4、荧光定量PCR的方法
接下来我们就来了解一下荧光定量的主要方法,我们如何选择合适的方法?
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。而荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类,特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物;而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法,在这里主要介绍这2种方法,其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。
4.1非特异性SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料(结合示意图),在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强(作用机理图)。因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
SYBR Green I与DNA双螺旋小沟区域结合示意图
SYBR Green I的优点: 实验设计简单,仅需要设计上下游一对引物,不需要设计探针,无需设计多个探针即可快速检验多个基因,通用性好;成本低;能够通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。因而在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。
SYBR Green I的缺点:由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性,SYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高。实验过程中通过溶解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。另外,因为SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反应。
下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的:
首先,分别求出6个重复样品X基因和GAPDH基因平均Ct值后,应用参照基因GAPDH对未处理样品和药物处理样品进行校正:
△Ct(未处理样品)=X基因 Mean Ct值-GAPDH基因 Mean Ct值=26.52-20.34=6.18
△Ct(药物处理样品)=X基因 Mean Ct值-GAPDH基因 Mean Ct值=24.18-20.12=4.06
然后,对未处理样品和药物处理样品的△Ct进行归一化:
△△Ct=△Ct(药物处理样品)-△Ct(未处理样品)=4.06-6.18=-2.12
最后,我们就可以根据△△Ct算出药物处理样品与未处理样品间X基因的表达差异:
2-△△Ct=2-(-2.12)=4.35
因此药物处理样本的X基因的表达水平是未处理样品的4.35倍。
上述结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基因相对于校准样本,用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。
为了更直观的表示样品间的表达差异,最后我们可以将计算得到的相对量用图表来表示,如下图: