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标题: 【求助】免疫沉淀沉淀不完全 [打印本页]

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:47 标题: 【求助】免疫沉淀沉淀不完全

我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！

作者: popo520 时间: 2013-7-3 15:47

这个抗体可以进行IP？

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:47

QUOTE:

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这个抗体可以进行IP？

可以的，说明书上说可以进行IP

作者: popo520 时间: 2013-7-3 15:48

沉淀后的检测实验是怎么设计的？

作者: 04906 时间: 2013-7-3 15:48

沉淀后的上清取出，跑电泳，珠子用RIPA裂解液洗两次后加入适量裂解液及Loadingbuffer，95度煮5min，然后跑电泳，转膜后用HSP90的一抗杂，上清中的蛋白量远比沉淀中的多。不知这样有错没

作者: one 时间: 2013-7-3 15:48

What isotype of your antibody? Did you check the beads fit the antibody isotype or not?

作者: NBA 时间: 2013-7-3 15:49

珠子用哪里的？

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:49

QUOTE:

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珠子用哪里的？

isotype是rat IgG2a，珠子与它的isotype 是适合的。愁死了，会是什么问题呢？

作者: bling 时间: 2013-7-3 15:50

Modify the cell lyses buffer as following :

50mM Tris HCl pH 7.5

150 mM NaCl

1% Triton X-100

add proteinase inhibitors freshly

作者: vera+ 时间: 2013-7-3 15:51

大多数情况是抗体或者珠子原因
自身的话 1 lysis是否可以用NP-40
一抗过夜孵育珠子3h以上

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:51

珠子是santa的，protein A/G plus-agarose immunoprecipitation reagent （sc2003）。裂解液用的RIPA，配方是50mMTris(pH7.4),150mMNaCl，1%NP40，0.1%SDS，说明书上说特别适用于免疫共沉淀。麻烦大家帮我看看有没有不妥的地方？

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 15:51

SDS may influence protein bind onto antibody in some cases, it is why I suggest you delet SDS in cell lyses buffer.

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:51

谢谢！我明白了，下次用不含SDS的裂解液试试。是不是只要不含SDS就行啊？Triton和NP40都行吗？

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 15:52

Yes. The CHAPS is better but it is very expensive.

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:52

我还想再问下：IP后洗涤是否也用同样的裂解液？为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 15:58

A.IP后洗涤是否也用同样的裂解液？
Yes.

B. 为了不破坏蛋白之间的相互作用，洗涤步骤是否有需要注意的地方？
1. Washing beads gently.
2. Add glycerol to final 5% if necessary, it can make protein stable in some cases.
3. Add phosphase inhibitors if the PPI may relate to the statuse of protein phosphrylation.

Good luck!

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:58

BOSS兄，另外清洗珠子时用的离心条件是怎样的呢？2000r，3min行吗？

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 15:59

Yes. 2000rpm x 3min or 3000rpm x 2 min are OK.

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 15:59

我最近用非变性裂解液又做了一次，HSP90大部分都沉淀下来了，但是杂AKT，看到的结合量还是很少，请大家帮我想想还有什么地方有可能破坏了蛋白之间的相互结合？比如清洗珠子的时候能不能不用裂解液，用PBS可以吗？我觉得这样比较温和。谢谢了！

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:00

另外，我还想问一下：coIP阴性对照是怎么设的？我们实验室没有正常的IgG,应该用什么设阴性对照呢？是不是应该设一个只加珠子不加抗体的对照啊？来证明珠子不会将蛋白沉下来。

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 16:00

我最近用非变性裂解液又做了一次，HSP90大部分都沉淀下来了，但是杂AKT，看到的结合量还是很少，请大家帮我想想还有什么地方有可能破坏了蛋白之间的相互结合？比如清洗珠子的时候能不能不用裂解液，用PBS可以吗？我觉得这样比较温和。谢谢了！

1. You can decrease the concentration of salts and detergent, e.g. 50mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0. 1% Triton X-100/NP-40, and using 1/3-1/5 of proteinase/phosphase inhibitors after first washing because most non-binding proteins are washing away.

2. You can use linker reagent to treat sample if you are so worry about decrease of PPI.

另外，我还想问一下：coIP阴性对照是怎么设的？我们实验室没有正常的IgG,应该用什么设阴性对照呢？是不是应该设一个只加珠子不加抗体的对照啊？来证明珠子不会将蛋白沉下来。

Typical controls for co-IP are

1. Normal Ab isotype as Ab used in IP.

2. Use same cell/tissue from knock out animal.

3. 只加珠子不加抗体 only for pre-cleaning cell/tissue lysates, it can not be used as control.

4. 我们实验室没有正常的IgG: You can ask your supervisor to buy it, it is cheap.

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:00

谢谢！我还想问下linker reagent是什么啊？

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 16:01

DSP IS COMMON ONE. Search on net and read the introduction of this reagent.

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:01

这次用PBS洗的珠子，不含去垢剂，操作很轻柔，但是改观不大，哭！请问还有哪些地方没注意到的呢？

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 16:01

1. Why use PBS 洗珠子?

2. You did not write down your experiment step by step, who knows 还有哪些地方没注意到的呢？

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:02

具体操作步骤如下：1 蛋白用非变性裂解液（不含SDS）裂解，定量，加入HSP90一抗（rat），1mg蛋白对1ug的抗体量，4度摇床摇晃24h;
2 加入珠子，500ug蛋白对应20ul 50%的珠子，4度摇床摇晃过夜；
3 反应结束后4度2500r，3min离心，取出上清，珠子用PBS轻柔地清洗两边（用PBS是因为它只含盐，不含去垢剂，为了不破坏蛋白之间的相互作用），每次洗完4度2500r，3min离心，弃上清。
4 清洗后的珠子加入Loading buffer 100度煮10min，电泳，western.
结果HSP9080%都能沉淀下来，但是和它结合的蛋白如AKT等非常少。郁闷。
请大家帮我看看哪里有错?

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-3 16:02

具体操作步骤如下：1 蛋白用非变性裂解液（不含SDS）裂解，定量，加入HSP90一抗（rat），1mg蛋白对1ug的抗体量，4度摇床摇晃24h;
2 ug 抗体 would be better

2 加入珠子，500ug蛋白对应20ul 50%的珠子，4度摇床摇晃过夜；
25-40 ul 50%的珠子would be better. o/n is OK.

3 反应结束后4度2500r，3min离心，取出上清，珠子用PBS轻柔地清洗两边（用PBS是因为它只含盐，不含去垢剂，为了不破坏蛋白之间的相互作用），每次洗完4度2500r，3min离心，弃上清。
用PBS轻柔地清洗: when you write paper for publication, are you sure your reason can be accepted by reviewer?

4 清洗后的珠子加入Loading buffer 100度煮10min，电泳，western.

结果HSP9080%都能沉淀下来，但是和它结合的蛋白如AKT等非常少。郁闷。
Read this paper carefully
Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 September 26; 97(20): 10832–10837

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:03

我用PBS清洗珠子也是根据珠子的说明书做的，santa的珠子说明书是说用RIPA裂解液或PBS清洗均可。不知有什么问题？另外那篇文献我研读了以后再跟你讨论哈。

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:15

我这次做CoIP打算用以下缓冲液清洗珠子：50mMTris,150mMNaCl,pH7.5,按1:100加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，请大家帮我看看行不行？希望这次就能做出来，谢过先。

作者: 莓菓333 时间: 2013-7-3 16:16

另外我还想问一下，每次清洗珠子用多少体积的清洗液合适啊？少了怕洗不干净，多了又怕破坏二者之间的相互作用。

作者: yychen 时间: 2013-7-3 16:16

我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！

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你好，我最近也要做免疫沉淀，请问铺板的时候贴壁细胞要铺多少密度的啊？实验过程中的蛋白用的比较多，我今天测了蛋白浓度都不够用。。。
还有用的一抗是不是与做western 的一抗不同啊？我做western 的一抗说明书上面应用范围里面没有提到可以用于做免疫沉淀。是不是得重新买可以做免疫沉淀的抗体啊？

作者: yychen 时间: 2013-7-3 16:17

谢谢！我明白了，下次用不含SDS的裂解液试试。是不是只要不含SDS就行啊？Triton和NP40都行吗？

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不可以用SDS裂解液的啊

作者: yychen 时间: 2013-7-3 16:17

我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！

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一抗有多克隆和单克隆，有啥区别啊？

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