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标题: 【求助】酵母双杂交实验流程问题请多指教！ [打印本页]

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:08 标题: 【求助】酵母双杂交实验流程问题请多指教！

我上个月做了 mating （酵母双杂交的一种办法）。
现在已经做到了，X-gal assay。
从230多个克隆里第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。

What can I do for it NEXT~

我的具体步骤是。

一：文库建立

1. mammalian cell total RNA --> Poly A RNA --> dsRNA --> 提纯 dsRNA。
2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现并长势饱满.
3. 每个150ㅠ，放入5ml freezing media ，将细胞收集在一起，均匀混合，1ml 分装， -70度保存。

二：酵母双杂交

1 . mating , mating product 分别涂在 40个 TDO（SD/-H -L -T）， 10个 QDO( SD/-A-H-L-T) 。
2 . mating efficiency 3% 大于下限值2%。
3 . 实验步骤说明上，说3-8天克隆会出现。可是我的大概 12天才长了出来（TDO）。
小心的将 TDO上长出来的 280个克隆，转移到TDO。
　再次培养了４天左右　发现　21个在转移后没有继续长，所以淘汰掉。
４．将TDO上的克隆，转移到　QDO　（for strong interaction assay ）／　牙签上　剩下的一点点细胞　划在了100ㅠ的TDO(for colony X-a-gal filter assay) 。　双重选择，在QDO上生长，并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
5. 以上方法，选出223个在　QDO　上生长的克隆。
6. X-a-gal filter assay 两次。　

到这里　问题出来了　从230多个克隆里第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
而且，书上说　X-a-gal filter assay最多不要超过８小时。
可是我的克隆，基本都是在６－８小时之间　变蓝的。

请大家　一起分析一下，怎么两次　X-a-gal filter assay　变蓝的差距这么大。
难道，都是假阳性？？

我首先将两次实验重合的　11个克隆的　plasmid DNA 提了出来，正在测序。

剩下的怎么办？　11个也太少了，之后的实验，怎么办？　有必要　再作一次　X-a-gal filter assay么？？　要是，又发生么变化，怎么办？？

拜托各位！！　！

作者: 49888 时间: 2013-8-16 15:09

我用的试剂盒与你的一样。不过X-a-gal filter assay 我没做过，而是把在QDO上生长的菌落，挑到QDO＋X-a-gal 的平板上。一块9cm的平板等分成8份扇型区域，可以划线8个菌落。然后挑蓝色的“单菌落”抽提酵母质粒进行分析。

还有，据我发现，这个试剂盒推荐的阴性对照在TDO上也能生长，但生长速度会明显比阳性对照慢。

作者: 49888 时间: 2013-8-16 15:09

我见过别人用这个试剂盒做出过假阴性的情况，这是我后来验证的时候发现的。我建议还是把经过X-a-gal filter assay 显阳性的菌落都划线到QDO＋X-a-gal 的平板上，看能不能得到蓝色的单菌落。

这里要注意，QDO＋X-a-gal 平板上划线需要一定的技巧，划的菌体不能太多，菌体太多得不到单菌落得。记住，最好能得到蓝色的单菌落。

作者: mamamiya 时间: 2013-8-16 15:18

有11个克隆足够了，只要真能筛到别人没筛到的。你不是做组学的。而且酵母用来做组学，有点不使用，后续的pulldown,co-ip会做死去。

验证的话，要再次共转化质粒入AH109，不能用以前的已经转化的。即便是阳性对照，pgadt7-t + p53,你把放置一个月的板子拿出来做显色，一样不显。酵母显色，生理活性的检测，必须make fresh.

你是做酵母融合？mate
这个我没做过，我只做过一个BD对library的。我记得mate是双库对筛的时候用的。不太推荐划线，因为曾经将阳性对照和阴性对照划同一板子，再滤纸显色，居然阴性也有点蓝，不过淡淡的，可以忽略不计。如果是筛选弱的相互作用，就最好不要。不过谁想要弱的呢，所以划一块板，也问题不大。大家慢慢切磋吧，相互进步

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:19

我也不是特别喜欢　mating 的方法。这是老板再读PhD时，曾经用过的办法。
我们实验室，做的是　RANKL sianal 引导的　Osteoclast 分化实验室。
市场上，目前还没有　针对我们实验室体系的酵母cDNA文库.

实验室，我是第一个做酵母实验的，问都没有地方去问 (郁闷ing) 。
摸爬滚打了５个月，终于从文库做到了　Y2H的尾声。

突然间发现，分析实验结果才是最重要的。

多谢２位的回复。

我会参照的，，，谢谢，再次感谢。

作者: zsxan1990 时间: 2013-8-16 15:20

11个还嫌少啊，关键要看这挑出来的11个单菌落测序后是不是你想要的，只要里面有一两个测序后没发生移框，是重要的基因，那往后就是一片坦途了，呵呵。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:22

不过，就是有点想不通。
为什么，变蓝的细胞，差距这么大。
68个，和 74个。
除了重合的11个外。
难道是，其他的，假阳性的可能性大么？？

酵母的变化为什么这么难琢磨呢，，，似是又非是。。

作者: 3648755 时间: 2013-8-16 15:26

要是11个真正的阳性结果是不少了。我不知道你所说的做两次是步骤是啥。系统说明书应该还要再进行转化验证，就是提取酵母细胞中的猎物质粒然后再进行再转化验证。要是还是阳性说明结果还是比较可靠地。系统的对照也要充分的利用好。因为猎物和诱饵在酵母细胞中有可能会丢失，或者会有多个诱饵和猎物进入同个细胞中。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:27

要是11个真正的阳性结果是不少了。我不知道你所说的做两次是步骤是啥。系统说明书应该还要再进行转化验证，就是提取酵母细胞中的猎物质粒然后再进行再转化验证。要是还是阳性说明结果还是比较可靠地。系统的对照也要充分的利用好。因为猎物和诱饵在酵母细胞中有可能会丢失，或者会有多个诱饵和猎物进入同个细胞中。

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提取质粒，再转化的方法，是不是就是将我的bait和提取出来的partner --cotransfection 一次？？
或者，我打算做的是 GST pull down。
因为，我们实验室 GST pull down system 比较好。

先选出来的 11个克隆，我做了 colony PCR 发现没有多个猎物。都是一条基因。。

上面，我说的做两次，指的是 X-a-gal filter assay 做了两次。
可是两次，选出的变蓝克隆，都不一样。。
酵母的可变性，假阳性的变化，难道这么大么？
还是第一次经历全过程，下不了肯定的结论，比较着急~~~

唉！！

作者: guagua 时间: 2013-8-16 15:27

提取质粒，再转化的方法，是不是就是将我的bait和提取出来的partner --cotransfection 一次？？
或者，我打算做的是 GST pull down。
因为，我们实验室 GST pull down system 比较好。

先选出来的 11个克隆，我做了 colony PCR 发现没有多个猎物。都是一条基因。。

上面，我说的做两次，指的是 X-a-gal filter assay 做了两次。
可是两次，选出的变蓝克隆，都不一样。。
酵母的可变性，假阳性的变化，难道这么大么？
还是第一次经历全过程，下不了肯定的结论，比较着急~~~

唉！！

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个人对酵母双杂交一点点肤浅的认识，仅提供给你参考。

1. 提取质粒，再转化，可以采用你说的共转，也可以交换宿主菌，再做一次mating，应该说mating比共转还是好作一些，而且更有优势；

2. GST pull down 那是需要你的诱饵蛋白和靶蛋白都能很好的表达与纯化，仅有该实验可能还是不够，因为这个是体外实验，还需要CO-IP或者FRET来进行验证，共定位只能间接说明两蛋白之间的相互作用。Humana Press有一本书叫做Protein-protein interaction，你可以仔细地选择部分章节进行参考；

3. 至于两次都不一样的情况，既然都是单基因的话，可以优先考虑共同的部分，即变蓝呈交集的部分，测序后仔细分析。

酵母双杂交从建库到筛选是件很累人的事情，这么快就能做这么好，值得鼓励，而且做的是osteoblast，那么下一步可以考虑在MSC诱导成骨过程中这些基因或蛋白的关键作用了。

个人意见，仅供参考。不足之处，请批评指正。

作者: langlang 时间: 2013-8-16 15:30

我也正在做Mating，同路人，给你一些建议：

1. 个人认为在做酵母双杂交时，目标要明确，紧盯最后的测序结果，这是你的最终目的。所以实验在做熟后，不要在某一步停留耽误时间，双杂只是整体实验方案中的第一步，找到兴趣基因后，后续的一系列验证实验才是关键。

2. 在你的实验中，先关注那11个克隆。菌落PCR的条带大小相同，不见得就是一个东西；可以把PCR产物进行酶切，看是否酶切后的条带也相同。然后把不同的克隆拿去测序看看（其实都拿去测序也不是不可，就看实验室能否承受了，毕竟测序的钱在整个实验中的比例不算大），看测出的序列是否为基因的编码序列及读码框在AD载体上是否正确（这两点都很重要）。如果有比较好的结果就马上着手进行后面的实验了（pull-down、co-IP等）。

3. 至于其他的候选结果可以慢慢验证。首先你的X-gal assay的结果其实不能说明问题，毕竟是两次非平行操作，有误差是正常的，只是你的误差确实大了点；在我的实验中反倒是通过X-gal能排除的克隆并不多，大概80-90%都变蓝；建议PCR、酶切分组后，选一些先去测序。再次共转化涂QSD平板是对的，同时做单转化AD涂QSD也是需要的（验证AD的自激活，不过基本上AD自激活的情况不多）；找到兴趣候选蛋白后互换载体共转化验证也可以（即AD-bait、BD-prey，共转化涂QSD平板及X-gal assay；当然是在时间允许的情况下可以选择做这步，但要是克隆做的不熟就算了，费时间）。基本上在酵母中的验证实验就这些了，如果有好的结果就先恭喜一下了。

4. 还有几点对于后面实验的小提示。首先筛到得基因很可能不是基因全长，如果序列包含该基因的重要结构域，可先不着急拿到基因全长，继续进行后续实验即可。同一基因在众多候选克隆中出现的次数越多，则可能性越大。找到兴趣蛋白后，体内体外的验证实验（在实验室系统成熟的情况下）应该比较顺利才对，侧面反映二者互作的可能性很大。构建载体时可添加tag，使用标签抗体便于节省时间和经费，得到较好结果后，再扩增基因全长、购买抗体（当然经费允许则另当别论）。

总而言之实验要同时开展，边找边做，找到一两个并能做出结果就相当好了；可能叙述过程中有不妥或错误的地方，还请见谅，祝实验顺利。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:30

感谢各位的经验之谈。。。

感觉，心里有底了。

等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。

PCR产物，直接作的测序。

因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。

结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。

只能等了。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:31

还有，我用其他的一个 Bait 按照上述的方法，

现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....

奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。

在 QDO上竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！

现在，将这 100多个克隆，重新划了一次 QDO 2天就长满了。

X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。

今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。

我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。

我至今，已在 QDO上选出了近 300多个克隆。。

希望各位，，给予点评！！！

谢谢！！

作者: cwcwcww 时间: 2013-8-16 15:34

感谢各位的经验之谈。。。

感觉，心里有底了。

等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。

PCR产物，直接作的测序。

因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。

结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。

只能等了。

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从酵母中提取后，可以转化大肠杆菌，然后再提取，测序。

作者: cwcwcww 时间: 2013-8-16 15:40

还有，我用其他的一个 Bait 按照上述的方法，
现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....

奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。

在 QDO上竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！

现在，将这 100多个克隆，重新划了一次 QDO 2天就长满了。

X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。

今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。

我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。

我至今，已在 QDO上选出了近 300多个克隆。。

希望各位，，给予点评！！！

谢谢！！

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有排除诱饵的自激活么？

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:43

有排除诱饵的自激活么？

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在早先，，做 Bait transformation的时候，曾作过的。

当时，做的是将 GBKT7 - Bait 转入 Y187...

之后在，， SD/-Trp/X-a-Gal..SD/His/-Trp/X-a-Gal... SD/-Ade/-Trp/X-a-Gal...

上都涂抹过，，，当时都没有呈蓝色。

而且，只在 SD/-Trp 生长。。

应该算是没有自激活吧。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:43

从酵母中提取后，可以转化大肠杆菌，然后再提取，测序。

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两手都在准备。。 PCR purification kit 结果看得更快一些。。

这次，为了保险起见，已经做液体培养了，大概明天晚上提取质粒。
在转染 E.coli。

我的 Kit 说明书上说，
要是 Bait 和 library 质粒，各自的 antibiotics marker 不同的话，
就可以直接转入普通的 DH5a E.coli菌系。。
如果相同，就必须转入 KC8 E.coli。

我的 library和 bait 分别为 Kana+, Amp+，，
那是不是就说，我只要在 yeast提取出来质粒，就可以用普通的方法。

input DNA --> ice 5min--> heat shock 42度 90s --> ice 5min --> plating

转入通的 DH5a E.coli菌系，液体培养+ antibiotics
再用一般的质粒提纯kit 提取质粒DNA，测序。对么？？

作者: xyw5 时间: 2013-8-16 15:46

是的，毕竟酵母里面质粒复制不如细菌快啊。

个人建议，仅供参考。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 15:46

不过，现在想想，当初做自激活验证实验的时候，

用的 X-a-gal 是溶解后 6个月左右的时候。活性好像不是特别好。。。

当初，是借别人的用的。

借给我的人，说是他上个月作过 X-gal asssay，显色没什么问题。

我不会那么惨吧~~

自激活，没有变色，是不是跟当初的 X-gal的活性降低，也有关系呢？？？

您一提起自激活，我怎么突然打了冷颤。。

10分钟前，将 bait 划到了新的 X-gal plate上。

作者: ukonptp 时间: 2013-8-16 16:00

QUOTE:

原帖由 =pkchen= 于 2013-8-16 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不过，现在想想，当初做自激活验证实验的时候，

用的 X-a-gal 是溶解后 6个月左右的时候。活性好像不是特别好。。。

当初，是借别人的用的。

借给我的人，说是他上个月作过 X-gal asssay，显色没什么问题。

我不会那么 ...

呵呵，有时候结果太好了，也会下意识的去怀疑，做实验，有时候就是自己折磨自己，然后求得解脱的过程。

作者: INK 时间: 2013-8-16 16:01

将来会怎么样，交给阿拉去。自己做好当下的工作。实验就是充满了可变性。无需担心明天的实验结果，先生活好才最要的。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 16:09

以平常心面对，，尽我所能吧。

可能是因为第一次接触yeast做Y2H， Y2H实验量又是这么的庞大。。

期待的，付出的，比起其他实验多的缘故吧。

心疼~~~

不过，大家这么热心帮忙，给了我很多动力。。

感谢 HaveNoMoney，shashababy，wlei211, havocking，feiflyfei888，各输己键，各位热心的解答！！！！！！

今后，有什么不明白的，不免还会麻烦各位！！！呵呵~~

谢谢！！！

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 16:18

sequencing 结果出来了。。。

我的两个 bait的实验结果

1号 bait---->

共 45个当中，
6个 G protein，
2个 cathepsin D,
5个 GAPDH,
3个 Actin,
1个 cathepsinL

2号 bait --->

45个都是 NM_010240.2 Mus musculus ferritin light chain 1 (Ftl1), mRNA

其他的sequencing 正在进行中
用的是同一个Library...... 怎么回事呢？？

作者: orangecake 时间: 2013-8-16 16:19

看大家讨论甚欢，本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手，十分遗憾还看不懂各位高人的发言，俺在此蒙住头问问各位前辈：请问这个实验怎么入门？可以从哪些方面入手还了解，身边很少人做这个实验的，十分苦恼，无奈老板委以重任，本人终日惶恐，唯恐不能胜任。还请各位指点迷津！十分感谢！

作者: hustwb 时间: 2013-8-16 16:19

sequencing 结果出来了。。。

我的两个 bait的实验结果

1号 bait---->

共 45个当中，
6个 G protein，
2个 cathepsin D,
5个 GAPDH,
3个 Actin,
1个 cathepsinL

2号 bait --->

45个都是 NM_010240.2 Mus musculus ferritin light chain 1 (Ftl1), mRNA

其他的sequencing 正在进行中
用的是同一个Library...... 怎么回事呢？？

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ferritin、MT2A一些专家认为属于假阳性的靶蛋白，具体文献2000年前后有解释。

前面的45个测序结果，可以结合你的诱饵蛋白进行分析，决定是否进行下一步实验。

个人建议，仅供参考。

作者: hustwb 时间: 2013-8-16 16:20

看大家讨论甚欢，本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手，十分遗憾还看不懂各位高人的发言，俺在此蒙住头问问各位前辈：请问这个实验怎么入门？可以从哪些方面入手还了解，身边很少人做这个实验的，十分苦恼，无奈老板委以重任，本人终日惶恐，唯恐不能胜任。还请各位指点迷津！十分感谢！

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如果老板只是感兴趣，不愿意拿出4-6万让你来完成这个实验的话，可以考虑早点换课题。

类似的例子遇到已经很多了，甚至一些朋友连诱饵载体都构建好了，也转化了，但是老板不愿意拿钱买文库或者其他相关的试剂，中断的不少。

仅供参考。

作者: yonger 时间: 2013-8-16 16:20

我这里有个有意思的现象，我有一个基因，只编码36个AA
但是不论连接在AD，还是BD上，都能自激活。
说明有2个可能
1.这个蛋白本身既有ＡＤ又有ＢＤ功能。不过似乎不太可能，现在报道的转录激活因子中，没有小于１００ＡＡ的，这个太猛了。
２.能激活转录复合物的产生。不确定是光谱，还是专一针对ｌａｃ－ｚ这个报告基因。正在补充实验，看看能不能激活酵母双杂交的其他营养缺陷。

欢迎大家的奇思妙想。

作者: yonger 时间: 2013-8-16 16:22

有查了点综述，发现有类小肽，含螺旋-转角-螺旋结构，有一段碱性肽段，可与DNA结合。小肽间可以同源形成2聚体，也可以异源。进而可引发转录产生。估计我这个东西类似。

作者: BOSS2011 时间: 2013-8-16 16:22

看大家讨论甚欢，本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手，十分遗憾还看不懂各位高人的发言，俺在此蒙住头问问各位前辈：请问这个实验怎么入门？可以从哪些方面入手还了解，身边很少人做这个实验的，十分苦恼，无奈老板委以重任，本人终日惶恐，唯恐不能胜任。还请各位指点迷津！十分感谢！

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我觉得入门的最好材料就是试剂盒的操作手册，上面从原理到操作，已经都很详细了。先把原理搞明白，再对照原理图看操作流程图，最后看具体的操作步骤。如果还有时间的话可以再找些综述性的论文看看。

想成为高手的话，就要多看资料，多做了，呵呵。

作者: jkobn 时间: 2013-8-16 16:25

我马上就要做这个实验了，想请教一下各位，做这个实验之前要准备一些什么东西？是不是只要订一个酵母双杂交的试剂盒就可以了？还要不要订别的试剂盒？另，哪种试剂盒好用一些？谢谢！

作者: jkobn 时间: 2013-8-16 16:26

我是新手，在此想请教各位问一个层次比较低的问题：酵母双杂交实验中的诱铒蛋白常是已知的，目标蛋白可能已知也可能未知，那么怎么获得目标蛋白和诱铒蛋白的DNA编码序列？是不是先要做PCR把目标，蛋白和诱铒蛋白的DNA编码序列扩增出来？

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 16:26

我马上就要做这个实验了，想请教一下各位，做这个实验之前要准备一些什么东西？是不是只要订一个酵母双杂交的试剂盒就可以了？还要不要订别的试剂盒？另，哪种试剂盒好用一些？谢谢！

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个人觉得，还是clontech的好。毕竟已经在酵母试验领域，先进了这么多年。我用的是 SMART lll 系。听说已经出来 SMART Gold了。你打听打听各个代理商吧。

作者: =pkchen= 时间: 2013-8-16 16:27

我是新手，在此想请教各位问一个层次比较低的问题：酵母双杂交实验中的诱铒蛋白常是已知的，目标蛋白可能已知也可能未知，那么怎么获得目标蛋白和诱铒蛋白的DNA编码序列？是不是先要做PCR把目标，蛋白和诱铒蛋白的DNA编码序列扩增出来？

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在clontech网址上，可以下载一套适合刚刚接触酵母试验的〈试验说明书〉。

我这次的Y2H试验，基本都是自己摸索，做出来的。
十分理解，刚刚开始时的迷茫/彷徨。

不要灰心，我相信，试验是有灵性的。功到自然成！！呵呵

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