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标题: 【讨论帖】Tricine-SDS-PAGE胶的使用方法与心得 [打印本页]

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:06 标题: 【讨论帖】Tricine-SDS-PAGE胶的使用方法与心得

先说一下Tricine胶的好处。
Tricine胶比较容易将样品压平，具体原因我也没有搞清楚，但可以肯定的是这种胶跑出来的Marker又细又直，同样，显出来的条带也压的很好。与普通的SDS-PAGE胶跑出来的结果相比，Marker扩散没有那么厉害，各泳道条带间隔明显，不像普通胶的条带容易连到一起。反正跑出来的条带就是很漂亮。

Tricine-SDS-PAGE胶的配方：（我一直用的就是10%这个浓度，把8KD和280KD都做出来了）
分离胶积层胶
ddH2O 1.85 mL 2 mL
AB-3 1 mL 250 uL
Gel-Buffer(3*) 1.65 mL 750 uL
甘油 0.5 mL —
10%AP 25 uL 22.5 uL
TEMED 2.5 uL 2.25 uL
(这个配方来自DXY，今天又回来了，呵呵)

3*Gel-Buffer 配方：(200mL量)
Tris-Base 48.44g
Tris-HCl 31.52g
SDS 0.6 g
pH 8.45,很难溶，可以60°C水浴促进溶解。

AB-3 (100mL量)
丙烯 48g
双叉丙烯酰胺 1.5g
注意：丙烯溶解后会使溶液体积增大，故只要用约80mL水溶解即可，完全溶解后再定容。通风橱内操作，注意保护自己！

外槽电泳液（+极）（Anode Buffer）10*
Tris-Base 46.92g
Tris-HCl 17.73g
500mL体积，pH 8.9。

内槽电泳液（-极）（Cathode Buffer）10*
Tris-Base 24.22g
Tricine 35.84g
SDS 2g
200mL体积，pH 约8.25。

（内外槽电泳液的体积这样配，是因为一般电泳槽内槽一次只要150mL液体，而外槽需要400-500mL液体。）

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:06

制胶时，分离胶做好后加水压平，一般20min就凝固了。
这里有个技巧，已经在某个帖子里回答别人了。为了避免样品漏的问题，可在分离胶凝固后（表现为分层处出现一条清晰的分界线），这时候，可以不急着把水控干，而是配置积层胶，但是AP和TEMED先不加，再空出水（枪头沿一边吸尽即可），再在积层胶里加入AP,TEMED，迅速混匀，先取少量胶液灌入板内，轻轻摇晃几下，润一遍，弃掉这些胶液，这时候尽量去干净，动作要快。再正式灌满胶液，插上梳齿。

跑电泳时，可以60V先压约30min，可以看到溴酚蓝变的又细又直，待进入分离胶，可以看到预染的Marker已经分离，就可以将电压调至120V跑完。

转膜与普通的都一样，这里建议30V恒压转2小时(用于80KD以下的蛋白分子），如果有更大的蛋白280KD的mTor,可以再这2h后再加350mA 30min，效果很好，280KD以下90KD以上的都可以加350mA这一步，时间根据分子量来定。90KD加15min即可。

先写这些吧，有什么问题我们再讨论。希望对大家的实验有所帮助。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-7-31 13:06

我想请教一下楼主Tris-Base和Tris-HCl有什么区别？还有就是Tricine-SDS-PAGE系统不是应该有3层胶吗？
小弟最近正在做一个6K分子量小蛋白的western-blot，可用普通的sds-page电泳后所得到的压片条带不是很理想，希望楼主给予帮助，非常感谢。

作者: greenbee 时间: 2013-7-31 13:07

你6K分子量小蛋白的western-blot能做出来？能把你方法说说吗？我在做7.5的，普通的sds-page电泳，啥也没有?非常感谢啊！园里说Tricine-SDS-PAGE系统3层胶适合5K以下蛋白。

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:07

6KD的蛋白我没做过，但是应该可以。如果要用孔径更小的膜效果会更好一些
这个系统是很稳定的。

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:08

Tris-Base就是Tris碱,Tris-HCl就是Tris盐酸。
做普通胶不是有PH6.8和8.8的Tris-Hcl吗？配置时好像就是用Tris-base加酸调的PH值就可以了
TAKARA参考书上有这个配方。
我们这个系统里用的Tris-Base和Tris-HCl就是两种不同的粉剂。
3层胶我还没做过，因为这个蛋白分离范围已经很大了，足够了。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-7-31 13:08

多谢楼主回复了。
另回复楼上的问题，我做6kd的蛋白用的是普通的sds-page，分离用的是20%的胶，之所以不满意是因为电泳条带有些弥散，最后压片的结果不是很好看，所以想尝试Tricine-SDS-PAGE。至于电泳条件是恒流11mA 30min，随后15mA 1小时，具体情况可参考预染marker，感觉这个条件和楼主的恒压情况可以基本对应，小分子蛋白又是做western-blot不宜跑得太久。转膜我用的是湿转，20V 1.5-2小时（起始电流大概130mA左右），和楼主的条件也差不多。电泳仪可能比较老了，貌似还是Pharmacia的。

作者: ALALA 时间: 2013-7-31 13:09

楼主，大约17KD左右的蛋白，用0.45um的膜来转会不会转过啊？

作者: qiangren789 时间: 2013-7-31 13:09

请问小分子量的对照物（肌球蛋白F1\F2\F3）在哪可以买到？价格怎么样？

作者: skytree 时间: 2013-7-31 13:09

Tris：三羟甲基氨基甲烷，
分子式：(HOCH2)3CNH2
结构式：

图片附件: 78718035.png (2013-7-31 13:10, 2.81 KB) / 该附件被下载次数 26
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17340

作者: skytree 时间: 2013-7-31 13:12

Tricine：三羟甲基甲基甘氨酸
分子式：C6H13NO5
结构式：

图片附件: 54456087.gif (2013-7-31 13:12, 1.35 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17341

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:13

对于这个错误给大家道歉！
我的整个体系是从师姐的实验记录本中摘抄下来的，有了出入，我已查阅相关文献，证实版主skykiller是对的。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-7-31 13:13

昨天做了tricine SDS_PAGE,没有AB-3，就用的Bio-Rad的30%的stock solutions，调整了一下用量.
Anode buffer: 0.2 M Tris-HCl, pH8.9
Cathode buffer: 0.1 M Tris, 0.1 M Tricine, 0.1% SDS, pH8.25
Gel buffer: 3.0 M Tris, 0.3% SDS, pH 8.45
Electrophoresis: 80V 30min, 200V 60min.
结果小分子量的条带很弥散，不只是什么原因？请楼主和高手指点迷津。图片做的不好，让大家见笑了。谢谢！
10% 分离胶 4% 积层胶
DDH2O 2.3 ml 3.36 ml
Gel buffer 3.3 ml 1.2 ml
AB ( 30% stock) 3.34 ml 0.67 ml
Glycerol（100%） 1 ml 0 ml
10% APS 50 μl 40 μl
TEMED 6 ul 5 ul

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:14

第四道似乎漏了。
小分子量的条带本身就会弥散。
你仔细观察就会发现，分子量越大条带越细，分子量越小越弥散，表现出的就是条带很粗。

作者: 阿凡提 时间: 2013-7-31 13:14

你的甘油是纯的？会不会很难吸起来啊！这样会不会不准，能问下你的丙烯酰胺是百分之几的啊!你的浓缩胶和分离胶Gel-Buffer的PH值是一样的啊？

作者: eric930 时间: 2013-7-31 13:25

LZ，按照你的配方，我制的浓缩胶根本不凝固，电泳完了，转膜时发现浓缩胶就跟浆糊似的，什么情况呢？你的配方没问题吧？

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:25

浓缩胶不凝是不是AP不行啊 AP粉剂很容易吸潮时间久了就失效了还有温度低了会影响凝固的
可以把10%AP和TEMED的量加大会凝的快些
上面的配方是按我实验记录本录上来的

作者: nvdabing 时间: 2013-7-31 13:27

还有至于版主的留言问题
我想说的是只有负极缓冲液用了tricine
我一直用的是上面的配方 tris-base 和tris-HCl都写的很清楚没有错的

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