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标题: 【求助】提蛋白时细胞很粘稠怎么办？ [打印本页]

作者: koook5695 时间: 2013-8-9 09:59 标题: 【求助】提蛋白时细胞很粘稠怎么办？

J774细胞，消化下来后在裂解液里面也会粘在一起成“鼻涕”状，用枪也吹不散，会影响提取蛋白的效果吗？需要先煮沸吗？

作者: qhyu 时间: 2013-8-9 10:07

蛋白浓度太高了，热变性以后可能变成“鸡蛋羹”一样的凝胶状态。
1，000，000细胞一般至少用裂解液100微升，酌情增加。

作者: xingyi08 时间: 2013-8-9 10:07

超声以剪切基因组，就不发粘了，提取跨膜蛋白（能尽量保留生物活性的）可以用以下试剂盒

作者: lixi559 时间: 2013-8-9 10:08

蛋白浓度太高了，增加裂解液的量，同时可以用超声碎裂器碎裂，如果没有这个可以把加裂解液的细胞悬液放在六孔板里，用tip倒过来反复的磨

作者: 8s5g 时间: 2013-8-9 10:11

我又一次裂解液加少了，煮过之后就是胶状了哦。

还是要注意细胞的数量的

作者: koook5695 时间: 2013-8-9 10:12

蛋白浓度太高了，增加裂解液的量，同时可以用超声碎裂器碎裂，如果没有这个可以把加裂解液的细胞悬液放在六孔板里，用tip倒过来反复的磨

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但是同样的裂解液裂解等量不同种类的细胞为什么差别那么大呢？HELA细胞好好地，J774就粘稠的不行

作者: caihong 时间: 2013-8-9 10:14

超声，DNase，homognizer，断裂DNA的都应该能减少黏稠度。

作者: 966735obeng 时间: 2013-8-9 10:14

4°离心135000转10分钟可以吗？然后用10ul枪头挑去粘稠物。

作者: lxh031 时间: 2013-8-9 10:15

有没有哪位高人知道提取跨膜蛋白（能尽量保留生物活性的）用什么裂解液比较好？感谢！感谢！

作者: Ao7 时间: 2013-8-9 10:15

微量恒温器70度加热半小时慢慢融

作者: mamamiya 时间: 2013-8-9 10:15

貌似没有合适的解决方法啊？

作者: mamamiya 时间: 2013-8-9 10:16

超声以剪切基因组，就不发粘了，提取跨膜蛋白（能尽量保留生物活性的）可以用以下试剂盒

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同意，建议超声，以打碎基因组；或者使用不含SDS的裂解液

作者: ukonptp 时间: 2013-8-9 10:20

我们实验室从美国回来的教授改进了实验方法，提蛋白时很好用。

以六孔板为例，一般从培养箱取出后弃去培养基，用预冷的PBS洗或不洗，之后整个过程均在冰上进行。

取150ul/孔裂解液（RIPA:PMSF=100:1）,一般在冰上震荡5分钟左右后就可离心12000g,20-30分钟后取上清，细胞碎片和核酸等即可浓缩沉淀在管底，一般是很少有胶状物质的的，LZ可以试试

作者: DDD 时间: 2013-8-9 10:34

SP!

&, 如果不需要核内蛋白，裂解时间短一些，比如5min, gDNA就很少。

作者: kuohao17 时间: 2013-8-9 11:04

我们实验室从美国回来的教授改进了实验方法，提蛋白时很好用。

以六孔板为例，一般从培养箱取出后弃去培养基，用预冷的PBS洗或不洗，之后整个过程均在冰上进行。

取150ul/孔裂解液（RIPA:PMSF=100:1）,一般在冰上震荡5分钟左右后就可离心12000g,20-30分钟后取上清，细胞碎片和核酸等即可浓缩沉淀在管底，一般是很少有胶状物质的的，LZ可以试试

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一般在冰上震荡 5 分钟左右后就可离心 12000 g ,20-30 分钟后取上清？
不好意思，因为明天第一次提取蛋白，所以不太明白，看到很多资料都是说冰上裂解 30min，然后再 12000 rpm，离心 5min。
所以想问下，我要提取的是人贴壁肿瘤细胞株的全蛋白，应该是选择前者还是后者呢？

作者: woshiduiyan 时间: 2013-8-9 11:07

粘稠物就是DNA啊，你可以最高速离心半小时到一小时，取上清。也可以加适量DNase，超声等办法。如果你做免疫共沉淀，并且蛋白相互作用可能RNA依赖，就不要用超声了，免得破坏RNA造成假阴性。

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