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标题: 【求助】纯化His-tag 蛋白不同咪唑浓度梯度洗脱蛋白电泳图 [打印本页]

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:06 标题: 【求助】纯化His-tag 蛋白不同咪唑浓度梯度洗脱蛋白电泳图

用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好？

请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~

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作者: eric930 时间: 2013-7-22 13:07

明显200mM的好啊，非特异性带明显少了很多了

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:07

QUOTE:

原帖由 eric930 于 2013-7-22 13:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

明显200mM的好啊，非特异性带明显少了很多了

我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？

作者: NBA 时间: 2013-7-22 13:08

怎么看你这图好像反了？

作者: youyou99 时间: 2013-7-22 13:08

用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好：????
请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~

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你试一下先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子，降低一些非特异性吸附，然后重新梯度洗脱测试，如50，100，150，200，300mM看看

作者: youyou99 时间: 2013-7-22 13:08

我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？

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前面杂蛋白都洗出来了，所以你200mM看上去相对较纯，先将样品调到咪唑浓度10mM左右，再重新进行梯度洗脱试试吧。

作者: 8princess8 时间: 2013-7-22 13:10

先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:10

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-7-22 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

怎么看你这图好像反了？

呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
应该是什么样的啊？

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:11

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2013-7-22 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
电泳跑的不好：????
...

是说进行二次纯化吗？
还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:11

QUOTE:

原帖由 8princess8 于 2013-7-22 13:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱

用10-20mM咪唑的缓冲液多洗了之后，直接用高浓度咪唑洗目标蛋白吗？

作者: bs4665 时间: 2013-7-22 13:12

呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
应该是什么样的啊？

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把这图垂直翻过来才对

作者: bs4665 时间: 2013-7-22 13:12

是说进行二次纯化吗？
还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子

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就是刚破完菌后，往样品里添加咪唑使终浓度为10mM左右。然后上样前柱子也要用含10mM咪唑Binding Buffer平衡一下，减少一些非特异性吸附

作者: BUK 时间: 2013-7-22 13:13

不知道你最终要求多少的纯度的？

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个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。

作者: hulu呼噜 时间: 2013-7-22 13:13

缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

作者: standbyme 时间: 2013-7-22 13:13

我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？

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你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:14

不知道你最终要求多少的纯度的？

个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。

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想在纯化之后做一下蛋白的Km值，最适pH，还有最适温度之类的表征
做这些是不是需要很纯的蛋白呢？
Ni柱纯化后的蛋白可以做这些表征吗？

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:14

缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

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谢谢，我再调pH试试~
感觉很难得到很纯的蛋白啊

作者: shanzhapia696 时间: 2013-7-22 13:15

你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱

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嗯，好
以前用的10mM，现在改成20mM的试试
谢谢啦

作者: zsxan1990 时间: 2013-7-22 13:16

我感觉你蛋白挂柱有问题。挂的不多。

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