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标题: 【求助】about TAP（蛋白相互作用） [打印本页]

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 10:51 标题: 【求助】about TAP（蛋白相互作用）

请教前辈们，最近本人从《生物化学与生物物理学进展》（2004；31（4），379－384）上看到一篇新技术讲座――《串连亲和纯化（TAP）技术在蛋白组学中的应用》，对于前面介绍的TAP新方法很感兴趣。希望能够利用该方法来筛选与我的兴趣蛋白相互作用的蛋白，但是有一个问题在这里向大家请教一下。
我的兴趣蛋白是一个分泌型的糖蛋白，也就是说它是经过修饰加工，穿膜，切断信号肽后细胞外发挥作用的。我注意到介绍该方法的文章，主要应用成功例子是筛选酵母和果蝇细胞中的蛋白复合体，那么不知该方法是否可以用于我的分泌型糖蛋白的相互作用研究呢？

作者: mamamiya 时间: 2013-7-6 10:57

应该可以的，原则上说TAP所连的基因是可以转到培养的动物细胞中，所以其表达的蛋白理论上是能经过修饰加工的；在哺乳动物细胞中也有成功报道，可以到网上搜搜看，methods可能就有，园子里也有相关连接。我也想做的，但老板不同意，怕冒风险，所以不肯出钱买载体，让我自行解决，很遗憾呀！

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 10:58

应该可以的，原则上说TAP所连的基因是可以转到培养的动物细胞中，所以其表达的蛋白理论上是能经过修饰加工的；在哺乳动物细胞中也有成功报道，可以到网上搜搜看，methods可能就有，园子里也有相关连接。我也想做的，但老板不同意，怕冒风险，所以不肯出钱买载体，让我自行解决，很遗憾呀！

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前辈，谢谢指点：）
可我还有一个问题不很清楚。我的蛋白是分泌型的，也就意味着其可能是在细胞外发挥作用的，相互作用的蛋白或受体也应该是细胞外结合的吧。那么，应用TAP筛选到细胞内结合的相互作用蛋白还有意义吗？

作者: memory 时间: 2013-7-6 10:58

个人认为首先做个不同阶段蛋白定位研究，如果您的蛋白均在细胞外，而且转运途径也很清楚，那么我想还是换个研究方法吧，如GST PULL DOWN.

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 10:59

个人认为首先做个不同阶段蛋白定位研究，如果您的蛋白均在细胞外，而且转运途径也很清楚，那么我想还是换个研究方法吧，如GST PULL DOWN.

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前辈，谢谢指点。请问如果要做不同阶段蛋白定位研究的话，那应该大致分为哪几个阶段，并且采用什么手段呢？

作者: kswl870 时间: 2013-7-6 11:00

能否上传《生物化学与生物物理学进展》（2004；31（4），379－384）上看到一篇新技术讲座――《串连亲和纯化（TAP）技术在蛋白组学中的应用》，我想学习一下。谢谢。

作者: kswl870 时间: 2013-7-6 11:01

蛋白定位研究首先应该考虑你所要研究的蛋白的可能作用和分类，比如细胞周期蛋白，就得做细胞的同步化，如果细胞培养有特殊条件，比如低氧或低糖等等，就需做time course.有条件的话最好用激光共焦扫描仪，国外高点文章都这莫做的。

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 11:02

蛋白定位研究首先应该考虑你所要研究的蛋白的可能作用和分类，比如细胞周期蛋白，就得做细胞的同步化，如果细胞培养有特殊条件，比如低氧或低糖等等，就需做time course.有条件的话最好用激光共焦扫描仪，国外高点文章都这莫做的。

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嗯，我也看到好多用激光共聚焦来做蛋白定位的。我的蛋白是在癌旁组织中表达丰富，且具有特异性抑制内皮细胞增殖的作用。

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 11:03

谢谢已经下载了。你研究的可是胞外分泌型蛋白？我认为应首先确定靶器官，然后再看该蛋白在靶细胞的定位，可以构建C端GFP融合表达载体，激光共焦还是可用的。如果想动态观察蛋白的合成、分泌和作用，恐怕就得用荧光相干光谱了。据说激光共焦也有倒置功能的，我不太清楚。

作者: ero11 时间: 2013-7-6 11:05

谈谈关于构建好的TAP克隆表达状况的检测方法：
构建好的克隆在进行下一步的实验时需要先进行小量表达检测蛋白的表达状况，如果有针对目的蛋白的特异性抗体当然最好，如果没有也可以借助TAP标签的组成特点，即带有两个串联的IgG结合结构域，这样使用不相关的抗体作为一抗，如果有大小正确的条带显示就证明蛋白有表达。这个方法很有效，我用鼠抗和兔抗都作过，均可得到较好的效果。进行这方面实验的战友如有需要不妨试试。

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:05

您好！不知您的TAP载体购自哪家公司，国内有代理吗？我前一段时间做PULL DOWN找结合蛋白，结果很不理想。一年半时间了，一点进展没有，很急呀，估计得延期毕业了，希望得到您的指点！谢谢。

作者: DDD 时间: 2013-7-6 11:06

QUOTE:

原帖由 u234 于 2013-7-6 11:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好！不知您的TAP载体购自哪家公司，国内有代理吗？我前一段时间做PULL DOWN找结合蛋白，结果很不理想。一年半时间了，一点进展没有，很急呀，估计得延期毕业了，希望得到您的指点！谢谢。 ...

我不是我们实验室第一个做这个的，载体的来源我并不是很清楚，好像是国外试验室改造的，向别人要的。我这方面的实验也只刚开始，如前所说将进行完检测，后续纯化还没做，还没有更多经验可交流，希望有进展了能更多和大家交流。此外，你提到做Pull Down找结合蛋白，结果不理想，是否是原核体系中进行的呀？会否是相互作用依赖真核中特有的一些修饰呢?

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:08

我也说不清楚，老板现在很是生气！没办法，只好换其他方法试试啦。

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 11:09

我不是我们实验室第一个做这个的，载体的来源我并不是很清楚，好像是国外试验室改造的，向别人要的。我这方面的实验也只刚开始，如前所说将进行完检测，后续纯化还没做，还没有更多经验可交流，希望有进展了能更多和大家交流。此外，你提到做Pull Down找结合蛋白，结果不理想，是否是原核体系中进行的呀？会否是相互作用依赖真核中特有的一些修饰呢?

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我也是打算用pull down来寻找相互作用的蛋白，请问，如果可能存在您所说的是在原核体系中进行，而且相互作用依赖真核中特有的一些修饰，有什么好的解决办法吗？

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:09

如果蛋白结合真的需要修饰的话，原核应用可能会受到限制的，我不知道其他更好的解决方法，请原谅！

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 11:10

如果蛋白结合真的需要修饰的话，原核应用可能会受到限制的，我不知道其他更好的解决方法，请原谅！

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不过还是谢谢你哟：）至少给我也提了个醒。那么请问你现在换用了其他的方法吗？

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:11

没有呀，想做免疫共沉淀抗体又没有，做双杂交老板又不舍得花钱，做TAP又没有买到载体，唉！我真不明白，做个实验咋这么难？条件不行，老板还总找你要data。

作者: bgf5 时间: 2013-7-6 11:12

QUOTE:

原帖由 u234 于 2013-7-6 11:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

没有呀，想做免疫共沉淀抗体又没有，做双杂交老板又不舍得花钱，做TAP又没有买到载体，唉！我真不明白，做个实验咋这么难？条件不行，老板还总找你要data。 ...

同志！你咋跟偶是一样子的处境呀：（我现在也卡壳在这里了，郁闷呀）

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:14

唉，苦命的娃！如果5月实验室还没有弄到TAP系统，我准备从蛋白功能研究入手，总不能坐以待毙。有时间我们可以聊聊。

作者: bling 时间: 2013-7-6 11:14

我也有个疑问想请教大家：按照冷泉港那本书上纯化磷酸多肽的方法，结合蛋白缓冲液是乙酸pH为2，会不会造成纯化出来的蛋白是不可逆的变性的？
我想得到有活性的蛋白。
另外还有的方法上还用到乙腈，是不是也会使蛋白变性？

作者: ququer787 时间: 2013-7-6 11:15

没有呀，想做免疫共沉淀抗体又没有，做双杂交老板又不舍得花钱，做TAP又没有买到载体，唉！我真不明白，做个实验咋这么难？条件不行，老板还总找你要data。

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做免疫共沉淀如果没有针对你蛋白的抗体，你可以构建带标签的真核表达载体，在细胞中过表达以后收取蛋白再进行免疫沉淀，当然这需要标签抗体，有商业化的抗体可以买，如果你的老板同意的话。此外，顺便问问你是什么专业？

作者: u234 时间: 2013-7-6 11:15

我当时也考虑过，但是我不知道这样做结果是否可靠，文章档次是否受影响？另外，您是否见过这种方法的文章，我倒觉得TAP原理也是这样的。我是生化与分子生物学专业，方向是蛋白质化学，你呢？

作者: ququer787 时间: 2013-7-6 11:16

QUOTE:

原帖由 u234 于 2013-7-6 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我当时也考虑过，但是我不知道这样做结果是否可靠，文章档次是否受影响？另外，您是否见过这种方法的文章，我倒觉得TAP原理也是这样的。我是生化与分子生物学专业，方向是蛋白质化学，你呢？ ...

在验证蛋白相互作用时用细胞或组织内源性表达的蛋白当然是最说明问题的,但需要针对蛋白的特异性抗体，这并不是总能满足的条件。现在文章里用标签抗体做这方面实验的应该还是很多见的，JBC或JCB等杂志都可以见到，不知你要求发何种水平的文章？
再者TAP实际上也是标签，并且还比较大，它的可信度增加更多是因为经过了两步纯化去除了一些杂蛋白的污染。并且这种方法更适合进行一定规模的，筛查某一目的蛋白的相互作用蛋白，而对于只是想检测某两蛋白间相互作用并非最佳方案，因为最后纯化所的的样品分离后进行质谱鉴定，我认为找到你感兴趣蛋白的几率并非100％，甚至还要低。检测不到并不能说就没有相互作用，犹如撒网捞鱼，没捞着并不代表没有。这时用抗体是更有针对性的，而且更高效。可以用标签抗体先做，同时尽量寻找蛋白的特异抗体，从公司购买或自己制备，另外现在有的公司你只要告诉他你的蛋白序列，他可以帮你分析抗原表位，合成肽段制备抗体，一般来说效果还是可以的，不妨从这方面也想想办法。祝你顺利！

作者: any333 时间: 2013-7-6 11:17

终于找到家了
偶也在设计TAP实验哦, 大家一起交流!
偶准备用多种载体试一试, 手头构建好的TAP载体有3个. 载体应该问题不太, 但做每种载体时的工作量好象很大的,需要的细胞非常多,大家要有心里准备(10 T-175 flasks/TAP vector)
我也是命苦,前面有几个人做过双杂但不知是该基因对酵母有毒性还是其他什么原因,做这个实验酵母总长不起来.所没只有想别的办法.

作者: DNA 时间: 2013-7-6 11:17

谢谢各位的见解，发现研究蛋白质相互作用的方法还是挺多的，不过都有局限性，我现在正在做一考题，

在某种疾病的患者中发现某蛋白的表达水平显著地变化，如何通过蛋白质相互作用研究此蛋白在此疾病的发病过程中的分子机制？举出至少五种方法（实验和生物信息学均可），画一个流程图来说明，并简述你列出的每种方法的研究目的和优缺点。本人对这方面不是很了解，希望各位可以慷慨解囊，谢谢！

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