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标题: 【讨论帖】Western blot省钱大攻略 [打印本页]

作者: toy 时间: 2013-8-3 15:59 标题: 【讨论帖】Western blot省钱大攻略

也做了一段时间的western blot了，中间经历了波波折折，从一开始的手忙脚乱，到现在的灵活自如，还是有不少体会的~~一个体会是WB可以省钱，只要省的是时机，完全可以用更廉价的代价做出超值的结果。
废话少说，我先说说自己的几点体会吧，也算抛砖引玉。
1）SDS-PAGE电泳缓冲液可以反复用：只要保证内槽的缓冲液是干净的，外槽用旧的缓冲液就可以了；
2）半干转膜用的3MM滤纸也可以反复用：一定要标记好3MM滤纸的上下面，只要上下不颠倒就可以用10几次；
3）大部分一抗是可以回收的，回收后保存在4度，1个月内用一般没有问题；
4）NC膜可以剪得很小，只要你的目的条带包括就可以了。
DXY高手如云，希望大家提出更多的省钱策略，把WB做好。

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-8-3 16:03

这个话题挺好的！希望大家都能谈谈自己在做WB中的体会与心得。当然这个贴的主题是“省钱”和“省时间”！

做Western Blot的时候，蛋白电泳—转膜—封闭—抗体—显色这几个步骤是环环相扣，任何一个环节出了问题，都会得不到好的结果！很多时候大家都会把一部分责任归咎到自己没用好的试剂和耗材上面。诚然，好的试剂能为带来好的结果助一臂之力，但不一定是决定性因素。以往我们集中讨论过wb试验技巧的问题，但在wb中如何做到用物美价廉的试剂做出好的结果似乎并没有这类讨论，希望大家在这里能把自己的心得和体会介绍一下，加分从优！

1. 不反对广告帖，但要说产品好，最好能提供具体的试验结果图！
2. 谈体会的朋友，也可以把自己的试验图贴上来。

作者: mod=8048 时间: 2013-8-3 16:04

我也说几点自己的体会：
1，配胶很多人是按照分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8），浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8），10％SDS 分开加的，其实这样麻烦，因为这三个在胶里的终浓度是不变的，分别是0.375M，0.125M和0.1％，因此可以把SDS直接分别加进分离胶以及浓缩教缓冲液，配成4x的BUffer直接配胶。
2，WB里面现用现配的有APS,脱脂奶粉封闭液，1抗2抗以及洗脱液，其他比如PBS/PBST,running buffer,trans-buffer,考马斯/立春红等都可配成高倍数的母液储存，用时稀释。
3，分离胶聚合时间长点好，因此可以提前一天配好封存后4度过夜，省时间。

作者: vivian4123 时间: 2013-8-3 16:06

支持一下版主和楼主，楼主和版主说的很多，受教良多，我也补充几点

1、一抗二抗都可以回收，我平时做都是每块膜5ml，泡膜，然后摇床上摇，结合充分，抗体太少0.5-1ml，只能孵贴，抗体结合不充分，肯定影响效果，我的做法虽然看似浪费，都是抗体可以回收，4度保存1-2周，一直做该抗体的话，其实比你那每次配0.5-1还划算，而且更容易做出结果

2、同时做几个蛋白，如果分子量差不多，可以同时跑胶，如果二抗相同那就更加好了，第二天加二抗就不会混乱

3、电泳槽和转移槽建议用后冲洗，特别是转移槽，一定要水跑过夜，至少几个小时，因为转移液里的甲醇和tris都有腐蚀作用，槽里的铂金丝可比黄金还贵哦

4、一膜做多个因子，做过，不过没做出来，个人经验是：可以时一下，如果做出来，那你就省时省钱，如果做不出来，那试一下就可以了，不然浪费时间和钱，不推荐广泛使用，爆出来的背景也不好，条带肯定也没有新鲜的膜好

作者: toy 时间: 2013-8-3 16:06

呵呵，希望大家响应啊，毕竟不是每个实验室都很富有的，希望集思广益，不断改进WB，最后整理出dxy特有的WB省钱省时超值protocol~~~

还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。

作者: c86v 时间: 2013-8-3 16:07

非常好的话题，其实前面我也有讨论过这个话题，比如抗体如何回收，或者用较好的发光试剂盒节约抗体等等。今天我来说一个最近才用的方法，感觉挺好的：
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板，其实不贵，但是我建议最好几个实验室一起买，我买的100个/800RMB，直接美国空运过来的（国内代理）。

每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便，可以反复使用。而且对于比较窄的膜，完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错，但是注意最好是买未处理表面的那一种。

图片附件: 64556111.jpg (2013-8-3 16:07, 73 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17445

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-8-3 16:07

呵呵，希望大家响应啊，毕竟不是每个实验室都很富有的，希望集思广益，不断改进WB，最后整理出dxy特有的WB省钱省时超值protocol~~~

还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。

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对于预染marker稀释之后跑胶的效果，朋友能否提供相关实验的结果图具体的看看呢？

作者: langlang 时间: 2013-8-3 16:08

我是新手，想问一下大家几个问题：
先谢谢啦
1）回收的一抗下次用的时候需要补加抗体吗？加多少比例合适？
我的是两个santa的抗体，分别用1：500和1：300
2）我的strip buffer配方是1M PH6.8 tris-HCL 6.25ml
10%SDS 20ml
B-巯基乙醇 0.7ml
双蒸水补足到100ml
为什么strip时室温30min上次杂的抗体洗不掉，
50度水浴30分钟的话杂内参都出不来了？
3）santa的GAPDH稀释多少合适？做过一次1：1000没出来。

作者: youyou99 时间: 2013-8-3 16:08

我也说几点自己的体会：
1，配胶很多人是按照分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8），浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8），10％SDS 分开加的，其实这样麻烦，因为这三个在胶里的终浓度是不变的，分别是0.375M，0.125M和0.1％，因此可以把SDS直接分别加进分离胶以及浓缩教缓冲液，配成4x的BUffer直接配胶。
2，WB里面现用现配的有APS,脱脂奶粉封闭液，1抗2抗以及洗脱液，其他比如PBS/PBST,running buffer,trans-buffer,考马斯/立春红等都可配成高倍数的母液储存，用时稀释。
3，分离胶聚合时间长点好，因此可以提前一天配好封存后4度过夜，省时间。

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实验室一直采取储备液的方法，省了很多容器和配试剂的时间

SDS加到缓冲液中我没试过，但是一次不小心把SDS放冰箱了，结果析出好多结晶，缓冲液是放冰箱的，加上SDS的话有没有同样的析晶问题呢？或许浓度小点没关系？

有一次配了胶没跑电放冰箱了，明天跑胶结果条带特别难看，堪比鬼带，不知是不是浓缩胶分离胶同时放冰箱的问题。只能没跑完就停了，重新洗板，干燥，配胶，上样。

作者: youyou99 时间: 2013-8-3 16:10

1. 建议转完膜后一定要丽春红染色看看，一来可以基本判断蛋白的降解情况，二来看看转膜是否成功，丽春红染不出的话，及时找原因重新做，也算是省钱省时间的一种方法。昨天实验室丽春红没有了，转膜之后很不放心，不知转成了没有，待会显影看看......

2.关于一抗孵育，我们一直用封口机做小袋子，一两毫升抗体可以充分孵育很大的一块膜，孵完还可以回收抗体。

3. 加样时多加两孔阳性样品，转膜后剪成小条，做单一抗，但二抗的对照，可以排除一些背景产生的原因。

作者: 68943512yao 时间: 2013-8-3 16:10

呵呵，希望大家响应啊，毕竟不是每个实验室都很富有的，希望集思广益，不断改进WB，最后整理出dxy特有的WB省钱省时超值protocol~~~

还有预染marker问题：
预染marker一般都很贵，尤其是伯乐等公司的，所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释，如：建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane，这样做一次预实验，一般是稀释一倍还可以用的。

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Marker我个人认为Fermentas的pageruler性价比还是不错的，而且还是双色预染，我一般用2ul，转膜后效果和我刚刚上面的那个图差不多。1ul转膜后效果不是太好。

作者: tianmei001 时间: 2013-8-3 16:11

我们一抗二抗稀释都是用10cm*7-8cm大的小塑料盒，一抗一直在里面放这就行，用完就放4度，最少都能用两次，国外的还可以用3、4次。用奶粉溶于TBST稀释抗体的，不过最近听说用鱼皮稀释的抗体能用4-5年呢，请问那位有用过的吗，介绍以下，谢谢
还有卖抗体的时候多跟他们要赠品，说不定还能赠个小包装的，或二抗什么的呢，能要多少算多少

作者: 68943512yao 时间: 2013-8-3 16:12

楼上说的SDS析出问题我没发现，我就是这样配的，也是4度存放的
还有配好的胶过夜肯定不好，水分蒸发了胶干了跑当然不好，我说的是分离胶配好加水封存凝固后可以放4度
另

我再补充点;j蛋白变性的时候可以使用PCR仪，设一个98度的PROTOCAL，这样煮沸的时候存在的爆管以及进水的问题都解决了，很佩服这个主意，因为那2个问题我都遇见过，很郁闷的。。

作者: zwsyrt 时间: 2013-8-3 16:12

个人认为一抗还是不回收的好，我们实验室一直是用封口机将EP手套按膜的大小做成小袋子，只用1、2ml就足够了。每次santa的抗体1：1000～1：2000，也不算浪费。

作者: plaa 时间: 2013-8-3 16:12

做了好多的WB，说一下自己的体会，和大家交流：
1.抗体我也认为没有必要回收。买一次抗体，对整个试验来说绝对的绰绰有余，包括中间还可用来做免疫荧光试验；如果回收后效果不好了，那就相当于你浪费了好多的前边的材料，更重要的是，浪费了时间，大家大部分都是上学期间做试验，几年就要毕业，什么最不能浪费？我认为是时间。试验可以再做，但日子确一天一天越来越少，不值。。。
2。每次跑WB，加预染marker，这样剪目的条带可有的放矢，尽量剪小却不会丢掉目的蛋白，这样后边的PVDF膜，转膜时的滤纸，后边孵育的抗体都能相应节约；
3。膜发光后，用stripping buffer洗脱后，加入新的抗体，可反复利用，节约时间和蛋白样本及其PVDF膜等等。

作者: orangecake 时间: 2013-8-3 16:13

非常好的话题，其实前面我也有讨论过这个话题，比如抗体如何回收，或者用较好的发光试剂盒节约抗体等等。今天我来说一个最近才用的方法，感觉挺好的：
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板，其实不贵，但是我建议最好几个实验室一起买，我买的100个/800RMB，直接美国空运过来的（国内代理）。

每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便，可以反复使用。而且对于比较窄的膜，完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错，但是注意最好是买未处理表面的那一种。

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用封口膜自己做相应大小的盒子也不错的。

作者: kuohao17 时间: 2013-8-3 16:13

做了几次western blot，和各位大家比，估计还是新手，说说自己的"节省"
1 节约时间，首次做的时候最好用“最浪费”的条件做，比如一抗二抗的稀释倍数了，试验所使用的耗材和试剂了，只要能做出来，再“浪费”也值得，如果第一次做不出来不经试剂耗材浪费了，时间也浪费了，更重要的是信心受到打击。
2 在试验成功的前提下，考虑试剂耗材的节省，我们孵一抗二抗发光液都是用封口膜自制膜盒，这样很节省抗体且接触良好。在使用PVDF膜时，我一般先用尺子把胶，滤纸的的尺度量好，然后剪膜，很合适且转膜的时候基本不用考虑短路问题很省时间（第一次做转膜花了90MIN）。
3 如果短期（一周）使用，定影液也可以回收的，个人感觉显影液回收效果不好。
4 在同样样品不同目的蛋白时，可以以MARKER为标准，转膜后剪开，分别孵育不同抗体。

作者: 小荷尖尖 时间: 2013-8-3 16:14

刚刚写了好多话，本来想弄张图片上来的，没发现不能超过300kb，结果写的内容全部没有了。只好言简意赅的重新写点了。
简单说来有以下几点：
1：所有的液体都可以配成10*的贮存液，这样比较方便，也减小误差
2：runningbuffer 外槽中的液体是可以重复利用的，至少五次
3：跑胶完毕，先裁胶，在转膜，因为PVDF膜很贵，这样比较划算
4：一抗可以用5ml的EP管回收，以便重复利用
5：发光液的使用，先把目的条带裁下来，然后将发光液200UI直接打到PVDF膜上，然后压片，曝光。因为发光液也很贵。
其实这里面最贵的也就是一抗，二抗，PVDF膜，发光液，这几个环节做好了，就可以花最少的钱，做最好的WB了。

作者: hold住 时间: 2013-8-3 16:15

说说我的体会:
1 湿转的转膜液可以重复用几次,用后放在四度.如果恒压转发现电流比上次小,可以在里面补充甲醇(挥发过多)
2 转膜用的滤纸可以重复用
3 marker可以用2-3ul，完全够用
4 跑完胶。根据预染marker就能估计目的条带的位置，所以可以剪下合适大小的膜。
5 封闭液我们买脱脂奶粉，用PBS配，效果还可以
6 不要吝啬的是洗脱液，每次洗脱多放一些，洗涤时间每次也不少于5分钟，保持背景干净；
7 杂交时，用压膜机做杂交的口袋，杂交液基本都是2-5毫升就够了，按照1：500稀释，抗体也不过用两三微升，如果不是抗体不够用救急，一般不回收重复用。

作者: toy 时间: 2013-8-3 16:16

前面几位站友提的建议十分中肯，受益匪浅！
我再补充一点：在进行PBST洗非特异性条带的时候大家用什么样的盒子？我用的是包96孔板的塑料盒，这样既环保又省液体。
以前用过150mm培养皿，但是觉得没有该塑料盒方便。
再附上一张96孔板的塑料盒：

图片附件: 64034336.snap.jpg (2013-8-3 16:16, 68.95 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17446

作者: DNA 时间: 2013-8-3 16:17

也说下我们做wb的经验
1 提蛋白还是买成品的裂解液，国产的就行，1ml也就1块左右，效果一般好过自己配的
2 各种液体配置成高浓度的储备液，4度储存，前一天配好胶，4度过夜，第二天跑，加预染marker。电泳内液换新的，外液回收（一周），转膜液提前配置（消泡沫），不回收。
3 切胶转膜的时候依据marker条带，都用尺子量一下，NC膜还比较省
4转完立春红染一下，不过染不出来也不一定没有。立春红可以配成10*放起来，室温就行。1*工作液也可以反复用
5封闭用的奶粉可以用试剂公司的那种，比超市买来可以喝的那种好些，浓度也不用太大，5%就成
6孵育抗体的时候用过手套、自封袋来裁成和膜大小相称的小袋，也用过封口膜反贴，没回收过抗体。感觉要是说省还是反贴，不过要是一次做很多个样，然后膜比较长，冰箱里面不平可能效果就会比较差，一般就是有几个泳道的出不来，不过预试还比较省，条件摸差不多了再封袋子
7定影显影都买的是特便宜的照相馆用的那种，1L七八块，配好了都放在棕色瓶里，临用前倒出来，用完回收，定影用的久些，显影差不多也可以用三四周

作者: applebook=213 时间: 2013-8-3 16:17

楼主的话题很好，但结合我的经历，省钱还要考虑试验结果。我来谈谈我的western blotting省钱而又保质的经验：

1、一抗反复回收利用，至少2周。抗体的费用应该来说是WB中耗费最大的，我们日常试验中通过使用专用的抗体稀释液（内含防腐剂和蛋白稳定剂），同时每次牛奶封闭后用PBS充分浸洗后放入一抗液体中，否则会因为牛奶变质而使一抗提前失效。

2、二抗亦可反复利用。建议用PBS稀释，不用牛奶稀释，因为牛奶容易变质而影响抗体的特性。

3、PVDF膜的反复利用做同一样品中的多种抗体。我们课题组最多做过6种抗体（用同一张膜），效果很好的。两次之间需要用抗体去除液（如碧云天）孵育，抗体去除液也可反复多次使用。

4、发光剂的巧用。每次根据mark的位置，估计到目的蛋白的可能位置范围，直接对着目标位置涂发光剂，十分省试剂，尤其对大膜。进口的发光剂10ml包装的1000元左右，太贵了。

以上观点，仅供参考。若经费充足的话，建议还是保证质量的前提下，再考虑如何节约试剂，尤其是珍贵的样品。

作者: 阿敏 时间: 2013-8-3 16:20

问一下，你的那个盒子是什么盒子，买的哪里的？可否告知。我觉得我们实验室用的盒子太大，每次用起来太烦！

作者: utt0989 时间: 2013-8-3 16:20

说下我们实验室的两大妙方呵呵
1 用胶片子制作抗体盒子，有时候显影没成功的胶片或者曝光的废弃胶片都可以用来做这种胶片盒子。根据膜的大小来做，几个角用胶水粘下，方便又好用，关键是省抗体，每次只要2ml左右的一抗
2 分子量相近的可以重复显影，一个蛋白显影结束后，我们将膜用1%0，就是千分之一的NAOH，每次5min×3次，再用TBST洗5min×3次，然后将膜放另一个一抗过夜，效果很好，我们也不买stripping buffer。这种方法我们一直在沿用，效果不错。

作者: toy 时间: 2013-8-3 16:20

进行SDS-PAGE电泳时，我用的是伯乐MP3系统，内槽电泳缓冲液一定要超过最低的挡板，外槽的电泳缓冲液是槽子的一半就可以了，这样可以节省电泳缓冲液，前提是内槽的电泳缓冲液不外漏。

作者: youyou99 时间: 2013-8-3 16:21

WB可以先配好4*的母液，用时直接加AP和TEMED还有DDW就可以，这样一次同时加6到8块板子都没问题，另外二抗是可以回收利用一到两次的。
至于膜的重复利用，个人经验不支持，那个洗膜液太酸，对条带还是有影响的

作者: tie8 时间: 2013-8-3 16:21

支持一下楼主和楼主们的好建议，收获不少，我也补充几点好了

1、一抗二抗都可以回收的，抗体价格不菲，如果每次先用现配也代价太高，当然看各个实验室的条件，回收后如果一直用住，则4度保存1-2周，如果暂时不用可-20度保存，以作抗体不足时的备用。
2、有机会就可同时做几个蛋白，分子量相近的，可以同时跑胶，小分子量的蛋白注意把握时间，不要跑过头，内参不必加二抗，不同蛋白如果二抗应用的是相同的那就方便了
3、转膜的PVDF膜建议充分利用，特别是蛋白条带少的时候，能为实验室节约一点是一点啊，切膜的时候注意边角料的再利用
4、一张膜做蛋白和内参一起，条带相近时可以试着平切膜，聪明的话两端各放一个Marker可以校正水平程度，如果胶跑得不平整不推荐使用。
5，显影液可以倒在玻璃板上，依照膜的大小抽吸配比，第一次显影若是曝光过于不理想，可以将膜重新洗过再利用来显影，大多有效，Strip以后的膜显影已经打折，所以争取把握住第一次刚跑出来的才好！

作者: tie8 时间: 2013-8-3 16:22

再后续补充一点，牛奶配的若干抗体中，为了防止长菌变质，可以加入少量叠氮钠，还是蛮有用的！

作者: windy+++ 时间: 2013-8-3 16:23

相比较而言，我们实验室的条件可能要好一些。我们用的是LI-COR's Odyssey Infrared Imaging System 。我们实验室的记录是一条膜连续显色4次，外加最后一次常规显影，共检测了5种蛋白，是一位资深的师姐做的，抗体全部是回收使用的。这种方法适合检测那些分子量相近的蛋白，图片的质量很好。

作者: flower-201 时间: 2013-8-3 16:23

我也谈谈自己的经验吧：
1 转膜缓冲液可以仿佛用三次
2 用marker，省事省抗体省时间，fermantas的sm18810很准确，我用内参试过许多次，确实指示明确。
3 block的奶粉，一抗，二抗都可以回收使用，最好回收后-20度保存，我的一抗一般可以反复用10次，-20保存半年后还是可以很好地杂出来条带。
4 不推荐使用国产抗体，风险太高，其实我们要的是结果，试剂再便宜，如果不出结果，那就会变成代价最高的试剂。尤其是wb，步骤多，那一步出了问题，都会功亏一篑，每一步的试剂都很昂贵，关键是浪费时间，损折信心。
5 我曾经打算买nunc的四孔板，但我们这里没有代理，最后我想出来了新办法，就是自己买博世的锯条锯细胞培养瓶，75的培养瓶瓶底需要2.5ml杂交缓冲液，用封口膜做盖子，杂交完毕后，直接连瓶底和杂交液-20度冻存。通常我们用的大培养瓶瓶底可以孵育8.3cm长的膜，小培养瓶底可以孵育4-5cm长的膜。
6 我不推荐strip，巯基乙醇的味道令人痛不欲生，而且strip的效果也不好。我推荐用marker指示切割膜，一般分子量相差10kd以上的蛋白都可以用marker切割开的。
7 ECL液体可以很节约地使用，用一个60cm的dish，竖立，把1mlECL液体点在壁上，然后把切割好的膜条在液体里滚一下，就可以完全反应了，这样1mlECL液体可以杂两张8*5的膜。
8 每次显影前务必检查显影液是否氧化变色，我曾经有一次因没有检查已经变质的显影液，导致糟蹋了6m lalpha公司金贵的ECL液体，心疼死我了，那可是好不容易要来的试用装呀！
9 SIGMA.MERCK的试剂确实很好，虽然买的时候觉得贵，但很少出意外，算了算，实际效果要比国产试剂性价比高。
10 小心试剂供应商卖假货，我中过好几次招了，***。
11 目前我用过的最好的抗体还是cst的，尤其他们有一些sample kit，每种抗体40微升，按我的使用方法，足够用了，说的更过分一些，10微升足矣。
12 试剂的购买是省不下来钱的，但我们自己合理巧用，可以把试剂省下来，呵呵，就是不能变现。唯一的好处是心里不会觉得亏欠老板太多。

作者: luoliqiong 时间: 2013-8-3 16:24

抗体的确是WB中最耗钱的，孵育抗体用的容器大小是节省抗体关键的一环。很多实验室是用透明手套的指头当作容器。我的创新是将一次性细胞培养瓶从正中间矢状面纵向切开来，一分为二变成2个槽子。这样的容器每次加含有抗体的脱脂牛奶的容积可以低至2.5ml左右，做5-6条带是没有问题的。这也算俺对所在实验室的一个小小的贡献吧：)

作者: zranqi_1 时间: 2013-8-3 16:27

孵育的时候可以把96孔板的盖子上面铺张保鲜膜，把膜贴在上面，然后把抗体加在上面就ok了。

作者: summerxx 时间: 2013-8-3 16:27

省钱的方法除了如何节约过程中的耗材，试剂之外，注意细节，保证每一步的质量，避免重复操作也算一种节约吧。
譬如随着电泳时间的推移，电泳液温度会升高，令条带变形，严重时不得不重新跑胶。可以预先把缓冲液在冰箱里冷却，这样可以减少因电泳后期温度升高导致条带变形的情况（尤其在环境温度较高时，还可以把电泳槽整体埋入放有冰的大容器里）。有时加一个简单的步骤就可以做出比较漂亮的结果了。

作者: bongte 时间: 2013-8-3 16:28

想起了小新的一句话：什么都没有，还敢开店呀？！

为什么很多人都在想怎么省钱，而不把精力用在提高成功率，多想idea，多出成果上呢？

难道大家有那么多时间用来做这些无聊的事吗？

我的观点，能购买试剂盒的购买试剂盒，能委托公司做的委托公司做。

为什么在国外的实验室做实验的效率非常高呢？

时间就是成果呀！

作者: kuohao17 时间: 2013-8-3 16:28

前面个各位战友说得都很详细了，我只说一下怎么节省显影时候的胶片吧，其实很简单。根据PVDF膜的大小，用剪刀剪取合适大小的胶片进行显影，一般的一张柯达胶片在显影时可以剪成两半，使用两次。剪剩下的胶片在放到胶片盒里，避光保存，一般是不会曝光的。

作者: toy 时间: 2013-8-3 16:29

对于预染marker稀释之后跑胶的效果，能否提供相关实验的结果图具体的看看呢？

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我把fermentas公司的预染marker进行了稀释，然后转膜照相。供参考，不做广告哈~~~
说明：我用伯乐的MP3电泳系统，1mm的厚度，共10个电泳孔道。上样量和上样顺序如图所示。

图片附件: 36365984.jpg (2013-8-3 16:29, 31.19 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=17447

作者: toy 时间: 2013-8-3 16:30

还有抗体的问题。一抗对实验结果相当重要，因此一定要选择质量可靠的一抗，有的时候国产一抗也不错，因此大家在做实验，决定买抗体之前，可以在园子里搜搜关于一抗的评价，有的时候可以买到性价比很高的一抗。
ECL发光液，我一直用进口的，如果哪位站友有用很不错的国产发光液，可以推荐一下。

欢迎大家就这个问题发表自己的看法。

作者: summerxx 时间: 2013-8-3 16:30

感谢你的意见！
请见PM。想听听版主的意见，真的。我认为这位仁兄说的不错，至少对我来说这样，但是不能走极端，我的意思是自己掌握了技术后这样，事实上博导硕导就是这样的，他们想课题，我们去实现或者检验。摒弃了硕士学习技术外，找人做是最好的方法，当然前提是你有比这个更重要的工作。
做了好多WB，想了好多方法，也是为了省钱。
1 孵育一抗最好还是要盖住膜，我自己也用培养瓶做了好多模具，每次4ml。
2，不提倡重复利用二抗
3，在样品上下足功夫，样品不好，一切白搭。
4，自己没底，就不要先想省钱，结果第一
5，显影液放在4°，用时倒入小盆，不用及早收起来，放在外面很容易变质，显影后水洗充分，千万不要和定影液混和了！
6，每次曝光时用一点二抗点NC膜一起曝光，以利于确定失败原因，这个其实是最简单的
7，我做WB很不稳定，同样的条件，有时好有时差，区别是用用过的一抗、电泳液和転膜液。所以重要的实验要用新的，保证结果，重复实验可以尝试旧的。
8，一抗用4%的BSA配加0.1%的NAN3，二抗用牛奶配，不然一抗很难重复用，第二天牛奶会变臭的！
9，有时间一抗孵育过夜
10，显影液定影液很关键，颜色不对就不要用了，定影液一般颜色无色，显影液用了就会黑，变黄了就小心些，我觉得如此。
11，发光液推荐一下普利来的吧，12.5ml 2瓶 100元多点吧，效果可以。

作者: summerxx 时间: 2013-8-3 16:31

又想起两个来，特来补上，以后随有随写吧
1 TBST洗三次，后两次可以不扔，收集起来在下一步洗涤时可以洗头遍
2 block 用5%MILK in TBST，用完留着，配二抗时可以用。如果一抗也用milk，也可以用。
3，孵育一抗孵育盒子盖上保鲜膜，以防蒸发水分。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-8-3 16:31

我们是这样封抗体的：
用封膜机将一次性PE手套根据膜的大小做成小袋，先剪下适合大小的手套薄膜，封好相邻两边，将膜小心放入，封好第三边，留下第四边的小口，将配好的抗体用枪轻轻打进去，将气泡挤出，再封成密闭小袋，放摇床上就行了。到时候了取出膜来再回收抗体。这样做很能节省抗体，而且效果很好，是我们实验室的传统做法。
另外，由于每做一次就损耗一点，连续做几次后量少了自然需要配新的抗体加上，就不用担心时间长了抗体失效了。当然抗体品牌的选择很重要，也有订的抗体不好怎么做结果都不好的。

作者: IAM007 时间: 2013-8-3 16:32

哎，整天做实验，也没有考虑过省钱的方法。还是考虑多的好一点，这样对实验了解的会更清楚。像上面所说的，外国确实都是买的，因为他们给学生发的钱很多，是不可能让学生来做这些东西的，他们有更重要的事情要做。说实话，国内能做得起的实验室估计也不是很多。关键还是资金问题，有好的idea，没有资金，是不行的。

作者: abc816 时间: 2013-8-3 16:33

哎，整天做实验，也没有考虑过省钱的方法。还是考虑多的好一点，这样对实验了解的会更清楚。像上面所说的，外国确实都是买的，因为他们给学生发的钱很多，是不可能让学生来做这些东西的，他们有更重要的事情要做。说实话，国内能做得起的实验室估计也不是很多。关键还是资金问题，有好的idea，没有资金，是不行的。

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多、快、好、省，是最重要地。有了好的idea再加上节省就更好了。

作者: babybabe 时间: 2013-8-3 16:33

这个主题开的好，一下学到很多，补充点我们的做法：
试剂准备：我们把APS每0.1g分装在干净的EP管里，临用的时候加1ml水轻轻混匀就可以用了，非常方便，连续使用就放在4°，暂时不做这液体可以冻在-20°，一个月之内问题不大。电泳缓冲液我们也是10X的，转膜缓冲液是2X的，效果很好，一两个月之类都不用调整pH值。WB一抗很重要，我们使用过的santa、abcam、CST、millipore的效价都比较高，用起来反而节约并且放心，其中磷酸化抗体CST的最全，可惜每支抗体量有点少。
做胶：上胶条的时候一定要用梳子将两个底脚刮好，底边不够直问题不大。灌胶有一点点气泡直接用针头挑破就可以了。天冷的是后把胶放在37°温箱，可以节省不少时间。
其它：胶片的确是事先裁好比较好，我们的经验是用干净的裁刀，就是那种杂志什么修边用的一个板子侧面有铡刀。一次可以裁好N张胶片，省时。装在套elisa板子的那种袋子里，外面在罩上密封的文件袋，很安全。暗室里一摸出来就能夹在夹子里曝光。

作者: TAT 时间: 2013-8-3 16:34

我每次孵育一抗二抗，都需要5ml左右的体积才能覆盖住膜。我用的是小培养皿。看到前面有位附图的那个小格子，不过800RMB买100个，我们实验室根本就不做细胞，也买不到1个。。。看到很多人说用封膜机，想知道在哪有卖的，超市有么。。

作者: am10 时间: 2013-8-3 16:35

以前实验室显影时没有红灯，完全凭感觉和经验来压片。这样不好掌握压片的时间和浪费胶片。后来，我将红纸包在一个普通的白炽灯的灯罩上，做成暗房的红灯，将其挂在离放压片盒40公分左右的高处。好处是明显的，归结起来，一是可以肉眼看见压片的全过程，掌握压片时间。二是可以将胶片剪成和NC膜比例合适的大小，不担心胶片太小，也节约胶片。三是利于示教。

作者: bs4665 时间: 2013-8-3 16:35

非常好的话题，其实前面我也有讨论过这个话题，比如抗体如何回收，或者用较好的发光试剂盒节约抗体等等。今天我来说一个最近才用的方法，感觉挺好的：
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板，其实不贵，但是我建议最好几个实验室一起买，我买的100个/800RMB，直接美国空运过来的（国内代理）。
每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便，可以反复使用。而且对于比较窄的膜，完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错，但是注意最好是买未处理表面的那一种。

这个细胞培养板在抗体孵育的时候不要在摇床上摇吗？摇的话这么一点抗体稀释液不会摇不充分吗？还有，多条条带一起的话不会相互间产生摩擦而损失蛋白吗？

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