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标题: 【求助】原核表达的奇怪现象--关于终止密码子的效率 [打印本页]

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-8-1 15:29 标题: 【求助】原核表达的奇怪现象--关于终止密码子的效率

我用的载体是PET32a，BL21表达宿主。
目的片段5KD左右，后面设计了TGATGA两个终止密码子，但是事实证明，这两个密码子都被通读了，蛋白翻译在载体的终止子上结束。
我查过大肠杆菌偏爱性方面的资料，TGA应该有很强的终止效率。另外测序证明载体和片段的序列都是正确的。
不知道大家有没有遇到这类情况，请各位赐教！

作者: DNA 时间: 2013-8-1 15:30

一般说来，如果引物设计时加了终止密码，在蛋白质翻译的时候，翻译到终止密码时即会终止蛋白翻译。如果没有加终止的密码的话，回持续翻译至载体下游的自带终止密码处而停止翻译。对你的问题有几个疑问：1.你说终止密码被通读了，而且还事实证明，这个“事实证明”是怎样证明的？蛋白质测序？跑PAGE?你的目的片段有5kD，如果终止密码被通读了最多多了几十个氨基酸，我觉得跑PAGE时是看不出来的。不知道你是怎样证实终止密码被通读的？2.如果确实是被通读了，我觉得最有可能的地方是在克隆的时候ORF的完整性没有注意，导致了你的移码突变。因为pET32a的上游还有个Trx蛋白先翻译，因此你的目的基因在下游，需要注意开放读码的完整性，仔细核对引物和质粒图谱，说不定问题就解决了。祝你成功

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-8-1 15:31

首先说第二个问题，移码的问题我早就注意过，测序表明没有发生。
第一个问题，我的目的蛋白终止子后面带有HIS.TAG标签，如果发生通读这个蛋白自然带有这个标签，过NI柱时会挂在柱子上，这是比较明显的证据，另外，从SDS-PAGE胶上看蛋白偏大，更符合通读后的数值。而且，别人也出现过类似的结果。所以基本可以肯定是发生了通读。

作者: DNA 时间: 2013-8-1 15:31

不知道兄弟注意没有，（1）pET32a质粒上游就有Histag标签，就在多克隆位点的上游，介于Trx蛋白和多克隆位点之间，即使你的目的基因上有终止密码，蛋白翻译时也确实终止了，只是多克隆位点下游的Histag标签不会翻译，而上游的Histag标签也会翻译出来。因此，过柱时也会挂在Ni柱上啊。（2）过柱时不仅有Histag标签的蛋白可以结合Ni柱，其实很多杂蛋白也可以结合在Ni柱上，这就是为啥在做蛋白纯化时要模咪唑浓度的原因，但是一般的杂蛋白和Histag标签蛋白的结合能力不一样，因此可通过不同咪唑洗脱达到分离纯化蛋白的目的。（3）即使出现了你说的那种情况，我仔细看了下pET32a的图谱，如果通读了的话，最多比不通读时多20个左右的氨基酸，这在做PAGE时是不易区别出来的。个人见解，仅供参考，望多交流。

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-8-1 15:32

首先谢谢您的分析
上游的HIS.TAG我当然有注意，纯化很大程度上用这个。
问题是目的蛋白切下来之后仍然能挂在柱子上，这个就比较奇怪了，我用WASHING BUFFER洗过，同样洗不下来。如果发生通读会多出17个氨基酸，我知道在胶上不明显，但是我电泳时除了MARKER还加了同样大小的蛋白做对照，发现我切下来的蛋白明显偏大。确实很值得怀疑。

作者: xingyi08 时间: 2013-8-1 15:33

原核表达（E.coli）中，TAA的终止密码子的效率要高于TGA。
TGA更适合真核的终止。

至于具体文献楼主自己检索一下，有很多较早的文章分析过终止效率。

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-8-1 15:34

谢谢我已经订了引物了，估计下周可以有结果，我会发上来。

作者: 圆圆圈圈 时间: 2013-8-1 15:34

你加3个不同的终止密码呗。。总有一款适合你。。开玩笑拉
我也是一般用taa，这个不管真，原核，都是使用最多的，一般来说。

作者: XYZQ 时间: 2013-8-1 15:35

换了TAA，确实停下了，谢谢各位！

作者: zranqi_1 时间: 2013-8-1 15:36

最近我也在做PET-32A载体的表达,请问巴蛇战友可不可以把诱导条件和洗脱条件发上来我们好借鉴一下,不胜感激!

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-8-1 15:38

诱导一般就是IPTG常规诱导，不过你要摸索一下条件，时间，IPTG浓度，诱导温度，甚至AMP的浓度。你说的洗脱是指NI柱吗，同样要摸索一下，先用常规的方法，然后根据电泳图改变咪唑浓度。祝好运！

作者: zsxan1990 时间: 2013-8-1 15:41

我的一个蛋白用的也是TGA终止的，测序正确，但表达出来的蛋白分子量也偏大，不知道会不会是通读了，但是我的蛋白没有后面的HIS标签，不能肯定是不是通读了。
看到有些帖子说到蛋白电泳的表观分子量和实际分子量可能有区别，所以不能很肯定是否通读
这里还有个疑问：通读的话一般会在哪里停止呢？我蛋白设计的那个终止子越过后，还有两个不同位置的终止子，前一个的话，分子量还是小，后一个终止的话，蛋白分子量倒差不多。
敬请lz，各位指教

作者: yes4 时间: 2013-8-1 15:41

俺从开始就被人告知，终止密码子是三套一块上的，从没出过问题。显得有点笨，但是省得麻烦很多。

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