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标题: 我接下来的16Spcr要扩增更多倍数来做吗？ [打印本页]

作者: #断点# 时间: 2013-8-31 13:25 标题: 我接下来的16Spcr要扩增更多倍数来做吗？

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最近开始做土壤pcr-dgge试验了，我是用MP公司的试剂盒提取土壤DNA的，但是我提取的dna是黄色接近棕色的，这是为什么？腐殖酸太多吗？然后做16Spcr时，我用四个同时提取的不同模版，分别稀释0,2,5,10倍，结果只有稀释5倍扩增一个出来，10倍扩增2个出来，这是为什么？我接下来的16Spcr要扩增更多倍数来做吗？在接下来的V3区pcr该怎么做比较好？
去年我在其他学校学习的时候做的dgge胶染色后条带非常少，我是用8%的胶，梯度是30-50%，后面渐渐改成30-40%,条带还是那几条，这是为什么？我该怎么改进？用的土样是森林里的表层土，这种土不是应该微生物很丰富吗？还有dgge胶我后面是还要用quantity one软件分析，请问是用扫描仪扫描比较好，还是用凝胶成像仪拍照比较好？相机能拍吗，拍的照片能用于软件分析吗，会不会有误差？
不好意思，问题有点多，我是刚开始做pcr-dgge的菜鸟，都说这个技术不好做，我是我们院第一个做的，也没有人带，一切都要自己摸索，很茫然啊，请各位大侠相助！！！

作者: 疲惫黑眼圈 时间: 2013-8-31 13:26

应该是你提取的DNA腐植酸含量太高了，影响了PCR的效率。一般来说，模板里面杂质太多影响PCR的话，可以通过降低模板量来减少杂质，从而提高PCR的效果。我觉得你还是纯化一下比较好，颜色看着发黄肯定不好用的。
DGGE，我用的是6.5%的浓度，40——60%，不过，我觉得你条带还是PCR的问题，PCR不好扩增不出来啊。你说用Quantity One分析，我也试过，我是用成像仪拍照的，扫描仪没用过不清楚，相机拍的也就看看而已，分析的话应该是不成的。

作者: 艾玛@加油 时间: 2013-8-31 13:29

前面的问题PCR问题，我来回答你，后面的DGGE我不做，所以没办法了。
MP试剂盒提出来的效果还是不错的，里面的腐殖酸含量确实很高，你放在冰箱里冻一下，隔天的效果就差了很多，所以需要稀释一下，我也是稀释5倍然后拿来做实验的，我曾经试过拿胶回收试剂盒把基因组DNA回收一下，效果还不错，如果你一直扩增不出来，你可以试试！

作者: =心晴= 时间: 2013-8-31 13:31

如果要用Quantity One做分析，最好还是用DGGE检测系统专用的成像仪拍叫，那是最理想的了，如果没有的话，可以用普通凝胶成像仪拍，保存成tiff格式的图片，这样Quantity One就可以打开图片进行条带识别和分析了。不过最重要的还是前面PCR样品的准备。祝你好运！

作者: 不化妆的lay 时间: 2013-8-31 13:33

我们实验室一直用的是MOBIO的PowerSoil试剂盒，提出来效果不错，可以直接用于下游PCR实验~

作者: 哦买噶 时间: 2013-8-31 15:11

可以先测一下DNA浓度，再稀释到10到20纳克左右作为模板再PCR，后面的DGGE可保存为TIF格式，再用quantity one分析，我觉得PCR扩得好才是关键

作者: 集贤阁 时间: 2013-8-31 15:18

纯化可以用试剂盒也可以自己手工。我做的是农田里面的土壤，有机质含量很高的，用的OMEGA的试剂盒，也没有像你说的颜色发黄，OD260/230很低，也不影响PCR。我不清楚你的土壤样品是什么，不过你是不是用试剂盒的时候操作有问题啊？在我的印象里，MO的盒子好于OMEGA，我用手提法提取DNA的颜色才是黄色，PCR的时候有些引物还是可以扩增出来的啊。
你说的PCR问题，扩增有没有问题和条带亮度没有太大关系，条带亮只能说DNA含量高而已。

作者: 哈达 时间: 2013-8-31 15:23

这位仁兄我也刚开始做DGGE 一直跑不出来带啊~~就有一次跑出二十多条但是达不到切胶回收的标准半个多月了快伤死了提DNA没用试剂盒 CTAB提的感觉不是样品的问题求交流

作者: 哈达 时间: 2013-8-31 15:34

那个仪器的电流有问题亮度这个东西说白了就是插入双链的染料多，小片段数量多可以很亮，大片段数量少也可以插入很多染料显得亮，所以不能简单的以亮度来判断。

作者: 化小样 时间: 2013-8-31 15:52

比如通过Mark比对大小对不对啊，已知序列的PCR还可以测序测定，还有看看泳道是否有拖尾弥散的现象等等。

作者: 明灰灰 时间: 2013-8-31 15:55

Mo Bio有个PowerClean DNA Clean-Up Kit试剂盒，可以用于去除粗提DNA的腐殖酸。我有个室友用过，效果挺好

作者: 誓言@谎言 时间: 2013-8-31 15:57

建议直接做高通量测序，DGGE分辨率太低！用的SYBGREEN I燃料，比较常用的

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