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标题: 【求助】蛋白定量方法的哪个好？ [打印本页]

作者: PINK 时间: 2013-7-26 16:59 标题: 【求助】蛋白定量方法的哪个好？

现在的文献测定蛋白基本不用lowry法了，但我改用考马斯亮蓝G250法（文献和参考书都极力叫好的方法）连标准曲线都有很大的问题，还是lowry稳定可靠。我们科里好几个人都发现G250法不好，是什么原因呢？我们用的水是去离子水，好长时间没有换柱子了，我发现其PH值达到9甚至10左右，是不是我们的水有问题？还是该方法就没有那么好？

作者: DONT 时间: 2013-7-26 17:00

我认为G250方法还没有lowry法可靠，不过用不同的方法还要根据你测的东西不同而定，我以前实验要求不严格，只是大概定一下量所以就用过G-250法，后来用bio－rad公司的蛋白质定量的一个试剂盒，不是很贵，测定方法很简单，就是利用lowry法，你为什么说这种方法过时了呢？我记得上大学时老师们就说G250不如lowry法准确呀。

作者: 30moonriver 时间: 2013-7-26 17:00

G250很快，可在低浓度蛋白下就不灵光了
lowry比较麻烦，精度高些
还有bca法，可信度很高的，不过觉得贵了些。

作者: moonlight45 时间: 2013-7-26 17:01

其实用那种方法，还要看你的设备，我们实验室的分光光度仪很准确，我做EMSA，测核蛋白，标准曲线的Rsq是0.9998，结果十分稳定。lowry法麻烦了一些。一般的分光光度仪用G250测起来稳定性不好，我也试过，Rsq只有0.8几。

作者: caihong 时间: 2013-7-26 17:02

G250指的是什么意思

作者: duoduo 时间: 2013-7-26 17:03

G250就是——考马式亮蓝G250染色测定蛋白含量方法——大家简称了

作者: PINK 时间: 2013-7-26 17:03

大家是做实验的，不是写书的，所以在这里讨论才真可得到较为真实的结果。我估计我的原因可能是：我用lowry法时为节省试剂采用减半的办法，标准曲线也挺好。但G250减半就不行了，估计正如楼上战友所说，G250定微量蛋白要差一些，就是说它不如lowry法准确。丁香园万岁！！

作者: windy+++ 时间: 2013-7-26 17:03

G250法也叫bradford法。我们实验室一般都用这方法，要说测微量蛋白，它要比双缩脲法灵敏度要高的呀。作标准曲线时，不妨多取几个点。我测得标准曲线Rsp可以达到0.995以上。

作者: newway 时间: 2013-7-26 17:04

要知道G250法要求是每次测蛋白都得重新做标准曲线的。
还有，有些去污剂是可以干扰的。

作者: ending 时间: 2013-7-26 17:04

每种方法都是有局限性的，G250和lowry都会受到一些如去污剂或还原剂的影响的，所以要根据具体情况选择不同的方法。

作者: vera+ 时间: 2013-7-26 17:05

也许每个人的试验体会不一样吧。G250法测微量蛋白是不可靠的。但在蛋白含量较高时还可以，我做出来的曲线重复性还是很好的。BCA很贵，操作时也要很小心，因为是微量测定，很小计量的污染都会大大影响测量的结果。

作者: 6327555 时间: 2013-7-26 17:05

BCA法测蛋白含量能很好的去除如去污剂的影响，灵敏度高，同时它又是lorry的改进方法，是一个很好的测蛋白含量的方法，不过确实贵了点

作者: 9900 时间: 2013-7-26 17:06

我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！

作者: 9900 时间: 2013-7-26 17:06

我也是用Lowry法测蛋白浓度。
哪种方法准，要根据你的蛋白具体来确定，因为Lowry法的原理是酪氨酸在起作用，用的蛋白质标准是BSA，所以它要求你的待测蛋白的酪氨酸与BSA中的酪氨酸残基数差不多的情况下就比较准，所以说哪种方法准要视具体情况而定。

作者: damingxia0904 时间: 2013-7-26 17:13

方法原理灵敏度(mg/ml) 备注
Lowry法  碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物  0.025-0.25  650nm
G-250染色法  蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收.考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色  0.01-1  595nm
凯氏定氮法  有机物与浓硫酸共热,有机氮转变为无机氮氨,氨与硫酸作用成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨.借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此过量酸液被中和的程度即可计算出样品的含氮量,再推知蛋白含量  0.2-2
双缩脲法在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物。  1-10  54Onm
215&225吸收差法  蛋白质的肽键在200-250nm有强的紫外吸收，且波长越短光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射。用215nm 和225nm 光吸收差值可减少非蛋白质成分引起的误差。  0.02-0.1  mg/ml=0.144(A215-A225)
280吸收法  蛋白质中的W和Y残基的苯环中含共轭双键，在280nm有最大吸收  0.1-1  280nm
280&260吸收差法  核酸260nm的吸收比280nm强，而蛋白质正相反，  0.1-1
  mg/ml=1.45A280-0.74A260
可以根据你要求的精度，可信度，结合试剂的价格和操作的难易选择一种就可以了。

作者: wsll 时间: 2013-7-26 17:14

诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.

作者: ladyhuahua 时间: 2013-7-26 17:14

QUOTE:

原帖由 wsll 于 2013-7-26 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.

考马斯亮蓝G—250法于1976年由Bradford建立。所以考马斯亮蓝G—250法又叫 Bradford法。

作者: qhyu 时间: 2013-7-26 17:15

我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-7-26 17:15

QUOTE:

原帖由 qhyu 于 2013-7-26 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？

目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法：Bradford法和BCA法
Bradford法（也叫考马斯亮蓝G—250法）测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中atteb-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20, 60, 80低于0.015%。另外Bradford法是基于酸性溶液的反应。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。不适用BCA法时建议使用Bradford法。
美国FDA批准用BCA法蛋白定量。
你在实验中要注意比色皿一定要在每次测量后立即用95%乙醇浸泡，然后洗净，再用蒸馏水洗净，不然会影响结果。另外要先测低浓度的样品，后测高低浓度的样品。如果自己测量有问题，那就买试剂盒吧，Bradford蛋白浓度测定试剂盒和BCA法测定试剂盒都有。Bradford法的便宜一点。

作者: 8princess8 时间: 2013-7-26 17:15

我们是做药品生产检测的,在测定蛋白含量是还是用LOWRRY法的,因为<生物制品规程>就是这样规定的

作者: 04906 时间: 2013-7-26 17:16

我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！

参见汪家政《蛋白质技术手册》上面说的很详细。其实很多有关生化实验技术的书都有介绍的。

作者: finger 时间: 2013-7-26 17:17

我做过考马斯G250法，发现不同时间有影响，而且显色液每次用前要过滤，否则有絮状物，结果稳定性不好。文献上把它吹得多好多好，有点骗人。

作者: TAT 时间: 2013-7-26 17:17

其实可以自己摸索一下了，考法确实挺麻烦，显色液每次都要过滤，但是用熟了，也就不会觉得麻烦了，每一种方法都有它一定的局限性，多数战友推荐的都是自己用的比较好的方法，你也可以摸索出一种适合自己实验的合适的方法出来压

作者: 04906 时间: 2013-7-26 17:18

我们实验室（基因工程）一直用BCA法，是师姐以往老看国外论文上用此法而购买的。觉得比较简便，标准曲线重复性很好。其实不应该算贵吧。我们买了一大瓶，全实验室人用，五年多了，才用一半不到。所以觉得不应该算贵。

作者: INK 时间: 2013-7-26 17:18

我也是G250，还可以，标准曲线很好。

作者: rxcc33 时间: 2013-7-26 17:19

G250的配制时需注意考马斯亮蓝必须在乙醇完全溶解后再加磷酸，溶液难，可用37度 5‘ 100W超声溶解，这样做出的两个曲线都很稳定，另外，可用G250粗测，再用lowry，推荐使用新法lowry测蛋白。而生物制品规程版本的不准确。
即BSA先稀释成1mg/ml母液（-20度保存）用时稀释为0.5mg/ml，各管分别取0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml,补足水到总体积0.5ml。而待测样品稀释为0.25mg/ml左右也取0.5ml.每管加入（25ml无水碳酸钠+0.25ml 0.5%五水硫酸钙+0.25ml 1%酒石酸钠）上述混合液0.25ml/管。10’后加入1N FOLIN酚试剂 0.25ml/管，注意混匀。30‘后500nm测OD。
此法很准确。

作者: zsxan1990 时间: 2013-7-26 17:20

我们用Bradford法，这个方法很好。但关键是要掌握好蛋白与solution反应的时间，这非常重要！

作者: BUK 时间: 2013-7-26 17:21

我们实验室（基因工程）一直用BCA法，是师姐以往老看国外论文上用此法而购买的。觉得比较简便，标准曲线重复性很好。其实不应该算贵吧。我们买了一大瓶，全实验室人用，五年多了，才用一半不到。所以觉得不应该算贵。

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能不能详细说说protocol，对你的方法有兴趣，又懒得查书，^_^，
BTW：是不是每次测的时候都要测标准曲线？还是只要刚买回来的时候测一次就行了？

作者: c86v 时间: 2013-7-26 17:22

我们实验室主要也是用BCA法，用的是碧云天的试剂盒，两三百元一个吧，能测500个样。我们实验室不少人觉得BCA的标曲不好做，我的经验是把标曲留在最后做，并且使用梯度稀释的方法来加蛋白标准品，这样每次的加样体积都固定，而不是按照说明书的固定浓度而体积梯度变化，感觉那样的话在加样体积小的时候误差比较大。感觉用这种方法做标曲基本都能一次成功。

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