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标题: 【求助】关于考马斯亮蓝染色问题 [打印本页]

作者: niangao1980 时间: 2013-7-30 17:59 标题: 【求助】关于考马斯亮蓝染色问题

我刚刚入手蛋白质表达实验阶段，做了几次SDS-PAGE
发现染色效果不好，染色模糊，而且越是低分子量的蛋白质越是着色模糊，蛋白条带也很少。
我的染色液配制时间不长，我配制的成分是：水异丙醇冰乙酸考马斯亮蓝
脱色液是：水，冰乙酸乙醇
我问老师染色液中异丙醇与脱色液中乙醇不一致，是否影响染色效果，老师说不影响。
所以我现在想请教为什么我的染色效果不好？
还有一个问题就是电泳完毕直接染色，还是先浸泡在固定液一会再染色

作者: yychen 时间: 2013-7-30 18:00

是不是与染色液和脱色液的配制有关呢？

一般用的染色液: 蒸馏水甲醇冰乙酸考马斯亮蓝R-250；脱色液：蒸馏水，冰乙酸甲醇

电泳完毕后直接用蒸馏水漂洗凝胶两次即可进行染色。

作者: standbyme 时间: 2013-7-30 18:01

电泳完毕后直接用染色液染色即可！另外，染色液和脱色液可以相同，只是染色液中有染色剂。低分子量的蛋白质越是着色模糊可能是蛋白质从胶的空隙中逃了，适当加大胶的交联度，快速染色（微波加热）可能回奏效。如果是低分子量的蛋白比较多，用尿素胶体系一试！

作者: changlhsyo 时间: 2013-7-30 18:01

还有一个问题就是电泳完毕直接染色，还是先浸泡在固定液一会再染色
？
我用的染色方法有两种：
第一种是电泳完毕后，直接染色，但染色的时间长一般需要过夜染色，然后先用高浓度脱色液脱色，再用低浓度脱色液脱色；
这用方法的缺点是时间太长了。
第二种方法是电泳完毕后，先固定30分钟，然后高温进行染色30分钟，在高温进行脱色，一般很快就会出现结果，但这种方法的蛋白胶不太容易制成干胶。
两种方法染色效果都挺好的！！！

作者: jkobn 时间: 2013-7-30 18:02

请问什高浓度脱色液和低浓度脱色液区别是什么
我觉得是不是我电泳的电压太高，产热高，导致染色效果也不好
我电泳的电压是350~420V，电流是30mA~40mA,我开始认为是我的缓冲液配置有误，重新配制仍然是这样，而且因为是双面跑胶，总是一面跑的快，一面跑的慢，是因为两面的浓缩胶和分离胶不一样长，还是电泳槽的问题呢？电压太大会不会影响我的染色效果呢？

作者: niangao1980 时间: 2013-7-30 18:03

呵呵，高浓度稀释不就成了低浓度吗？低浓度为了偷懒脱色过夜用的。
象我这种懒人。我是一跑完胶就用自来水洗一下，然后考染5分钟，然后就是脱色拉。
跑分离胶电压为100v，浓缩胶为200。
你所说的“发现染色效果不好，染色模糊，而且越是低分子量的蛋白质越是着色模糊，蛋白条带也很少”
我估计是电泳缓冲液的问题。你用一下新的看看

作者: 00无名指00 时间: 2013-7-30 18:03

我觉得有可能是染色的时间短，一般要0.5-1小时的，染色时间短，自然带少，至于模糊要注意胶浓度问题，小分之的热扩散厉害，所以不要电泳时间太长，胶浓度别太低，电泳的电流稍微小点，小分子模糊是很正常，只要不很厉害没有关系。

作者: niangao1980 时间: 2013-7-30 18:04

我每次都是染色过夜的，应该染的透彻，因为总是一板胶跑的快，一半胶跑的慢，跑的快的染色效果较好一些，跑的慢的小分子量的蛋白就什么也看不到。
我配制的是15%浓度，我觉得不是胶浓度的问题，应该是电泳的问题。
因为电流小，当然跑电泳时间长，电流30mA，电压都380V了。
我觉得好象也不是电泳液配制的问题，因为电泳液我配制了好几次，都是这样，而且如果是电泳液的问题，应该不会影响两板胶跑的速度问题。
这样排除各种因素，是不是电泳装置的问题呢？
各位大虾不知同不同意我的分析。

作者: kulee 时间: 2013-7-30 18:05

请问什高浓度脱色液和低浓度脱色液区别是什么
我觉得是不是我电泳的电压太高，产热高，导致染色效果也不好
我电泳的电压是350~420V，电流是30mA~40mA,我开始认为是我的缓冲液配置有误，重新配制仍然是这样，而且因为是双面跑胶，总是一面跑的快，一面跑的慢，是因为两面的浓缩胶和分离胶不一样长，还是电泳槽的问题呢？电压太大会不会影响我的染色效果呢？

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困惑中,您跑的是mini胶还是大胶,mini胶的电压能跑到这么高吗?发热量太大的话肯定蛋白质容易扩散.您用的电泳条件是恒压还是恒流亦或恒功率?难道您两面的浓缩胶和分离胶不一样长吗?如果不一样长那么肯定两面跑的速度不一样,分离胶和浓缩胶PH值和胶浓度都不一样,跑的快慢当然也不一样啦.
感觉问题还真不一定是染色的问题

作者: niangao1980 时间: 2013-7-30 18:05

是的，我跑的胶是mini胶，电泳的条件是恒流，我两面的浓缩胶和分离胶确实是不一样长，您说的对，如果胶不一样长，会影响电泳的速度，我再调一下实验条件，使胶的长度大致一致，如果还是跑的不一样，那也许就是电泳装置本身的问题了。谢谢楼上大虾的回复！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-7-30 18:05

1. 染色液配方：

MW
CBB G-250 854.0  试剂纯 0.10g
冰醋酸 60.05  分析纯  70ml
甲醇 32.04  分析纯  250ml
去离子水       680ml

2. 脱色液配方：

冰醋酸 60.05  分析纯  70ml
甲醇 32.04  分析纯  250ml
去离子水       680ml

染色10-30分钟，脱色至背景无色蛋白条带清晰为止，中间可更换一次脱色液，染色液可回收再次使用。

3. 小分子条带不清晰是正常现象。

4. 建议浓缩胶80v，分离胶160v

作者: fox_79 时间: 2013-7-30 18:06

起码5小时以上或者染色过夜

作者: BOSS2011 时间: 2013-7-30 18:06

不用单独去固定胶，如果用Helan或类似的配方，染色液就可以固定。
，380伏，30毫安，你可以算一下功率是多少瓦，我觉得有点大，最好调整一下。

作者: okhaha 时间: 2013-7-30 18:07

我开始考染时，染得也不太清楚，我的看法是：
1、最好先固定、后染色、脱色，固定最好不要省，关键染色时间要足够长，我一般过夜，而且，染色液用过一段时间会变稀，也会影响染色效果，需要重配。
2、是不是蛋白上样量太少，或电泳没完全分开，可能使一些带不够清楚，因为考染毕竟灵敏度不如银染。

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-7-30 18:08

您好，我是做肽的电泳的能否参考这种方法？

作者: lgm 时间: 2013-7-30 18:08

推荐一个极为优秀的配方：
染色液：考马斯亮蓝R-250 1g，乙醇45%，冰乙酸 10%，加水定容至1000ml。
脱色液：冰乙酸10%，乙醇30%。

我们是实验室每天五台电泳仪做SDS-PAGE，都是用的这个配方，人格担保绝对好用。没有甲醇，减少毒性，效果一样好。

加入染色液100ml，加盖微波煮沸，振摇染色2-3min，回收染色液，自来水漂洗，加脱色液50-100ml，脱色10-20min，观察。整个过程绝对不超过40min，过夜染色真没必要。我用500ml的染色液，每次用完回收，可以用几十次上百次，最后有机溶剂挥发光了，染完色，胶变的很大，就要重配了。配制好的染色液可以存放很长时间，想等它坏掉不知要几年时间。

10KD以下的蛋白条带都是弥散的。需要看小分子量可以用trisin胶。

电泳液按照分子克隆配制，时间久了胶上会有背景。哈哈，有一次我曾经误用稀释10倍的电泳液，条带会走的慢些，不过效果还是不错，10KD的条带在12%的胶上都能看到。

作者: leifengta 时间: 2013-7-30 18:08

按照分子克隆操作就OK了

作者: wmp1234 时间: 2013-7-30 18:09

请教高人，我的胶脱色后，缩小了30%！

而且染色效果也不是很好。底色很重，蛋白条带还不明显！
染液配方：500mL 甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水，2.5g R-250
脱色液配方：500mL 甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：染色液200mL，4小时
脱色：脱色液500mL，过夜
实验室没有脱色摇床，我用的振荡器最低速度振荡的

作者: zranqi_1 时间: 2013-7-30 18:10

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2013-7-30 18:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教高人，我的胶脱色后，缩小了30%！

而且染色效果也不是很好。底色很重，蛋白条带还不明显！
染液配方：500mL 甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水，2.5g R-250
脱色液配方：500mL 甲醇，100mL冰醋酸，400mL 水
染色：染色液200mL，4小时
脱色：脱色液5 ...

此方法灵敏度不高，时间太长。

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