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标题: 蛋白沉淀的一个小问题~用于液质~ [打印本页]

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 14:51 标题: 蛋白沉淀的一个小问题~用于液质~

大家好，我做一个血浆的样品分析方法学，
sci文献报道的有不少用蛋白质沉淀的方法，沉淀剂用的甲醇，
我在重复的时候发现，当挥干之后，100ul流动相复溶，再离心的时候，除了底部的少许沉淀，100ul的溶液中还漂浮有肉眼可见的细小沉淀，这样子肯定是不能直接进液质了，请问这种情况是为什么呢？
我沉淀蛋白用的6倍量的乙腈（甲醇也试过了），离心转速13000rpm，10min。。。

请问大家有什么好的解决办法么？我在液相上试了一下，发现回收率还不错，这是这种小沉淀是怎么来的呢？肯定进液质会堵柱子啊。。。

作者: ngoir 时间: 2010-3-3 15:36

不是很清楚，不过我你可以把离心完的上层清夜再过一下滤膜
或者加个预柱啊

作者: q_r_epcnge 时间: 2010-3-3 15:47

楼上说的对.你把上清液用针筒式过滤器过滤下.进样看看.可以先在液相上做个对比,看下过滤前后,对所测成分有没有影响

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 15:58

额，我觉得用针筒过滤好麻烦啊，1000多个样品，汗。。。。
预柱是肯定要用的。。但是那样也可能堵啊。。

还有好的建议没？

作者: Roger01ws 时间: 2010-3-3 16:00

上清液过滤器过滤再进液相看看

作者: 茉莉花茶 时间: 2010-3-3 17:08

1.离心取上清
2.用有机相滤膜过滤（膜孔径0.2um，这是最稳妥也是最简便的方法，如果这你都嫌麻烦就别做样品处理了……我们的样品处理方法比这个复杂n倍！）
3. 色谱柱前面一定要加预柱

作者: amelican_beauty 时间: 2010-3-3 17:11

QUOTE:

原帖由 kidpk 于 2010-3-3 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大家好，我做一个血浆的样品分析方法学，
sci文献报道的有不少用蛋白质沉淀的方法，沉淀剂用的甲醇，
我在重复的时候发现，当挥干之后，100ul流动相复溶，再离心的时候，除了底部的少许沉淀，100ul的溶液中还漂浮有肉眼可见的细小沉淀， ...

一、这个正常，复溶后再离心取上清就行

二、别完全挥干（挥至尽干），加流动相定容看看会不会出现悬浮物。

三、液相能看得到，含量还可以，加大复溶体积，用微型过滤器过器（有一种专门过小量样品的过滤器，液体损失很少），前提是对目标物无吸附

作者: amelican_beauty 时间: 2010-3-3 17:12

QUOTE:

原帖由 kidpk 于 2010-3-3 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
额，我觉得用针筒过滤好麻烦啊，1000多个样品，汗。。。。
预柱是肯定要用的。。但是那样也可能堵啊。。

还有好的建议没？

补充：最简单、省钱就离心取上清

作者: aasle 时间: 2010-3-3 17:15 标题: 回复 #1 kidpk 的帖子

这是由于甲醇、乙腈等有机溶剂在将你的药物萃取出来的同时，也会将血浆中的某些蛋白质、磷脂、脂肪等一同萃取。你说的“小沉淀”，本人认为是蛋白。这种情况，我们一般将样品过一次性、针筒式滤膜。

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 18:31

QUOTE:

原帖由 amelican_beauty 于 2010-3-3 17:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一、这个正常，复溶后再离心取上清就行

二、别完全挥干（挥至尽干），加流动相定容看看会不会出现悬浮物。

三、液相能看得到，含量还可以，加大复溶体积，用微型过滤器过器（有一种专门过小量样品的过滤器，液体损失很少），前提是对目 ...

请问你可以说说这种微型过滤器具体的品牌么？没有用过。。。
再则就是，用普通的那种小注射器前面加个滤膜的好使么？我感觉复溶体积太小，过滤。。。。。。加大复溶体积又会影响检测限

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 18:33

QUOTE:

原帖由 茉莉花茶 于 2010-3-3 17:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.离心取上清
2.用有机相滤膜过滤（膜孔径0.2um，这是最稳妥也是最简便的方法，如果这你都嫌麻烦就别做样品处理了……我们的样品处理方法比这个复杂n倍！）
3. 色谱柱前面一定要加预柱 ...

你说的这个过滤就是说的用注射器前面加个滤膜过滤的那种？

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 18:36

QUOTE:

原帖由 amelican_beauty 于 2010-3-3 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

补充：最简单、省钱就离心取上清

我是离心取的上清，
我的办法是，蛋白沉淀之后，离心取上清，然后尝试过两种取的办法，一个是将上清倒出来。。。另外一个是将上清用一次性枪头吸出来。。。感觉结果都差不多。。。。因为为了提高回收率，还是尽量要把上清液都转移过来吧。。。

另外我觉得不是药物的问题，我单独操作血浆，不加药，也有类似的情况，这个中间是不是有什么诀窍？关于蛋白沉淀的。。。

作者: 小蹄子 时间: 2010-3-3 18:49 标题: 回复 #1 kidpk 的帖子

很简单的事情，取1——2mL够进样的加个滤膜过滤一下就行了。

作者: kidpk 时间: 2010-3-3 19:35 标题: 回复 #13 小蹄子的帖子

什么样的滤膜？是插在注射器前面的那种？

作者: amelican_beauty 时间: 2010-3-4 08:47

QUOTE:

原帖由 kidpk 于 2010-3-3 18:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问你可以说说这种微型过滤器具体的品牌么？没有用过。。。
再则就是，用普通的那种小注射器前面加个滤膜的好使么？我感觉复溶体积太小，过滤。。。。。。加大复溶体积又会影响检测限 ...

以前用过，进口的，没注意是什么牌子！作用同普通的过滤器一样，只是横切面小，液体损失少，接普通的注射器。能离心就离心吧，过滤的成本比较高，以前我们是用于量少，且需要无菌的药理方面。

作者: kcuw589 时间: 2010-3-4 08:48

朋友，这么多样品一个人做吗？有时候不辛苦是不行的。

作者: kidpk 时间: 2010-3-4 11:35 标题: 回复 #15 amelican_beauty 的帖子

可是离心之后还是有漂浮的。。汗。。。13000rpm啊。。。
另外就是，一般离心取上清液怎么取呢？用枪头感觉不能保证回收率啊，但是倒出来的话又会有少许沉淀倒出来。。。

作者: zxlyid 时间: 2010-3-4 21:53

建议这种情况用液液萃取试试，相对来说要比直接沉淀蛋白要干净的多，而且也没固相萃取那么麻烦

作者: 出国吧 时间: 2010-3-6 20:29

1，要用初始流动相，不要用纯有机相。复溶时可以超声试试。

2，离心不能解决就要用过滤头

Waters Syringe Filters， P/N WAT200508, 4mm PTFE 0.45um (好用，溶液残留非常少，低于10uL）

Phenomenex regenerated cellulose membrane 0.45um, 4mm syringe filters, P/N AF0-3103-52.

国产的也有，但是牌子忘了，上海的试剂公司就有。

作者: luxuanbu 时间: 2010-3-6 20:32

楼主还要过膜呀过完膜应该就没那么多了

作者: iTIANMING 时间: 2010-3-6 20:34

建议：1.过0.45或0.22um滤膜；
2.效果不好的话，样品预处理采用液液萃取或固相萃取试试

作者: 考研吧 时间: 2010-3-6 20:38

你可以根据药物性质选择碱化或者酸化我也是做的血浆处理，我用的是Na2Co3碱化的。

作者: michael_b_rex 时间: 2010-3-6 20:42

没做过

你的流动相是什么？可能是乙腈沉淀的不够完全

能不能过滤后再进样？

作者: gongww 时间: 2010-7-9 15:50

在血浆样品处理过程中，沉淀蛋白得到的样品最脏，建议加入流动相复溶后，再次离心，色谱柱前加预柱，这样最好。

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