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标题: 【求助】WESTERN 伯乐半干转膜条件求助 [打印本页]

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 17:57 标题: 【求助】WESTERN 伯乐半干转膜条件求助

各位大侠９９偶吧！
　本人暑假在四十几度高温条件下做ＷＢ．组织蛋白上样每孔２００ug，大约２０ul/孔，电泳８０Ｖ跑出浓缩胶，１００Ｖ分离胶至底部，切胶约３＊７ＣＭ２，伯乐半干转膜仪（２５０Ｖ／３．０Ａ／３００Ｗ），目的蛋白３８ＫＤ，３０ＭＡ恒流转１６０分钟，用的ＰＶＤＦ膜是师兄留下来的，也不知道是哪个公司产的，ＤＡＢ显色，效果还不错．
　现在分别用了millipore和北京中杉的ＰＶＤＦ膜，孔径是０．４５um,同样的条件做不出来了，每次转膜后都发现膜很花，怀疑是有短路电压过高所致（超过了２５Ｖ），封闭以及一抗二抗杂交后膜不花了，但是ＤＡＢ显色又全花了，目的蛋白出不来．现提出几点疑问，望好心人帮忙解答：
　１，恒流转膜和恒压转哪个效果好些，我们实验室的仪器不能超过２５Ｖ，有没有用伯乐半干转膜仪做过ＷＢ的大虾，４０ＫＤ左右蛋白转膜条件求助！
　２，膜花的原因是什么？并且感觉膜比以前用的要薄，会不会３０ＭＡ恒流转１６０分钟将目的蛋白转过了？
　３，偶还要做培养细胞的蛋白，每孔上样４０ug够了吗？

作者: JK.jon 时间: 2013-7-10 17:58

你的PVDF膜用之前用甲醇泡了没有，一般泡10秒就可以了（泡到膜全透明）还有可能就是你的封闭没封好。每孔上样４０ug够了

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 17:59

我们用的也是伯乐的，我比较过感觉恒流较好，一般60-20KD一起转，200mA左右35-45分钟比较好。此时电流一般不会超过25V。
我觉得用0.22的膜比较好，上海生工的NC膜用得挺好。细胞蛋白40ug可以阿

作者: glass 时间: 2013-7-10 17:59

200mA，45分钟不会超过25V么？我原来试过几次，100mA总是20多分中就超过25V了，然后继续转到1小时，之后染胶，上面大带小带还是一大堆

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 18:00

有一次用过一次100％的甲醇，膜放进去立刻溶解掉了，后来就都没有泡甲醇，但是那个时候都是做出来了的啊！
to xiaocan76：200MA估计电压会很高了吧，应该会超过25V的哦，我用30MA都要慢慢调才能使电压不超过25V呢！
我看论坛里有人推荐40KD左右恒压25v转1hr

作者: 98776langtao 时间: 2013-7-10 18:00

我做半干转膜时也出现过一次膜花的情况，但没有影响结果，当时考虑是电转的过程转移缓冲液加的太少的原因，现在做的时候铺好三明治再在上层滤

纸上滴一些转移缓冲液让它足够湿润。

我一直用横流转膜：1.5mA/膜面积，13KD的60min, 60KD的90min

millipore的PVDF膜好像都要用甲醇激活的，有的公司膜可能不用，你再问问millipore

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 18:01

我今天用甲醇激活膜了，没有出现花膜的情况了！
今天的目的蛋白约45KD，用25V恒压转了90 min，MARKER上的大分子量蛋白有些转到下层滤纸上了，杂交一抗1：200，二抗1：3000，DAB显色未出结果。不知道是膜转过头了还是杂交比例出了问题，望大家提点建议，谢谢！

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 18:01

各位大侠９９偶吧！
　本人暑假在四十几度高温条件下做ＷＢ．组织蛋白上样每孔２００ug，大约２０ul/孔，电泳８０Ｖ跑出浓缩胶，１００Ｖ分离胶至底部，切胶约３＊７ＣＭ２，伯乐半干转膜仪（２５０Ｖ／３．０Ａ／３００Ｗ），目的蛋白３８ＫＤ，３０ＭＡ恒流转１６０分钟，用的ＰＶＤＦ膜是师兄留下来的，也不知道是哪个公司产的，ＤＡＢ显色，效果还不错．
　现在分别用了millipore和北京中杉的ＰＶＤＦ膜，孔径是０．４５um,同样的条件做不出来了，每次转膜后都发现膜很花，怀疑是有短路电压过高所致（超过了２５Ｖ），封闭以及一抗二抗杂交后膜不花了，但是ＤＡＢ显色又全花了，目的蛋白出不来．现提出几点疑问，望好心人帮忙解答：
　１，恒流转膜和恒压转哪个效果好些，我们实验室的仪器不能超过２５Ｖ，有没有用伯乐半干转膜仪做过ＷＢ的大虾，４０ＫＤ左右蛋白转膜条件求助！
　２，膜花的原因是什么？并且感觉膜比以前用的要薄，会不会３０ＭＡ恒流转１６０分钟将目的蛋白转过了？
　３，偶还要做培养细胞的蛋白，每孔上样４０ug够了吗？

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对不起，我当时写错了，转膜时电流应该是300MA！由此给大家带来的不便，深表歉意！

作者: 8princess8 时间: 2013-7-10 18:03

各位大侠９９偶吧！
　本人暑假在四十几度高温条件下做ＷＢ．组织蛋白上样每孔２００ug，大约２０ul/孔，电泳８０Ｖ跑出浓缩胶，１００Ｖ分离胶至底部，切胶约３＊７ＣＭ２，伯乐半干转膜仪（２５０Ｖ／３．０Ａ／３００Ｗ），目的蛋白３８ＫＤ，３０ＭＡ恒流转１６０分钟，用的ＰＶＤＦ膜是师兄留下来的，也不知道是哪个公司产的，ＤＡＢ显色，效果还不错．
　现在分别用了millipore和北京中杉的ＰＶＤＦ膜，孔径是０．４５um,同样的条件做不出来了，每次转膜后都发现膜很花，怀疑是有短路电压过高所致（超过了２５Ｖ），封闭以及一抗二抗杂交后膜不花了，但是ＤＡＢ显色又全花了，目的蛋白出不来．现提出几点疑问，望好心人帮忙解答：
　１，恒流转膜和恒压转哪个效果好些，我们实验室的仪器不能超过２５Ｖ，有没有用伯乐半干转膜仪做过ＷＢ的大虾，４０ＫＤ左右蛋白转膜条件求助！
　２，膜花的原因是什么？并且感觉膜比以前用的要薄，会不会３０ＭＡ恒流转１６０分钟将目的蛋白转过了？
　３，偶还要做培养细胞的蛋白，每孔上样４０ug够了吗？

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说说我们的做法
1，就个人意见我觉得恒压转膜的效果更好一点，我们用的方法是100V恒压转膜3小时，但全程注意降温，因为会产生很多热量。
2，蛋白一般是不会转过的，膜先用甲醇泡10s左右，注意洗膜和封闭，牛奶要好，我们用的是光明的脱脂奶
3，细胞裂解液每孔上40ug足够了！

祝你好运！

作者: misswu61 时间: 2013-7-10 18:03

请问你们的目的蛋白分子量多大？用的是哪个公司的转膜仪？我用的是伯乐半干转膜仪，说明上标志有电压不能超过25v,如果按25v恒压转膜，45KD蛋白需要转多长时间？
PS：我今天将38KD蛋白25v恒压转60min，电流约70ma，一抗建议稀释范围1：100-1000，我用的1：200，二抗建议稀释范围1：5000-100000，我用的1：3000，一会就可以看结果了（我暑假的时候就是用的这个浓度做出来的）

作者: finger 时间: 2013-7-10 18:03

做半干转用的是NC膜，转之前没用甲醇泡过，转完之后发现膜花掉了，但封闭后用TBST洗过之后，膜好像掉了层东西又变干净了。怎么回事呢？

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作者: hold住 时间: 2013-7-10 18:05

NC膜不需要甲醇浸泡直接用转膜液浸泡就可以

膜花可能是膜的浸泡时间过短没有完全润湿还有可能是电流过大或是转移过程中降温不够

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