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标题: 【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:25 标题: 【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨

蛋白新纯化思路探讨

思路：得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体，将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，然后再将需要纯化的样品过这个柱子，所有杂蛋白都结合在柱子上，目的蛋白穿透出来。

具体例子：原核表达蛋白纯化
1. 无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清过X柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白1穿透出来，实现纯化。
2. 无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将沉淀拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，复性后过Y柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白2穿透出来，实现纯化。
问题肯定会有很多，我们课题组想尝试这样做一些，请大家给点建议，有哪些需要注意的地方，谢谢。

作者: cwcwcww 时间: 2013-8-30 15:25

你这样的方法可以倒是可以，但是，这样的纯化方法一是周期太长，二是成本太高。我觉得没有办法普及。但是，你的想法确实很有创意。

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:26

QUOTE:

原帖由 cwcwcww 于 2013-8-30 15:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你这样的方法可以倒是可以，但是，这样的纯化方法一是周期太长，二是成本太高。我觉得没有办法普及。但是，你的想法确实很有创意。

哦周期和成本我现在暂时不会考虑谢谢

作者: popo520 时间: 2013-8-30 15:26

个人觉得不是很实际，
1. 抗体的制备，以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫，然后得到针对每一种抗原的抗体混合物？这个基本无法实现的，且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标；
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱，稳定性如何，这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利，该柱子的层析效果也值得商榷，是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了？希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的；
4.表达的结果不同批次间会有差别，成分也会有所不同，总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统，不同环境与条件的表达产物差别很大，使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用（假设其可以用）。

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:27

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原帖由 popo520 于 2013-8-30 15:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
个人觉得不是很实际，
1. 抗体的制备，以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫，然后得到针对每一种抗原的抗体混合物？这个基本无法实现的，且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标；
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合 ...

嗯谢谢你的热心帮助
你的意见很宝贵
很多方面我也有想过
我只是现在想试试看
结果到底会怎么样

作者: yjf1026 时间: 2013-8-30 15:28

个人觉得不是很实际，
1. 抗体的制备，以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫，然后得到针对每一种抗原的抗体混合物？这个基本无法实现的，且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标；
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱，稳定性如何，这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利，该柱子的层析效果也值得商榷，是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了？希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的；
4.表达的结果不同批次间会有差别，成分也会有所不同，总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统，不同环境与条件的表达产物差别很大，使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用（假设其可以用）。

不过认为可以试一下

作者: orangecake 时间: 2013-8-30 15:28

这是个crazy的想法，发飚的想法，很好的想法，楼主大胆地实施吧

作者: lxh031 时间: 2013-8-30 15:28

个人觉得你的想法有些不切实际，举例如下
1、你既然能够制备抗体，为什么不制备目标蛋白的单抗，然后偶联到介质上，用来纯化目标蛋白。
2、能否得到抗所有杂质的抗体还需考证，且一些物质是不会产生抗体的，况且你连杂质都不知道有多少种，是什么成分。
3、自己偶联的亲和层析介质载量很低的，如果杂质量较大，即使产生抗体也会流穿，且杂质的含量各不相同，决定你必须先分析杂质都有什么，比例是多少。
4、本来很简单的试验为什么要设计的很复杂啊，两米的距离你非要向反方向走从地球的另一端到达目标。
但是楼主也有逆向思维的能力，学习了。并祝福楼主能够考虑大家的意见。

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:29

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原帖由 lxh031 于 2013-8-30 15:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人觉得你的想法有些不切实际，举例如下
1、你既然能够制备抗体，为什么不制备目标蛋白的单抗，然后偶联到介质上，用来纯化目标蛋白。
2、能否得到抗所有杂质的抗体还需考证，且一些物质是不会产生抗体的，况且你连杂质都不知 ...

我导师的目的就是要让目的蛋白穿透里面有特殊的目的
亲和介质我们倒是自己买的谢谢你的宝贵意见

作者: 101010 时间: 2013-8-30 15:35

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我导师的目的就是要让目的蛋白穿透里面有特殊的目的
亲和介质我们倒是自己买的谢谢你的宝贵意见

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多种抗体，说不定有那个就和你的目的蛋白有其他的相互作用（比如疏水、离子键等）。

作者: DONT 时间: 2013-8-30 15:35

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多种抗体，说不定有那个就和你的目的蛋白有其他的相互作用（比如疏水、离子键等）。

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:36

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原帖由 DONT 于 2013-8-30 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多 ...

单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，这个我倒是没有想到谢谢

作者: cocacola 时间: 2013-8-30 15:36

觉得这个想法非常好，但是目前很难实施
一个是比较复杂，成本高，需要寻找更简便的方法
一个是纯化的纯度，只有理论上是成立的

作者: standbyme 时间: 2013-8-30 15:37

我觉得楼主钱烧不完的话不如把序列给公司，几周就能拿到你要的东西了，而且比你的想法省钱

作者: hold住 时间: 2013-8-30 15:37

sepharose载量有限，一般破菌上清中杂蛋白起码占80%以上，要将每一种杂蛋白都挂住，那每个抗体需要挂多少在sepharose上？而且是每一个抗体都要有这么多的量，那总体来说这个sepharose上要挂多少蛋白？或者你可以加大填料的量来解决这个问题，但这个量将非常巨大。
而且蛋白纯化除了去除杂蛋白外，还有核酸、色素、多糖等很多成分要去掉，现有的Ni柱基本可以去除这些成分，但抗体柱可能就不行了。当然也可以通过后续的纯化去除，但如果大批量做的话，第一步的抗体柱纯化起不到浓缩样品缩小样品体积的作用，后面的离子交换还是凝胶过滤做起来就比较麻烦了

作者: NBA 时间: 2013-8-30 15:38

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原帖由 hold住 于 2013-8-30 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

sepharose载量有限，一般破菌上清中杂蛋白起码占80%以上，要将每一种杂蛋白都挂住，那每个抗体需要挂多少在sepharose上？而且是每一个抗体都要有这么多的量，那总体来说这个sepharose上要挂多少蛋白？或者你可以加大填料的量来 ...

谢谢你的提醒困难是有很多的但是我觉得吧可以作为一个纯化思路或许不一定适合这个案例但有可能其他方面有意义

作者: youyou99 时间: 2013-8-30 15:39

过程有些复杂，成本高

作者: mickeylin 时间: 2013-8-30 15:41

楼主主要想利用这种手段开发一种类似于protein A捕获抗体的通用平台技术，我同意3楼的意见。个人认为这种混合抗体柱子可能有各种意想不到的情况发生，使得该步层析无法超越或接近常规纯化介质的效率。

作者: duoduo 时间: 2013-8-30 15:41

总觉得有点大炮打苍蝇的感觉，或者用一些很复杂的方法去合成乙醇的感觉。难道不能直接用目标蛋白的抗体（利用相似已知蛋白来制备的）来纯化吗？

作者: baidukk 时间: 2013-8-30 15:43

其实我也觉得这个想法不切实际，哈哈，楼主不要骂我哈，不过这个逆向思维是值得欣赏的
1 你用一个及其复杂的混合物（既有Ecoli的毒素，又含破碎细胞时用的去污剂，溶解蛋白时用的高浓度尿素或者盐酸胍）去免疫一只兔子，我首先想到的是这只兔子在产生抗体前能否保证活着，在国外估计是不允许拿动物做这种实验的
2 假设兔子活着，整个混合物中成分过于复杂，每种成分的免疫原性参差不齐，肯定会有某些杂蛋白的抗体水平相当低，根据水桶效应，你要去除所有杂蛋白必须保证抗体浓度最低的那个达到一定水平，这个量肯定需要实验来验证，但是肯定很大，绝对比你直接用目标蛋白免疫得到多抗或者做单抗要浪费得多
3 即使得到了所有杂蛋白的抗体，谁也没法保证这些抗体和你的目的蛋白没有交叉反应，就算第一次没有交叉反应，也无法保证每次都没有，也就是说这个实验是没法重复的，如此复杂的混合物中能和你的目的蛋白有交叉反应的可想不在少数，一旦有交叉反应，过柱子的时候必定是干干净净的全部留在柱子上，没有起到纯化的效果
4 做单抗的时候通常都需要筛选效价高，亲和力强的单抗，用这个混合物免疫得到的超级多抗中肯定合格的抗体是少数，最终亲和的效率肯定也达不到要求
这种实验还是建议楼主拿出一个可行的计划再动手，免得浪费时间和金钱，时间和经费多宝贵啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-8-30 15:44

如果真的想这么做的话，应该用普通的层析方法，例如离子交换，将蛋白做一下初步纯化，减少一下体系的复杂性，再去做免疫尝试。

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-8-30 15:45

没有用的，不是所有蛋白能引起足够强的免疫反应，也不是所有蛋白引起的免疫反应是体液的。

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