4度过夜，次日去水再灌浓缩胶，为什么它们是分开的，没有连在一起？

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应该是封胶的水没有完全吸干的缘故。

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 16:05

再问楼主一个问题：
我提取的蛋白和2*的上样缓冲液混合后，出现絮状沉淀。上样缓冲液没问题，请问是什么原因造成蛋白沉淀呢？
谢谢！

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你的蛋白的等电点是不是与buffer的pH相近啊？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-6-28 16:06

我要做的两个蛋白质的分子量分别为198KD和289KD，电泳的时候要注意些什么呢？
以前没有搞过这方面的东西，盼望大侠指点。谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-6-28 16:07

我要做的两个蛋白质的分子量分别为198KD和289KD，电泳的时候要注意些什么呢？
以前没有搞过这方面的东西，盼望大侠指点。谢谢

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大分子量蛋白质电泳应注意分离胶和浓缩胶的浓度，可用浓缩胶2.5%-3%，分离胶5%试试，其他操作与普通蛋白质电泳相同。

作者: 暗香涌 时间: 2013-6-28 16:08

单体没有问题的话我个人倾向于认为AP有点问题。我最近也碰到这个问题，AP容易潮解，可能容易变质。配的时候要充分的混匀。AP和TEMED不能加得太多，尤其是TEMED不能加太多。一般胶凝固时间以1h左右为好。加太多胶凝固太快，凝固的不均匀，分辨率会受到很大的影响，而且，胶凝固太快的话，像Marker等可能就会有“鬼带”出现，也就是某些条带下面会多出一两条条带。15％的胶跑30和45KD的蛋白应该可以了，注意跑的时候电压不要太高，不要跑太快，如果还想要提高分辨率的话，推荐跑梯度胶，10－17.5％，但是要小心，浓度太高胶很脆，剥胶的时候别剥破了。

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TEMED加少了反而容易凝固

作者: 暗香涌 时间: 2013-6-28 16:10

不知道是不是因为浓缩胶没凝好（但是等了近1个小时应该凝固了），拔梳子时会把样品槽拔坏，连续好几次了，很郁闷，请教解决办法

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拔的时候因为里面有气体,所以有时会弄坏样品槽.
你可以在拔梳子的时候往样品槽中加入水.

作者: 暗香涌 时间: 2013-6-28 16:13

最近做的western总是出现一些问题，请各位战友及版主给予解答：

1、我用的是Bio-Rad的装置，0.75mm胶，全细胞裂解液，每孔上样15ul，总蛋白约25ug。半干转膜，目的蛋白约88KD，0.8mA/cm2恒流转膜1.5小时。但是最近2次总是转膜很不完全，转移缓冲液是按照分子克隆的配方（2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS、200ml甲醇，加水至1L），低分子量的还好，高分子量转的很不完全，见附图。（PVDF膜和NC膜都是如此）
2、因为是细胞的内源性膜蛋白，可能量比较少，最后western出来的条带都比较弱。15ul的上样量应该不多，而且总蛋白也没有超载，但最后的条带都有点手牵手，实在搞不清楚是怎么回事。
3、细看显色的条带，好像颜色很不均一，深一块、浅一块的，这是为什么呀？（上面的是目的条带，下面的是actin）。目的条带还有双眼皮，但因为是一个泳道直接下来的，按照分子量从中间剪开分别孵育抗体的，是不是能排除电泳的问题呢？

请各位战友多多帮助！不胜感激！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16892

作者: IAM007 时间: 2013-6-28 16:17

我的样品到分离胶后，在稳压的情况下，电流增大，由30mA逐渐增为140mA，结果是样品条带很清楚，但是没有跑下来，集中在分离胶的上、中部位。不知是何缘故？真急人哪

作者: one 时间: 2013-6-28 16:18

tricine－sds尿素，跑浓缩胶稳压１５０v，开始电流４０mＡ
（８＊１０cm两板）电流逐渐变小，一个小时后，只有１０mＡ，这算正常吗．

作者: langlang 时间: 2013-6-28 16:18

请问我跑SDS-PAGE时泳道之间总是相互影响很大,甚至完全偏向另一泳道,这是什么原因,我跑的胶为15%的分离胶,样品已经利用Tris-HCl(8.0,0.05M)透析处理,谢谢.

作者: bring 时间: 2013-6-28 16:19

大家好，我现在要做分子量4KD的蛋白的SDS-PAGE，这是我的电泳图，，溴酚蓝已经跑到了板底，不知道是什么原因，左边marker下面的两条带看不到，右边是我的样品，大家能不能帮我分析一下，优化一下条件呀，一个星期了总是不成功，另外我的上样量10ug，是不是少了？

图片附件: 22894939.jpg (2013-6-28 16:19, 52.64 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16893

作者: jrwyyplt 时间: 2013-6-28 16:19

楼上的应该是电泳时间比较长，小分子的蛋白跑到最后扩散了，所以看不见最后2条带了。建议溴酚蓝跑到电泳胶的中间偏下一点就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 16:20

tricine－sds尿素，跑浓缩胶稳压１５０v，开始电流４０mＡ
（８＊１０cm两板）电流逐渐变小，一个小时后，只有１０mＡ，这算正常吗．

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电泳时，电流出现一些变化，一般是正常的，检查一下是否影响您的实验结果，如果没什么影响，可以不用管它。

作者: NBA 时间: 2013-6-28 16:21

请问我跑SDS-PAGE时泳道之间总是相互影响很大,甚至完全偏向另一泳道,这是什么原因,我跑的胶为15%的分离胶,样品已经利用Tris-HCl(8.0,0.05M)透析处理,谢谢.

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胶不均匀，或样品浓度差别过大，可导致泳道变形

作者: NBA 时间: 2013-6-28 16:21

大家好，我现在要做分子量4KD的蛋白的SDS-PAGE，这是我的电泳图，，溴酚蓝已经跑到了板底，不知道是什么原因，左边marker下面的两条带看不到，右边是我的样品，大家能不能帮我分析一下，优化一下条件呀，一个星期了总是不成功，另外我的上样量10ug，是不是少了？

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带靠的太紧了，与分离胶浓度过高有关，可调低一点分离胶浓度试试！

作者: wsll 时间: 2013-6-28 16:21

背景太浓：
最近一段时间做western ，发现压片后背景色很浓，以前的条件（那时基本没有背景）与现在做的一样（一抗二抗的比例），封闭的时间足够长，洗膜是10min×4次，可是总是发现背景很深，也不知是什么缘故，会不会是提蛋白过程出现问题，还是洗膜的时间不够长？

作者: 2541 时间: 2013-6-28 16:22

谢谢楼主！我想问个转膜的问题，我做的蛋白分子量100KD左右，用200mA电流转100min，这样行不？我看人家的marker转过来好像比我浓，还有封闭时一般需封闭多少时间？

作者: xue258 时间: 2013-6-28 16:24

楼主您好，我在做一个19KD左右的目的蛋白，用12%的胶跑的，但每次跑胶的时候溴芬兰跑进分离胶一厘米后就开始变的有点弥散了，开始怀疑是我的胶的问题，后来用别人的胶跑也是这样的情况。不过MARKER跑的还是可以，染胶后跑的结果也还过的去，不过一直还是没做出我的目的条带，不知道是转膜的原因还是其他，总是在50KD左右出现一条比较亮的非目的条带，而且背景比较干净，我现在都开始怀疑我的抗体了。希望楼主能给小弟提点建议，我现在真的急啊！！！

作者: zwsyrt 时间: 2013-6-28 16:27

请各位帮忙看看我的这张电泳图，很奇怪的目的蛋白，怎么就跑成那样了啊？

作者: INK 时间: 2013-6-28 16:27

我的蛋白质样品加上5×loading buffer(汪家政蛋白手册上的配方），90度5分钟之后出现了颗粒沉淀，请问这是怎么回事啊？？

作者: @STAR@ 时间: 2013-6-28 16:28

楼主帮我看看我的电泳照片吧。跑来好多次了，一直是这样！很多莫名的横带。电泳液是新的！靠边的两个孔都没有上样，连MARKER的泳道里都有！郁闷！

图片附件: 67450173.snap.jpg (2013-6-28 16:28, 14.28 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16894

作者: 98776langtao 时间: 2013-6-28 16:29

我最近在做GUS-GM-CSF融合蛋白在烟草中的表达,我用组织染色法确定叶片中有GUS蛋白,而且表达量也挺大的.提取的蛋白样品也用凝胶荧光检测到有GUS蛋白,但是SDS-PAGE之后,但与未转烟草对比,却看不到差异条带,这是什么原因?怎么解决呀?哪位楼主给点意见,不胜感激!!

作者: hold住 时间: 2013-6-28 16:33

我做27KD蛋白，用15%胶，可溴酚兰已跑到胶底部，但蛋白却仅跑一半。我用的Tris－HCL缓冲系统的浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8，不知怎么改进。谢谢。

作者: yonger 时间: 2013-6-28 16:34

急求：请教Tricine-SDS-PAGE胶时样品缓冲液中加入酚红与SDS-PAGE中加入溴酚蓝一样都是作为指示吗？哪Loading Buffle里还需要加入溴酚蓝吗？谢谢！

作者: qumm1985 时间: 2013-6-28 16:34

请教：菌液离心除去菌体，取上清，由于其中蛋白质浓度太低，经SDS-PAGE，看不到条带。所以将上清真空减压浓缩20多倍，浓缩液的蛋白含量约为一点几mg/ml,进行SDS-PAGE。
样品在浓缩胶部分较难浓缩，蓝色的带一直比较宽，其他同学的样品都浓缩成窄窄的一条篮带，我的有他们的两三倍宽。继续跑时，过会看到蓝带的前后都有黄色的物质。染色脱色后，竟然没有条带，不知何故，请楼主指教，万分感谢！

作者: 子衿青青 时间: 2013-6-28 16:37

背景太浓：
最近一段时间做western ，发现压片后背景色很浓，以前的条件（那时基本没有背景）与现在做的一样（一抗二抗的比例），封闭的时间足够长，洗膜是10min×4次，可是总是发现背景很深，也不知是什么缘故，会不会是提蛋白过程出现问题，还是洗膜的时间不够长？

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最近又重新提蛋白做了一次，发现好多了，一抗二抗的稀释浓度也没有改变，我觉得可能是提蛋白的过程出现了问题，大概是细胞裂解的时间不够长，或者是细胞裂解夜的量太大了导致目的蛋白的浓度变小了，也有可能是离心的时间不够长，我觉得差不多就是这几个原因了，反正现在问题是解决了，哈哈，顺便提一句，版主好久不来了啊。

作者: ero11 时间: 2013-6-28 16:38

请问：我的样品用Folin-酚法测得蛋白浓度为1mg/ml，可是跑SDS-Page时上样量的达到100ul才能看得见样品。如果上样20ul什么也看不见，我的蛋白是碱性蛋白，Loading buffer是2*的。染色液没问题，Marker染的很好。请问这是什么原因？

作者: ero11 时间: 2013-6-28 16:39

大家好，我刚做实验步久，有问题请教大家，请问：现在急需免疫小鼠，所以决定切胶，请问具体操作是怎样得啊？
1）跑PAGE的上样量应该怎样？样品还是要用2×SDS-PAGE上样缓冲液处理后再上样，是吗？
2）一般检测时候，我只上15微升的样品，现在需要抠胶，那么是否得增大上样量？
3）用考马斯亮兰染色后再切的胶，影响是否会很大？
4）切下的胶应该怎样处理，是直接把切下的胶埋到小鼠腹腔，还是用上面方法把蛋白透析出来呢？
5）一般用这种方法得切多少胶？我想免疫8只小鼠？

作者: yes4 时间: 2013-6-28 16:40

我没有做过动物的，我做的是植物蛋白的PAGE，（1）上样量跟你所用的胶的大小有关吧，想BIO-RAD mini型的最大上样量也就是25微升。PAGE胶是非变性胶，所以上样缓冲液里不加SDS，其余的同SDS-PAGE（2）只要你的梳子孔够大可以加大上样量吧（3）你可以用考马斯亮蓝染一个泳道的，然后剩下的胶和它对照着切，要是都染了的话我认为应该有影响吧
剩下的那两个问题我就不知道了，呵呵
这些是我的一些观点，我也是个跑电泳的新手吧，不知道这些问题解答的怎么样，呵呵

作者: ero11 时间: 2013-6-28 16:40

我现在在是把胶直接切下来（其中一条带and marker用考马斯亮兰蓝色，对准后切胶，染色后的胶会缩小一点。）放入1.5mlE管中，加入约700ul的PBS捣碎，用封口膜将口封住，再把它们放在4度冰箱里的脱色摇床上快速振荡（230/分），12h和24h后分别收样，走电泳，看效果。

作者: wu11998866 时间: 2013-6-28 16:44

我是新手，我的蛋白是120KD，用7.5%分离胶，5%积层胶，转膜时9V恒压半干转3小时，转完考染发现所有蛋白都没转过去，请各位不吝指教。
注：我实验室只有一个仪器，输出电压恒定，不能调整

作者: idea2011 时间: 2013-6-28 16:45

我的课题是纯化一个真菌产的膜结合的酶蛋白，这个蛋白的疏水性比较强，离子性较弱。为了维持蛋白的活性，我在缓冲液中加了0.1%的非离子型表面活性剂（Triton X－100）。如果缓冲液里不加表面活性剂，那么目的蛋白在缓冲液中的溶解度非常低，超滤浓缩时甚至有部分目的蛋白会析出。表面活性剂的存在对蛋白的纯化没有影响，但是在SDS－PAGE分析中却出现了问题。
这几次在蛋白电泳分析时都出现了同样的现象---胶上的条带非常非常不清楚。SDS－PAGE分离胶的浓度是12.5％，浓缩胶的浓度是5％。据我个人分析，应该是表面活性剂起了一定的干扰作用，因为在SDS——PAGE上样前，我把较纯的蛋白冻干浓缩了10-20倍（如果不浓缩，那么蛋白量达不到显色的要求），这样表面活性剂业随着浓缩了10－20倍，即表面活性剂的浓度变成1％-2％。
有资料报道说应该在电泳A液中加少量的Triton X－100，但是绝大多数的报道并没有提到有什么特殊的处理步骤。

作者: ROSE李 时间: 2013-6-28 16:45

我最近在做脑组织的P-CREB的western blotting
提样方法是直接用1乘的SDS上样缓冲液，按1：10的体积加，之后超声裂解10s，而后直接沸水煮沸后，10000g离心5min，之后上样，结果条带很散，后来每次上样之前10000g离心5min，发现底部有沉淀，再上样跑了一次，发现好了一点，之后再这样重复，条带总是很丑，很难看。
我自己分析可能离心时间和速度不够，毕竟是组织的，杂质较多，导致条带很丑，因为一般组织的离心都15000转，10-20min左右。第二个在一乘的上样缓冲液中加入一些氟化钠，原钒酸钠，蛋白酶抑制剂。请各位指教一下。

作者: bamboo16 时间: 2013-6-28 16:48

我是新手，我想请教几个问题：

1、我做的是膜蛋白，其片段从20kd到100kd都有，请问15%的的分离胶能行吗？因为我的Marker是宽分子量的，6kd~200kd。

2、前辈们有直接用菌体蛋白来跑SDS的吗？可以给点经验之谈吗，例如怎么处理样品、上样量多少合适之类的。。

3、能把胶上的目的条带切下来直接去功毒吗？如果可以，具体的方法能传授一下吗 ?

作者: bamboo16 时间: 2013-6-28 16:50

今天不知道怎么回事，前两天都能用的样品，今天上样时怎么也沉不到孔底，，是怎么回事啊。。是不是我冻融了两三次的原因？有什么办法没有啊？加甘油行不行？　

作者: redbutterfly 时间: 2013-6-28 16:51

谢谢楼主整理的资料和精心的解答
我也有一个问题：现在我做的胶总是出现皱眉”（两边向下中间鼓起）现象，您说是两板之间的底部间隙气泡未排除干净，可以可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。我想知道，在灌胶之前先把缓冲液加入然后就开始灌胶，不能再把缓冲液倒掉，是这样的吗？
Thank you very much!

作者: 3648755 时间: 2013-6-28 16:51

在调电极缓冲液时加入很多NAOH才调到8.3,过多的NAOH对跑胶有影响吗

作者: any333 时间: 2013-6-28 16:53

请问:我最近跑sds-page 溴酚蓝条带和蛋白带很接近,有的甚至在溴酚蓝条带的前面,是何原因呢?

作者: duoduo 时间: 2013-6-28 16:53

没有关系，该加多少就加多少，关键是浓缩胶缓冲液的pH调整到6.8，这很关键，每次调pH时，注意校正pH计。

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在调电极缓冲液时加入很多NAOH才调到8.3,过多的NAOH对跑胶有影响吗

作者: duoduo 时间: 2013-6-28 16:55

若您的溴酚兰跑到底了，那么就是一些小肽，分子量比溴酚兰大不了多少。
也有一种可能是玻璃板没有刷干净，玻璃表面可能带有一些蛋白，这些蛋白
可能也会跑在溴酚兰之前。另外，缓冲液最好过滤后使用。

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请问:我最近跑sds-page 溴酚蓝条带和蛋白带很接近,有的甚至在溴酚蓝条带的前面,是何原因呢?

作者: okhaha 时间: 2013-6-28 16:55

急问：
国产电泳仪什么牌子比较好
我们想作SDSPAGE
还有核酸蛋白接受仪什么牌子比较好阿

作者: vvmmoy 时间: 2013-6-28 16:58

六一厂的还可以。

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急问：
国产电泳仪什么牌子比较好
我们想作SDSPAGE
还有核酸蛋白接受仪什么牌子比较好阿

作者: qumm1985 时间: 2013-6-28 16:58

求助：最近做western，总是出现相邻的蛋白上样孔目的条带连成一条线的情况，左右蛋白条带之间不能看到明显的界线。电泳的梳子间距应该是足够了的。请教一下应该如何解决这个问题啊!

作者: youyou99 时间: 2013-6-28 17:01

虽然我做了不少SDS－PAGE，但是对其中的某些步骤还不甚了解，我的意思是说不知道有些操作的目的，比如说样品要和一定量的buffer混合这一步，有时有2×buffer（10微升样品加10微升buffer），有时用5×buffer（20微升样品加入5微升buffer），这些buffer的配置是有一定差别的，但是采用何种buffer以及加入的量有没有一个线性的关系呢？
还有一个很愚蠢的问题，请不要笑话我。变性SDS电泳的电压和电流最佳是多少，我们实验室一直采用200v，电流60mA，但是我发现好多人跑胶的电压和电流都比我们实验室用的低好多，我们实验室的操作对吗？

作者: ritou1985 时间: 2013-6-28 17:03

问下高手，当pr的相对分子质量小于1000时，对凝胶系统有什么特别的要求和改变。有人做过sds－尿素系统吗？

作者: mysmdbl 时间: 2013-6-28 17:04

求助：
原来的师姐已经在一个志贺菌株中成功表达过一个分子量58kd的蛋白，并用western blot验证过蛋白的存在。我现在把师姐冷冻的细菌重新摇起来然后做sds－page电泳。现在的问题是跑出来的蛋白条带很淡，几乎都看不清楚，包括蛋白marker也是如此
我的细菌是这样处理的：5ml菌液对数生长期后3000rpm离心5min，pbs重悬，煮沸5分钟。取10微升样品加等量2×上样缓冲液。
电泳系统：5％基层胶，12％分离胶，标准蛋白20微升直接上样，电泳缓冲液按分子克隆配置。
蛋白条带很淡已经出现四次了，依然不知道问题在哪，前几次出现的时候认为是上样的问题。现在实验室有个师姐用同样地标准蛋白和电泳缓冲系统跑出来的蛋白效果很好，很清楚。所以现在很是郁闷，已经耽误半个多月了，不能再耽误了。请教高手指点。谢了先

作者: langlang 时间: 2013-6-28 17:05

虽然我做了不少SDS－PAGE，但是对其中的某些步骤还不甚了解，我的意思是说不知道有些操作的目的，比如说样品要和一定量的buffer混合这一步，有时有2×buffer（10微升样品加10微升buffer），有时用5×buffer（20微升样品加入5微升buffer），这些buffer的配置是有一定差别的，但是采用何种buffer以及加入的量有没有一个线性的关系呢？
还有一个很愚蠢的问题，请不要笑话我。变性SDS电泳的电压和电流最佳是多少，我们实验室一直采用200v，电流60mA，但是我发现好多人跑胶的电压和电流都比我们实验室用的低好多，我们实验室的操作对吗？

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其实加buffer的量没有什么很严格的限制，一般配置上只是其中组分的量多少问题，最后加完了，都是把buffer变成了1×的了，一定要保证buffer是足够的，让SDS能与蛋白充分结合就好。用5×buffer只是在蛋白浓度低时能够提高你的蛋白上样量，而不至于使样品被buffer进一步稀释；如果样品浓度大的话，可以用2×buffer
SDS-PAGE的电压和电流，只要按照你们实验室的常规操作就可以了，既然你们每次做的电泳结果没有问题，还怀疑什么呢？
不同实验室的电泳槽产品质量不一样，能承受的电压等条件也不同，有的槽子不能用大电压的。

作者: XYZQ 时间: 2013-6-28 17:08

我前几天跑的SDS－PAGE胶的结果很奇怪。在堆积胶的底部有大片的混浊的东西，在脱色以后这些混浊虽然减轻了许多，但是这些东西究竟是什么？
我跑的蛋白样品是辛基疏水柱洗脱下来的，洗脱的缓冲液中含有0.1%的表面活性剂，收集洗脱有活力的部分然后透析除盐，再冻干浓缩了十几倍然后上样SDS－PAGE，每孔的上样量在5微克上下。经过浓缩的样品中含有2％左右地表面活性剂Triton X－100。

作者: zranqi_1 时间: 2013-6-28 17:09

我的样品是水稻穗子,用TCA丙酮法提取蛋白,裂解液配方为尿素(9M/L),2%CHAPS,50mMDTT,微量PMSF。电泳条件：12%分离胶，5%浓缩胶，25mA恒流，银染。结果蛋白条带不清晰，不知道是因为什么原因，请高手指点！！！！

作者: bluelake 时间: 2013-6-28 17:10

请教一个问题，我现在要跑的一个蛋白分子量是289KD，不知道这么大的蛋白用10%的分离胶是否可以分开？电泳的时候用的是130v，最大的marker是116kd，所以等最大的marker跑大底的时候才停止电泳，然后把整张胶都转下来，不知道这样是否能够保证我的目的蛋白能够分开？
转膜用的是湿转，400MA 3小时，这个条件能行吗？
我已经做了几次了，结果都不是很好，第一次条带特别的淡，由于买不到这么大的marker，也不能比对是不是目的条带，顺便请问一下在哪里可以买到这么大的marker？第二次做出来的结果条带虽然有但是条带看起来很模糊，还有弥散和拖带的情况，急盼请指点！

作者: abc816 时间: 2013-6-28 17:14

整个帖子都看了一遍，真是获益非浅啊！我有个问题请教一下：你们做SDS-PAGE时配胶的配方都是参考哪本书的？我看了几处：《分子克隆》、郭尧君《蛋白质电泳实验技术》、汪家政《蛋白质技术手册》。虽然大体意思都一样，但是配胶的方子有很大的不同呢！请问各位有经验的电泳高手，哪一种配方比较好用呢？正在困惑中！谢谢了

作者: kuohao17 时间: 2013-6-28 17:16

汪家政的《蛋白实验技术》，我认为越经典的方法越实用。

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整个帖子都看了一遍，真是获益非浅啊！我有个问题请教一下：你们做SDS-PAGE时配胶的配方都是参考哪本书的？我看了几处：《分子克隆》、郭尧君《蛋白质电泳实验技术》、汪家政《蛋白质技术手册》。虽然大体意思都一样，但是配胶的方子有很大的不同呢！请问各位有经验的电泳高手，哪一种配方比较好用呢？正在困惑中！谢谢了

作者: yapuyapu 时间: 2013-6-28 17:16

《分子克隆》、郭尧君《电泳实验技术》、汪家政《蛋白质技术手册》。虽然大体意思都一样，但是配胶的方子有很大的不同呢！

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哈，应该说任何一个都可以，以分子克隆为首，三个都够经典的。但不知你所说方子很大不同在何处？母液不同则方子肯定不同，但缓冲液、SDS终浓度都是一样的。AA母液的比例倒是会有点差别，结果是最佳分辨效果会有差异，但一般为29:1或29.2:0.8，上下比例都可以。Ap和TEMED两个催化所用可以根据凝胶聚合速度随意调整。

郭尧君的因为专门讲电泳，所以在原理和应用方面更加详细。你参见郭的相关章节肯定有详细叙述并可释你所疑。

作者: hustwb 时间: 2013-6-28 17:17

谢谢各位的精彩回帖。小弟有了很大的受益！！！！
这两天做Western blot，蛋白分子量43kd，我用12％的分离较，5％的积成胶，上样量50ug，用5*loading buffer，恒压先80V,marker分层后110V，一直跑到底，转膜用恒流200mA，3h，脱脂牛奶封闭过夜，一抗（1：300；500；600；1000）都试过，室温摇床2h，二抗（HRP）（1：6000；7000；8000）都试过，室温摇床2h，洗都是TBS－T 15min*3，ECL时没有荧光，曝光什么都没，然后用DAB显色也是没有条带，但用丽春红染有明显条带。
请教各位： 1.我的试验过程及条件是否合适，那里需要改进？
2.我的胶跑的自认为还行，没有歪，marker的条带分的很清楚，不知到这样算不算跑胶没问题；
3.丽春红染有条带，DAB无条带，是不是我的目的蛋白没转上，或者转过了？我的首要问题是想知道我的膜上有没有我得目的蛋白，怎么可以知道啊？或者我提蛋白是没有把目的蛋白提出来？
4.会不会是一抗与目的蛋白结合的问题，或者是一抗跟二抗结合的问题，怎么排除？
5.我很菜，做了好几次都没结果，好难过，我一个人在黑暗中摸索，不知道问题出在那里，不知道该怎么尝试，郁闷，希望得到各位的帮助，给点意见，谢谢啊！！！！

作者: S6044 时间: 2013-6-28 17:17

谢谢各位的精彩回帖。小弟有了很大的受益！！！！
这两天做Western blot，蛋白分子量43kd，我用12％的分离较，5％的积成胶，上样量50ug，用5*loading buffer，恒压先80V,marker分层后110V，一直跑到底，转膜用恒流200mA，3h，脱脂牛奶封闭过夜，一抗（1：300；500；600；1000）都试过，室温摇床2h，二抗（HRP）（1：6000；7000；8000）都试过，室温摇床2h，洗都是TBS－T 15min*3，ECL时没有荧光，曝光什么都没，然后用DAB显色也是没有条带，但用丽春红染有明显条带。
请教各位： 1.我的试验过程及条件是否合适，那里需要改进？
2.我的胶跑的自认为还行，没有歪，marker的条带分的很清楚，不知到这样算不算跑胶没问题；
3.丽春红染有条带，DAB无条带，是不是我的目的蛋白没转上，或者转过了？我的首要问题是想知道我的膜上有没有我得目的蛋白，怎么可以知道啊？或者我提蛋白是没有把目的蛋白提出来？
4.会不会是一抗与目的蛋白结合的问题，或者是一抗跟二抗结合的问题，怎么排除？
5.我很菜，做了好几次都没结果，好难过，我一个人在黑暗中摸索，不知道问题出在那里，不知道该怎么尝试，郁闷，希望得到各位的帮助，给点意见，谢谢啊！！！！

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1. 转膜用恒流200mA，3h，感觉转移时间有点长了。
2. 看跑胶有没有问题，你可以在做WB之前跑胶看看你的蛋白提出来了没有。最好是在WB时，同时跑两块板，一面用来转膜，一面用来考染。如果样品少，可以在同一块板上进行，然后切开分别操作。
3. 想知道膜上有没有目的蛋白，可以在转膜后封闭前，加立春红染色，就可以看到目标位置是否有蛋白。要知道提蛋白是否把目的蛋白提出来，只能提前进行电泳染色看看。
4. 抗体稀释问题，应该是倍比稀释，像你这种1：300；500；600；1000没有意义，可以这样比如1：200；400；800；1600，自己随便设置。
一抗和二抗的问题，你可以本版搜索一下，以前我们回答过这些问题。可以用点杂交。
5.自己一个人摸索是很郁闷，浪费时间，可以经常来本版搜索一下，有很多这方面的帖子。

作者: tianmei001 时间: 2013-6-28 17:19

不知道你是帅哥还是美女，我都谢谢您，发自内心的！！
小弟很水，原理知道甚少，如果问题很幼稚请原谅，给点耐心啊，谢谢啦
1：转膜电流我想用2.5h试一试，不知可以否？我已经用1.5h试了下，有marker，但是丽春红染没蛋白条带，我得转膜缓冲液没有SDS，同学说有SDS的只要1h；
2：“看跑胶有没有问题，你可以在做WB之前跑胶看看你的蛋白提出来了没有。”呵呵，我不是很明白，我的蛋白是从组织中提的，转膜后丽春红染色有蛋白条带啊，是不是说我提了蛋白出来的，只是不知道我的目的蛋白在不在里面， “要知道提蛋白是否把目的蛋白提出来，只能提前进行电泳染色看看。”这个不懂，你是说我要用丽春红染，看目标位置是否有蛋白？
3：“想知道膜上有没有目的蛋白，可以在转膜后封闭前，加立春红染色，就可以看到目标位置是否有蛋白” 我然后有很多条带，marker45，目的蛋白分子量43，因为膜从上到下都有条带，目标大致位置也有，而且有一条比其他的蛋白明显，并且粗些，但是还是不好肯定那就是目标蛋白；
4：抗体的比例让各位见笑了，我开始用1：500和1000，几次没结果后改为1：300和600，那我就听老师，
5.此外，老师对我的试验认为还有那里不妥？还需要我提供那些资料，您觉得我的问题大致出在那些地方，我好去改正排除

作者: PCR 时间: 2013-6-28 17:20

请问：1、我目的蛋白85kd，一抗说明书写的条带一般在100kd，查分子克隆应该用8%的分离胶；蛋白Marker 7条，最小10几kd，最大117kd，说明书写用12-15%分离胶；8%跑过几次，Marker小分子量的带就丢失了，而且条带有脱尾现象，显影出现过一次目的蛋白，在胶中间位置，我到底该选择百分之几的分离胶？是否12-15%的胶跑不出来80多kd的蛋白？
2、做WB，加入AB液后荧光条带很清楚显示，可X片却透亮什么条带都没有，显色液刚配，以前用过没问题，曝光时间2-3.5分钟都试过，以前2分钟做相同蛋白出来过条带,大侠指点下什么原因？还有，显色液我的怎么很快蘸2下就得停止，3下就黑了，是否因为新配的，太灵敏了，来不及观察阿

作者: zzzz 时间: 2013-6-28 17:20

请教楼主一个问题：

我煮过后蛋白样品可以在4度放多久？下次跑胶的时候，这批样品还需要煮吗？

谢谢！

作者: veiwu 时间: 2013-6-28 17:21

斑竹辛苦了，我有一个问题：我用的是北京六一仪器厂生产的电泳仪，最近跑beta-actin时，10%的胶4到5个小时Marker才刚跑开。听同学说他们的也就是一个小时就够了，回顾操作没有问题，很不明白为什么跑得这么慢是我的电泳仪的问题吗？请不吝赐教。

作者: 30moonriver 时间: 2013-6-28 17:21

请问搂主，我在转膜时用１２０V恒压９０分钟，一般没问题，但有时电源会突然自动跳至电流转，此时没法再设回电压，请问是电源问题还是短路或其他原因？

作者: chenshuanhe 时间: 2013-6-28 17:21

斑竹辛苦了，我有一个问题：我用的是北京六一仪器厂生产的电泳仪，最近跑beta-actin时，10%的胶4到5个小时Marker才刚跑开。听同学说他们的也就是一个小时就够了，回顾操作没有问题，很不明白为什么跑得这么慢是我的电泳仪的问题吗？请不吝赐教。

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有可能是上槽电泳液加少啦,没有完全覆盖上样孔.以前我也碰到过这种情况.

作者: 9900 时间: 2013-6-28 17:22

想请教您下，大肠杆菌表达体系，诱导后目标蛋白在包涵体中，菌体经过菌体洗涤、超声破碎、包涵体洗涤、盐酸胍溶解变性后透析复性，得到复性液。但对比目标蛋白在全菌电泳、复性液以及复性液等电沉降这三条SDS-page泳道结果发现，复性液等电沉降后目标蛋白比全菌电泳时下移约1K，复性液直接电泳比全菌电泳下移约2K，这是为什么呢？
会不会是蛋白质在复性之后带上了一定的正电荷（复性液pH在等电点之上）或者是破碎变性过程中肽链断了？

作者: KGZ564 时间: 2013-6-28 17:26

楼主，从你那受益匪浅啊。我的蛋白条带很密，而且拖尾，35kD以下的条带根本看不清啊。而且，marker的最后两条带18.4kD和14.4kD比其它的要模糊许多啊？这是什么原因啊？

作者: wmp1234 时间: 2013-6-28 17:27

楼主您好：

我一直是跑SDS-PAGE电泳的，在原来的实验室一直跑的很好，现在到了新实验室开始跑电泳，所有的试剂都是新买的，结果我配10%的胶始终不凝，所有的配方我都检查了，和原来的一样的，能帮我找找原因吗?

作者: u234 时间: 2013-6-28 17:28

请问，电泳有无最低上样量，今天每孔上样20ug，居然考马斯亮兰染色后没有条带出来，真是奇怪，难道是我的染色脱色出现了问题。还请各位指教，如果能给出一个考马斯亮兰的染色脱色详细方案，本人更是不甚感激！

作者: moonlight45 时间: 2013-6-28 17:28

marker条带歪斜是怎么一回事啊？请高手指点

图片附件: 60024791.snap.jpg (2013-6-28 17:28, 14.57 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16897

作者: xue258 时间: 2013-6-28 17:29

楼主您好：

我一直是跑SDS-PAGE电泳的，在原来的实验室一直跑的很好，现在到了新实验室开始跑电泳，所有的试剂都是新买的，结果我配10%的胶始终不凝，所有的配方我都检查了，和原来的一样的，能帮我找找原因吗?

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所有配方都一样，那就要怀疑试剂是否有问题，换个厂家的APS跟TEMED看下

作者: xue258 时间: 2013-6-28 17:29

请问，电泳有无最低上样量，今天每孔上样20ug，居然考马斯亮兰染色后没有条带出来，真是奇怪，难道是我的染色脱色出现了问题。还请各位指教，如果能给出一个考马斯亮兰的染色脱色详细方案，本人更是不甚感激！

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1ug都可以看出来。
染色脱色配方用甲醇和醋酸的那个配方
另外染色脱色时间跟温度关系密切，建议50度染色脱色
染色40分钟，脱色1.5小时，OK

作者: xue258 时间: 2013-6-28 17:30

marker条带歪斜是怎么一回事啊？请高手指点

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歪有可能是胶不均匀，如果每次都是歪的，还有一个可能是铂金丝的问题
另外两边的孔经常会有些歪，边缘效应很难那避免，但不会像你的那么歪

作者: avi317 时间: 2013-6-28 17:31

请问，电泳有无最低上样量，今天每孔上样20ug，居然考马斯亮兰染色后没有条带出来，真是奇怪，难道是我的染色脱色出现了问题。还请各位指教，如果能给出一个考马斯亮兰的染色脱色详细方案，本人更是不甚感激！

1.对于G250而言,其灵敏度参考资料上有说是3ng/条带,不过我们现在上样仍然按10ng/条带的灵敏度算
2.G-250脱色直接用水脱色就ok

作者: wood533 时间: 2013-6-28 17:32

水脱色很慢的

作者: loli 时间: 2013-6-28 17:34

楼主您好，我想请教下，我蛋白酶应该是27KDa左右，用millipore超滤管浓缩后，用bca法测的蛋白浓度约为1.1mg/ml，上样量为20微升，可是怎么也跑不出条带,能帮我分析下吗？我用的是4%浓缩胶，12.5％分离胶，100V跑浓缩胶，150V跑分离胶的，用考马斯亮兰染色的，marker跑得很正常，帮同学同样处理的样品也跑得很正常。跑SDS－PAGE前还测过酶活，酶活没有下降，可是就是跑不出条带，急啊，谢谢

作者: Ao7 时间: 2013-6-28 17:34

我最近做梯度胶一直不太理想，请问配制梯度胶加甘油是何道理？甘油的浓度对梯度胶有什么影响啊？

作者: tuuu2 时间: 2013-6-28 17:41

楼主好，帮忙看看我的电泳图。我用的是 5% 和 12% 的胶，电压分别是 80 V 和120 V . 最右边一条是 Marker。左边两条是样品，下面一些小分子量的带没有跑出来。不知道可能是哪些原因。谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-6-28 17:46

再补充一点：我的上样量： 20微升样品 + 20 微升 2 x buffer （样品约为 50微克），marker 20微升。还有就是煮沸后直接上样了，没有离心，这会有影响吗？谢谢！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-28 17:46

大家好！我那个蛋白是二聚体，所以要跑非变性的蛋白电泳。各位谁跑过非变性的蛋白电泳？麻烦和我说说.
电泳缓冲液，分离胶，堆积胶还有样品buffer都按书上的配了，跑出来的是一条带。但现在问题是marker，我用sds-page的marker跑，跑的不好，模糊不清。请问sds电泳和非变性电泳的marker不能通用吗？如果不能通用的话非变性的marker大家都用哪个公司的，应该注意什么？请教大家！谢谢！！

作者: kuohao17 时间: 2013-6-28 17:46

请教楼主：
我做的脑脊液，PH3-10NL的胶条，用的伯乐的一套仪器，银染。帮忙看一下要怎样改进呢？要用PH4-7的胶条吗？关于聚焦，样品处理，聚焦等方面。

作者: owanaka 时间: 2013-6-28 17:47

我的电泳图如下：有些泳道有一条染色较深的竖带，像第七泳道，请高手指点！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-28 17:47

我的电泳图如下：有些泳道有一条染色较深的竖带，像第七泳道，请高手指点！

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是不是样品里面什么固体颗粒？？

作者: 2541 时间: 2013-6-28 17:48

相关疾病：
头痛
楼主及各位高人:
我在跑SDS-PAGE电泳出现了一些问题：1、条带和相邻的条带连成一条弧形，是由于刚才点样以后，放置了一段时间，样品扩散？；2、跑聚集胶时电压用的是120v，但电流只有20mA，保持恒压进入分离胶以后，但是电流只有10mA了。而且越跑越慢！电流越跑越低。光聚集胶就跑了3个小时，分离胶花的时间更长。我的试剂和缓冲液都是新配的。怎么回事啊？头痛啊，新手上路，请大家多帮忙啊！

作者: 04906 时间: 2013-6-28 17:50

我的目的蛋白是55KD的，麻烦各位推荐一套合适的标准蛋白，谢谢各位

作者: 3N4G 时间: 2013-6-28 17:51

请问丙酮沉淀蛋白后，上样时如何使沉淀溶解，老是溶解不了，郁闷阿

作者: wsll 时间: 2013-6-28 17:51

我纯化的蛋白,透析后用聚乙二醇浓缩，BCA法定量为0.37mg/ml,可是为什么蛋白电泳看到条带呢? Marker是正常的,处理的同批次的样品,别的都出来了,可是就目的条带没有出来?
还望指点下,谢谢了

作者: utt0989 时间: 2013-6-28 17:51

楼主你好，想请问几个问题：
⑴蛋白样品离心后取上清，加4Xloading buffer，煮之前忘了没混匀，loading buffer沉在下面，煮完后混匀对样品有影响吗？
⑵样品煮完离心后甘油沉到管底了，分装后各管的蛋白浓度会不会不均一，蛋白质在甘油和水中溶解度差别大吗？
⑶有没有什么办法、窍门让条带跑的细且直，条带之间不连接，（上样量又不能太少，有些蛋白不好测）

作者: utt0989 时间: 2013-6-28 17:53

你好，请问一下，蛋白样品在加了loading buffer 并煮沸后原则上不应发生降解，但为何-20度长时间保存的样品转膜后丽春红染色后条带拖尾？

作者: skytree 时间: 2013-6-28 17:54

楼主你好，想请问几个问题：
⑴蛋白样品离心后取上清，加4Xloading buffer，煮之前忘了没混匀，loading buffer沉在下面，煮完后混匀对样品有影响吗？
⑵样品煮完离心后甘油沉到管底了，分装后各管的蛋白浓度会不会不均一，蛋白质在甘油和水中溶解度差别大吗？
⑶有没有什么办法、窍门让条带跑的细且直，条带之间不连接，（上样量又不能太少，有些蛋白不好测）

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1、应该没有影响。煮沸的过程中有对流作用。
2、甘油不应该沉底的。甘油与水混溶，不存在分相问题。
3、做熟了自然就好了。可以分隔上样，样品之间的孔只加1*loading buffer，这样会浪费孔，但条带确实会好看些。

作者: lixi559 时间: 2013-6-28 17:54

诱导后的菌液怎样处理后能做western b?我是超新手帮帮忙啊~！

作者: JK.jon 时间: 2013-6-28 17:55

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2013-6-28 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

诱导后的菌液怎样处理后能做western b?我是超新手帮帮忙啊~！

不需要特别的处理啊，就像做普通的SDS-PAGE一样先做电泳。

建议您先找一些WB相关试验技术资料来看一看。

版内有很多，请搜索。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-6-28 17:55

最近跑的wb，marker在浓缩胶已经开始分开，marker上了10μl，最终跑完电泳后marker的条带又粗又浅，以前做的不是这样的，还是蛮好的，不知道什么原因，头大，请各位帮我解答一下，多谢多谢！

作者: 966735obeng 时间: 2013-6-28 17:56

楼主您好昨天跑自己提取的二型胶原蛋白（MW 117左右）电泳，胶浓度8%，用稳压94v，电泳液配置应该没有问题，跑完只用了1小时10分钟，考马斯蓝染色后只有maker清晰显示，而自提蛋白和标准阳性对照蛋白均没有任何条带，请您帮忙分析一下原因，谢谢！

作者: zsxan1990 时间: 2013-6-28 17:57

电泳的过程中由于漏液，导致电泳终止，对实验有什么影响吗？

作者: pencil菲 时间: 2013-6-28 17:57

好帖啊！

请问下楼主，跑完PAGE脱色完成后，整个凝胶比刚跑完时明显缩小了很多，不知道是什么原因，请指教，谢谢。

作者: orangecake 时间: 2013-6-28 17:58

SDS-PAGE 下胶注入后，加水封闭，加水时应该怎样加才能不让胶面凹凸不平？？是不是水刚加下去的时候是不平的？要等凝胶凝固了就自然会平？有时刚加水后我就能看到波浪的折线，就是不平，那等一下水能不能把它压平？？

有时刚加水后看不到折现，那一般都是平了。

到底怎么加水才能使下胶平？

作者: hustwb 时间: 2013-6-28 17:58

“SDS-PAGE,特别是等点聚焦和PAGE结合（双向电泳）也是检测蛋白质结构变化的很好的方法。”这是《血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则》中的一句话，目的想考察蛋白质制品灭活病毒前后的结构变化。

我公司产品情况：冻干制品（主要含有纤维蛋白原，另有少量的凝血因子、白蛋白）。

我公司依照《血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则》的建议，想采用SDS-PAGE进行蛋白质制品灭活病毒前后的结构变化研究。那么是采用还原SDS-PAGE（加入巯基乙醇），还是非还原SDS-PAGE呢？

另外，2010版药典三部附录IV C SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中写道：“非还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析；还原电泳凝胶中分子量标准，经扫描获得分子量标准曲线，计算供试品的分子量。”
我是否可以这样理解：我公司产品含有三种蛋白，是混合物，因此不适合用非还原SDS-PAGE，因为非还原电泳凝胶是进行进行纯度分析的，无法分析混合物。然而如果用还原SDS-PAGE，就破坏了蛋白质的结构，无法进行灭活病毒前后蛋白质结构变化对比。我是不是理解错了？

针对我公司的这种实验目的，选择哪一种实验方式更合理呢？

作者: moonlight45 时间: 2013-6-28 17:59

是不是样品不一样染色方法就不一样呢

作者: nvdabing 时间: 2013-6-28 18:00

SDS-PAGE 下胶注入后，加水封闭，加水时应该怎样加才能不让胶面凹凸不平？？是不是水刚加下去的时候是不平的？要等凝胶凝固了就自然会平？有时刚加水后我就能看到波浪的折线，就是不平，那等一下水能不能把它压平？？

有时刚加水后看不到折现，那一般都是平了。

到底怎么加水才能使下胶平？

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这个我们这边是用异丙醇压平分离胶的液面，等胶凝后再蒸馏水清洗干净。效果不错。

作者: windy+++ 时间: 2013-6-28 18:01

楼主您好我是一学生准备做电泳的实验想问下样品药物的处理方法由于样品不是粉末状要研磨我想请问一般都是用什么溶液处理样品的是Tris-HCl+百分之十的SDS吗？需要加甘油或者蔗糖吗？如果要加，那么甘油或蔗糖在这过程中起的是怎么样的一作用呢？

作者: tangxin_80 时间: 2013-6-28 18:01

我最近配的SDS-PAGE胶的上样孔底部老是会有小孔（就是与梳子头部接触的胶老是会产生小泡，凝固后就变成小孔了，拔了梳子重新插还是不能很好地赶走小泡），上样后小部分样品流到这些小孔里，这样的结果就是同一个上样孔里少部分样品跑在其余样品的前面。为什么与梳子头部接触胶老是会产生小泡？

作者: winnercs 时间: 2013-7-2 11:35

楼主您好：
麻烦请问如果蛋白分子量在4000KD左右可以用SDS-PAGE吗？分离胶的浓度如何选择？谢谢啦

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