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标题: 【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶 [打印本页]

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:00 标题: 【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶

BL21(DE3）诱导表达后的，超声破碎之后，高速离心分别取上清，以及沉淀重悬液跑SDS-page，结果上清中的蛋白含量很少，但是沉淀中很多。出现这样的情况是不是因为我的菌体很多没有破碎完全，所以沉淀中目的蛋白量比较多，这影响判断包涵体表达吗？是不是在超声之前加点溶菌酶会排除这样的误差干扰？加溶菌酶有没有什么不利的因素？感谢各位指导

作者: youyou99 时间: 2013-8-20 17:01

不需要加溶菌酶，超声完全，以溶液不再象泥沙样浑浊为标准，溶液变澄清，沉淀中较多，说明蛋白以包涵体形势存在。

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:01

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2013-8-20 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不需要加溶菌酶，超声完全，以溶液不再象泥沙样浑浊为标准，溶液变澄清，沉淀中较多，说明蛋白以包涵体形势存在。

首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧，我一般摇1L的菌，大约有6g的湿菌，裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀，然后全部拿去超声，从泥沙样浑浊状态到澄清，没实现过，所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多，超声时间过长，有些蛋白碳化的现象了，所以一般到“某种”状态，我就不超了。

作者: 8princess8 时间: 2013-8-20 17:02

建议分成多管再进行超声破碎，这样的话比较彻底，6g湿菌一起超声的话，时间长，产生的热量也多，蛋白也容易降解，同时超声不彻底，不好判断。

作者: qianqin1977 时间: 2013-8-20 17:03

如果蛋白很珍贵，那就是用商业化的裂解液，譬如默克/NOVAGEN的bugbuster，针对GST等大标签的可溶性融合蛋白很适用；如果蛋白表达量很高很容易得到，那就超声吧，个人感觉超声到菌液透明的程度很难把握（尤其是菌液量比较大的情况下），毕竟超声功率和超声时间很难优化。

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:04

建议分成多管再进行超声破碎，这样的话比较彻底，6g湿菌一起超声的话，时间长，产生的热量也多，蛋白也容易降解，同时超声不彻底，不好判断。

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谢谢，的确是这样的，分管超可以更容易判断，谢谢

作者: www.1 时间: 2013-8-20 17:05

我摇2L的菌液后大概可以收到7g湿菌体，然后不加溶菌酶直接超声15分钟，感觉效果挺好，过程参照分子克隆。如果你的目的蛋白和溶菌酶相差很大，可以加一下比较破碎效果

作者: skytree 时间: 2013-8-20 17:08

首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧，我一般摇1L的菌，大约有6g的湿菌，裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀，然后全部拿去超声，从泥沙样浑浊状态到澄清，没实现过，所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多，超声时间过长，有些蛋白碳化的现象了，所以一般到“某种”状态，我就不超了。

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不要说6g菌，选择好超声探头和超声功率，100g菌体，1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少，破菌液也可预冷。

一般用工作4秒，间隙4秒，超声200次足够了。总时间大约25min。

对破菌来说，没有必要去判定是否完全破碎。因为你要的是重组蛋白，而不是破菌率。即使有部分菌体没有破碎又有何妨呢。

作者: c86v 时间: 2013-8-20 17:09

可以采用先加溶菌酶破壁，然后放在磁力搅拌器上搅拌，大约30min变成粘稠状即可，然后超生，常规功率，超3s，歇3s，就可以离心了，菌体一般摇个200-300ml。

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:10

不要说6g菌，选择好超声探头和超声功率，100g菌体，1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少，破菌液也可预冷。

一般用工作4秒，间隙4秒，超声200次足够了。总时间大约25min。

对破菌来说，没有必要去判定是否完全破碎。因为你要的是重组蛋白，而不是破菌率。即使有部分菌体没有破碎又有何妨呢。

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可否指导下超声探头和功率有什么需要注意到事项吗？谢谢

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:10

我摇2L的菌液后大概可以收到7g湿菌体，然后不加溶菌酶直接超声15分钟，感觉效果挺好，过程参照分子克隆。如果你的目的蛋白和溶菌酶相差很大，可以加一下比较破碎效果

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非常感谢您的分享，至于超声探头的选择和超声功率的选择您有什么建议吗，可否指导下？

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:15

可以采用先加溶菌酶破壁，然后放在磁力搅拌器上搅拌，大约30min变成粘稠状即可，然后超生，常规功率，超3s，歇3s，就可以离心了，菌体一般摇个200-300ml。

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谢谢，你所说的常规功率是多少呢？可否分享

作者: okhaha 时间: 2013-8-20 17:15

我一般100ml菌液，离心后，加裂解缓冲液至10ml左右。超声5s停5s，功率为350瓦。

作者: xue258 时间: 2013-8-20 17:16

我认为：
1、你先去1ml发酵液做小量超声实验，如果，超声液是浑浊的表明是包涵体。
2、如果是透明的建议你改变超声条件，超声条件可试15mm的振幅杆，功率45%，超声4s，间歇6s，超声4min，共超3次试试。
3、一般不需加溶菌酶的。

作者: plaa 时间: 2013-8-20 17:19

我认为：
1、你先去1ml发酵液做小量超声实验，如果，超声液是浑浊的表明是包涵体。
2、如果是透明的建议你改变超声条件，超声条件可试15mm的振幅杆，功率45%，超声4s，间歇6s，超声4min，共超3次试试。
3、一般不需加溶菌酶的。

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谢谢，如果是透明的就不是主要是包涵体了吗？功率45%是什么意思啊

作者: zsxan1990 时间: 2013-8-20 17:20

做SDS-PAGE的目的是验证是验证胞内、胞外还是胞壁表达以及表达量的多少，SDS-PAGE上样量很少的，没必要破碎那么多菌。如果你要提取目的蛋白，就要根据表达的具体位置进行不同方法的操作啦

作者: one 时间: 2013-8-20 17:20

谢谢，如果是透明的就不是主要是包涵体了吗？功率45%是什么意思啊

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菌液变透明的话就指示细菌破裂较彻底，而且重组蛋白为可溶，所以才会透明；如果是包涵体，那么就不能溶于水，所以会混浊了。“功率45%”是很多超声仪设定功率时显示的一种参数，比如我这边超声仪满功率的话是900瓦，那么45%就可以换算成405瓦了。
另外，对比我的经验，蛋白个体差异大，有些蛋白几下就能超声澄清了，而我手上的两个蛋白常常100多秒都达不到澄清。而且同等超声条件和时间，小体系确实比大体系容易破碎澄清，不是视觉误差，我把大体系超声后的菌液换到小管子后对比而得。所以我准备试试上面斑竹的意见，索性一次超声个25min左右试试。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-8-20 17:21

建议用溶菌酶破碎试一下，如果在沉淀中，那么是由于包涵体造成的。

作者: duoduo 时间: 2013-8-20 17:21

非常感谢您的分享，至于超声探头的选择和超声功率的选择您有什么建议吗，可否指导下？

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φ2变幅杆功率用400w，φ6变幅杆功率用600w

作者: am10 时间: 2013-8-20 17:22

对于超声波破碎来说，没必要加溶菌酶，最主要的是改变破碎条件，比如稀释比例，破碎时间等；一定要做好冰浴。6g菌体算很少的了，关键是探头大小要合适，如果选最小的探头那么一次要破碎完可能有点力不从心。

作者: any333 时间: 2013-8-20 17:22

加溶菌酶可以，我就是这样做的。
但要考虑你的蛋白大小，不要和溶菌酶的size相近就行，还有就是溶菌酶不要加的太多。

作者: 2541 时间: 2013-8-20 17:23

在讨论这个问题之前，首先要确定蛋白表达是以包涵体的形式，还是可溶性的。如果是包涵体，细胞破碎后离心收集沉淀。如果是可溶性的，则离心取上清。另外，判断菌体是否完全破碎也没有一个确定的标准；要根据经验自己多摸索。
在超声前不需要加溶菌酶。

作者: gogo 时间: 2013-8-20 17:23

加和不加溶菌酶其实对于菌体破碎没有本质上的区别，个人或实验室操作习惯而已，只是在某种程度上提高蛋白的可溶含量，但这个提高率不是很高，如果目的蛋白是以包涵体形式表达，那加了溶菌酶也不太可能弄到上清。
bugbuster个人觉得没有超声破碎效果好，方便时方便，对于小量表达分析是很不错，但只能作为参考，
破碎条件，这个班里有太多的帖子，个人觉得还是要重质不重量，对于我们发文章做点科研的，一点量就够了，所以质最重要，那就是尽量保证蛋白的不降解，迅速，对后面下游的纯化才有意义。
祝好运！

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