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标题: 标准曲线时，BSA是需要每次测定都要重新配制吗？ [打印本页]

作者: 大球球 时间: 2013-8-31 11:23 标题: 标准曲线时，BSA是需要每次测定都要重新配制吗？

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各位师兄师姐，紧急求助，就是用考马斯亮蓝法测定土壤蛋白，但是不管是预实验还是正式试验，测定的结果并不相同，尽管重复了很多次，不知道问题出哪里了？忘各位师兄师姐帮帮忙。
1、标准曲线时，BSA是需要每次测定都要重新配制吗？在测样品的时候是直接加100ul待测样品，其他与标准曲线一样。
2、提取的土壤蛋白储存在4°冰箱中，放置一个礼拜左右，对测定结果有影响么？还是会有蛋白变性的可能性？还是提取完成后放置在-20°条件？
3、考马斯染液反应时间为10min，并在一个小时之内测定完成，这个时间是不是有问题？

作者: 美丽婷婷 时间: 2013-8-31 11:24

4度放置时间长了肯定有问题，这个温度下有一部分蛋白酶还是有活性的。土壤中的其他物质有可能对考染的结果产生影响。

作者: 双_视野 时间: 2013-8-31 11:28

1) BSA需要一批多配些，分装在棕色瓶中，4度保存。做标准曲线不需要每次都重配，但做好每一瓶做好标准曲线后尽快用掉。启用另一瓶时，如果间隔时间长，需要重新做标准曲线；
2）蛋白提取后肯定要冷冻保存。
3）显色反应一般都在半小时以内。

作者: 莫莫莫 时间: 2013-8-31 11:41

考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是测定蛋白质疏水基团的数量来定蛋白质含量，有一定的误差，随着时间的推移有可能你的样品中的蛋白质可能在分解，样品做出来肯定要冷冻，你可以一次多做点平行，真不行就定氮测定，就是麻烦点，祝好运

作者: 千里之外 时间: 2013-8-31 11:45

标准曲线一般重新做比较准确。我们取样总体积是250ul不知道你们的是不是。而且要稀释一定倍数然后再反应5分钟等连续几次读数稳定后，让读数在0.2-0.8之间，记录吸光度值，再用公式计算下。

作者: grace! 时间: 2013-8-31 11:50

一方面可以检查是不是机器故障，如基线没有归零；
另一方面样品总量是不是足够；一般鲜重以0.5g为宜。

作者: 巅峰时刻#-# 时间: 2013-8-31 11:54

大哥，测得时候你的温度要在室温，也就是必须要和标准曲线时，的温度一样。离心去掉杂质！有些蛋白要在3000r的转速下才得，不知道你的蛋白要多少了，自己试。还有呢，陪考马斯亮蓝的时候乙醇的量可是会影响的哦，一定要准确配置。

作者: hero_b 时间: 2013-8-31 11:58

配制好BSA后，可以分装-20保存一部分，不用每次都配，但每次用的最好一次用掉，避免反复冻融。
蛋白样品一般放在-70吧。4度肯定不行
考马斯一般5-25分钟效果最好

作者: 纯化小兵 时间: 2013-9-3 21:56

4℃存放1周容易染菌，最好是-80或者-40冻存，前提也是无菌过滤后

作者: Kiwi2021 时间: 2022-8-30 12:07

配制好BSA后，可以分装-20保存一部分，不用每次都配，但每次用的最好一次用掉，避免反复冻融。 https://168won.com/view/sgAirship/pk10kai.html

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