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标题: 【讨论帖】朊病毒 [打印本页]

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 15:33 标题: 【讨论帖】朊病毒

相关疾病：
牛海绵状脑病
朊病毒作为蛋白质病毒在版子里已经多次被大家谈起，从200多年以前被发现的羊骚痒症，到近两年的疯牛病，正因为这种能够自我复制的蛋白质病毒的神秘，才让我们一次又一次关注它。

关于朊病毒，蛋白质版早就想立一话题专门讨论，从关于朊病毒的基本知识，可以从病毒的分类开始，到朊病毒的结构，朊病毒感染活体细胞的机理，到朊病毒与相关疾病的研究，到朊病毒给人们对“蛋白质”认识的启示，所有的所有，只要是相关话题，大家都可以谈。可以说这个方向太广了。为了保证我们的讨论更有序，来学习的朋友更容易找到方向，建议：

将你所要讨论的方向写在第一行，哪些是转贴，来源，哪些是自己的认识标清。

非常欢迎大家积极参与讨论，可以提问题，可以回答版中的问题，也可以提自己的想法收获等。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 15:38

相关疾病：
感染牛海绵状脑病朊病毒病失眠
在展开话题前我先来简单介绍一下朊病毒（prion）

Prion 这个词最开始是由Prusiner （1997年获诺贝尔医学奖）描述一种具有感染性质的蛋白样物质。早期发现这种物质的特别之处是因为：用能降解核酸的条件处理它时，如离子，紫外放射，都不能减弱它的感染能力。同时，用处理蛋白质的方法，如蛋白酶作用能减弱其感染能力。

正常情况下prion 以无害形式存在，但它能导致有害物质的生成，导致各位疾病的发生。

以下是在网页上找到的一番关于朊病毒发现史的叙述：

300年前，人们已经注意到在绵羊和山羊身上患的“羊搔痒症”。其症状表现为：丧失协调性、站立不稳、烦躁不安、奇痒难熬，直至瘫痪死亡。20世纪60年代，英国生物学家阿尔卑斯用放射处理破坏DNA和RNA后，其组织仍具感染性，因而认为“羊搔痒症”的致病因子并非核酸，而可能是蛋白质。由于这种推断不符合当时的一般认识，也缺乏有力的实验支持，因而没有得到认同，甚至被视为异端邪说。1947年发现水貂脑软化病，其症状与“羊搔症症”相似。以后又陆续发现了马鹿和鹿的慢性消瘦病（萎缩病）、猫的海绵状脑病。最为震惊的当首推1996年春天“疯牛病”在英国以至于全世界引起的一场空前的恐慌，甚至引发了***与经济的动荡，一时间人们“谈牛色变”。1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利·普鲁辛纳（Stanley B.P Prusiner），因为他发现了一种新型的生物——朊病毒（Piron）。

斯坦利·普鲁辛纳经过多年的研究，终于初步搞清了引起搔痒病的病原体即阮病毒的一些特点。他发现阮病毒大小只有30一50纳米，电镜下见不到病毒粒子的结构；经负染后要见到聚集而成的棒状体，其大小约为10～250 x 100～200纳米。通过研究还发现，朊病毒对多种因素的灭活作用表现出惊人的抗性。对物理因素，如紫外线照射、电离辐射、超声波以及80～100℃高温，均有相当的耐受能力。对化学试剂与生化试剂，如甲醛、羟胺、核酸酶类等表现出强抗性。对蛋白酶K、尿素、苯酚、氯仿等不具抗性。在生物学特性上，朊病毒能造成慢病毒性感染而不表现出免疫原性，巨噬细胞能降低甚至灭活朊病毒的感染性，但使用免疫学技术又不能检测出有特异性抗体存在，不诱发干扰素的产生，也不受干扰素作用。总体上说，凡能使蛋白质消化、变性、修饰而失活的方法，均可能使朊病毒失活；凡能作用于核酸并使之失活的方法，均不能导致朊病毒失活。由此可见，朊病毒本质上是具有感染性的蛋白质。普鲁辛纳将此种蛋白质单体称为朊病毒蛋白（PrP）。
朊病毒病除上文提到的几种由朊病毒引起的疾病均发生在动物身上外，人的朊病毒病已发现有4种：库鲁病（Ku-rmm）、克——雅氏综合症（CJD）、格斯特曼综合症（GSS）及致死性家庭性失眠症（FFI）。临床变化都局限于人和动物的中枢神经系统。病理研究表明，随着阮病毒的侵入、复制，在神经元树突和细胞本身，尤其是小脑星状细胞和树枝状细胞内发生进行性空泡化，星状细胞胶质增生，灰质中出现海绵状病变。朊病毒病属慢病毒性感染，皆以潜伏期长，病程缓慢，进行性脑功能紊乱，无缓解康复，终至死亡为特征。

　　1982年普鲁宰纳提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”，以后魏斯曼等人对其逐步完善。其要点如下：①朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型PrPc）和搔痒型（致病型PrPsc）。两者的主要区别在于其空间构象上的差异。PrPc仅存在a螺旋，而PrPsc有多个β折叠存在，后者溶解度低，且抗蛋白酶解；②Prpsc可胁迫PrPc转化为Prpsc，实现自我复制，并产生病理效应；③基因突变可导致细胞型PrPsc中的α螺旋结构不稳定，至一定量时产生自发性转化，β片层增加，最终变为Prpsc型，并通过多米诺效应倍增致病。

作者: wood533 时间: 2013-7-19 15:55

相关疾病：
牛海绵状脑病感染
来源于：Wikipedia，自由的百科全书

朊病毒是一种具有感染性和自我复制能力的因子，也叫做普列昂获蛋白质侵染因子。虽然它们具体的活动和复制机制还不是很清楚，但是它们通常被认为是引起先前一系列人们了解甚少的传染性海绵状脑病的原因，这些脑病包括羊搔痒症和牛绵状脑病（也叫“疯牛病”）。这些疾病对脑组织结构的影响都是致命的和不可医治的。
朊病毒最早由美国旧金山加利福尼亚大学的斯坦利·B·布鲁辛纳（Stanley B. Prusiner）于1982年发现的。 Stanley B. Prusiner of the University of California, San- Francisco
Cited for his discovery of prions, “an entirely new genre of disease-causing agents……” 美国神经学家,因为提出"朊病毒学说"而获得1997年诺贝尔奖

推测朊病毒仅由蛋白质组成，没有核酸。在这之前，科学家认为所有的病原体都有可复制的核酸（细菌、病毒等等）。

研究人员发现了一个突破口：这种具有感染性的因子主要由被称为PrP的蛋白质组成的。这种蛋白质可以在细胞的膜上找到（具体功能还不了解），但是与具有感染性的因子PrpSC与正常因子PrPC在形状上有一点不同。科学家推测这种变形的蛋白质会引起正常的PrPC转变成具有感染性的蛋白质，这种连锁反应使得正常的蛋白质和致病的蛋白质因子都成为新病毒的材料。在这个假说被提出来以后，产生PrP的基因被抽离出来，产生不同形状的突变基因被成功的定义和复制，研究实验鼠的结果为这个假说提供了支持，这些证据现在是强有力的，但并不是无可争议的。

朊病毒似乎在直接与受感染的组织接触时感染性很强。例如，人们可能会因为注射直接来源于人类脑下垂体的生长激素而感染Creutzfeldt-Jakob疾病，或通过脑部外科手术的仪器传染（朊病毒可以幸存于通常为外科器械消毒的高压灭菌器）。通常也认为，使用受感染的动物可以通过积累缓慢地引起疾病，特别是可以引起朊病毒在时代间积累的同类相食或类似的行为。虽然这种风险没有被证明，但是现代农场不接受给反刍动物喂养反刍动物蛋白质粉末就是一个警惕。

朊病毒没有引起免疫系统察觉的原因是，它们的“安全形式”从个体出生的一刻起就存在于体内。“危险”朊病毒与之的差别只是它们的折叠结构有微微的差别。朊病毒通过不断聚合，然后在中枢神经细胞中堆积，最终破坏神经细胞。根据脑部受坡缓的区域不同，发病的症状也不同，如果感染小脑，则会引起运动机能的损害；如果感染大脑皮层，则会引起记忆下降。
有用的朊病毒并不是所有的染病毒都是危险的，事实上，它们存在于很多植物和动物中。正因为如此，科学家认为这些变形的蛋白质一定为它们的寄主带来了一些好处。这个假设在对一种特定的藓类植物进行研究的时候被证实。正常情况下，当一个地方的藓与另一个地方的藓长得足够它们的外层细胞向接触时，病毒会从一个受感染的藓的部分传播到另一个没有受感染的藓的部分。但是，软病毒似乎似乎会绕到被感染的藓的边缘部分。这可以引起藓边缘部分的细胞死亡，从而形成一个屏障，组织病毒穿过，从而避免受到污染。

1965年，研究人员在布赖恩·科克斯（Brian Cox）的指导下，发现了一种奇怪的遗传，他们把它称为[PSI+]因素（[PSI+] element）。1994年，里德·维克尼（Reed Wickner）提出假说，认为[PSI+]和另一个遗传因子都是朊病毒。很快人们就注意到热休克蛋白（heat shock proteins，可以帮助其它蛋白质正确折叠的蛋白质）可以减少[PSI+]的影响。研究人员的研究显示出了氨基酸序列如何帮助PSI蛋白质（Sup35p）在它朊病毒和非朊病毒状态间转化。这个研究使得Susan Lindquist认为，朊病毒转换在某种情况可能是有利的，使得它们在进化中得以保留。也有人推测朊病毒与细胞分化有关，这个过程由干细胞推动，把细胞功能专业化（例如肌肉细胞和血细胞）。英文中文版都有：cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/Prion')

《朊病毒分子病理学》（Molecular Pathology of the Prions ）
　　Harry F.Baker 编著，2001年Humana Press Inc.出版,279页。
　　作者系国际公认的朊病毒研究专家，他们在分子水平上综述了朊病毒研究的最新发展，用新的方法去了解朊病毒蛋白质和朊病毒疾病。利用各种关键技术，这些著名的科学家正在探索并阐述朊病毒蛋白质的正常功能，发现和测量对朊病毒疾病的早期免疫反应，尽可能地探索治疗的目标。他们还用转基因大鼠和新的电生理研究去阐明包括朊病毒在内的致病机理。
　　《朊病毒分子病理学》为基础研究和临床神经病理学家提供了最新的研究发展和方法，以了解朊病毒的发病机理。
本书特点：1. 包括了病理学组织上的显微镜方法分析的技术；2. 提供研究病理学的最新电生理技术；3. 应用转基因方法探索朊病毒疾病的发病机理；4. 概括最新的发展和方法以了解朊病毒疾病；5. 用大脑移植术研究致病过程。
PrpSc形成后,在生物体内选择靶神经元,或选择同源的PrpC.以PrpSc为模板,PrpC——Prp*——PrpSc
*(PrpC是一种膜糖蛋白,其代谢周期从内质网开始.GPI锚和甘露糖在那里迅速附着于PrpC,再沿细胞分裂途径送至高尔基体N-寡糖被修饰并唾液酸化;再由分泌小泡运送至细胞外表面.绝大部分以GPI锚锚定在细胞表面;经过半衰期
3-6个小时后重新进入细胞内.)

作者: wood533 时间: 2013-7-19 15:57

相关疾病：
感染朊病毒病
一．朊病毒一般性质：
朊病毒的早期认识多源于羊瘙痒病的研究，它是一种具有侵染性且不含核酸的蛋白质。朊病毒蛋白(PrP)分子量为27，000至30，000，是构成朊病毒的基本单位，PrP本身不具有侵染性，由3个PrP分子构成的“朊病毒单位”具有高度侵染性。PrP 还能聚合成杆状颗粒，约由1000个PrP构成的这种杆不单独存在，总是排列成丛。杆和丛都有传染性[7，8]。PrP由17种氨基酸，246个分子组成[7]。它包括两种形式[9]：细胞型（the normal or cellular form of prion protein, PrPc）和异常型（the pathogenic or scrapie form of prion protein , PrPSc）。PrPC分子量33—35KU，含一对二硫键和2个N 型复合寡糖链，二硫键和糖基化残基都在PrP的C端。N端含22个氨基酸残基组成的信号肽序列，C端含由23个氨基酸组成的糖基磷酸肌醇锚受体结合位点（GPI）[10]。PrPC是一种膜蛋白，已证明它是定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDS）[11]。PrPSc与PrPC具有下列不同生化特性：（1）在非变性去污剂中PrPSc是不溶的[12]；（2）PrPSc具有相对的抗蛋白酶水解特性[13]；（3）PrPC和PrPSc都依赖GPI附着在细胞膜表面，经磷酸肌醇脂酶C（PIPLC）酶解后PrPC从膜上释放出来,而PrPSc不释放，TritonX-100进行相分配后，PrPC处于水相,而PrPSc处于TritonX-100相中[14]；（4）特异的抗体只与PrPSc有血清反应，而与PrPC无反应，证明两者含有不同的构象表位[15]。（5）糖基化比例和部位不同，PrPSc糖基化比例要低于PrPC[16]。

二.朊病毒基因及表达：　
朊病毒蛋白本身并不含有核酸，它是由宿主染色体基因编码的。迄今已克隆了人、25种非人灵长类动物、仓鼠、小鼠、大鼠、牛、绵羊、水貂、大捻和阿拉伯大羚羊等的朊病毒蛋白基因，并推导和测定了它们的序列。人的朊病毒蛋白基因定位于20 号染色体短臂上，小鼠的朊病毒蛋白基因位于第2号染色体短臂上，有研究者认为PrP基因为一持家基因[17]。朊病毒蛋白的RNA并不是由一个外显子组成，但整个开放阅读框（ORF）包含在一个单一的外显子中，这消除了各种结构异构体的朊病毒蛋白是由于RNA的拼接而翻译成的。但不排除象RNA编辑及蛋白质的拼接等机理的存在[18]。
　　
对 cDNA5’的分析发现其mRAN在不同位点启始，Northern杂交也说明鼠的不同组织中朊病毒蛋白mRNA水平各不相同，最高表达量在脑部和胎盘，这说明朊病毒蛋白的表达是组织依赖型的[19]。

三．朊病毒的感染、增殖和构象转化：
虽然作为传染性海绵脑病（朊病毒病）原型的绵羊痒病已有260多年历史，但直至1982年Prusiner首次提出朊病毒假说人们才认识到它的病源物。目前，其假说中蛋白质致病部分已为大多科学家接受，但朊病毒的感染途径、增殖方式仍存在争议。

1. 传染途径：
Jackson[20]认为人感染朊病毒病有三种可能途径：

一是遗传突变，使朊病毒蛋白失去细胞型而易于折叠成致病型；

二是医源性感染，如角膜转移手术中的捐献者为朊病毒的感染者[21]，注射用的人生长激素和促性腺激素是提取于朊病毒病患者的腺垂体[21]；

三是饮食感染，如食用朊病毒病患者的脑组织[21]。而Alter [21]不认为遗传突变是感染朊病毒的病因，他提出自然得病学说，认为PrPSc可能是PrPC翻译后转变而成的。

2．朊病毒增殖的可能机理：
大多学者认为有一编码朊病毒氨基酸序列的基因组，但此DNA不存在于朊病毒中，而是正常哺乳动物基因组的一部分。

朊病毒的感染可活化或改变这一基因，使之转译出蛋白质。

亦有人认为朊病毒中存在某种小的核酸片段，它可能是基因活化的扳机。此片段插入到寄主细胞染色体的PrP基因前面，即在此基因转录起始位点之前，插入的核酸片段可作为基因表达的启动子或强化子。如果朊病毒本身只含有蛋白质，PrP本身可能结合到DNA控制PrP基因转录的区域而起到同样的作用。大多数结合到DNA上的蛋白质都趋向于阻遏基因的表达，但一种蛋白质刺激其本身合成的现象并不是没有先例[22]。　
　　
此外，有少数学者认为朊病毒是通过与生物中心法则不同的信息流来增殖的。它可能先由PrP转译成RNA或DNA，然后再合成子代PrP。这一过程需要逆转译酶和逆转录酶，前一种酶还从未被发现过，也可大胆设想朊病毒的氨基酸序列可直接作为模板合成新的蛋白质分子，但这种蛋白质指导的蛋白质合成也从未被发现过[22] 。
　　
可见，朊病毒增殖的研究不仅对这类特殊病原物是重要的，还牵连到生物中心法则，是一个十分有意义的问题。

3.朊病毒蛋白的构象转化：
大多学者认为PrPSc的是由PrPC转变而成。对于朊病毒基因的序列分析表明PrPC和PrPSc具有相同的氨基酸序列和共价修饰，而利用FOURIER变换红外光谱（FTIR）和圆二色谱（CD）对其二级结构的研究证明两者之间存在构象上的差别，牛朊病毒成熟蛋白正常型（bPrPcL）中?-螺旋约占36.1%, ?-折叠约占11.9%，无规则卷曲约占33%，转角约占19%[23]而PrPSc则含43%的?-折叠，及30%的?-螺旋 [24,25] 。　
　　
有研究者观测到在酸性条件下PrP有两种折叠途径，通过对人PrP的90-231残基片段[26]和鼠PrP的121-231残基片段在PH4.0的研究发现一个折叠平衡反应的中间体，这个中间体构象主要为?-折叠[27]，专家推测它就是PrPC向PrPSc转变反应的中间体。最近对人的PrP91-231的研究表明，在酸性条件下PrP可折叠成几乎全是?-折叠的可溶单体[20]。现认为溶解性、PH、氧化还原电位共同决定PrP折叠途径[20,28]。还有实验证明肽链内部疏水基团之间的作用[29]和肽链与金属离子结合情况[30]影响PrP折叠方式。
　　
那么，PrPC是如何转变成PrPSc的呢？研究者提出两种不同的机理[31]：

一种转换模式认为PrPSc的形成是一种核依赖的聚合过程，即“种子”模型。PrPSc低级聚合物充当“种子”。在没有“种子”存在时，固有的PrPC和极少量PrPSc单体之间发生快速的可逆性构象变化。这是一平衡反应，PrPC单体构象比PrPSc稳定。当条件适宜时，PrPSc分子之间可互补缔合而变得稳定。从而使平衡式向PrPSc方向反应，直至形成一稳定的“种子”。这个“种子”可通过互相粘着而继续生长，最后碎裂成小的感染单位。对于这个稳定转换过程的障碍就是起始的核形成过程。低级聚合物的形成在热力学上并不是有利的，因为依靠分子间相互作用所获得的自由能不足以抵消结合所带来的熵增加，直到一个最小规模的核形成后，这种状况才得到改观。这种模式表现出聚合反应的一些特征，如需要超过临界浓度的蛋白质浓度以及动力学反应是一个拖后的相变化，此模式能解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病。此模式已有科学实验支持[32]。　　
　　
另一种转化模式是模板介导的转换过程，即重叠模式。这种模式认为PrPSc构象比PrPC更稳定，这种转换在热力学上有利但在动力学上却进行得十分缓慢，两者间存在着能量屏障。在这种模式中，PrPSc依靠催化PrPC或一个不稳定的中间体的重排来提高转换，以形成更稳定的PrPSc构象。感染性将依赖于PrPSc结合和催化中间分子转换的能力。这种模式能够解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病。点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量，同时加快它转换PrPSc的速率。但此模型还无科学实验支持。　
　　
实际上，这两种模式并不是互相排斥的，在朊病毒繁殖过程中可能是这两种模式共同作用。

四．致病原因：经过将近20年的研究，朊病毒本质及引起细胞死亡的原因依然不清楚。现在大多学者认为PrPSc是致病物。到目前为止最高浓度的富集制备物中每105个PrP单体包含一个感染单元[33]。已有许多假说解释海绵化和神经细胞丢失的机制。研究表明PrP106-126片段对神经有直接的毒害作用[34]。当缺乏PrPC时神经元被氧化的可能性增大，这表明PrPC可能有抗氧化的功能[35]。亦有人提出PrPC具有调整程序细胞死亡的功能，在感染过程中PrPC缺乏而导致细胞死亡。最近有许多报道在朊病毒感染的脑神经组织中发现了大量程序性细胞死亡，还不清楚这些细胞是否是由朊病毒的感染而引起的[20]。但是，亦有深刻系列的实验证明PrPSc本身并无毒性。这些学者认为PrPSc的感染引起PrPC的缺乏，而PrPC的缺乏才是朊病毒病的真正病因 [36，37，38]。

作者: any333 时间: 2013-7-19 15:57

我记得刚不久有文章说朊病毒致病需要RNA的参与！

作者: redbutterfly 时间: 2013-7-19 15:58

其实，研究朊病毒的致病机理，首先应该弄清从正常的alpha-螺旋为主的蛋白质结构到bata-折叠为主的致病结构转变是由基因突变造成的变构还是由蛋白质在周围化学物质的影响下造成的变构。就是说这种变化是在核酸水平上还是在蛋白质水平上。
个人意见！！

作者: INK 时间: 2013-7-19 15:58

相关疾病：
脑炎
蛋白质因其缺乏遗传表面，而且遗传嗅觉不灵敏，不能作为遗传物质，早已成为定论。Prion（传染性蛋白质颗粒）问题对此带来一片疑云。把羊疯痒闰（scrapie）、牛海绵状脑炎（bovine spongiform encephalopathy，BSE）、人库鲁（Kuru）症、克罗伊茨费尔特-雅各布（Creutzfeldt-Jacob）综合征、格-斯-沙（Gerstmenn-Straussler-Scheinker）综合征的病原传染性蛋白颗粒（proteinaceous infectious particle）定名为prion，为的是和类病毒、拟病毒相区别。

prion蛋白（prion related protein，简称PrP）由宿主的基因编码。人PrP基因位于20号染色体的短臂，鼠PrP基因位于2号染色体。健康人、畜的PrPc其相对分子量为33~35kDa，对蛋白酶敏感、无传染性。

而病人、病畜PrPsc的N端比PrPc约少50氨基酸，相对分子质量27~30kDa，抗蛋白酶，有传染性。迄今未见prion内有常量核酸。用种种降解核酸的办法提取传染性颗粒，传染性不会下降。据计算，即使残留有核酸，其长度也不会超过80个核苷酸。传染时也不携带外源核酸。此病潜伏期有长、短之分，其传染有种属屏障，有不同的株系。潜伏期长短之不同，由突变氨基酸所处位置和突变的性质而定。种属屏障由氨基酸序列差异而来。

PrPsc不是单体而是多聚体，PrPsc多聚体三维结构不同，是株系不同的原因。从十几年的研究结果来看，PrPc转变为PrPsc是由于翻译后修饰之故。PrPc以α-螺旋为主，PrPsc则多β-片层；PrPsc的N端剪短，增加β-片层，但无损于传染性。PrPc的原有功能不明。将小鼠编码PrPc的基因剔除（knock out），然后用传染性蛋白质颗粒浸染，在众多感染小鼠中，起码能活上2年，而且健康，无疯痒病征；PrPc基因健在的小鼠，经传染性颗粒侵染后，半年之内，统统死亡。此实验充分证明PrPsc确由PrPc译后修饰而来，也排除了微量外源核酸的作用问题（图1-2）。

最近报道酵母线粒体伴娘蛋白Hsp60（由核基因编码）缺失突变体中，输入的野生型Hsp60不能折叠、组装成为有功能的14聚体。共生蛋白（symbionin）和GroEL（细菌Hsp60）有85%同源，能使叶绿体中未折叠的核酮糖二磷酸羟化酶亚基在离体条件下正确折叠起来。根据这些现象，可以推测病人、病畜的PrPsc指导健康人、畜PrPc折叠、组装，使人、畜罹病。将人工合成的PrPc与天然的PrPsc混合，产生一种PrPc复合物，其许多特性都和PrPsc相似；加2%十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl，即sodium dodecyl sarcosinate）则不能形成这种复合物；只有PrPc而不加PrPsc也不能形成这种复合物。这种具有PrPsc许多特性的PrPc复合物是否有致病性，尚未进行研究。

无独有偶，酿酒酵母的蛋白质Sup35p、Ureap以及鹅掌柄孢壳（Podospora anserine）的Het-s和PrPsc一样，也有传染性，也能聚集成为抗蛋白酶的凝聚体。将正常Sup35pPsi-和先前已有的PrPsc样的Sup35pPsi+共同温育，只要添加适量的伴娘蛋白Hsp104p，可使前者转变为后者；而且重复多轮，仍然保持传统活性。研究清楚其中道理，对了解哺乳动物PrPsc的增殖，将会提供有用的信息。
----摘自：
童克中，基因及其表达，科学出版社，2001，第二版，3-5

作者: tangxin_80 时间: 2013-7-19 15:59

相关疾病：
脑炎感染
篇名： Positioning of follicular dendritic cells within the spleen controls prion neuroinvasion
刊名： Nature
ISSN： 0028-0836
卷期： 425 卷 6961 期出版日期： 20031030
页码：从 957 页到 962 页共 6 页

Peripheral infection is the natural route of transmission in most prion diseases. Peripheral prion infection is followed by rapid prion replication in lymphoid organs, neuroinvasion and progressive neurological disease. Both immune cells and nerves are involved in pathogenesis, but the mechanisms of prion transfer from the immune to the nervous system are unknown. Here we show that ablation of the chemokine receptor CXCR5 juxtaposes follicular dendritic cells (FDCs) to major splenic nerves, and accelerates the transfer of intraperitoneally administered prions into the spinal cord. Neuroinvasion velocity correlated exclusively with the relative locations of FDCs and nerves: transfer of CXCR5-/- bone marrow to wild-type mice induced perineural FDCs and enhanced neuroinvasion, whereas reciprocal transfer to CXCR5-/- mice abolished them and restored normal efficiency of neuroinvasion. Suppression of lymphotoxin signalling depleted FDCs, abolished splenic infectivity, and suppressed acceleration of pathogenesis in CXCR5-/- mice. This suggests that prion neuroimmune transition occurs between FDCs and sympathetic nerves, and relative positioning of FDCs and nerves controls the efficiency of peripheral prion infection.

Prion对小鼠生物钟的改变?这不是很新的研究结果但是值得看看！
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传染性泡状脑炎（TSEs－transmissible spongiform encephalopathies）的临床诊断一直是一个很困难的问题，因为往往要到疾病发展到晚期的时候病人才能表现出临床症状来。Dell'Omo et al.在European Journal of Neuroscience上报道的最新研究发现被不同prion种系所感染的小鼠在临床症状产生之前就表现出生物钟活性的显著改变，而且这些改变是与prion的种系有关的。
研究者将小鼠用三种prion种系进行感染，分别是139A、ME7和牛的泡状脑炎BSE种系301C。用一个自动的跟踪系统，小鼠的活动被连续的监控了七个星期。最显著的活动改变出现的夜间，小鼠最活跃的时期。注射了301C和ME7的小鼠表现出夜间活性的持续抑制，从开始监控时就产生。而139A种系注射小鼠则一开始表现出正常的活性，但在临床症状开始产生后表现出异常的活跃。在11周后，301C注射小鼠表现出比ME7注射小鼠活动少的多。
研究者认为这种监控的系统同样适用与大型动物，这显然是早期诊断的一个重要指标，而且如果活性改变还与病毒种系有关的话，检测出受感染动物是受何种病毒感染也是十分可能的了。

相关文章及链接：
ORIGINAL RESEARCH PAPERS
Dell'Omo, G. et al. Automated home cage monitoring of mice infected with BSE and scrapie differentiates early behavioural changes according to prion strain. Eur. J. Neurosci. 2002 (doi:10.1046/j.1460-9568.2002.02128.x)

FURTHER READING
Collinge, J. Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annu. Rev. Neurosci. 24, 519-550 (2001) | Article | PubMed |

WEB SITES
Encyclopedia of Life Sciences: prion diseases

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 15:59

非常感谢楼上大家的讨论，刚刚帮楼上几位重新编辑了一下贴，把我看到的要点加黑或加红，希望有助于来此的朋友阅读。

对于朊病毒我也知之不多，从上面的贴子中总结出了下面几点，也希望大家一同补充：

1。朊病毒是一种蛋白质病毒，能够自身复制，而因为它没有（或是带有极少量的核酸，小于80bp），所以大体上认为它的复制是宿主细胞编码而成的。如 hp521 提供的材料探讨了几种朊病毒复制的机理：

（1）朊病毒活化了宿主细胞的基因，使原来不编码的部分编码成为病毒蛋白；

（2）很短很短的核酸序列插入宿主基因组内，起到强启动子的作用，将下游基因强制表达（个人理解类似于MMTV mouse mammary tumor virus 的作用机制）；

（3）中心法则的补充，有逆转译酶的作用，使蛋白质直接复制为蛋白质。这种说法到现在为止还是个假想，因为还没有这种酶被发现过。

2。朊病毒在正常状态下是不致病的，当它从正常构象细胞型（PrPc）转变为异常型（PrPSc）时才会致病。于是又有了关于致病机理的讨论：

根据 hp521 提供的材料，提出了两种模型：

（1）平衡模型，即正常构象更稳定于异常构象
（2）重叠模型，即两种构象的存在有个能量差

我个人理解两种模型其实本意是相似的，即两种构象的变化以能量为基础。

金色田野提供了另一个视野：正常朊病毒蛋白与异常蛋白在蛋白组成上不同，异常蛋白的N端要少出几十个AA，从而使异常蛋白抗蛋白酶，具有感染性。而这种变异蛋白的突变发生位点和种属来源直接与其致病性相关。

这种构象不同又表现为，正常蛋白alpha 螺旋为主，异常蛋白以beta折叠为主。由一些来自于酵母菌的分子伴侣的实验证据推测为：是一些分子伴侣参与了正常蛋白的异常折叠，从而发挥了异常的功能。

话说到此就在想，也许现在还没有找到一个好的方式来分离致病异常蛋白和非致病蛋白，否则也很清楚到底是蛋白质序列改变的问题，还是蛋白质构象发生改变的问题。从现有的材料看起来，这两个问题还不是很清楚。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:01

相关疾病：
牛海绵状脑病
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/413200')

眼镜蛇在一些时日前对朊病毒有过一番论述，原贴链接在上面。他主要提出了一些现在对朊病毒仍悬而未解的疑问，关于其中的一点，到底是朊病毒序列的变化还是构象的变化导致了致病性的产生，我们已经有过些许探讨。下面看一看眼镜蛇的论述：

几个问题：

1。为什么BSE（疯牛病[icesugar75 注]）在英国以前未爆发？

英国20世纪80年代初改变了传统的饲料生产流程，降低了饲料中的脂肪含量，脂肪被认为是免受PRION感染的重要因素之一

2 Kuru病是第一个被发现和PRION有关的人类疾病，但当流行区改变了食尸习俗后，发病率显著降低甚至为零，基本排除了垂直传播或动物传播的可能

目前对于Prusiner 提出PRION 是TSE病原的不同意见（有些个人看法在里面）：
1。 PRION是病原还是病原作用的对象？是因为病原感染宿主后，PRION的二级结构才发生变化，还是PRION在宿主体内自动发生结构改变而致病？怎么实验证实这个事件是我们应该考虑的。

2 。研究表明已有的PRION“毒株”经过传代20代以后仍然保持稳定。单单依靠第遗传二密码如何实现传递如此庞大遗传信息的过程？密码子20个，二级结构的种类就更少了。

3 。现在发现了好几种和PRION有关的人兽共患病，如何在人兽之间流行？有的中间宿主没有确定，有的感染途径如血液等一直未得到肯定。

4。小分子的核酸也可能对UV或离子耐受，而且也发现过ssDNA抵抗UV的先例，是否提示了PRION背后可能至少部分和核酸有关？

5。中心法则及其补充经过了无数次实验的考验。如果Prusiner的学说完全正确，无疑从一定角度对它发起了挑战，尽管我们不能墨守陈规，但对动摇生命科学根基的理论还是应当三思。

所以Prusiner的获奖引起了一些争议，历史上第一次把未获证实的诺贝尔奖授给了至少在相当大程度上还是假说的创立者。我坚信真理越辩越明。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:01

我们已经对朊病毒有了一个大概的了解，作为唯一的蛋白质病毒（so far），它给蛋白版带来了这么好的话题。下面，想提一篇文章，关于朊病毒复制机理的文章，欢迎大家共同读一下，有心得可以写在这里，有问题可以提出来，我们共同学习，在讨论中共同进步。

文章来源：Nature 2003 Oct, vol 425, page 717-720

题目：RNA molecules stimulate prion protein conversion

文章简要介绍：我们前面提到过朊病毒非致病性到致病性的转变。这篇文章要证明的假设是，这种构象转变需要RNA分子的存在（in vitro）

大家都有过读文章和写文章的经历，一篇学术文章，首先要有假设(hypothesis)，然后在文章中设计实验来证明这个假设，再从所得到的实验结果得到最终的结论(conclusion)。一篇文章是否严密，首先要看所设计的实验能否验证这个假设，第二个重要的步骤就是，从所得到的实验结果，能否推出文章最后的结论。

应该承认的是 nature 上的文章因为篇幅所限，有些步骤分得不是很清楚。我们暂以这篇文章为例，读一读关于朊病毒的进展，同时来找一下文章的假设、实验和结论都是什么，每一个环节都是否严密。文章能发在 nature 上，它九成会是篇好文章，但不排除被我们挑出瑕点的可能，我们一起来试一下！

作者: 2541 时间: 2013-7-19 16:02

正常朊蛋白的可能功能

PrPc是一种膜糖蛋白，通过GPI锚定于细胞膜。其代谢周期从内质网开始。GPI锚和甘露糖聚糖在那里迅速附着于PrPC，再运送至高尔基体，在该处它们的N-寡糖被修饰并唾液酸化。然后，由分泌小泡运送至细胞外，以GPI锚固定于细胞表面，以磷酸脂酶或蛋白酶处理能将其除去。PrPc正常的半衰期只有3-6小时。它似乎是通过内陷(caveoae)重新进入细胞内降解。其正常功能目前还不明确，可能的功能是：铜结合蛋白；PrPc的表达可能对GABA(γ-氨基丁酸)的受体功能是必需的，通过细胞的信号转导来影响受体的功能；PrPc通过与电压敏感的钙通道相互作用，从而与细胞内钙的调节有关；PrPc可能在细胞上长期存在，起调节突触功能的重要作用。PrPc通过与GABA系统的相互作用而影响昼夜节律；PrP可影响长期记忆；还可能参与淋巴细胞活化[4，15，16，17] (图2-2)。

抗PrPSc形成的研究（请问这一部分是不是指朊病毒蛋白从正常型到异常型需要X蛋白的作用？为什么取名X蛋白呢，不知对X蛋白的研究是否有什么进展。在这里如果把X蛋白理解为“蛋白折叠的分子伴侣”，不知是否合适？）

　　人们未能分离出X蛋白，但已找到确切证据证明其在PrPSc形成中的作用[12]。替换PrPc 214～218位残基会阻止PrPSc的形成。绵羊171位氨基酸残基突变成Arg以后，表现出明显的TSE抗性。167和171位氨基酸残基突变后，也有类似结果[1]。此结论似乎可以反证“氨基酸残基95～170的区域，形成PrPSc与PrPc结合的界面，在残基165～171位组成内环,为X蛋白结合位点”这一推测的合理性。基因突变可以干扰PrPSc与PrPc的结合及Ｘ蛋白的作用。

朊病毒作用于细胞的可能机制
　　朊病毒作用于细胞的可能机制主要是自由基学说。1996年Brown等证实人工合成的人类朊蛋白第106～126位氨基酸残基序列对表达PrPc的神经细胞有毒性作用，对正常的星形胶质细胞或PrPc缺失的小胶质细胞则无毒性[13]。机制是此段多肽提高细胞内氧化自由基浓度，而致使神经元凋亡[7，8，9]。朊蛋白的神经毒性作用基团主要集中于106～126位氨基酸多肽链区域[9，10]。实验表明由PrPc106～126诱导的细胞死亡可归因于凋亡，细胞的凋亡程度依赖于PrPc106～126的浓度[3]。PrP蛋白N-末端的无规卷曲区域可能不直接参与致病过程。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:02

PRP，非常感谢你的这篇综述，觉得写得很不错，和我们要讨论的话题十分贴近。可是后面几个图，三级结构和构象转变的，看不到。是我电脑的事还是图没有附上？如果手头还有，可否贴上来让大家看一看？

下面这张图是PRP综述里的图一，朊病毒蛋白的二级结构图：

图片附件: 43085935.jpg (2013-7-19 16:02, 59.85 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17143

作者: zsxan1990 时间: 2013-7-19 16:03

prp 三级结构

图片附件: 10980078.jpg (2013-7-19 16:03, 20.96 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17144

作者: zsxan1990 时间: 2013-7-19 16:03

PrPc向PrPSc转中X蛋白作用模式图。
在此做一下说明，图中的protein X 就是在前文提过的蛋白X，是指导alpha 螺旋为主导的正常朊病毒蛋白变为beta 折叠为主导的异常朊病毒蛋白（致病蛋白）的分子伴侣。刚查了一下，对X蛋白的研究现在还没有更多进展，只知道它是一个分子伴侣。[icesugar75 注]

图片附件: 38239610.jpg (2013-7-19 16:03, 18.14 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17145

作者: mamamiya 时间: 2013-7-19 16:03

这张是具有感染性的朊病毒蛋白的结构图，注意是以折叠为主：

图片附件: 12684741.gif (2013-7-19 16:03, 22.84 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17146

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:04

不知大家有没有时间读一下上面推荐的 nature 上关于 “prion 复制需要小分子RNA的参与” 这篇文章？

文章一点不难，而且要证明的事情很简单：具有感染性的朊病毒蛋白在复制时需要RNA分子的参与。

1。用不用全文翻译？
2。是译为主还是讨论实验方法为主？
3。有多少朋友能参与讨论？大家能投入多少时间？（我可以帮忙找背景材料，如果参与讨论的朋友不懂哪一步可以提出来，我不行还有别人行呢）

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:06

相关疾病：
感染
文章来源：Nature 2003 Oct, vol 425, page 717-720

题目：RNA molecules stimulate prion protein conversion

先把我上面的问题 hang on 着，欢迎大家在文章讨论的同时随时提出宝贵意见，您的参与是对我最大的支持和鼓励！一篇文章的讨论并不是最重要的，最重要的是想通过这种形式，来帮助大家学会怎么阅读论文，怎样通过阅读别人的文章来build up 自己的科研思维。（也许话说得大了些，大体上是这个意思吧）

下面我就简单介绍一下这篇文章的内容。

文章的假设直接指向：具有感染性的朊病毒的复制需要小分子特异性RNA的参与

文章所用条件：体外

（对体外模型当然有不周到的地方，对此，在文章介绍中第一句就提到：We previously showed that PrPres amplification in vitro shares many specific features with the pathogenic process of prion propagation in vivo, including strain and species specificity. 这里还特意指明了，研究结果表明不同种属来源的朊病毒和朊病毒的不同strain 性质相似。附件的图版是不同鼠体内朊病毒的构象相似状况，请看一下）

主要实验技术：跑胶（蛋白胶和核酸胶）

（方法十分简单，这也验证了一些说法：NATURE或SCIENCE上的文章，实验方法可以很普通，主要在创意。如果我们中的谁想到了一个好主意，只加了加热，也一样可以发在NATURE，SCIENCE 上）

请大家注意一下：这篇文章主要讨论的是有感染性的朊病毒的复制过程，而上面我们讨论过的更多是关于无感染性朊病毒到有感染性的“构象转变”，所以请不要混淆了。

文章based on 的一些理论依据是：有感染能力的朊病毒的复制不需要核酸（一些实验证据表明的）；构象翻转机制现在还不清楚。

文章的思路：被朊病毒感染的Hamster （一种大鼠，仓鼠？）的脑匀浆与健脑匀浆混合，三十七度过夜，测具有感染性的朊病毒蛋白的增殖（diluted prion-infected brain homogenate (0.1% w/v) is mixed with either 5% (w/v) normal brain homogenate or buffer control and incubated overnight at 37 oC. Hamster Sc237 PrPres is amplified about sixfold under these conditions ）；为了证明不是蛋白酶、核酸酶、双链小RNA、DNA与RNA杂交体、单核苷酸的作用，分别把它们的抑制剂或降解试剂加入，再跑胶，看是否对复制有影响

文章结论：

-- 有感染性朊病毒体外复制需要特异性小RNA分子的参与

-- 哺乳动物RNA有作用，而非脊椎动物的RNA不行

-- 有感染性病毒的复制过程中，宿主的RNA可能参与了构象翻转

文章有很多疑点，希望大家按着这个思路读一下，我们一起讨论一下这篇文章。时间很多，我们可以讨论一个月，两个月。文章讨论时贵精不贵多，有了思路和方法以后就好读多了。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:10

相关疾病：
感染
这是来自不同物种：mouse, hamster 的朊病毒的构象（从多螺旋结构看来应该是不具感染能力的），很相象。

图片附件: 41388716.snap.jpg (2013-7-19 16:10, 40.42 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17147

作者: 49888 时间: 2013-7-19 16:20

Benzonase

<enzyme> Product of genetic engineering which hydrolyzes both DNA and RNA; from serratia marcescens(粘质沙雷氏菌);both Dnase and Rnase activity.
Synonym: benzon nuclease, ben endonuclease
Benzonase® - The smart solution for DNA removal
For the first time, an effective biochemical method is available for removing DNA and RNA from laboratory and industrial scale bioprocesses. It is called Benzonase® endonuclease.
Benzonase® is a unique, genetically engineered endonuclease offering a variety of advantages over existing methods of nucleic acid removal.
Benzonase® endonuclease has proven its value in the laboratory for well over ten years and is successfully applied in the pharmaceutical and biotechnological industry in the downstream processing of biopharmaceutical actives e.g. monoclonal antibodies, virus vaccines, gene therapy and recombinant proteins from E.coli.

Benzonase® is applied whenever the presence of nucleic acids might cause interference i.e.

• Purification and characterisation of proteins, and peptides
• Purification of antibodies and viruses for therapeutic use
• Safety of biopharmaceuticals

FDA guidelines for the manufacture of recombinant biological entities for therapeutic use demand that nucleic acid contamination should be limited to 10 pg per dose. Benzonase® - alone or in combination with other steps - offers a powerful and well-accepted tool to achieve regulatory requirements.
Benzonase® is covered by several patents, i.e. US Patent No.5,173,418, EP Patent No.0229866 B1

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:23

第二个问题：micrococcal nuclease 是什么酶，作用特点？

既是第二个问题，加一点点难度：除了用英文，用部分中文解释一下。

问题提示：同第 1 题，文章中没有，可查资料回答。

作者: rxcc33 时间: 2013-7-19 16:29

起源 : Staphylococcus aureus菌体的培养液
概述
Micrococcal Nuclease-------微球菌核酸酶(MNase)是一种内切核酸酶，作用于单链及双链核酸[包括DNA 和RNA <icesugar75注>]，生成3'磷酸末端。对单链核酸的作用较好，能较好地分解DNA或RNA的富含AT或AU区域。本酶不需要Mg2+,其催化作用需要Ca2+的存在。

活性定义: 以热变性小牛胸腺DNA作底物，在37℃，pH8.0的条件下，30分钟内生成1 OD260的酸可溶性物质的酶的活性定义为1 U。
纯度 50 U的本酶和1 μg的λ-DNA在Mg2+存在下37℃反应10分钟，DNA的电泳谱带不发生变化 .SDS电泳表现95%以上的纯度。
使用注意 : 本酶的活性严格依赖于Ca2+的存在，用EDTA或EGTA可以终止反应。
用途: 细胞粗抽提液中核酸的水解。
为制备核小体 (Nucleosome) 时消化分解染色质 (Chromatin)
参考资料：
Pelham, H. R. and Jackson, R. J., Eur. J. Biochem. 67, 247 (1976).
Noll, M., Nature 251, 249 (1974).
Heins, J. N. et al., Proc. Nucl. Acids Res. 1, 79 (1976).

Ye, X. et al. Defective S phase chromatin assembly causes DNA damage, activation of the S phase checkpoint, and S phase arrest. Mol. Cell 11, 341-351 (2003) | PubMed |

Mujun Zhao*, Zhenyu Wu, Wenlin Chen, Tsaiping Li:“The Biological Significance of Micrococcal Nuclease (MNase) hypersensitive sites of rRNA chromatin template of Silkworm Attacus ricini”， Molecolar Biology of the Cell. Vol.10, (Sup) pp.282a, 1999

作者: lixi559 时间: 2013-7-19 16:30

Benzonase is a genetically engineered endonuclease which degrades both DNA and RNA strands in many forms to small oligonucleotides. It promotes quick reduction of the viscosity of cell lysates, which facilitates ultracentrifugation and increases the capacity and life of chromatography columns. It saves time, reducing proteolysis and increasing the yield in targeted protein and offers complete elimination of nucleic acids from recombinant proteins.
来源:cuturl('http://www.oswel.com/code/en/mod_38.htm')

作者: pencil菲 时间: 2013-7-19 16:31

我注意到这篇文章不是以article而是以letter形式刊登的，所以觉得Nature的编辑还是相当慎重的。蛋白质折叠的问题是中心法则的最后堡垒。现在如果能弄清楚新生肽如何折叠，无疑将是最的重大突破。但是我们研究蛋白质时，大多是进行的体外实验，当然这符合先把问题简单化然后再把问题复杂化的顺序，可体内和体外的差别很大，如我以前发的一个帖说生物大分子的拥挤环境对蛋白质的影响一样，现在人们对体内生物大分子环境如何影响蛋白质的折叠越来越关心。所以，PrP如何完成折叠，体外和体内还是有些区别，特别是要考虑到体内免疫系统的参与，考虑到体内生物大分子拥挤环境的参与，也许确实需要小分子RNA，更有可能的RNA的背后还藏有别的分子，就合DNA的复制、转录一样，除了核酸外，有为数众多的小分子参与。

附：一些关于蛋白质折叠的观点
在试管中做蛋白质折叠实验的条件往往人为简化或不得不简化，与新生肽在细胞内折叠的条件有质的或量的差别。所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子，它们大约占用细胞容积的20－30％，总浓度高达每升80－200克，因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的“拥挤”环境中，使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少，这种情况对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很大的影响。最近，有人呼吁，在体外研究蛋白质折叠必须考虑模拟细胞内的“拥挤”环境。此外，某一种蛋白在某一时刻在细胞内的局部浓度可以非常高，这样高浓度的蛋白质在试管中必然发生聚集而不可能完成折叠。所以，在体外进行的实验，为了提高蛋白折叠效率，并且有利于进行分析，实验所用的蛋白浓度总是很低的；温度也常在37摄氏度以下，有时低到10摄氏度以下，以减缓反应速度。溶液成分也尽量简单，便于分析。
1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:32

第 3 个问题：再加些难度

讲一下 RNase A, RNase T1, RNase V1, RNase H 的作用特点，包括相同点和不同点。

问题提示：都是RNase, 都可降解 RNA，具体能降解何种形式的 RNA 呢？单链的，双链的，还是长的，短的？降解产物是长的，短的，还是有什么末端特征的？-- 文章中只有星点线索，推荐网上查找资料。

作者: ritou1985 时间: 2013-7-19 16:34

RNase H: 起源
Escherichia coli HB101 containing E. coli rnh plasmid (pKH11) and regulator plasmid (pNT203)
概述
RNase H是特异性分解RNA-DNA杂交体中的RNA链的核糖核酸内切酶，产生具有游离3'-OH和5'-磷酸末端的产物，该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。
一般性质分子量 21,000 最适pH pH8.0附近活化剂 Mg2+或Mn2+
活性定义以Poly(rA)·Poly(dT)为底物，在30℃、pH7.7的条件下，20分钟内产生1 nmol酸可溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位 (U)。
用途 :
通过Okayama-Berg法进行cDNA Cloning。
DNA-RNA杂交体的检定。
在Oligo(dT) 存在下除去mRNA的Poly(A) 末端。
mRNA的定量。

Remove RNAs. For isolate highly pure plasmids ideal for transfection or automated sequencing

RNase A, Bovine Pancreas
核糖核酸酶A(牛胰)
概述：
核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二脂键。反应终产物是嘧啶3'磷酸及末端带嘧啶3'磷酸的寡核苷酸。
来源：牛胰。
DNase活性去除：
将固体RNaseA溶于10mM Tris-HCl，pH7.5，15mM NaCl缓冲液或灭菌水中，在100℃煮沸15min后在室温缓慢冷却。
应用：
1. 从DNA：RNA杂交体中除去杂交的RNA区。

RNase Cleavage Site
A 3' of ss C's and U's
V1 base-paired nucleotides

从这里进入可以找到RNase A或 V1 的许多相关作用介绍
cuturl('http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?2275')
cuturl('http://www.ambion.com/techlib/tn/92/9214.html') [icesugar75 添加]

RNase A cleaves 3' of single-stranded C and U residues. RNase V1 cleaves base-paired nucleotides

Ribonuclease T1 (RNase T1) is an endoribonuclease that specifically cuts RNA or deaminated RNA at the 3’-end of guanosine residues and adjacent nucleotides through a 2’, 3’-cyclic phosphate intermediate mechanism. Epicentre’s RNase T1 is cloned from Aspergillus oryzae and over expressed in E. coli to produce a highly pure enzyme without contaminating DNase or non-specific RNase activity. [icesugar75 补充]

这是一个例子（附件中）：Structural Analysis of an RNA.
The RNA molecule shown above was end-labeled and subjected to digestion with RNases A, TI, and VI. The resulting fragments were visualized by denaturing PAGE.

图片附件: 79862920.jpg (2013-7-19 16:34, 18.39 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17148

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:34

下面来小结一下：

为了让大家充分理解文章中第一个figure 的意义，我们已经做了不少准备工作。首先就是关于不同类型的 RNase。因为文章要研究的是RNA与prion 复制的关系，所以什么样的RNA，单链双链，长链短链，与结果息息相关。

研究RNA二级结构的酶主要用了RNase H，RNase V1, RNase T1. 这几种酶作用特点各有不同，milkmoon 的介绍非常详尽，有一个小小的图表传上来，希望有利于大家查看：

RNase H 特异性分解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA，对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。

图片附件: 55655793.gif (2013-7-19 16:34, 4.97 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17149

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:35

好了，我们做了这么多准备，现在来看看文章的第一个图做了些什么实验：

图1A：用RNase (DNase-free); RNase A; RNase T1; Micrococcal Nuclease; Benzonase 分别加入复制反应体系中，观察这些酶的加入，对有感染性朊病毒蛋白复制的影响。酶是不同稀释度的。

Note for your convenience:

--- RNase A: 降解 DNA 和 RNA 杂交产物中的RNA
--- RNase T1: 降解 RNA
--- Micrococcal nuclease: 同时水解DNA 和 RNA （无论单双链）
--- Nenzonase: 同时水解DNA 和 RNA （无论单双链）

注意：
1。方法是蛋白跑胶做 Western Blot
2。第一行中所使用的 RNase 种类没有提及；

从图1A中可以看出文中给出的结论：prion 的复制是不依赖DNA 而是RNA的，而且是 RNase 剂量依赖的。

现在提出第 4 个过关问题：

既然文章用 western blot 做蛋白质定量，从图1a 看来，它缺少了哪一个重要的对照？

图片附件: 70526190.jpg (2013-7-19 16:35, 22.19 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17150

作者: ritou1985 时间: 2013-7-19 16:35

相关疾病：
感染
主任都引导到这里了，随便说说：是不是缺少DNase作用后的一组结果！不过或许思维有误！[不是思维有误，这部分实验在图1b 呢。icesugar75 注]

“都怕别人以为跟你是一伙儿的了” 莫怕，莫怕！我只是为了学习，在你提出问题之前我还没有太多的考虑，这样可以增加认识，但是提出问题是更可贵的，因为你已有了答案。。。。。。[我哪里的答案，一起讨论嘛，icesugar75 注]

另外提一下“分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质”对这个不应该提出太大的疑问，如果这个显然的问题没得到大家在很多未知的前提下的一种默许的话，这篇文章未免。。。。。。[没见这方面的材料啊，很难讲的。 icesugar75 注]

我随便浏览了一下，捏来一点：

海绵状脑病本病为一组疾病，其共同特点是脑灰质疏松呈海绵状，其中亚急性海绵状脑病和Kuru病可见于人类和灵长类。此类疾病的病原体为小分子量（60000）的糖蛋白称为Prion(Pr)。Pr是正常神经元的膜蛋白，本身并不致病。如其结构发生一个氨基酸的变异，形成Pr5C则不能被蛋白酶完全降解，形成Pr27-30。后者形成类淀粉蓄积于神经元胞体内，造成神经元死亡。Pr27-30感染（接种）于另一个体可起模板作用，进行大量复制，造成疾病蔓延。Kuru病仅发生在大洋洲巴布亚新几内亚，由于食人尸脑而传播。革除陋习后此病几乎已绝迹。

Priori的微生物学特征

　　一、理化性质；Prion具有非常的理化特性，能使核酸失活的物理方法(如煮沸、紫外线照射、电离辐射等)和化学方法(如核酸酶、羟胺、锌离子作用)对其均无影响，Prion感染后的提纯制备物亦测不到核酸，但许多蛋白质变性剂可使其感染性不可逆地失活。因此，Prion是一种缺乏核酸的蛋白质因子。

　　二、生物学特性；Prion是一分子量为33kD～ 35kD的糖蛋白，Prion蛋白(prion protein，Prp)由 254个氨基酸组成(人类Prp为253个氨基酸)。研究发现，Prp存在异构体，既Prpc和Prpsc。Prpc是存在于正常组织的功能还不清楚的糖蛋白，对蛋白酶敏感，不致病，Prpsc分子量为27kD一30kD，对蛋白酶有抗性，是可致病蛋白质。在正常脑组织中只有Prpc，没有Prpsc，而患病大脑中则既有Prpc，又有Prpsc。尽管这两种Prp的氨基酸序列相同，但其立体构象却不一致。Prpcα螺旋高达42％，β片层仅 3％，而Prpsc却相反，α螺旋仅3％，而β片层则高达43％。这种构象的差异导致了化学性质和生物学作用的明显不同。Prion不含核酸，它如何复制，现尚无定论。

　　三、分子生物学：不论动物抑或人类，Prion由宿主染色体上一个单拷贝基因编码，人Prion基因 (PRNP)位于20号染色体的短臂上，小鼠Prion基因则位于2号染色体上。人PRNP的突变常发生在第32、48、56、72位密码子处，多为重复片段的插入或点突变，突变的结果是使Prpc分子转变成Prpsc。

　　Prion的传染性与遗传性
　　Prion不仅有传染性，而且有遗传性。（临床内科杂志，4：169；1999）
cuturl('http://www.xssc.ac.cn/discussion')
cuturl('http://medicine.bjmu.edu.cn/department/biophysi/biophysics/LAB/NewSNL/training%20course/reviews/TSE97review.pdf/applydetail.asp?rno=505&cla=C0')

作者: yes4 时间: 2013-7-19 16:39

相关疾病：
牛海绵状脑病
谈一点PrPc的功能

Prion的编码基因为PRNP，编码PrPc和PrPsc两种蛋白质，两者构象不一，PrPsc为疯牛病的病原体。虽然大多数的文献一提到PrPc就说其功能还不明确，但实际上近年来对PrPc功能的研究还是有一些进展的，归纳如下：
1、PRNP基因敲除的小鼠出现异常的睡眠模式和电生理特性，并且对药物诱导的癫痫的敏感性增加；
2、PrPc能与Cu离子结合，能调节胞内Cu/Zn超氧化物歧化酶的功能，与细胞的氧化应激反应有关
3、PrPc能激活Lyn、Syk、Fyn等激酶继而进一步激活PKA、PKC、PYK2等下游分子
4、PrPc有抑制神经细胞凋亡的作用
5、目前已经鉴定了多种与PrPc相互作用的蛋白质，包括heparin-like compounds、 the neuronal phosphoprotein synapsin Ib、Grb2、 Pint1 、Laminin、stress-inducible protein 1等。

作者: yes4 时间: 2013-7-19 16:40

有没有任何文献证实，分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质？

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谈一谈自己的看法，相关的和不相关的。prion 蛋白由254个氨基酸组成，其分子量应为26－27Kd，但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰，的实际分子量为33Kd左右，用经典的prion 蛋白抗体3F4（Sigma）进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd，但可以通过蛋白酶K试验进行区分，PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到，而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

prion 蛋白的结构已经研究得较清楚，列如下：
1－23aa:信号肽序列
23－90aa:脂筏靶向信号
51－90aa:8肽重复序列（与Cu离子结合部位）
180aa and 196aa:糖基化位点
112－145aa:疏水区
178aa和213aa形成二硫键
231－252aa:GPI锚定信号肽

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:41

prion 蛋白由254个氨基酸组成，其分子量应为26－27Kd，但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰，的实际分子量为33Kd左右，用经典的prion 蛋白抗体3F4（Sigma）进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd，但可以通过蛋白酶K试验进行区分，PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到，而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

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相关疾病：
感染

我对单独跑胶来判断分子量大小可以，但是，如何知道：

1。它是由原蛋白复制得来的？
2。它仍然保持其模板的感染活性？(cloner 已经解决了这个问题，下面的贴子画红加黑的部分)

我们在前面的资料中可以看到，朊病毒蛋白的致病形式与非致病形式只是构象不同，是否有这种可能，复制后的蛋白就不具有感染能力了呢？

先把这个问题 hang on 在这里，哪位朋友有了想法或答案定来告知！

一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒，而没有感染性的不可被检测，是吗？不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:41

我们来看一下图1b：对朊病毒蛋白复制没有影响的一组酶

-- RNase V1：水解双链RNA
-- RNase H：水解 DNA-RNA 中的单链 RNA，对其它类型核酸没有作用
-- DNase: 没有 specify 到底是哪一种
-- EcoRI：降解 DNA 常用酶
-- Apyrase：腺酸水解酶，能将腺三磷酸（ATP）及腺双磷酸（ADP）水解成腺单磷酸（AMP）及无机磷
-- Heparinase III: 肝素酶

前四种酶的使用很好理解，排除了DNA-RNA，dsRNA, DNA 在复制系统中的作用。

用 apyrase 的目的是：排除高能量ATP, ADP 在系统中作用的可能。因为大家都知道，水解核酸时会产生这些小分子，是否这些小分子在系统中起作用，这个考虑很重要。

下面第 5 个过关问题：

使用 Heparinase III 的目的是什么？

问题提示：heparinase III 能水解什么样的蛋白，为什么要除去这种蛋白在系统中的作用？

图片附件: 47954246.jpg (2013-7-19 16:41, 26.09 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17151

作者: gogo 时间: 2013-7-19 16:44

现已有证据认为细胞内的RNA分子可以使prpc转化为prpsc

作者: loli 时间: 2013-7-19 16:44

这里很热闹啊！我猜测一下。
Heparinase III cleaves heparan sulfate exclusively, and does not cleave unfractionated heparin or low molecular weight heparins.

一种葡萄糖醛酸酯酶，是能降解硫酸乙酰肝素的葡萄糖苷酸内切酶(endosluconidase)。肝素酶的作用底物是硫酸乙酰肝素，可降解肝素蛋白聚糖上的侧链。肝素酶的抑制剂，如硫酸海带多糖等。

prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰，实际分子量比27Kd大。PrPc和PrPsc可以通过蛋白酶K试验进行区分，PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到，而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。Heparinase III的加入可能其上的聚糖侧链，是否为利于Rnase或Dnase或其他更好的作用肽链？（受启发的地方：apyrase 的目的是：排除高能量ATP, ADP在系统中起作用。）

不明白的地方，图1A 中显示了对朊病毒蛋白复制有影响的一组酶，在不同的梯度时与蛋白的表达量有关，前面却出现了个M（1，3泳道），这是什么？sc是否为PrPsc 蛋白的标准样品？（由于看不到全文，icesugar75可否将NATURE全文上传）[哥哥，全文就在前面的一张贴上，再看看？M 看来是阳性对照的意思-- icesugar75 注]

prion一词原来的字源是protein由和infection, 合并而来，显然突出了它的特征：在化学性质上是蛋白质；在机能活动上具有感染性。异常蛋白的N端要少出几十个AA，从而使异常蛋白抗蛋白酶，具有感染性。这点似乎可以在基因找到类似的例子，如中华医学遗传学杂志（2001,18(4).-268-271）调查中国藏族人群中CCR5△32等HIV相关的等位基因在的频率和分布情况，发现CCR5△32小于0.15%, 提示中国藏族人群很可能在遗传上是HIV－1易感的人群。Prion 是否也有这样的性质，也许这能从另一个方面提示对于将来预防该病毒的侵袭是否有帮助？

作者: memory 时间: 2013-7-19 16:45

PRION是PRoteinaceous Infectious ONly的缩写。

作者: memory 时间: 2013-7-19 16:45

我对单独跑胶来判断分子量大小可以，但是，如何知道：
1。它是由原蛋白复制得来的？
2。它仍然保持其模板的感染活性？(cloner 继续解决一下？)
cloner 的意思是：用一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒，而没有感染性的不可被检测，是吗？不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。

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1、首先明确PrPsc为致病形式，Prpc为正常形式。

2、PrPsc的蛋白酶抗性是由于其构象改变引起的，我不知道有没有单独识别PrPsc的抗体，上面所述的单抗3F4即可识别PrPsc，也可识别PrPc,但PrPc无蛋白酶抗性，经蛋白酶K处理后就无法为3F4所识别，PrPsc和PrPc由此而可被区分。 [谢谢，这是问题的关键！icesugar75 注]

3、PrPsc似乎有分子伴侣的作用，在它的作用下，原本应该正常的PrPc都折叠成了PrPsc的形式。下面是一个示意图。[这个观点还有待证实吧？-- icesugar75 注]

图片附件: 43302075.snap.jpg (2013-7-19 16:45, 17.97 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17152

作者: wmp1234 时间: 2013-7-19 16:45

使用 Heparinase III 的目的是什么？

问题提示：heparinase III 能水解什么样的蛋白，为什么要除去这种蛋白在系统中的作用？

heparinase III是一种葡萄糖醛酸酯酶，是能降解硫酸乙酰肝素的葡萄糖苷酸内切酶(endosluconidase)。该酶 cleaves selectively, via an elimination mechanism, sulfated polysaccharide chains containing 1-4 linkages between hexosamines and glucuronic acid residues. The reaction yields oligosaccharide products (mainly disaccharides) containing unsaturated uronic acids which can be detected by UV spectroscopy at 232 nm. The enzyme is active only towards heparan sulfate and does not cleave heparin or low molecular weight heparins.
这种酶常应用于糖生物学(99年Nobel Price),寡糖文库的制备,从heparan sulfate制备二糖.
(受启发rPsc似乎有分子伴侣的作用，在它的作用下，原本应该正常的PrPc都折叠成了PrPsc的形式),糖生物学研究表明:有的分子伴侣发挥功能需要靠蛋白上的寡糖链识别(具体文献忘了,见附件文献提到的这样的意思),而heparinase III可去除糖蛋白的可寡糖链.(Prion是一分子量为33kD～ 35kD的糖蛋白,)因此,我认为,此处可能是排除PrPsc自身作为分子伴侣辅助PrP的复制或折叠.

作者: one 时间: 2013-7-19 16:46

本文说明：
1感染细胞如果混在正常的脑组织中，PrPres可增长6倍，去除组织中的ssRNA后，无增长；
2加入来源于鼠的外源性RNA后，PrPres可增长20倍；
3这种小ssRNA的两个特点：非脊柱动物不能增长PrPres，发挥活性需要rRAN参与；

本文并没有否定PRION仅是蛋白质的假说：
1一定大小的带电的DNA可以结合PRION，并且改变其构像，但作者的结论相反，可能和他们使用的DNA大小有关
2带负电的核酸本来就可以改变PRION的构像，但是未致病细胞的PRION和RNA被细胞膜分开，因此体内可能的情形是RNA只是“代言人”，要联合其他因子才能使PRION构像改变致病；
3这种RNA在正常哺乳动物组织中也存在
4高纯度提取PrPsc分析表明，类似大小的ssRNA并非Prion感染的所必须
5体内有多种聚合离子如硫酸葡萄糖氨基聚糖可改变Prion构像，体外实验不能模拟体内环境；
6该小ssRNA在不同宿主间有序列差异
展望：
1 本文所证实的RNA与蛋白质构像改变是否具有普遍性？还有别的蛋白质异常疾病是否也和RNA参与的蛋白质构像异常有关？
2至少目前，利用这个发现，可以提高诊断检测水平，提高生物食品、饲料安全性，尽早发现和Prion有关的疾病。

作者: ritou1985 时间: 2013-7-19 16:47

相关疾病：
感染
生物：我們都錯怪PrPSC了？！

編輯：倫子
Prion是一種會造成羊搔癢症、牛海綿狀腦病變，以及人類庫賈式症等神經系統病變的蛋白質病原。受到Prion感染的動物，神經系統內會有PrPSC(內生性PrPC的異構物) 的堆積，伴隨著神經元損失(neuron loss)、海綿狀腦組織(spongiform)等神經病變。據此，過去普遍認為PrPSC就是造成神經毒性(neurontoxicity)的元兇。然而，最近的研究顯示，我們似乎錯怪PrPSC了。

過去幾年間，科學家皆將把PrPSC視為神經病變的罪魁禍首，因此他們利用各種方法來阻止PrPSC的危害，譬如以酵素分解PrPSC，或以抗體阻斷PrPSC的活性區域，但成效皆未達預期。Mallucci, G.的研究團隊，則採取了嶄新的觀點來看Prion所造成的問題。

根據先前研究的暗示，他們不再試圖抑制PrPSC的堆積，而從生物體本身具有的PrPC 下手。他們將小鼠的PrPC基因剔除(Knock-out mice, Prnp0/0)，使小鼠無法產生PrPC，如此PrPSC便無從帶壞神經細胞內的PrPC。如預期地，Prnp0/0小鼠在受到Prion感染之後，並不會產生中樞神經的病變。更美妙的是，若將基因轉殖小鼠(transgenic mice, MloxP)感染Prion，即使小鼠已經開始產生海綿狀腦組織，其海綿狀腦組織竟可以逐漸填補修復！即使短期內小鼠腦部組織仍可偵測到PrPSC的存在，卻無法對神經細胞造成危害。

這個結果顯示，PrPSC本身並不具有細胞毒性，神經系統病變的關鍵其實在於神經細胞內PrPC的轉變(conversion)。若能抑制PrPC表現，便可阻止Prion感染所造成的危害，甚至逆轉局勢，讓已經受損的神經系統逐漸恢復。這個研究雖然只進行到小鼠階段，但對於遭Prion感染而造成神經病變的患者而言，確實是一個好消息。

原始論文：
Mallucci, G. et al. Depleting neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis. Science, 302, 871 - 874, (2003).

转自Sciscape

作者: langlang 时间: 2013-7-19 16:47

How to distinguish PrPsc from PrPc? (From FEBS Letters, 2001, 451)
a。PrPSc is partially resistant to proteolytic degradation,
whereas PrPC is sensitive to proteolysis;
b。 PrPC is a soluble protein, while PrPSc is stubbornly insoluble and becomes deposited in infected brain parenchyma;
c。PrPC is mainly composed of K-helical conformation, while PrPSc is rich in L-sheet secondary structure;
d。PrPSc is able to replicate itself in vitro and in vivo by converting PrPC into PrPSc .

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:48

PrPSc is able to replicate itself in vitro and in vivo by converting PrPC into PrPSc .

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看起来有感染性病毒的复制是通过转化正常病毒形式来实现的，有意思。不能直接从有感染性到有感染性吗？

作者: langlang 时间: 2013-7-19 16:48

不知道。如果证明了PrPsc能直接复制为PrPsc，就Nobel了，这是对中心法则的补充(DNA->RNA->Protein)，以前有人设想过的，还有人设想过从PrPsc

到RNA,只是需要证据

[ 本帖最后由 langlang 于 2013-7-19 16:49 编辑 ]

作者: langlang 时间: 2013-7-19 16:55

PRION是PRoteinaceous Infectious ONly的缩写。

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根据我所看到的资料，prion是Proteinaceous infectious particle（蛋白质样感染颗粒）的缩写修改而成，念成[pri:^n],prion国内学者译成朊病毒，而相应的朊病毒蛋白（PrP，Prion Protein）又称朊蛋白，它有两种形式，细胞型（Prion Protein of Normal Cell，PrPC）和致病型（Prion Protein of Scrapie，PrPSc），PrPC的C和PrPSc中的Sc是上标。通常我们所说的朊病毒应该是致病型朊病毒。

作者: linlinstar 时间: 2013-7-19 16:57

cloner 的意思是：用一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒，而没有感染性的不可被检测，是吗？不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。

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现在有很多针对PrP的抗体是不能区分两种不同的PrP（PrPC和 PrPSc）的，我手头看到的一篇文章说单抗15B3可以特异性识别PrPSc（Korth C, Stierli B, Streit P, Moser M, Schaller O, Fischer R, Schulz-Schaeffer W, Kretzschmar H, Raeber A, Braun U, Ehrensperger F, Hornemann S, Glockshuber R, Riek R, Billeter M, Wuthrich K, Oesch B. Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 1997, 390(6655): 74-77）。
要判断是PrPC还是 PrPSc，其实可以利用PrPC和 PrPSc对PK（蛋白酶K）的不同抗性来区别，PrPC是不能抵抗PK的消化的，而PrPSc则可以部分抵抗，再利用抗PrP抗体来捕捉，判断是否有留下的PrP片断就可以知道是PrPC还是 PrPSc了。

作者: ukonptp 时间: 2013-7-19 16:58

DR.P在biooo目中无人，自以为是prion研究中的老大，在微生物，分生，遗传各论坛有过浅尝辄止的讨论，却应者寥寥，第一次读过如此详尽的中文论述，受益匪浅。

惭愧，偶舍弃自己的专业去学做管理，浮躁了些，唉！无言的结局。。。

如果闲下来，一定到这里跟诸位交流些，--要知道，Dr.Prion的名字来源于他博士后正在研究的课题。

共勉！

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 16:58

Dr Prion 言重了。大家也都是为了共同交流，为此查阅了不少资料，付出了不少劳动。这个话题也是大家百忙之中腾出时间来参与的，都从中学到了不少知识。一直想把这个话题继续下去，苦于没有时间。希望Dr Prion 也抽空来参与指教！

作者: dog002 时间: 2013-7-19 16:59

讨论了许多prion，个人认为大家从微观角度的见地已经很有深度了。是否可以从宏观角度思考一些问题比如prion两种形态PrPC和 PrPSc，机制尽管有许多不明之处，但是和conformation的不同而引起病理变化有关是基本得到共识的。所以，有很多角度可以来讨论prion,而站在蛋白质角度，自然还是想到了折叠这个令无数英雄竞折腰的问题。蛋白质的折叠存在着太多的秘密，目前研究正常蛋白的主要障碍是缺乏有效的折叠示踪手段，因为很多蛋白质的存在时间或发挥功能时间太短，根本无法捕捉，更谈不上分析了。倒是做了一些体外的变性（去折叠）和复性（回复折叠）的研究，表明要弄清体外折叠之迷，对折叠启动、折叠中间体、折叠完结几个关键步骤必须作出分子理解。那么究竟有无所谓“折叠密码”存在？既然氨基酸序列既然完全可以决定肽链的折叠（这个结论获过nobel），再回到prion和上面nature的文章，核酸和折叠是否还是有关系的？一级结构无法完全决定折叠？体外没有解决折叠的问题，要想阐明prion的奥秘还很遥远。不过也许正是利用这个模型，回对折叠有所突破。当然需要物理学者和化学者假如生命科学工作者的队伍。

作者: bring 时间: 2013-7-19 17:00

Prion这种特殊的糖蛋白，无论是它的折叠，复制，或者遗传性，每次看到关于这个方面的东东，都是让人感到耳目一新，感到其中充满了无限的奥妙和乐趣……

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 17:00

眼镜蛇这一系列问题实在是太超前了，我想还没人能解答吧。关于蛋白折叠，未知的太多了。一个明显的例子就是：为什么native 的蛋白就比重组蛋白更稳定，更抗“折腾”。

刚刚看到了一篇关于PRION 的最新综述，美中之不足啊，Switzerland 的人写的，用语实在生涩，读了不到一页就累死了。

Mammalian Prion Biology: One Century of Evolving Concepts （Review）

Adriano Aguzzi and Magdalini Ploymenidou

2004 January 23, Cell, Vol 116, 313-327

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 17:01

Science, 2003, May 9, Vol 300:917~919

图片附件: 74496872.snap.jpg (2013-7-19 17:01, 101.18 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17153

作者: 8princess8 时间: 2013-7-19 17:01

相关疾病：
感染疾病
果然难读。鼓起勇气基本读完，理了一个大概。写得相当好，值得读。
构象转变不能脱离细胞来研究，但conformation的研究目前仅仅在细胞外或体外水平，在这个层次的研究进展十分有限
prion所致的相关疾病到底是遗传性疾病还是感染性疾病？如果是后者如何传播？
基因敲出小鼠Prnp0/0表现出对prion所致的相关疾病具有抵抗性，更重要的是，它们的表型和生理功能无明显异常，这个实验结果是对prion学说的最大挑战，有人又回到了“病毒病原”的思考
抗体的产生：Prnpc和PrnPsc的conformation差异没有表现在抗体上，即单抗无法识别区分二者，免疫机制是什么？
PrnPsc的的高级结构还在不断修正，取决于方法学进展
越来越多的yeast prion研究引起了对prion的新看法。
如果prion假说不成立，那么prion只是等待我们去研究的人体数十万蛋白中的一种，它是否可能参与信号转导、参与酶催化？目前的研究进展还不大。
prion可能是其他分子作用的地物或对象，因此许多科学家在寻找。
prion的神经损伤机制和治疗、诊断。但是由于基础研究差得很远，所以这些方面的进展我没有细看。
作者认为还有五个难题：
复制如何进行的，构象转变的机制怎样，能否抑制这个过程？
如何介定 prion的本质？归于病毒，但其和病毒的许多特征并不相符
prion 如何到达大脑，有那些分子参与，能够阻止它进入大脑吗？
神经病理机制是什么？
Prnpc的功能是什么？

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 17:02

是的，这些应该算是朊病毒研究的最新进展了，还有很多问题没有解决。到现在为止我们还不能说，朊病毒是可以自己复制自己的蛋白质，它还只是一

种假说。

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 17:02

Science Mar 5 2004: 1514-1516

图片附件: 14356795.snap.jpg (2013-7-19 17:02, 73.5 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17154

作者: nut6694 时间: 2013-7-19 17:03

最新的一篇文章：

致病性朊病毒蛋白必须与正常朊病毒蛋白同时存在才可致病，故

Hypothesis：正常朊病毒蛋白也参与了致病中枢神经的过程

基本方法：将单抗与正常朊病毒蛋白做 crosslink，打入C57BL/10 鼠的海马内，免疫组化，荧光染色，观察组织变化。

作者: DDD 时间: 2013-7-19 17:05

我这又一张prpC转变为prpSc的图片，和大家分享！

图片附件: 84227336.jpg (2013-7-19 17:05, 39.92 KB) / 该附件被下载次数 33
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17155

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:06

"Prion是一分子量为33kD～ 35kD的糖蛋白，Prion蛋白(prion protein，Prp)由 254个氨基酸组成(人类Prp为253个氨基酸)。研究发现，Prp存在异构体，既Prpc和Prpsc。Prpc是存在于正常组织的功能还不清楚的糖蛋白，对蛋白酶敏感，不致病，Prpsc分子量为27kD一30kD，对蛋白酶有抗性，是可致病蛋白质。"
這樣說是不太準確的，由于prpc和prpsc的一級結搆是完全一樣的，所以它們的分子量也應該是一緻的
prp27－30的産生是由于prpsc隻是部分地抗蛋白酶K的消化其N耑的柔軟捲麯（prp23－90）被降解后産生的大約142個aa殘基就是prp27－30

Prions
STANLEY B. PRUSINER†
Departments of Neurology and of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA 94143

图片附件: 94141251.jpg (2013-7-19 17:06, 13.84 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17156

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:07

现在有很多针对PrP的抗体是不能区分两种不同的PrP（PrPC和 PrPSc）的，我手头看到的一篇文章说单抗15B3可以特异性识别PrPSc（Korth C, Stierli B, Streit P, Moser M, Schaller O, Fischer R, Schulz-Schaeffer W, Kretzschmar H, Raeber A, Braun U, Ehrensperger F, Hornemann S, Glockshuber R, Riek R, Billeter M, Wuthrich K, Oesch B. Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 1997, 390(6655): 74-77）。
要判断是PrPC还是 PrPSc，其实可以利用PrPC和 PrPSc对PK（蛋白酶K）的不同抗性来区别，PrPC是不能抵抗PK的消化的，而PrPSc则可以部分抵抗，再利用抗PrP抗体来捕捉，判断是否有留下的PrP片断就可以知道是PrPC还是 PrPSc了。

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Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein
Communicated by Lynn T. Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, November 25, 2003 (received for review June 10, 2003)

A conformational change is
believed to convert the normal cellular prion protein into PrPSc.
Detection of PrPSc for diagnosis and prophylaxis is impaired because
available Abs recognizing epitopes on PrP fail to distinguish
between PrPSc and normal cellular prion protein. Here, we report
that an anti-DNA Ab, OCD4, as well as gene 5 protein, a well
established DNA-binding protein, capture PrP from brains affected
by prion diseases in both humans and animals but not from
unaffected controls. OCD4 appears to immunoreact with DNA (or
a DNA-associated molecule) that forms a conformation-dependent
complex with PrP in prion diseases. Whereas PrP immunocaptured
by OCD4 is largely protease-resistant, a fraction of it remains
protease-sensitive. Moreover, OCD4 detects disease-associated PrP
>10 times more efficiently than a widely used Ab to PrP. Our
finding that anti-DNA Abs and gene 5 protein specifically target
disease-associated DNA–PrP complexes in a wide variety of species
and disease phenotypes opens new avenues in the study and
diagnosis of prion diseases.

图片附件: 59059223.jpg (2013-7-19 17:07, 6.1 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17157

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:08

不同抗體識別位點

图片附件: 85851396.jpg (2013-7-19 17:08, 10.67 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17158

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:09

“人PRNP的突变常发生在第32、48、56、72位密码子处，多为重复片段的插入或点突变，突变的结果是使Prpc分子转变成Prpsc”

這些是prp八肽重復區的突變一般認為它們會影響prp跟Cu2+的結閤
而在prp的緻密domain區域有很多點突變跟傢族性的prion疾病相關
這些點突變被認為直接影響暸prpc到prpsc的conversion
所以研究遺傳性點突變蛋白是研究prp蛋白性質的一個非常重要的手段

图片附件: 16564676.jpg (2013-7-19 17:09, 40.04 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17159

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:10

這張似乎好一些

图片附件: 57064682.jpg (2013-7-19 17:10, 26.37 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17160

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:11

使用計算機糢擬的手段糢擬低Ph條件誘導的倉鼠PrPD147N從prpc到prpsc
的轉變
From conversion to aggregation: Protofibril formation of the prion protein
PNAS February 24, 2004 vol. 101 no. 8 2293–2298

图片附件: 30395103.jpg (2013-7-19 17:11, 28.49 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17161

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:11

糢擬的prpsc多聚體的形成

图片附件: 72507910.jpg (2013-7-19 17:11, 32.56 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17162

作者: c86v 时间: 2013-7-19 17:13

與電鏡炤片吻閤的很好

图片附件: 73688700.snap.jpg (2013-7-19 17:13, 93.72 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17163

作者: 49888 时间: 2013-7-19 17:14

Mammalian Prion Biology: One Century of Evolving Concepts （Review）

Adriano Aguzzi and Magdalini Ploymenidou

2004 January 23, Cell, Vol 116, 313-327

I just tried. It really couldn't be opened. I will ask others about the problem. Thank you for your remind.

作者: 49888 时间: 2013-7-19 17:14

我把你说的下面这篇文章的主要内容整理一下：

Cross-Linking Cellular Prion Protein Triggers Neuronal Apoptosis in Vivo.
Science 5 March 2004; 303: 1514-1516。

致病性朊病毒蛋白必须与正常朊病毒蛋白同时存在才可致病，故

Hypothesis：正常朊病毒蛋白也参与了致病中枢神经的过程

基本方法：将单抗与正常朊病毒蛋白做 crosslink，打入C57BL/10 鼠的海马内，免疫组化，荧光染色，观察组织变化。

以下附上全文

欢迎讨论（也可以翻译结论部分).加分从优!
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整理如下，如有错误请批评指正，谢谢！

这篇文章的主要目的是为回答阮病毒蛋白是如何导致神经细胞的死亡，这一一直困扰科学界的问题，并为其提供一种可能的答案。
主要结论：
（1）在prpC缺失的情况下，prpSc单独不具神经毒性，不能导致神经细胞的死亡；
（2）prpC可能直接参与了阮病毒引起的神经细胞的凋亡，即要导致神经细胞的凋亡prpC 和prpSc二者必须同时参与，任何一者都不能单独起作用；

（3）将prpC的单抗（含两个prpC识别位点，即二价抗体，这一点很重要。）注入小鼠海马部位，由此引起的神经细胞膜上的prpC之间的藕连（cross-linking，通过二价prpC抗体将附近的两个prpC藕连cross-linking在一起)将导致海马区的神经元大量死亡。

注意：prpC通过其抗体与附近的prpC的藕连（cross-linking)是在体内完成的，而不是象你所说的先在体外将prpC与其抗体cross-linking后打入体内，这一点你错了。

（4）作为对照组：作者在对照组小鼠脑内打入二价抗HIV gp120的单抗或者prpC的单抗的Fab片断（只有一个prpC识别位点），二者皆不会引起海马区神经元的凋亡。前者说明prpC的单抗引起的神经元的凋亡是特异性的，后者说明光是单一prpC分子与其抗体的结合不能引起凋亡信号，必须是两个以上的prpC分子的藕连才能诱导凋亡信号的产生。
（5）以上四点为阮病毒在体内是如何引起神经元的死亡的分子机制提供一个可能的解释：当prpSc进入体内时，自己首先多聚化成为多聚体(oligomers，prpSc因其不容性在体内常互相聚合成显微镜下可见的块状物)，该prpSc多聚体在引起神经元凋亡的过程中起到代替prpC单抗的作用而将膜上多个prpC分子藕合在一起，藕合的prpC将在神经元内诱导凋亡信号的产生，最终导致神经元的死亡。

注：
a. 该信号通路有点像tyrosine kinase receptors 家族的信号转导。该家族受体的信号通路的激活也是必须通过细胞膜上两个受体分子在磷酸化后的二聚化形成受体二聚体（dimer)来完成的。

b. 藕合的prpC在神经元内诱导的凋亡信号途径中应该含有部分神经元特异的信号分子，否则无法解释为何阮病毒感染的动物只引起神经元死亡，而同样高水平表达prpC的神经胶质细胞缺毫发不伤，反而在神经元大量死亡后代偿性的增生。

作者: 49888 时间: 2013-7-19 17:16

研究prion主要要弄清楚如下一些问题，这些问题有些已经有比较明确的答案，但是大部分都还没搞清楚或存在较大的争论，希望大家多讨论讨论。我希望在以后的贴子中尽我可能把这些问题的最新进展整理出来与大家讨论。

1. What is the nature of the infectious agent?
(1) Is PrPSc identical with the prion?
(2) How does PrPSc promote PrPC conversion into further PrPSc?
(3) Which other proteins assist in this process?
(4) Can we cure prion diseases by interfering with the conversion process?
(5) What are prion strains, molecularly speaking? How are the strain-speci.c properties encoded?

2. How do peripherally administered prions travel to the brain?
(1) Which molecules and cells are involved in neuroinvasion?
(2) Which inhibitory strategies have a realistic chance of succeeding?

3. What are the mechanisms of spongiform neurodegeneration?
(1) Which pathogenetic cascades are activated?
(2) What are the biochemical executioners of brain damage?

4. What is the physiological function of the normal prion protein, PrPC?
(1) PrPC is highly conserved, so it is probably useful.
(2) The Prnp gene was identi.ed in 1985, and Prnp knockout mice in 1992, yet the function of PrPC remains unknown.
(3) None of the phenotypes ascribed to the absence of PrPC has been explained in molecular terms.
(4) Is abnormal function of PrPC involved in prion disease pathogenesis?

5.why do we have prions?

作者: u76mp 时间: 2013-7-19 17:17

从上面看下来我看了很多关于朊病毒的资料，但绝大部分都是关于朊病毒在体内的一些研究，而我在其他版曾看到过一段资料：动物死后组织中的prion对环境抵抗力很强，如适应小鼠的痒疫因子埋在土壤中3年后或干热360℃1h仍有感染性.......所以有个问题我一直搞不明白，就是朊病毒在宿主体外是如何“存活”并保存感染性的呢？它有没像其它细菌病毒一样在体外有个“寿命”的期限的呢？如果有一般是多久呢？（例如说HAV在体外室温下可生存1周，在干粪中25摄氏度生存30天）麻烦楼主及各高人指导一下这朊病毒是否有类似的研究呢？谢谢。

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