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标题: 【求助】原核表达蛋白纯化 [打印本页]

作者: mingming0638 时间: 2013-6-29 11:04 标题: 【求助】原核表达蛋白纯化

我现在在做PGEX-4T-2的原核蛋白表达和纯化。通过SDS-PAGE证实已经有融合蛋白的表达。下一步我想进一步做蛋白大量表达以及纯化，用于以后的活性检测和动物实验。但不知该如何操作，不知那位战友可以指导一下在下。
多谢!

作者: yes4 时间: 2013-6-29 11:05

融合蛋白表达只是你成功的第一步，要获得SDS-PAGE电泳纯且有生物活性的蛋白还需要努力和一点运气。
1、确定目的蛋白是以包含体还是可溶性的形式表达：超声波破碎，分别收集菌体裂解上清液和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考染即可确定。如果为可溶性表达，那么你很幸运啊！如果为包含体，你还要努力，改变表达条件（原核表达手册上有详细的指导），获得可溶性表达。否则，要想通过变复性获得有生物活性的融合蛋白，工作量很大，而且效果不佳！
2、获得可溶性表达后就很容易了！按照标准的Protocol进行亲和层析就可以获得你想要的东东了！

祝你实验早日成功！

作者: DNA 时间: 2013-6-29 11:06

“标准的Protocol进行亲和层析”
有没有具体的步骤啊

作者: wood533 时间: 2013-6-29 11:07

这里有关如何使用Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化抗体的文章，希望能有所帮助
(一)　原理
　　葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
　　(二)　操作步骤
　　用0.1M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml
　　上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)

　　　　　　　　　　　↓

　　装柱后用0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡

　　　　　　　　　　　↓

　　标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤。
　　上样前用1M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜

　　　　　　　　　　　↓

　　加样，一般按25～30mgIgG／g湿胶比例加样，室温作用15min,0.1M PH8.0磷酸缓冲
　　液充分淋洗至淋洗液OD值为<0.02。

　　　　　　　　　　　↓

　　用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml／h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化
　　IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl
　　缓冲液洗脱。

　　　　　　　　　　　↓

　　用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液

　　　　　　　　　　　↓

　　收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定

　　(三)　试剂器材

　　1.　SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)

　　2.　磷酸缓冲液0.1M PH8.0＋0.02％ NaN３

　　3.　枸椽酸缓冲液　0.1M PH6.0　┐

　　　　　　　　　　　0.1M PH4.0　├＋0.02％ NaN3

　　　　　　　　　　　0.1M PH3.0　┘

　　4.　1M PH9.0 Tris溶液

　　5.　再生缓冲液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl调正PH至8.5＋0.02％NaN3；(2) 0.1M

醋酸钠含0.5M NaCl调正PH至4.5＋0.02％NaN3。

　　6.　1～10ml柱体积的玻璃柱或塑料柱

　　(四)　注意事项

　　1.　SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法:先用10倍柱体积0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M PH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

　　2.　SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或纯化免疫复合物。

　　3.　　、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

作者: qhyu 时间: 2013-6-29 11:07

镍亲和和GST亲和的方法可以看看书，或搜索下。

作者: mingming0638 时间: 2013-6-29 11:08

谢谢大家的帮助！
请问fanby，那我下一步就是要确定是否是可溶性表达，是吗？如果在裂解上清液中SDS-PAGE阳性说明是可溶性表达，如果在沉淀中就是不溶性对吗？只用超声波破菌，需不需要加溶菌酶和PMSF，如果需要，该如何加？多谢！

作者: 49888 时间: 2013-6-29 11:08

如果在裂解上清液中SDS-PAGE阳性说明是可溶性表达，如果在沉淀中就是包含体表达，但通常外源蛋白是一部分以可溶性表达，另一部分为包含体表达，只要有部分可溶性表达，你就可以应用亲和层析纯化目的蛋白了。

超声波破菌可以不加溶菌酶和PMSF（我做的时候没有加，超声波裂解的效果还不错），但一定要在冰浴中进行，以免你的目的蛋白失活。具体步骤为：沉淀菌体，缓冲液悬浮，每离心管2ml菌液，将超声波探头插入离心管中的菌液液面之下，然后将离心管置于冰水浴中，超声波功率200W，工作3s，间隔4-6S，重复30-40次，然后12000g离心10min，分别收集菌体裂解上清液和包含体，下一步就是进行SDS-PAGE电泳了！

作者: mingming0638 时间: 2013-6-29 11:09

真心感谢你无私的帮助，使我在前进的路上有了一盏明灯。我会按照你说的去做，老天保佑是可溶性表达吧！再问以下，亲和层析是怎样的，要买试剂盒吗，买那的好？不好意思总是问问题，但我是学临床医学的，对实验实在是外行！

作者: yueban-1147 时间: 2013-6-29 11:09

对于是否加溶菌酶的问题要看看你的融合蛋白的分子量有多大，如果大于150KD的，如果用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理，再结合超声波破碎，效果更好。

作者: guagua 时间: 2013-6-29 11:10

现在有很多专业的公司对外提供技术服务，象你这种情况我建议可以委托其它公司做，这样可以加快实验进度，另外还可以省下试剂耗材的费用。

作者: lgm 时间: 2013-6-29 11:10

我现在做的实验与楼主类似。
我的融合蛋白的分子量有45KD，超声波破碎，没用溶菌酶，上清中出现了可溶性蛋白，沉淀中也有，但是请教了几位老师说，可以用上清做下一步的纯化了，老师说可以做亲和层析，也可以做离子交换层析（更便宜），另外，我们还有一台新的Amersham公司（做纯化很专业的公司）的层析纯化系统要开始用。

作者: bling 时间: 2013-6-29 11:10

我现在做的实验与楼主类似。
我的融合蛋白的分子量有45KD，超声波破碎，没用溶菌酶，上清中出现了可溶性蛋白，沉淀中也有，但是请教了几位老师说，可以用上清做下一步的纯化了，老师说可以做亲和层析，也可以做离子交换层析（更便宜），另外，我们还有一台新的Amersham公司（做纯化很专业的公司）的层析纯化系统要开始用。
希望各位高手多指导，因为我做纯化是新手，不知是否对楼主“咪咪的梦”有帮助！！！

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如果有tag那亲和就可以了
不用亲和，离子交换一步很难达到要求的纯度，还是要结合其它层析方法。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=766260&sty=1&tpg=3&age=-1')

作者: Ao7 时间: 2013-6-29 11:11

定购Amersham公司的产品，Amersham公司网上有表达、纯化手册（GST Gene Fusion System Handbook），文件有点大，你自己从网上下吧！

网址：cuturl('http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/content/china_homepage')，在“Search”框里输入“GST Gene Fusion System Handbook”，新网页打开后点击“GST Gene Fusion System Handbook”，第三个网页打开需要你注册，注册后即可下载操作手册了！

手册里面试剂定购及操作步骤很详细！

作者: idoww 时间: 2013-6-29 11:11

我做的蛋白表达,离心沉淀后,将培养液上清倒掉,将菌体沉淀用含尿素的变性缓冲液进行悬浮,充分作用后,再高速离心,,结果在上清中有我的蛋白
请问各位,这是否能说明我的蛋白就是分泌性蛋白呢？
我也没有采用超声裂解的方法来破碎细菌。

作者: cj_mondy 时间: 2013-6-29 11:12

尿素是变性剂，也有可能造成细胞有破碎。建议用超声破碎后与你的这种方法做个对比，如果超声后的明显比这种方法含量高就不足以说明你的蛋白是分泌蛋白。

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