分析测试百科

标题: 【求助】两性电解质的作用原理？ [打印本页]

作者: 麦茶tea 时间: 2013-8-1 13:03 标题: 【求助】两性电解质的作用原理？

因为试验需要在做PH4~7的胶条，而对应的PH4~7的IPG buffer在订购过程中出了点问题，货期有点长，本身我的试验又比较紧张，这种情况下，我可以用PH3~10的IPG buffer来代替PH4~7的IPG buffer跑一向么？
两性电解质的作用原理是什么？

作者: 68943512yao 时间: 2013-8-1 13:04

我一直都用pH3-10的IPG buffer跑4-7的胶条的，没有什么影响。
两性电解质相当于溶液中的盐离子，有盐离子蛋白质才能很好的溶解，但是盐离子会影响等电聚焦，所以用两性电解质替代盐离子。

作者: 麦茶tea 时间: 2013-8-1 13:04

QUOTE:

原帖由 68943512yao 于 2013-8-1 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一直都用pH3-10的IPG buffer跑4-7的胶条的，没有什么影响。
两性电解质相当于溶液中的盐离子，有盐离子蛋白质才能很好的溶解，但是盐离子会影响等电聚焦，所以用两性电解质替代盐离子。 ...

用pH3-10的IPG buffer跑4~7的胶条跑了一次，感觉胶点跟跑3~10的胶条时差不多，而且有很多的横条纹，下面是我跑的PH3-10的胶条的图

图片附件: 42158077.jpg (2013-8-1 13:04, 11.37 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17380

作者: 麦茶tea 时间: 2013-8-1 13:05

再传一张我跑的PH4~7的胶条的图，这两张图都是用的PH3~10的IPG buffer，看这两张图的点似乎没多大区别...

图片附件: 94793615.jpg (2013-8-1 13:05, 13.51 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17381

作者: mimili_901 时间: 2013-8-1 13:05

你的胶横条文很多阿，聚焦时电压能升上去吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-8-1 13:05

PH4~7的IPGbuffer 。。。。。。。。。。。。。

作者: 9900 时间: 2013-8-1 13:06

能够用宽范围的IPG buffer 跑窄范围的IPG胶条，但是反之不行

作者: ii077345 时间: 2013-8-1 13:07

因为试验需要在做PH4~7的胶条，而对应的PH4~7的IPG buffer在订购过程中出了点问题，货期有点长，本身我的试验又比较紧张，这种情况下，我可以用PH3~10的IPG buffer来代替PH4~7的IPG buffer跑一向么？
两性电解质的作用原理是什么？

=========================================================================================================

你好.我也是研究生阶段接触到蛋白质组学的课题,当然我们课题组做的不仅仅是蛋白质组学的经典策略-双相电泳,我们用的更多的是多维色谱以及结合生物质谱技术.当然,双相电泳是个目前同时分离做多的一项技术,下面我简单介绍下为什么用两性电解质和怎么使用.

一、载体两性电解质
（1）载体两性电解质必需具备的条件：
（i）在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。
（ii）在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。
（iii）分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。
（iv）化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。
（v）应不与分离物质反应或使之变性。总起来说，当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这就是好的载体两性电解质。
（2）理想的载体两性电解质的合成：
用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑的pH梯度。载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260mμ）很低。

二、 pH梯度的选择
　　在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下范围时，因缺少中性载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低，必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时，可加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH离于10时，可补加胺使pH增加到11。载体在pH6附近电导较低，可以与蔗糖密度梯度互相补偿，蔗糖浓度高时电导低，所以可把pH6电导低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范围时，阴极在上，而用pH6以上范围时，阳极在上方。
三、蛋白质样品及分离容量
电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提纯，分析上可用来测定混合物中某一成分的相对比例：如大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱，占据了分离的有效部位。加样体积不受限制，最高可达80-85毫升。
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯度所能支持的蛋白质，提高密度可以提高分离容量；容量与区带高度的平方成正比，降低电压可使区带变宽，提高容量，但分辨率降低，聚焦时间长，用窄的pH梯长范围可以使区带变宽，提高分辨率。用110毫升柱时，每一区带蛋白质含量最高可达２0-25毫克，由于粗蛋白样品可分为很多区带，所以总量可以加至几百毫克；分离的容量与柱的横载面成正比，用440毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带可达一克。

因为IEF 涉及很多技术和实验技巧，我先给你简单介绍下吧。有问题你再给我发信息吧。希望可以帮你弥补下这方面的知识。

作者: linlinstar 时间: 2013-8-1 13:07

对于IEF中的两性电解质选择要注意浓度选择(特别注意:Bio-Rad和Amersham的两性电解质缓冲能力不一样，使用浓度也不一样).IPG胶条本身已经具有了固定化的IEF梯度,原则上可以不加两性电解质,但实际上我们在裂解蛋白和IEF的时候还是加了流动相的两性电解质,这个是用来溶解蛋白的,而且在IEF过程中可以让蛋白运动到指定的pH值处并且保持溶解状态不沉淀;但是这个追加的两性电解质有一个缺点就是会导致升压困难,所以,对于两性电解质的浓度选择是,加入的量使IEF能在设定的时间内达到聚焦电压,如果达不到，则减少量,如到达时电流小则可追加量.

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-8-1 13:08

我在纯化一种酵母表达的蛋白，分子量15KD，没有his或gst标签，老板说查查等电点，用等电点法纯化，请教各位战友，怎么查啊？谢谢！！！

作者: 麦茶tea 时间: 2013-8-1 13:08

我的PH4~7的buffer已经到货了，但是做了几次后，总是有横条纹......
在园子里搜索得知横条纹主要是由样品和聚焦引起的
我的样品是用clean-up试剂盒处理过的，聚焦总伏小时数已经高达60165V.h
我的上样量也只有50ul，不知道是什么原因，在高分子量蛋白那段区域总是有横条纹，下面上传一张我的胶图

作者: @STAR@ 时间: 2013-8-1 13:08

请问楼主PH4-7的IPG buffer 是在哪里定的啊？我是南京的，问了好多公司都没有这个范围的呢

作者: shanzhapia696 时间: 2013-8-1 13:09

我的PH4~7的buffer已经到货了，但是做了几次后，总是有横条纹......
在园子里搜索得知横条纹主要是由样品和聚焦引起的
我的样品是用clean-up试剂盒处理过的，聚焦总伏小时数已经高达60165V.h
我的上样量也只有50ul，不知道是什么原因，在高分子量蛋白那段区域总是有横条纹，下面上传一张我的胶图

===========================================

横向拖尾应该主要是蛋白沉淀引起的。试试加大DTT的量。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)