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标题: 【求助】原核表达做了两个月，没结果 [打印本页]
作者: 嗅嗅    时间: 2013-7-30 17:17     标题: 【求助】原核表达做了两个月，没结果


小生作一新分子的原核表达，预测分子量9.0 KDa左右，载体是pGEX-2T,GST融合载体，测序也正确，试过37度，30度，28度，IPTG 0.4－1.0mM，都不表达，连包涵体都没有。真急人啊。各位提提建议，不甚感激
作者: cocacola    时间: 2013-7-30 17:18


1　温度可提高至40度或42度；
2　诱导的时间最好从1小时到8个小时，每小时取样一次，跑SDS－PAGE；
3　看一下你用的载体是否正确；
4　IPTG的浓度可试一试0.1－0.4和1.0－1.5mM；
5　实在做不出来，可考虑换表达载体；可用pET载体和一些新的GST融合表　达载体。
作者: TAT    时间: 2013-7-30 17:19


同意楼上做法！
温度可降低，我做的是20度，表达出来了，而且大部分是可溶的！
作者: linlinstar    时间: 2013-7-30 17:20

考虑有无信号肽序列或核定位序列，有无稀有密码子影响
作者: orangecake    时间: 2013-7-30 17:20


除了诱导条件，第一，先看看是不是稀有密码子的问题，在分子生物学书上可以看到大肠杆菌缺乏的密码子。第二，到网上预测一下你的蛋白,是不是膜蛋白,它的二级结构，定位在什么地方。网站cuturl('http://ca.expasy.org')
作者: zzzz    时间: 2013-7-30 17:21


同意二楼的建议，
不过还有一种可能性就是你的蛋白已经表达出来了，可能浓度太低，跑电泳不一定能跑出来，这样你就可以借助一些提高电泳灵敏度的技巧来试试了。
如：1、进染色方法，银染，最近看到一篇关于考染的改进方法，不错
传统的胶体考染法（Electrophoresis 1988,9,255-262）
染色液的成份（0.1% G-250, 10%（NH4）2SO4，2% H3PO4，20%甲醇）

[1] 固定：12%（W/V）三氯醋酸（TCA）2h
[2] 染色：200ML染色液混合50ML甲醇 16-24h（染色液：在490ML含2%的H3PO4中加入50g（NH4）2SO4直至完全溶解，再加0.5gCBBG250搅拌混合，定容至500ML使用前摇匀）
[3] 漂洗0.1mol/L Tris-H3PO4(PH6.5)漂洗两分钟；25%甲醇漂洗不超过1分钟
[4] 稳定：在20%的（NH4）2SO4中稳定蛋白质-染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达30ng protein/spot

改进的胶体考染法—Blue silver法（Electrophoresis 2004，25，1327-1333）

染色液的成份（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇）
100ml H2O+100ml H3PO4+100g 粉末状（NH4）2SO4 先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解，用水定容到800ml ，搅拌后加入200ml甲醇。
灵敏度可达1ng protein/spot

染色方法同上。
2、蛋白先浓缩再跑电泳，可以采用TCA沉淀法
If your protein is too dilute, you need to concentrate it before load on gel. Here is a method to concentrate protein before gel:
CHCl3 Precipitation of Proteins
For concentration of proteins from a variety of aqueous solutions.
In a 1.5-ml eppendorf tube take
0.1 ml of sample (or as much as possible)
add
0.4 ml of MeOH
0.1 ml of CHCl3
0.3 ml of H2O (optional)
This should give two phases upon centrifugation at 12,000g for 1 min. Protein should be precipitated at the interface. Pull off the upper phase leaving precipitated protein behind.
Add 0.3 ml of MeOH to give one phase.
Centrifuge at 12,000g for 2 min. Precipitated protein should pellet to bottom of tube.
Note: it is possible to scale up by 1.5x and still fit in a microfuge tube.
祝你成功！
作者: 嗅嗅    时间: 2013-7-30 17:25

很感谢各位提出的建议，我看了一下，这个分子氨基酸序列中稀有密码子有16个，达到20％，要想用碱基突变的方法来更换为大肠杆菌偏好碱基是很难做成的。另外，预测它有两个跨膜区，N端可能在膜内，至于它与原核表达的关系，我还不懂，请swing2004解释一下。预测无信号肽。40度能诱导出蛋白吗？因为一般是低温诱导啊。pET载体是不带GST标签的吧？
感激！！!
作者: yjf1026    时间: 2013-7-30 17:25


只有约80aa，应该是能够融合表达的。
包涵体一般出现于表达比较多的时候。也可能是表达了，但和菌体蛋白大小相仿，不容易见到。改变PAGE胶的浓度，使它出现在胶的中间位置，以和周围的条带可以清楚分离。
也可以换载体或宿主菌试一下，或者用western检测。
作者: langlang    时间: 2013-7-30 17:26

我用PQE－30载体，也遇到了表达不出来的情况，实验计划已经超期两个月，读5年学位是肯定的了
作者: am10    时间: 2013-7-30 17:26

很感谢各位提出的建议，我看了一下，这个分子氨基酸序列中稀有密码子有16个，达到20％，要想用碱基突变的方法来更换为大肠杆菌偏好碱基是很难做成的。另外，预测它有两个跨膜区，N端可能在膜内，至于它与原核表达的关系，我还不懂，请swing2004解释一下。预测无信号肽。40度能诱导出蛋白吗？因为一般是低温诱导啊。pET载体是不带GST标签的吧？
感激！！!

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看看在起始的前25个密码子或40个密码子内有多少个稀有密码子？有无稀有密码子串联？如果有多个或串联，可用融合PCR 改造，试一试。
同时准备构建其他载体，两头走
作者: yychen    时间: 2013-7-30 17:27


pET-a-c(+)、pET-41Ek/LIC、pET-42a-c(+)都带GST啊，可以试一试。既然是融合表达，那么目的基因中的稀有密码子应该不会有太大影响。alishang说在起始的前25或40个密码子内的稀有密码子情况，这段肯定在GST基因内（当然如果是N端融合的话）。
另外可以做western-blot(用抗GST的抗体即可）看看是否有表达。
作者: am10    时间: 2013-7-30 17:36



QUOTE:
原帖由 yychen 于 2013-7-30 17:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

pET-a-c(+)、pET-41Ek/LIC、pET-42a-c(+)都带GST啊，可以试一试。既然是融合表达，那么目的基因中的稀有密码子应该不会有太大影响。alishang说在起始的前25或40个密码子内的稀有密码子情况，这段肯定在GST基因内（当然如果 ...

融合表达稀有密码子无影响？不知有无文献证明？本实验室表达一个11kDa的蛋白，在多个载体不能表达（包括pGEX,GST融合, 碳端），经改造后在同一pGEX载体里表达。
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:36


我认为稀有密码子是大肠杆菌不能提供这样的密码子，融合表达应该也会受稀有密码子的影响．
另外，我想问一下你的１１kD的蛋白经过怎样的改造可以在ＰＧＥＸ载体表达？
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:39

请教：
　　用ＧＳＴ融合蛋白表达，是不是不管目的蛋白有没有表达，GST都应该有比较强的带出来？
我现在的问题是，检测PGEX空载GST有表达，但重组质粒诱导没有表达，连GST也没有。我的目的蛋白8KD大小，不是膜蛋白，没有信号肽，没有稀有密码子。

谢谢！
作者: koook5695    时间: 2013-7-30 17:40

小生作一新分子的原核表达，预测分子量9.0 KDa左右，载体是pGEX-2T,GST融合载体，测序也正确，试过37度，30度，28度，IPTG 0.4－1.0mM，都不表达，连包涵体都没有。真急人啊。各位提提建议，不甚感激！

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我说一句很faint的话，不要打我啊，我只是一直小菜鸟啊。

你的IPTG有没有失效？

我曾经这样啊，换新配的就没事了，印象中温度和光会让它失效，是不是这样啊，请教各位高手。
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:42

谢谢，我的IPTG没有失效。还有哪位不吝指点？多谢！！
作者: 嗅嗅    时间: 2013-7-30 17:43


人多力量大啊，集思广益！谢谢各位的宝贵提议。我的这个分子中，稀有密码子没有连续的，分布于第2个（T），第五个（s），8，15，19，24，25，31，32，35，47，48，50，53，62，65，66，总共81个氨基酸。要改造还不知道怎么作？请alishang 教教，融合PCR怎样作的？至于IPTG应该没有失效，实验室其他人都是用的这。不过我的GST是表达有的。而且我还发现一个现象，未诱导的细菌量比诱导的要少多了，培养和诱导时间都是一样的啊？但有人说IPTG对细菌生长有毒性，诱导的细菌长的慢，真搞不懂咋回事？
作者: ladyhuahua    时间: 2013-7-30 17:44


我知道像BL21菌株不能识别AGG和AGA两种精氨酸密码子，如果序列中这两个密码子较多的话就会影响表达，不知道会不会是这方面的原因？
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:46

谢谢！还要请教:
1 我没有看到目的条带会不会是蛋白表达量仍然很少? 是不是只要有,就可以用western 检测?
2 我的目的蛋白只有8KD,如过我用his tag做融合表达,这样融合蛋白分子
量 14 KD,可以做吗? 因为我这有PET28,是his tag 的.
作者: fsdd817    时间: 2013-7-30 17:46



QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-7-30 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢！还要请教:
1 我没有看到目的条带会不会是蛋白表达量仍然很少? 是不是只要有,就可以用western 检测?
2 我的目的蛋白只有8KD,如过我用his tag做融合表达,这样融合蛋白分子
量 14 KD,可以做吗? 因为我这有PET28,是h ...

1，在你的对照样品设置完全的情况下，仍然没有看到特异的条带或粗细有差别的条带，则可能是你的蛋白没表达。大多数情况下，只要表达，都可看出来。western 检测是灵敏的，不管有没有，作western 检测验证是很必要的（前提是操作和试剂都没问题）。
2，我以前一直受目的蛋白小不易与His等融合的影响（在普通胶上不易分辨），但用HIS融合，纯化有优势。你的蛋白融合后有14KD，还是可以做的，15％SDS胶应是可以分辨的。
大胆地做
作者: lagua123    时间: 2013-7-30 17:48

我想问一下，有蛋白结构中有跨膜区，对于表达与否的影响会很大吗？
我正为此事发愁呢！
谢谢
作者: DONT    时间: 2013-7-30 17:48

除了诱导条件，第一，先看看是不是稀有密码子的问题，在分子生物学书上可以看到大肠杆菌缺乏的密码子。第二，到网上预测一下你的蛋白,是不是膜蛋白,它的二级结构，定位在什么地方。网站cuturl('http://ca.expasy.org')

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请教，如果是膜蛋白有什么特别的么，谢谢
作者: DONT    时间: 2013-7-30 17:50

还有请教，GST系统表达的全部是可溶的么，会有包含体么
作者: lxh031    时间: 2013-7-30 17:51

融合表达稀有密码子无影响？不知有无文献证明？本实验室表达一个11kDa的蛋白，在多个载体不能表达（包括pGEX,GST融合, 碳端），经改造后在同一pGEX载体里表达。

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不好意思，我确实没有看到有关稀有密码子对融合表达的影响，只是偶尔看到靠近5‘端的稀有密码子（或稀有密码子簇）对蛋白的表达有很大影响（Emanuel Goldman1，J. Mol. Biol. ，1995， 245：467–473）以及大量的优化密码子偏好后蛋白表达提高的例子（Claes Gustafsson, Sridhar Govindarajan and Jeremy Minshull，TRENDS in Biotechnology ，2004，22（7）：346-353）。不过我还是认为外源蛋白在大肠杆菌中能否表达与很多因素有关。如果考虑到稀有密码子的问题，除了如alishang所讲改造目的基因外，也可以选用表达携带稀有密码子tRNA的菌株，Stratagene,Novagen好象有。
作者: fsdd817    时间: 2013-7-30 17:52

还有请教，GST系统表达的全部是可溶的么，会有包含体么

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GST系统表达的蛋白不一定是可溶的，出现包涵体的现象是常有的事，这时往往纯化很难。这也是His融合可以克服的优点。
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:52

自己也做膜蛋白,一直没有表达.我知道膜蛋白做原核表达,难度挺大,因为它会整合到细菌膜里面,即使有表达,也很难拿到蛋白.
据我所知,如果你的蛋白不是可融性蛋白会形成包涵体,与质粒应该没什么关系.
作者: lagua123    时间: 2013-7-30 17:53

那么请教一下一般膜蛋白是怎么拿到的呢
作者: rxcc33    时间: 2013-7-30 17:53

人多力量大啊，集思广益！谢谢各位的宝贵提议。我的这个分子中，稀有密码子没有连续的，分布于第2个（T），第五个（s），8，15，19，24，25，31，32，35，47，48，50，53，62，65，66，总共81个氨基酸。要改造还不知道怎么作？请alishang 教教，融合PCR怎样作的？至于IPTG应该没有失效，实验室其他人都是用的这。不过我的GST是表达有的。而且我还发现一个现象，未诱导的细菌量比诱导的要少多了，培养和诱导时间都是一样的啊？但有人说IPTG对细菌生长有毒性，诱导的细菌长的慢，真搞不懂咋回事？

1、用Novagen的RosettaBlue（DE3）表达菌株可提供稀有密码子tRNA；
2、你的目的基因产物可能对表达菌有毒性，Invitrogen的带PL启动子的载体pLEX可允许毒性蛋白在大肠杆菌中表达。
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:54

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我现在放弃用原核表达拿蛋白了,我还不知道用什么方法可以拿到,但即使理论上可以,难度也很大.我现采取这样的方法:在跨膜区域之外的片段上设计引物,避开跨膜区.如果还是拿不到,就准备合成多肽.
作者: lagua123    时间: 2013-7-30 17:56



QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-7-30 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
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我现在放弃用原核表达拿蛋白了,我还不知道用什么方法可以拿到,但即使理论上可以,难度也很大.我现采取这样的方法:在跨膜区域之外的片段上设计引物,避开跨膜区.如果还是拿不到,就准备合成多肽. ...

那么请问，如果是做真核表达膜蛋白有没有可能蛋白表达在转化的真核细胞表面呢？
作者: PCR    时间: 2013-7-30 17:57

真是奇怪，为什么不换一下表达菌株呢？
推荐两种：Rosetta, BL21(pSBET)对稀有密码子的表达应该有帮助的啊。
作者: yueban-1147    时间: 2013-7-30 17:57

真是奇怪，为什么不换一下表达菌株呢？
推荐两种：Rosetta, BL21(pSBET)对稀有密码子的表达应该有帮助的啊。



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