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标题: 【讨论帖】Western 及抗体 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2013-9-5 15:40 标题: 【讨论帖】Western 及抗体

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问，但是我的时间有限，问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

sean

作者: NBA 时间: 2013-9-5 15:46

就我的经验看，就整个Western Blot来说，我觉得最关键的步骤在前面，1.制样 2.电泳 3.转移 4. Block，
其中1和3更为重要，后面的步骤按照标准来就行了，最多有一些小调整。你们在实际应用中有问题可问，越具体越好。我尽量解

作者: 831226 时间: 2013-9-5 16:20

蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:20

上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过（具体的数值我忘了，）

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:26

you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.

作者: xue258 时间: 2013-9-5 16:28

一抗，二抗的比例还是蛮重要的

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:29

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2013-9-5 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗，二抗的比例还是蛮重要的

对，调整好一抗，2抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
大家有问题就来问吧！

作者: plaa 时间: 2013-9-5 16:29

终于有牛人了，我准备做western blot ，但听说很难，不知你那有没有较好的protocol ，我好依葫芦画瓢

作者: qqq111 时间: 2013-9-5 16:29

我做WESTERN重复性很差，这一次出结果了，可是再重复做就不出阳性结果了，我反复做了好多次，就是不能每次都重复出来，而且，即使有阳性结果，条带也很浅，请问高人，是何原因？

作者: abc816 时间: 2013-9-5 16:31

请教一下，半干转是否要求膜，3m滤纸，胶同样大小？
因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
什么是短路？如何控制和发现短路呢？谢谢指点

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:31

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原帖由 abc816 于 2013-9-5 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教一下，半干转是否要求膜，3m滤纸，胶同样大小？
因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
什么是短路？如何控制和发现短路呢？谢谢指点 ...

一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:32

可否把你现有的实验设备及实验条件告诉我，我好告诉你一个比较合理的Protocol，另外，方便的化把要检测的蛋白和实验目的也告诉我好吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:38

能否具体点呢？就你现在告诉我的这点情况，我很难判断，
不过我觉得问题可能在，
1. 制样及上样，
2.转移。

作者: lixi559 时间: 2013-9-5 16:38

想请教Western的结果如何分析，一定要有内参照吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:38

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想请教Western的结果如何分析，一定要有内参照吗？

不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker

作者: lixi559 时间: 2013-9-5 16:39

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不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker

不好意思，请具体说一下该怎样分析结果，需要什么软件

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:39

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原帖由 lixi559 于 2013-9-5 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不好意思，请具体说一下该怎样分析结果，需要什么软件

如果你做定量或办定量，至少要用到一个光密度扫描分析软件，
如果不是，直接分析就可以了

作者: windy+++ 时间: 2013-9-5 16:40

我的样品制样：以上样缓冲液直接裂解细胞或是以三去垢剂裂解细胞。
上样：每孔上样大于500000个细胞。（普通小电泳槽）
转移：转移后以丽春红染色，可见膜上条带染色较强。
二抗的检测：以显色剂检测，二抗没问题。
封闭室温2小时，一抗2小时，二抗1.5小时。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:40

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原帖由 windy+++ 于 2013-9-5 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的样品制样：以上样缓冲液直接裂解细胞或是以三去垢剂裂解细胞。
上样：每孔上样大于500000个细胞。（普通小电泳槽）
转移：转移后以丽春红染色，可见膜上条带染色较强。
二抗的检测：以显色剂检测，二抗没问题。
封闭室温2小时，一 ...

可否告知样品的分子量，和转移方法和时间？

作者: windy+++ 时间: 2013-9-5 16:45 标题: 回复 #19 NBA 的帖子

样品分子量为：170KD，转移方法：半干为25－35伏，电流小于150mA，1－1.5小时。水浴为恒流350mA,1.5小时。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 16:46

170kd, 如果用半干法建议2.0mA/cm2, 时间2hrs，（7％SDS-PAGE）

你的方法也可以，你一抗做了阳性对照吗？是否是你的一抗出了问题呢？

作者: windy+++ 时间: 2013-9-5 16:59

我用的胶是10％的,因为如果用半干的化,无法恒流,所以电流刚开始时一般是大于2.0mA/cm2,但后来会逐渐下降,就达不到2.0mA/cm2了,可能会有一些影响。但是用水浴重复性也不好。我的这个实验倒是没做阳性对照（不知你说的阳性对照是不是指已知含目的抗原的样品？），一抗是从博士德买的，可是我们实验室里别人也从那儿买的，结果还可以。所以我还是很困惑。

作者: windy+++ 时间: 2013-9-5 17:00

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我用的胶是10％的,因为如果用半干的化,无法恒流,所以电流刚开始时一般是大于2.0mA/cm2,但后来会逐渐下降,就达不到2.0mA/cm2了,可能会有一些影响。但是用水浴重复性也不好。我的这个实验倒是没做阳性对照（不知你说的阳性 ...

半干法肯定可以衡流，你用什么power supply?,

作者: u234 时间: 2013-9-5 17:00

我用的是M15表达的一段47KD的蛋白，纯化后12%PAGE电泳肉眼几乎看不出杂带，做western显色后细菌对照出现色带，纯化过的目的带包括其上下都出现了色带，用病人恢复期血清做一抗。
请问是否是表达菌的问题，还是可能其他原因，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:00

"纯化过的目的带包括其上下都出现了色带"
你是说纯化的很好，但是Western有杂带，还是上下都有，对吗?

作者: yes4 时间: 2013-9-5 17:01

你好!
请问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
我是在红光下操作的,显影液和定影液都是新鲜配制的,我曾经做了p53的western,可以做出来,现在我的条件(一抗,二抗及电泳和转膜)和以前完全一样,显影液也是一个公司的.
真搞不懂!

作者: fei1226com 时间: 2013-9-5 17:01

我用的是BIORED全湿转膜的仪器，300v,400mA,75w.电泳过程中经常出现E9是什么回事？
另外想请教一下我测HIF-1,积层胶100v分离胶150v，转膜350mA1.5小时-2小时。电泳时电压多少最好？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:11

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原帖由 yes4 于 2013-9-5 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好!
请问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
我是在红光下操作的,显影液和定影液都是新鲜配制的,我曾经做了p53的western,可以做出来,现在我的条件(一抗,二抗及电泳和转膜)和以前完全一样,显 ...

你看是否是胶片已经曝光了,
1.可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.
2.胶片本来就被曝光了
3.显影时间过长.
自己摸排一下,有问题再问

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:11

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原帖由 fei1226com 于 2013-9-5 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的是BIORED全湿转膜的仪器，300v,400mA,75w.电泳过程中经常出现E9是什么回事？
另外想请教一下我测HIF-1,积层胶100v分离胶150v，转膜350mA1.5小时-2小时。电泳时电压多少最好？ ...

你要测的是乏氧抑制因子吗？
它的制样过程要小心。
E9是出错的标志，你转移过程中有一项指标超过了仪器的负荷。
我们一般电泳是积层胶60-80v分离胶100v

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:12

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问，但是我的时间有限，问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

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请帮我分析一下我的转膜效率低的原因：半干法：电压：15V，时间45分钟，目的蛋白：95KD，分离胶：百分之六。电泳条件：60V 30分钟，80V 3.5-4.0小时。下面是我的经丽春红染色后的结果：左边第一道为MARKER，好象也没有转上，其他的为样本。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:13

我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:13

我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。

我的图贴不上去，参照分子克隆上的5%的分离胶的分离范围是57-212KD，7.5%的分离胶的分离范围是36-94KD，10%分离胶的分离范围是16-68扩大，应该是5%到7.5%之间的胶才对呀！？
另外，你所说的2.0mA/cm2怎么讲，是根据胶的面积要求的电流吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:14

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原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。

我的图贴不上去，参照分子克隆上的5%的分离胶的分离范围是57-212KD，7.5%的分离胶的分离范围是36-94KD，10%分离胶的分 ...

是的，是按“胶”的面积要求的电流

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:15

你好：
我今下午研究了一下BIO-RAD的转膜仪。
我以前转膜的条件是：“恒压”15V，我观察了3分钟后，电流是95mA左右，我转膜45分钟，但结果转膜效率很低。
您建议我的按您所讲“恒流”而非“恒压”的原则及2mA/cm2，我的目的蛋白是100KD左右，我的“胶”的面积是25cm2，那么我的转膜电流是50mA啦，我观察了3分钟后，电压大概在7-8V左右，转膜1.5hrs。
您认为我的15V，95mA，45分钟的条件与您建议的50mA，7-8V，1.5hrs的条件，哪个转膜效率会更高一些呢？
望不吝赐教，谢谢！

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:16

一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

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我们一般是按照胶= 膜>滤纸 ,这样才不会短路啊！
按照你所说的膜>= 滤纸> 胶,会发生短路啊！
能解释一下吗？

作者: tuuu2 时间: 2013-9-5 17:16

"纯化过的目的带包括其上下都出现了色带"

你是说纯化的很好，但是Western有杂带，还是上下都有，对吗?

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是的,而且对照菌也出现了条带,会是什么原因?谢谢

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-5 17:17

你好：
我做WESTERN的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但是换成ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物，胶片是普通的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么原因，能赐教吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:17

我觉得有3个原因，
1.一抗有问题，效价太低，且未纯化。
2.表达量太低
3.你提蛋白时是否出了问题

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:19

一般的说，Ecl比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能：
1. ECL底物失活了，你可以检测一下
2. 敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物。
3.显影液没用了。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:19

上样缓冲液到底是1*SDS还是2*SDS？
所谓1*SDS是加等量样本前的浓度，还是加等量样本后的浓度？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:19

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原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
上样缓冲液到底是1*SDS还是2*SDS？
所谓1*SDS是加等量样本前的浓度，还是加等量样本后的浓度？

其实是无所谓的，我上样时用5X sample buffer ,只对半用，相当于1:2.5用，都没事。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:20

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-9-5 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实是无所谓的，我上样时用5X sample buffer ,只对半用，相当于1:2.5用，都没事。

哦！那是不是最好用新一点的，因为我前两次用的SDS都已经有一年拉，不会有影响吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:20

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原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哦！那是不是最好用新一点的，因为我前两次用的SDS都已经有一年拉，不会有影响吗？

重配总会好一点的

作者: tie8 时间: 2013-9-5 17:21

我想作内皮细胞(细胞数 5*100000)核因子的Western blot,能否因其在细胞浆中低表达使结果阴性.

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-5 17:22

我觉得有3个原因，
1.一抗有问题，效价太低，且未纯化。
2.表达量太低
3.你提蛋白时是否出了问题

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谢谢,我也觉得可能有第一个问题,因为是直接取自病人血清,有没有可能是M15菌体蛋白与人血清中抗体有较高的抗原性,而纯化蛋白又不可能绝对纯,我换过其他的菌表达,对PQE-30质粒载体好象不敏感,几乎没有表达.

作者: ritou1985 时间: 2013-9-5 17:25

我的western结果已经扫描存在电脑里了，能不能下载一个软件，检测电脑图像里的条带的光密度？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:25

除非表达量很低否则不会做Western是阴性结果的。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:25

有时间就经常跟我讨论把，我做了500多个融合蛋白了

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:27

最好是用胶片

作者: vivian4123 时间: 2013-9-5 17:28

谢谢请问怎样检测ECL底物的活性？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:28

你是说定量检测还是定性？
定量我还不会，定性可以在暗室中将底物混合好，再加已知好的Hrp，（极微量便可），看是否有荧光。

作者: xyw5 时间: 2013-9-5 17:28

本人拟作心肌组织CAMKII及P-CAMKII的western blot,拟按照分子克隆实验指南第二版上的对组织碎片的处理方法进行样本制备,即以悬浮缓冲液
0.1mol/L NaCI、 0.01mol/L Tris.CI（PH7.6）、 0.001mol/L EDTA（8.0）、1ug/ml aprotinin、100ug/ml PMSF分散组织，尽快加入等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液，然后煮沸及离心。我的问题是该方法所用的蛋白酶抑制剂是否合适，另磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等。盼答，谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:29

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原帖由 xyw5 于 2013-9-5 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
本人拟作心肌组织CAMKII及P-CAMKII的western blot,拟按照分子克隆实验指南第二版上的对组织碎片的处理方法进行样本制备,即以悬浮缓冲液
0.1mol/L NaCI、 0.01mol/L Tris.CI（PH7.6）、 0.001mol/L EDTA（8.0）、1ug/ml aprot ...

Buffer 没有问题, 蛋白酶抑制剂也可以,
NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:30

一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

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Buffer和滤纸选的对是什么意思啊？能具体解释一下吗？
Buffer指的是转膜液吗？是不是BIO-RAD的滤纸就不会短路！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:30

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原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

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Buffer指的是转膜液吗？是的，你用的就可以。
是不是BIO-RAD的滤纸就不会短路！ “我这里说错了，不是短路是烧膜，用Bio-Rad 就不会烧。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:31 标题: 回复 #55 NBA 的帖子

哎，可惜的是，我的Bio-Rad 膜已经用完啦，要不然就会省去很多麻烦，现在看来只能用普通滤纸代替看看效果怎样啦，ptglab,是不是普通滤纸按照你说的膜>=滤纸>胶就会烧膜呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:33

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
哎，可惜的是，我的Bio-Rad 膜已经用完啦，要不然就会省去很多麻烦，现在看来只能用普通滤纸代替看看效果怎样啦，ptglab,是不是普通滤纸按照你说的膜>=滤纸>胶就会烧膜呢？ ...

不一定的，你转移过程中多注意就可以了。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:35 标题: 回复 #57 NBA 的帖子

我的Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带（正常应该有6条）
，其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5％的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育（1：200，建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1：2000），均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出现非特异性条带。请ptglab帮忙分析一下：
1、Marker是否有问题？是MBI公司的，可分离14-116KD的蛋白，买了大概有一年的时间啦。
2、一抗（为多克隆抗体）、二抗的浓度及孵育的时间是否合适？
3、封闭的时间是否太短？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:36

恭喜呀！
1. marker 有可能被降解了，也有可能是它标称的上样量太少，不够，我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的。
2.建议，一抗4度过夜也很好，建议1:100,室温2hrs就够了，
3. 2抗室温1小时，1:2000,
我喜欢4度封闭过夜（室温2hr就够了），1抗室温1hr，2抗室温1hr，

最好是一抗4度过夜（或室温2小时）1:200，2抗室温1小时1:2000，换Ecl法.

作者: duoduo 时间: 2013-9-5 17:36

请教：
在作磷酸化蛋白时很多裂解液配方中又磷酸钠，作用是什么？
磷酸化蛋白的裂解过程有无特殊？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:36

是NaF吧，它是磷酸化酶的光谱抑制剂。
无特殊过程，有时需要加NaF

作者: 969 时间: 2013-9-5 17:37

您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

作者: nn255 时间: 2013-9-5 17:37

你好，我做线粒体膜UCP2蛋白的WESTERN BLOT，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120ug，换了个santa cloz的一抗仍不行。现在怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂；你的意见呢？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:38

我转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，请帮忙分析一下！谢谢！

图片附件: 60252517.snap.jpg (2013-9-5 17:38, 26.72 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18053

作者: 101010 时间: 2013-9-5 17:38

1、请问您裂解细胞用什么配方，对于磷酸化的蛋白配方有无区别？
2、对于磷酸化的蛋白是否可用5%的脱脂奶粉封闭？Cell Signal的说明书上说多克
隆抗体建议用BSA，单克隆抗体用5%脱脂奶粉封闭，不知您有何体会？
3、难道一定要用封闭液稀释一抗吗？
4、我想知道您的实验步骤？一抗的稀释倍数，孵育时间，二抗的稀释倍数，孵
育时间？封闭的时间？尤其对于磷酸化的抗体。

作者: flower-201 时间: 2013-9-5 17:39

表达丰度低的蛋白,又不能用ECL KIt 来做,如何提高灵敏性?谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:40

做200kd蛋白的Western Blot时要注意，
1. 分离胶最好选择>7%的， 6%最好了。
2. 剥胶时要注意。
3. 转移时间相应延长。
4.要做分子量参照。（否则出现杂带不知道如何分析）。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:40

你说的2个可能是对的，
但建议检查Wb过程，提高一抗浓度。再做一遍。
加PMSF一般就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:40

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:41

1、请问您裂解细胞用什么配方，对于磷酸化的蛋白配方有无区别？
无大的区别，最好加NaF。
2、对于磷酸化的蛋白是否可用5%的脱脂奶粉封闭？（建议用BSA）
Cell Signal的说明书上说多克隆抗体建议用BSA，单克隆抗体用5%脱脂奶粉封闭，不知您有何体会？（这么做没有任何意义）

3、难道一定要用封闭液稀释一抗吗？不定，实验步骤是可以根据实验的结果来调整的。
4、我想知道您的实验步骤？一抗的稀释倍数，孵育时间，二抗的稀释倍数，孵
育时间？封闭的时间？尤其对于磷酸化的抗体。
不是我不告诉你，告诉你也没有用。你要根据自己的抗体和蛋白来定这些条件。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:42

建议用Hrp加DAB，还不行就选择3抗。

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-5 17:44

我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:45

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原帖由 luoliqiong 于 2013-9-5 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

你的磷酸化蛋白是个什么蛋白？核蛋白？膜蛋白？胞浆蛋白？

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-5 17:45

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原帖由 NBA 于 2013-9-5 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的磷酸化蛋白是个什么蛋白？核蛋白？膜蛋白？胞浆蛋白？

是核蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:46

用上样缓冲液,这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-5 17:50

如果是膜蛋白或是胞浆蛋白又如何？我想多知道一些

作者: zzzz 时间: 2013-9-5 17:51

你好！我最近做了几次western，目的是检测细菌全细胞蛋白中我的目的蛋白（12.5kd），但是至今未得到信号带。条件是：NC膜，200mA两小时转膜。一抗（抗血清）1：2000，室温1小时；二抗1：2000，室温1小时。
NBT/BCIP显色，全细胞蛋白由TCA沉淀法得到。我本人对失败原因的初步分析是：
1.检测方法的灵敏度不够。由于目的蛋白在全细胞蛋白中含量较低，且分子量又小，用常规生色反应难以检测到。因此可换ECL试一下。
2.NC膜对于小蛋白的吸附能力不够强，或在转膜过程中小蛋白的转移效率较低。可考虑换成PVDF膜。
我在这方面的经验不足，想请你帮忙分析一下还有没有什么其他原因？能否推荐一下你认为好用的检测系统。最后十分感谢你对我们大家的热心指导：）

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-5 17:51

今天在精编分子生物学实验指南上建议磷酸化的蛋白在转移缓冲液中加矾酸钠，封闭液用5%BSA，1%母鸡卵白蛋白，10mmol/L Tris-Cl，pH7.4，0.15mmol/LNaCl，不知各位有何高见？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:51

如果是膜蛋白或是胞浆蛋白又如何？我想多知道一些，感谢您的无私帮助

如果你只想提取膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要要温和的多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:52

你说的几条都对，但是你的这个实验不是特别容易做，

你的目标蛋白太小了， 12.5kd（是不是细胞色素C？），含量又低，一般的10-20kd的蛋白PVDF膜吸附就不太好了，你可以先按你的想法做一下。
等你你遇到的具体问题你可以发mail给我。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:53

一般做磷酸化蛋白时都是用的5%BSA封闭液就够了，（再加1%母鸡卵白蛋白可能会更好，但我没有试过。
我用过5%milk做过，结果都很好，要具体事情具体分析。

作者: gogo 时间: 2013-9-5 17:53

请教：
我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？
胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:54

你pre-stained marker 8条带是多大的分子量？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:54

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原帖由 gogo 于 2013-9-5 17:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：
我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？
胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

1. Antibodies, a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane
2.抗体技术实验指南

作者: gogo 时间: 2013-9-5 17:54

我pre-stained marker 8条带分子量在6kd---198kd之间。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:55

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原帖由 gogo 于 2013-9-5 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我pre-stained marker 8条带分子量在6kd---198kd之间。

你看看书1，2%的胶就不能分离开6kd的带！！！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2013-9-5 17:55

我们是开始做Western的，转了好几次膜不知为什么都没有转上去，但mark每次都转上去了，用丽春红染膜什么也没有，胶用考马斯亮兰染有时有条带，有时又没。
不知出了什么原因？请多多指教。
不胜感激！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 17:56

QUOTE:

原帖由 雪山飞鹿 于 2013-9-5 17:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们是开始做Western的，转了好几次膜不知为什么都没有转上去，但mark每次都转上去了，用丽春红染膜什么也没有，胶用考马斯亮兰染有时有条带，有时又没。
不知出了什么原因？请多多指教。
不胜感激！ ...

你是否测量样品浓度？，还有查查Sample buffer出问题没有

作者: 雪山飞鹿 时间: 2013-9-5 17:57 标题: 回复 #88 NBA 的帖子

样品的浓度大约40ug每孔，转膜时的电压是恒压好还是恒流好，一般是怎样的条件，我们的机子是mini-8.1 biometro的，转膜的条件是150v，2小时，但总是转不上去。
不知出了什么原因？请多多指教。
不胜感激！

作者: zhenxin 时间: 2013-9-5 17:58

你可以尝试先用M15菌体总蛋白吸附病人血清后，再western blot，可以去除非特异条带。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 17:58

我现在要做核蛋白的WESTERN BLOT，但是我按照梁国栋主编的《最新分子生物学实验技术》的细胞核提取物的快速制备法来提核蛋白，但是提出后，我用BCA试剂盒测蛋白的浓度，发现蛋白浓度太低，只有1-2微克/微升，而我担心这样的浓度如果做WESTERN BLOT的话，每个加样孔的蛋白上样量是不是太低啦（每孔上样15-20微升，那上样量顶多是30微克左右），这样的话做WESTERN BLOT的话，是否很难出结果呢？
您提过核蛋白吗，您的蛋白浓度一般是多少？
您用过DAB来显色吗？（核蛋白的WESTERN BLOT）
另外，问一下，膜到底是用去离子水浸泡，还是用转膜液？因为分子可隆上写的是用去离子水浸泡5分钟以上啊！
请不吝赐教，谢谢啦！

作者: ukonptp 时间: 2013-9-5 17:59

你可以尝试先用M15菌体总蛋白吸附病人血清后，再western blot，可以去除非特异条带。

作者: DONT 时间: 2013-9-5 17:59

你用的是tank system吧，建议低电压，长时间，
如 28V 14－16hrs

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-5 18:00

我做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能，请指点。

作者: jkobn 时间: 2013-9-5 18:01

我也准备做WESTERN BLOT，想请教以下问题：
1 哪家公司的转印膜较好，帮忙推荐一下。
2 膜要如何处理？
3如果是6×8转印膜，要加多少一抗。
4 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

作者: lixi559 时间: 2013-9-5 18:02

请问：在不知道抗体的分子量和PI的情况下，怎样来做电泳？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:02

1你可以将样品浓缩，方法你可以找到
2我做过DAB显色法，还挺灵敏的，你想问什么?
3膜你可以用甲醇泡，(PVDF)

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:03

这多半是抗体的问题，你要看你抗体的说明，是否能做WB和IHC，

作者: DONT 时间: 2013-9-5 18:04

你用的是tank system吧，建议低电压，长时间，
如 28V 14－16hrs

=============================================================

为什么？

以上电压情况下，电流是几多？我们的机子可能只有10ma.
这可以吗？

转膜时恒压好些还是恒流好些？
有时候滤纸片和膜的大小及厚度不同电阻可能不同，相同电压下，电流会有不同！

望指点一二！

谢谢！

作者: DONT 时间: 2013-9-5 18:04

不好意思，你那里是否有较好一点的灰度扫描软件。

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:05

想请教一下：
我不知道所研究的蛋白在细胞内的含量是多少。可是做了多少次Western就是不出结果。国外用的是化学发光检测，我用的是DAB检测，请问是这里出了问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:05

1我一般喜欢用pvdf膜感觉都差不多， Millipo（我不在公司，记不清了），还不错，
2一般用甲醇泡泡就可以了，
3一抗的稀释度是有说明的，你根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml，
4无要求。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:05

1抗体的分子量都是差不多的，你是否要做抗体的电泳还是笔误？
2如果作未知抗原的电泳，你可以用何种方法来检测呢？用到抗体就可以查到相应分子量了。
3实在没办法就用梯度胶

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:06

一般tank System 用衡压好点，电流会因为系统的不同而不同

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:06

虽然DAB显色法检测的数量级比ECL法要差，但应该不是最大的问题，除非你的蛋白的表达量非常低，
多检查其它的地方对你的帮助可能更大

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:07

如果不是显色的问题，那我如何分析呢？
国外做的蛋白条带很强。我买的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。
难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。
我真的不知道是哪里出了问题，帮帮忙吧！

作者: yonger 时间: 2013-9-5 18:07

请问打虾，6XSDS加样buffer的配方，谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:08

你的步骤倒没什么问题，我怀疑问题是不是出在溶液方面。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:09

50%甘油，20％SDS，250mM tris ：9.5ml
巯基乙醇或DTT ：0.5ml
溴酚蓝 0.005％

作者: tuuu2 时间: 2013-9-5 18:09

我也准备做WESTERN BLOT，想请教以下问题：
1 哪家公司的转印膜较好，帮忙推荐一下。
2 膜要如何处理？
3如果是6×8转印膜，要加多少一抗。
4 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

==============================================================================

1，2. 我跟ptglab一样，也 pharmarcia的PVDF膜，感觉效果不错。PVDF先用甲醇泡一下就行了。
3. 我喜欢用杂交袋上抗体，这样比较节省——6X8的膜用1mL就够了，注意不要封气泡进去。
4. 上槽的缓冲液要没过加样孔，下槽没过电极就行了。

作者: xue258 时间: 2013-9-5 18:10

pVDF膜和NC膜都可以，一般质量都行
6*8的膜我一般用到了2.5ml，膜可以用封口膜塑料袋封起来，这样比较节约抗体，如果抗体非常珍贵，可以使用后回收（－70保存)，
如果你一张膜只加一种抗体，可以在转膜后用丽春红染一下，根据mark的位置对应找到需要的蛋白所在的位置，这样在以后的转膜中可以将胶剪小，这样比较省膜。
在电泳时，缓冲液最好和玻璃板上缘平齐，这样条带压得要好一些的

作者: IAM007 时间: 2013-9-5 18:13

我现在用组织蛋白做wb，效果一直不好，
用的是多抗系统，ecl显色
老板建议用同位素做，是否一定能比用多抗效果好

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 18:14

如果不是显色的问题，那我如何分析呢？
国外做的蛋白条带很强。我买的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。
难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。
我真的不知道是哪里出了问题，帮帮忙吧！

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我的建议：
1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。
4、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
6、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原因。

作者: =菓子= 时间: 2013-9-5 18:14

我现在想咨询一下，你有没有过提取细胞膜上糖蛋白的经验，100多kd，还有，我的一抗好像不好买，人抗猪的，直接用人血清行吗？

作者: zhezhe 时间: 2013-9-5 18:15

网上有你这样的高手，真是一件让人高兴的事！
我有一个问题想请教：实验中，我表达一个GST融合蛋白，在做Western时，上了两个样，一个为诱导前的菌体蛋白用来做阴性对照，一个是我纯化的蛋白。结果阴性对照中有一个条带显色。按这个现象，说是非特异显色吧，阴性对照的其他条带均未显色；说诱导前宿主菌也表达GST吧，分子量又比天然的GST大。你能帮我分析一下这其中的原因么？
谢谢先！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:16

你说的分析的很对，有一点点问题，我跟你讨论一下，

29kd和55kd是可以同时选用12％的胶，不用费劲做两块的，半干法转移1.0-1.2mA/cm2, 45mins到1hr，是没有问题的，

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:17

我有一个问题想请教：实验中，我表达一个GST融合蛋白，在做Western时，上了两个样，一个为诱导前的菌体蛋白用来做阴性对照，一个是我纯化的蛋白。结果阴性对照中有一个条带显色。按这个现象，说是非特异显色吧，阴性对照的其他条带均未显色；说诱导前宿主菌也表达GST吧，分子量又比天然的GST大。你能帮我分析一下这其中的原因么？
谢谢先！

哈还真不好答，
我先多问几个问题吧，这样好判断一些，
1.你说你用诱导前的菌体蛋白做阴性对照，一个是纯化的蛋白，纯化后是否跑了SDSpage，是否有带呢？
2.分子量比GST大多少呢？

作者: lxh031 时间: 2013-9-5 18:17

同意楼主的观点，可以公用一块胶。同时告诉楼主，我的WESTERN已经作出来了，作的还很漂亮，谢谢您的帮助！

作者: am10 时间: 2013-9-5 18:18

纯化的蛋白也有显色呀，但是因为阴性对照中的那条带，我不敢说这就是特异性的显色。
分子量大约大几个AA的样子吧

作者: yychen 时间: 2013-9-5 18:18

遇到高人了，精神一振。
请问MARKER用什么公司的好，国产的质量过关吗？

作者: bring 时间: 2013-9-5 18:19

但还是有些问题想和大家探讨：
我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！
细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:19

1.电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。
电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。

2.转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！
做wb时理论上单抗也应该有带，但由于单抗识别抗原结构的单一性，有时候对于抗原的某些结构不识别，因而wb的结果有时候不好。

3.细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？
这个制样步骤没什么问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:20

那我建议你用未转化的细菌做阴性对照，
2，只大几个aa你都能看出来？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:21

你说的marker是做什么用的？是指的pre-stained 的吗？如果是，据我所知都是进口的，

不过我们公司有Western marker，能显色或发荧光的。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:23

你的第2条应该没有太大的问题，我的建议不对。
我还是觉得你在制样方面出问题的可能性大，可能制的太稀了，你可否将上样量加倍看有无改善

作者: mimili_901 时间: 2013-9-5 18:24

首先谢谢大家给了我这么多好的建议，有朋友帮助的感觉真好！

但还是有些问题想和大家探讨：
我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！
细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？

请大家指点一二，谢谢！

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我觉得你这里面还是有一些小的问题
1、我建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90—-100V，再跑3小时左右。
2、转膜可用恒流，但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行，你就可以60mA的电流进行。（都是跟ptglab学的）。
3、我觉得你的抗体应该没问题。
4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。

作者: avi317 时间: 2013-9-5 18:24

我是新手，请教1：是否WB实验半定量一定要加ACTIN内参；2：发中华级文章要求结果用胶片还是膜照相相片，用扫描仪扫描膜后冲印相片行不？；3：用BANDSCAN分析结果行吗？4:蛋白定量后加多少ug总蛋白（全细胞总蛋白）合适？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:25

请教1：是否WB实验半定量一定要加ACTIN内参；
对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

2：发中华级文章要求结果用胶片还是膜照相相片，用扫描仪扫描膜后冲印相片行不？；
国内的文章要求不是很高，最好用的照片。当然了这取决于你的照片的结果。

3：用BANDSCAN分析结果行吗？
分析一般的结果没问题。

4:蛋白定量后加多少ug总蛋白（全细胞总蛋白）合适？
总蛋白量有个上限的，（具体的我忘了，）但是最好不要超过150ug/well
我回公司后给你个具体的答复。

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:25

first, thank you very much for both of you help me in time!
and now I still want to ask some questions

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:26

我想蛋白保存在-20度是正确的，但也不是绝对的，如果目的蛋白对冻融是敏感的，那还不如保存在4度，你说是吧

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:26

对不起，我没看懂你说的有关抗体的问题，你的意思是单抗没问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:27

是的，我觉得你的一抗没有问题。，
还有，你的蛋白最好分装后保存在-20度或-80，

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:29

好，那变性后的蛋白呢，可以放在4度吗，下一次再用时，只离心，不用变性了吧

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:39

有一点没有答好，“蛋白定量后加多少ug总蛋白（全细胞总蛋白）合适“

总蛋白量有个上限的，（具体的我忘了，）但是最好不要超过150ug/well
我回公司后给你个具体的答复。

作者: lxh031 时间: 2013-9-5 18:39

有一种蛋白是以二聚体形式存在并行使功能的，在蛋白电泳之前怎样才能使二聚体解聚呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:39

你好，你可以上样前煮下样品。stacking gel 用8M的Urea配置

作者: popo520 时间: 2013-9-5 18:40

我上样前一直是煮样品的，100度5分钟。请教8M Urea stacking gel的详细配法

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-5 18:41

这两天灌胶又出了点小问题：下胶灌完后，压正丁醇，在水平的折光线上出现了弯弯曲曲的、薄薄的一小层胶，而且很不齐，为什么呀？以前从没有出现过这种情况。是扳子没有刷干净吗？我用清洁精刷了很多次，又用自来水冲净，再用去离子水冲，很干净了呀！这样会影响电泳吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:42

在Stacking gel （不加Temed 和 Aps）加8MUrea，待溶解后，加Temed 和 Aps，即可。

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:42

不是你没洗干净的原因，是加压的时候，加快了，胶的表面被稀释了，但没有关系的

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-5 18:42

你说的可能是对的，我还没有验证，但是我那清楚流体力学的老爸也这么分析。
真是不知道你为什么对大家这么好，现在，象你这样的人已经不多了！

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:44

sds-page蛋白的最大上样量， 30ug/mm2（载荷面），

如你的comb是1.0mm，宽5mm，即这个well的载荷面为5mm2，则最大上样量为150ug。

作者: INK 时间: 2013-9-5 18:44

请问：我要用Western检测我处理前和处理后基因表达水平的变化，也算是半定量吧，内参是必须的吗？可不可以通过控制蛋白上样一致（即保证总蛋白量一致）。直接根据目的条带强弱来进行比较其变化？
如果要做内参，是分别进行内参和目的蛋白一抗孵育，还是将两种抗体同时加入进行孵育

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:44

你给自己看是可以不用内参，可是别人怎么相信你的上样量是一致的呢？

你查查内参的定义就知道了

作者: orangecake 时间: 2013-9-5 18:45

牛人，我想问一下，你作western所用的细胞裂解的方法，你提取的时什么蛋白，我要提取膜蛋白，但是做了一次，好像有点降解，请问高手有何建议。

作者: birdfish 时间: 2013-9-5 18:45

我想问问跑1.5mm的板子（bio-rad，小板，十孔的，用tricine 胶跑，上样35ul+7ul的6x上样缓冲液，结果胶很难看，条带看不清楚，小分子量处条带弯得很厉害
定流30mA
是放热量太大的原因，还是上样量太多了，还是可能是别的原因

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:46

加一点蛋白酶抑制剂试试，
还有你是如何判定蛋白降解了而且还是在提取得过程中？

作者: NBA 时间: 2013-9-5 18:46

是不是你倒胶前没有混匀，我没有看到你的胶，还有你可以用小电压（80-100V）跑会好一点。

作者: 131415 时间: 2013-9-5 18:46

如果上样量少（5ul）的话，虽然小分子量看不清楚，但大分子量处条带挺清楚的
而上样量大（25+25ul，48+8ul）的话则条带都看不清楚
会不会是积层胶不够厚

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-5 18:47

免疫沉淀的对照要做哪几个呢？
如果做免疫共沉淀，对照是否和免疫沉淀的一样呢？

谢谢您。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 10:05

我想你的问题出在上样量上，是吗？如果你测一下蛋白总量，这样就好办得多。如我上所说：“sds-page蛋白的最大上样量， 30ug/mm2（载荷面），

如你的comb是1.0mm，宽5mm，即这个well的载荷面为5mm2，则最大上样量为150ug。”

测一下蛋白量。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 10:09

你问的太不清楚了，
我不清楚您说的这个免疫沉淀是否是抗原抗体做梯度稀释的免疫沉淀。

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-6 10:09

就是immunoprecipitation呀，比如做一些激酶分析什么的要先做免疫沉淀，将细胞裂解液中的相应抗原用特异的抗体沉淀下来。

不知道这次说清楚了没有？

给您添麻烦了，不好意思。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 10:14

那要根据不同的实验条件来制定实验方法，
一般最好选用多抗，
实验一般分为3个阶段，
1 抗原溶液制备
2 裂解物非特异性本底的预处理
3 免疫复合物的形成和纯化。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-6 11:23

我用BCA的方法做总蛋白定量了，是13.92mg/ml，每孔上10ul，是139.2ug，应该可以了吧，可是为什么还是没有结果呢？

另外，我想问一下：为什么要存在最大上样量呢？难道多上对电泳不好吗？

作者: daod 时间: 2013-9-6 11:24

我想问问有什么方法可以提高上样量

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:24

你可以换一种方法测一下，还有你上10ul，直接染的效果如何呢？如果蛋白不多就是你没有

蛋白上多了，电泳时会发生变形，所以上太多了并不好。

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-6 11:25

请教核内抗原Western内参？

作者: yonger 时间: 2013-9-6 11:26

您好！看了很多您的帖子，真是很佩服，遂来讨教。我的目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就显示细胞中mRNA表达不高，我估计将培养上清冻干浓缩后采用western blot还可能检测不出，但如果用western，我是否一定要用0.2um的膜？我现在用Tris-tricine SDS－PAGE电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分离胶用40％T丙稀酰胺（2.6％C)浓度为16.5％，另外两层都用30％丙稀酰胺，中间一层浓度为10％，积层胶浓度为4％，凝胶厚度1mm,转膜的条件我试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，我的上样量为60ug细胞胞浆总蛋白，请教您，转膜的条件？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:26

1可以浓缩样品。
2增大上样体积。
来增大上样量

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:26

如果用western，我是否一定要用0.2um的膜
是的，一定要用，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，
你要根据你的实验器材来定，一般你要是有prestained marker就可以参照一下，如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:27

可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，你在网上查查就可以选出你要的内参

作者: cocacola 时间: 2013-9-6 11:28

多谢！我还想问一下，转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？

作者: birdfish 时间: 2013-9-6 11:29

你不是说

我想你的问题出在上样量上，是吗？如果你测一下蛋白总量，这样就好办得多。如我上所说：“sds-page蛋白的最大上样量， 30ug/mm2（载荷面），

如你的comb是1.0mm，宽5mm，即这个well的载荷面为5mm2，则最大上样量为150ug。”

测一下蛋白量。”

我的上样量没有超过最大值，但又出现那样的情况会是什么原因呢

“如果上样量少（5ul）的话，虽然小分子量看不清楚，但大分子量处条带挺清楚的
而上样量大（25+25ul，48+8ul）的话则条带都看不清楚
会不会是积层胶不够厚 ”

作者: woshituzhu 时间: 2013-9-6 11:30

我的样品的蛋白含量很底，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，这样的话增加上样量不是没有意义了，不知各位有没有碰到过？有什么办法。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:30

不是的，半干法推荐用衡流，一般跟据目的蛋白的大小来确定电流和时间，
你可以看看我前面的帖子。里面有说。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:32

你的buffer是否能把蛋白全部溶解呢？你可以试试15ul＋30ul（loading buffer），
还有，小分子蛋白本来量就少，“虽然小分子量看不清楚，但大分子量处条带挺清楚的” 是正常的。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:33

你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇

作者: gogo 时间: 2013-9-6 11:33

真好，我问一下；
我是作定量检测的，是不是用OPTIMAX软件就可以分析，但是就是搞不好，希望指教！

作者: loli 时间: 2013-9-6 11:34

那么，根据6KD,1mm胶，我应该采用多少豪安／cm2呢？能给我具体一点的建议吗？另外，我看到你提到过溴酚蓝和10KD蛋白跑在一起，那么我在电泳时是否注意不让溴酚蓝跑到分离胶的底部呢？曾经有人建议我用180mA,2小时转膜，你认为呢？

作者: biabiade 时间: 2013-9-6 11:34

你是说变性不完全吗？
蛋白本来就是液状的，煮过后基本一点不粘稠了
我试试看再说

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:35

我没有用过那个软件，用软件就能蛋白定量？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 11:35

0.4-0.6mA/cm2,, 30% SDS-PAGE,

“曾经有人建议我用180mA,2小时转膜，你认为呢？ ”

肯定不行

作者: utt0989 时间: 2013-9-6 15:04

我作western时碰到了一个问题：转膜时电压电泳仪的电压显示正常，但电流显示为0。我试了好几次都是这样。我用的是bio－rad的半干转印仪，六一的电泳仪。为什么会这样，请赐教。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:04

是否是衡压时电流小于最小值？

作者: 月牙牙 时间: 2013-9-6 15:04

不知做200KD 的目的蛋白你老人家有什么好方法？

作者: utt0989 时间: 2013-9-6 15:05

请问各位大侠，转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么东东，必须要加吗？还有Tris cl是不是就是用Tris和盐酸配出来的东东呢？

作者: mickeylin 时间: 2013-9-6 15:10

真不好意思，你上次说的话，我没有看懂。
还有，电泳时恒压比恒流能好多少呢？

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-6 15:10

真不好意思，你上次说的话，我没有看懂。

还有，电泳时恒压比恒流能好多少呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:23

你的意思是不是用Western Blot 测定 200kd的蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:29

转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。

tris－hcl就是tris盐用hcl调ph值，配置而成。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:32

200kd 可以用6％sds－page， semi-dry 3mA/cm2, 2-2.5hrs

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:34

你可以换一种方法测测蛋白含量

另外你可以先loading 10ul 的蛋白，电泳，染色看看蛋白量多不多

作者: mamamiya 时间: 2013-9-6 15:34

你真是一个无私的人！谢谢你对大家的帮助！
我也想请教一些问题，我想分离的蛋白是分子量260kd的，我应该用什么方法检测蛋白的浓度呢？SDS-PAGE电泳的分离胶浓度用5%可以吗？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作western吗？
各位大侠请不吝赐教！
一个蛋白质新手

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:34

测定蛋白浓度有很多方法，你可以根据实验室的条件来定，论坛上有很多，你查查就可以了。

260kd不好做，分离胶用6％就可以了， Stacking Gel 3.5％

作者: nvdabing 时间: 2013-9-6 15:44

我WESTERN时：

转膜用36V，18MA,20小时。

marker可以转上。

丽春红染色，膜上没有明显的条带，可见蛋白泳道影，向刷子刷得一样。

靠马斯亮蓝染胶，胶上仍可见蛋白条带。

孵育抗体后，未见明显条带，全是背景，也像刷子刷得一样。

不知问题处在那里？

谢谢！

作者: is2011 时间: 2013-9-6 15:44

如果超载了，要用什么方法来增加上样量，我的目的条带太弱了

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:45

你看看是否出在转移前的部分，如制样，电泳buffer，transfer buffer，上呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:46

如果超载了，要用什么方法来增加上样量，我的目的条带太弱了居然沉了

我不太明白你说什么？

作者: is2011 时间: 2013-9-6 15:48

我问的是“如果超载了，要用什么方法来增加上样量”

我需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚

作者: ladyhuahua 时间: 2013-9-6 15:48

现在我还在提蛋白阶段，我想用Trizol法提过RNA的组织碎片再提蛋白，已经试过几回，但提出的蛋白量不是很稳定，也不知道有没有我想要的这种大分子量蛋白，不过以后一定还有许多问题，不知道ptglab有什么建议吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:51

1.你可以浓缩样品
2.你可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
3.超载30％是不会有问题的。

作者: is2011 时间: 2013-9-6 15:53

我已经超了不少了，而且小分子量的也要

这样的话，是不是只能加大胶的厚度了？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:54

是的，你可以试试1.5mm的 comb

作者: is2011 时间: 2013-9-6 15:55

但是我已经用了，不知道还能不能再厚，好象厚胶效果不太好

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:56

一般是在转移上有差别，还有一个，你可否有办法提高你实验的灵敏度吗？

作者: xyw5 时间: 2013-9-6 15:57

我买的抗体说明书上说分离260kd用的是37.5:1(丙:双丙)的胶,这和29:1的胶有什么区别?谢谢!

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:57

有区别那个孔径更大，如果你不想重新配，你可以用5.5-6％的分离胶，我做过300kd的蛋白，效果也挺好的。

作者: ritou1985 时间: 2013-9-6 15:57

想向您请教几个问题。
我最近做了几次WB，但结果都不理想，DAB显色后出现的是一条比较连续的浅线，虽然线条出现的部位是我的目的蛋白应该在的位置，但每一泳道之间似乎没有间隔。而且我整张膜的背景非常黄，脏。
我在转膜后用丽春红染色出来的条带是清楚的，一抗建议稀释浓度是1：50~1：1000，我用的是1：50，4度孵育20小时，二抗建议稀释浓度是1：200~400，我用的是1：200，孵育过夜（大于12小时）。
一抗能回收再利用吗？回收的一抗应该保存在4度还是-20度？可以保存多久？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 15:58

你可以在你的封闭液，一抗稀释液，和2抗上找找问题。
一抗回收液在4％加防腐剂可以保持3－6月。

作者: 2541 时间: 2013-9-6 15:59

怎么会这样？我用的是多克隆抗体，跑胶只跑了两小时，太快了吗，哪个成分出了问题，DAB显色怎么这样。

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作者: 831226 时间: 2013-9-6 16:00

:我用的封闭液是5%的脱脂牛奶，用PBS配的，一抗，二抗用5%牛奶稀释，我用过一抗做免疫组化，结果很好，但WB的结果却信号很弱，这是为何？
另外我的二抗孵育时间是否过长？我看孵育时间有长有短，1.5~20小时不等，您觉得应该在多长时间好？谢谢您的指教！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:02

IHC是说明不了问题的，有很多假阳性，
2抗1小时就够了，
另外，你的一抗能做WB吗？
还有你上了阳性和阴性对照么？

作者: 831226 时间: 2013-9-6 16:03

我的一抗能做WB，且有人用这个抗体，这种稀释度作出来结果的。
阴性对照我作了，因为整个膜显色后背景不清晰，所以也看不太清楚。
阳性对照没做，请问阳性应该设什么？
我已经将我的丽春红显色及DAB显色的结果发到您的信箱，请帮我分析一下，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:05

你的Running Buffer，Transfer Buffer,是否成分是对的，还有你的DAB底物用的时候是否混匀了，是否操作上有问题，还有，你的DAB配的是否对

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:06

我看了你的结果，转移地挺好的，感觉你的一抗加的少了，2抗的孵育时间长了，1h就够了。
你最好问做出来的人要个阳性对照，判断结果起来方便一点。

作者: avi317 时间: 2013-9-6 16:07

最近做了一次PAGE（10％），用的是预染marker,发觉分子量大的条带正常，而跑前头的小分子marker则变窄，并且有两条是分不开，但考染发现样品的倒是正常的，请问是什么原因？
还有做WB电转的时候，多少层滤纸才是合适，太薄了会有什么影响？是不是最好用whatman的？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:07

你能否看看我前面的帖子，里面好象有提到这个问题，你看看是否是的。

作者: finger 时间: 2013-9-6 16:08

你好，请教：
我想用western的方法检测目的蛋白的表达。
拟采用的方案：接种8×10（5）的COS-7细胞于60mm的dish里进行转染，72小时后收集细胞。先用PBS洗2遍，用rubber police收集细胞（估计大约能收集200微升），然后加等量2×SBS上样buffer，煮沸5分钟。然后取20微升上样跑PAGE。没有这样做过，不知可行否？样品会不会太浓，太粘稠？
先谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:08

我觉得有点稀了，我喜欢10000000细胞用200-500ul的收集液，你可以把2×SBS换成5X的，这样可以体积少一点。

作者: finger 时间: 2013-9-6 16:08

我准备用polyfect做转染，试剂说明书建议的转染方案是在60mm的dish里种800000个COS-7细胞。你建议的细胞数目好像是在大flask里的，我因为看了一下分子克隆，里面说直接拿SDS上样Buffer煮细胞，会因为细胞内的DNA释放而使样品非常粘稠，分子克隆建议用超声处理，因为我没有处理过细胞标本，所以想请教，我想直接煮标本应该可以。谢谢！具体的试验还得再摸索，如果遇到问题，再请教您。

我觉得能解决他人的困难当然值得加分，就如同在检索SOS里一样，帮助一篇文献可以得一份，ptglab帮助不少的同志解决了问题，相比之下应该比贡献一篇文献要更有价值；而且不光是价值的问题，还有ptglab的热心，这个主题下这么多的回贴，版主是不是考虑一下。

作者: windy+++ 时间: 2013-9-6 16:09

我觉得能解决他人的困难当然值得加分，就如同在检索SOS里一样，帮助一篇文献可以得一份，ptglab帮助不少的同志解决了问题，相比之下应该比贡献一篇文献要更有价值；而且不光是价值的问题，还有ptglab的热心，这个主题下这么多的回贴，版主是不是考虑一下。

我也顶一下。
我觉得ptglab付出了那么多，应当得到更多的鼓励，虽然分数不是重要的，但是他这种默默无闻的奉献应当得到我们大家的承认。号召那些得到了ptglab帮助特别是真正解决了问题的同志们能够呼吁一下，我觉得这个要求也不过分。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:10

10000000,是在比较大的细胞培养瓶里做的,另外收集体积也是我个人的一个偏好, 所以建议你尽量是细胞裂解液浓一点,这样可以在上样时不会因为要上的细胞裂解液的体积太大而无法进行.

DNA释放出来最好能用超声波处理一下,比较快也效果也好. 水浴15-30mins也可以,但是不推荐.

作者: loli 时间: 2013-9-6 16:10

western的膜做过一次之后怎么存放呢？有的说干燥放，有的说湿着放，或者是泡在什么液体里？不知道怎么正确保存才可以再以后用的着的时候还能做出条带来？

谢谢。

作者: nn255 时间: 2013-9-6 16:11

你好，有一些问题想问一下各位高手，
1. 跑western，蛋白样品是否一定要煮过，
2. 我煮完以后，看到蛋白样品中有絮状的沉淀，这些是否蛋白还是其他东西。
附裂解液成分：50mm Tris-Hcl ph7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mm Nacl, 1mm EDTA, 1mm PMSF

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-6 16:12

有谁知道那里有抗HIF1大鼠抗体卖？有谁知道那里有HIF1全长基因得到？

作者: dog002 时间: 2013-9-6 16:13

武汉博士德公司有HIF-1抗体出售，HIF-1全长基因可以在 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide')上查询

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-6 16:13

我的目的蛋白，6KD，分泌性的一种激素。我用0.2 PVDF，半干电转25V35分钟，Marker上6.5KD的条带能够转移上去，但我的蛋白在6KD左右那个角上的膜会干掉，而且似乎看不到6KD的条带，难道分泌性的蛋白在胞浆内残留得如此至少，我必须用培养上清浓缩后的蛋白才能检测到马？文献上，检测这种蛋白水平多用的是放免，请教我的蛋白western 还做的出吗？

作者: avi317 时间: 2013-9-6 16:14

请教如何分离脑组织膜蛋白和胞浆蛋白？

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-6 16:14

请问从哪里能买到抗大鼠心肌L型钙通道各亚单位的多克隆抗体？我只查到抗α1亚单位的抗体，至今没找到抗β和抗α2/δ亚单位的抗体，您能帮忙查一下吗？谢谢。

作者: bs4665 时间: 2013-9-6 16:14

最近做GST融合蛋白的WB,我的蛋白表达量很低，加大了上样量，延长了时间，2.5h,转膜后染胶发现目的条带几乎还在，而其它部分都已转移，用的是GST多抗，结果只有GST对照有条带。这是怎么回事？我第一次是用我目的条带的单抗做的，发现也是转不动，但最后有弱条带出现。是转膜有问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:15

可以干放，没有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:16

1. 一般跑变性胶是要煮的，非变性胶不用煮。
2. 是否蛋白浓度太大，或是有其他什么成分在里面？应该是不会有沉淀的

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:17

要想区分开膜蛋白和胞浆是比较困难的，一般是用密度梯度离心得到相应的膜蛋白，另一份再做膜蛋白和胞浆蛋白的混合物

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:17

小分子的蛋白是分泌量很少，如果你能增大上样量，在转移时多加一倍的甲醇，降低电压，延长时间，是否会好一点。

作者: yychen 时间: 2013-9-6 16:17

请问做WB的玻璃板是特制的还是普通玻璃制造的，只要尺寸大小合适就行？我们实验室原装的玻璃板已打烂得差不多了！谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:18

是做SDS-PAGE用的玻璃吧，一般的肯定不行，要用硅化玻璃。六一厂可买。

作者: wmp1234 时间: 2013-9-6 16:18

我正准备做Western，能得到高手的指点太好了！我要测的TGF-bata1的浓度用ELISA测定只有几百个pg/ml,不知能否得到阳性结果？听说可以将样本浓缩后检测，但不知如何进行，又如何保持各样本浓缩倍数的一致？请指教。

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-6 16:19

是做SDS-PAGE用的玻璃吧，一般的肯定不行，要用硅化玻璃。六一厂可买。

请问六一厂的具体地址？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:23

你不用要求每一份样品的浓缩倍数一致，你只要让每一个well上的蛋白总量相同就可以了，

你可以根据自己的条件来选择相应的浓缩方法，你在论坛里可以找到很多种，选哪种就看你的实验条件和要求了。

作者: kuohao17 时间: 2013-9-6 16:24

我还是不太明白。我的疑问是干预前后的各组样本浓缩后检测当然可能有阳性结果，但是如何保持其相互间的可比性？有浓缩后做Western检测的相关文献吗？真想打电话给你问个清楚，不知能否打扰你呢？

作者: langlang 时间: 2013-9-6 16:29

我要取小鼠和人的标本做western，一抗用同时抗人和抗小鼠的，还是单独抗鼠和抗人的好呢？从效果上讲。

作者: yonger 时间: 2013-9-6 16:31

你好，最近我也在做Western，蛋白是我重组克隆的原核表达的蛋白，我将细菌用IPTG诱导后煮了跑电泳，湿转膜，用小牛血清4度封闭过夜，加的一抗是单抗，但是显色时发现有菌体蛋白也显色了出现杂带，想请教这是为什么？急盼你的回复！谢谢！

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-6 16:32

湿式转印用丽春红染色怎么染不出来

作者: youyou99 时间: 2013-9-6 16:35

您好，有问题请教：
1. 怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要（按您前面的上样量标准，我想偷懒，所以想根据western的结果再调整），罐胶有什么技巧吗？想跑漂亮,是不是应该先小电压,再高电压,总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带漂亮些?
2. 我看了您前面的帖子,对于分离胶的浓度,好像您推荐的浓度都要比其它的protocol推荐的高一些.依照您的经验,我想同时blot两种蛋白(50kd的SARS nucleocapsid protein及它的160kd的融合蛋白),我可否用6%的分离胶同时做blot? 那么转移的时候,我用恒流2.0 mA/cm2,转2小时,可以吗?
3. 看了前面的帖子,好像有种印象是: 转移的时候,小分子量容易转移,大分子量难转移,大分子量蛋白和小分子量蛋白的转移是有一些矛盾的, 是吗?为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?
4. 另外汇报一下上次western的结果及经验教训:上次转染了1.6*106细胞,收集,收集到了400微升体积,加6*loading buffer, 95度煮5分钟,-20度,交替3次,离心,上样,7%分离胶,先80v跑进分离胶,在100v电泳至溴酚兰出胶,biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟,预染marker全部进膜,转移后的胶考马斯亮兰染,可见残留的蛋白带,大分子量多些.blot时,封闭用5%奶粉TTBS 1小时,抗体稀释液TTBS,一抗(1:10,单抗上清,2000年制备)1小时,二抗(1:2000)1小时,均在室温.结果,50kd的小分子显色,160kd大分子未显色.
原因分析及准备改进:转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低,大分子量表达也会相对较低,加上大分子量蛋白的转移不完全,可能是我没有拿到大分子量条带结果的原因.另外背景稍微有一些脏(背景整体均匀一致),估计是二抗的浓度高了些,准备降至1:5000,另外抗体稀释液准备改用5%奶粉TTBS.封闭改为室温2小时.等有时间我把western-blot的结果照片扫描了发上来.
我准备明天在试验一次,现在已经很晚了,不知明天做的时候,能否得到您的指导.
先谢谢了,一次就想从您那里得到这么多的信息和经验,真是不好意思!

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作者: fsdd817 时间: 2013-9-6 16:36

请问六一厂的具体地址？

=======================================================

六一厂:北京市阜外定慧西里17号 100036
销售服务热线：（010）88121538 88141391 88136620
　　　　　　　　　　技术服务热线：（010）88141386（电泳仪电源）
　　　　　　　　　　　　　　　　（010）88125929-17（电泳槽）
　　　　　　　　　　　　　　　　（010）88123710-18（紫外分析仪）
　　　　　　　　
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作者: fsdd817 时间: 2013-9-6 16:37

你好：请问蛋白稀释的话是用双蒸水还是什么？谢谢！

作者: abc816 时间: 2013-9-6 16:38

蛋白稀释不能直接用水吧？离子浓度太低了。

作者: finger 时间: 2013-9-6 16:39

蛋白稀释不能直接用水吧？离子浓度太低了。

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那具体用什么稀释呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:39

我不知道你所说的可比性是个什么概念？

你可以浓缩后测定蛋白浓度，平均上样量，
有条件可以加上内参。

应该是你要的答案吧

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:39

因该没有好坏之分，只要都能识别人，鼠的蛋白就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:41

你用的是那个抗体？anti－his or anti Gst,

出现杂带是正常的，单抗也不是就能避免。

还有杂带是否是降解带？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:41

你的转移效果好吗？
染了胶吗？

用考马思亮兰染有颜色吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:45

对于第一个问题：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：
1. 电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。
2. 胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

第二，可以用， 2.0-3.0mA/cm2, 2hrs
第三，小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

对于第四个问题，我想你是不是要问：“我要检测的抗原（蛋白）是160kd的，但是结果只有50kd的那条带，同时，背景又相对来说比较干净，条带比较清楚，想请你给我提点建议”，是吗？
首先分析你的整个实验步骤。我发现了两个比较大的毛病：
1. 一抗用TBST稀释。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相一致，这样可以降低背景。你大概也意识到了，？
2. “biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟”，你是这么做的吗？因为我大部分时间是做的恒流转移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法，我不是很肯定你转30分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去。我建议你最好能将时间延长，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒压，可摸索一下，适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你，因为marker的量比较大，是很容易转上去的，实际上目标蛋白的量远远少于marker量。
我对你的结果分析如下：
1. 你的结果很好，估计离目标不远了，很快就可以成功。
2. 没有160kd的带是因为你的转移时间过短，适当延长转移时间（我怀疑这是主要的问题）。
3. 你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景会低一点。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:46

你用PBS稀释，或用其他的缓冲液，这要看你用什么样的离子，不会影响你的实验结果

作者: yes4 时间: 2013-9-6 16:46

相关疾病：
电击伤
感谢您的热心帮助！看到你一直使用“to XXX”，如果你喜欢，可以试一下点击要回复人的贴子上方的“quote”，这样就可以同时看到原贴。

作者: qqq111 时间: 2013-9-6 16:49

做半定量人卵巢癌细胞系的WB，内参B-actin，GAPDH,那个好？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:49

你用beta-actin就可以了

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-6 16:50

你用PBS稀释，或用其他的缓冲液，这要看你用什么样的离子，不会影响你的实验结果

谢谢您的回答，但我还是不太明白你说的“要看你用什么样的离子，不会影响你的实验结果”这句话的意思。

作者: daod 时间: 2013-9-6 16:51

我以前采用的15v 30分钟是biorad的半干转移说明建议的，这次我按2mA/cm2，2小时，转移的效果没有明显的改善。我再想办法改进。
其它的建议我已采纳，等我得到一张漂亮的western结果，我会放在这里的。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:52

意思是你采用的缓冲液中的离子，（如PBS中是磷酸根离子，钠离子，氯离子等等）不会对你的实验有影响，如果你要用蛋白的氨基跟某种物质连接则不能在缓冲液中有氨基，如不能加tris。

作者: lxh031 时间: 2013-9-6 16:54

我的浓缩胶开始2次是有效的,近2次就不行了,上样后有多长在跑到底端就有多长

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:55

还有一种可能，是你160kd的蛋白含量比50kd的少很多，不易检测，你是加的是什么一抗？
有可能是50kd的蛋白把大部分的一抗都结合完了？
分开做是否会好一点？

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-6 16:55

请问这浓缩胶到底出了什么问题啊?

作者: damingxia0904 时间: 2013-9-6 16:57

还有一种可能，是你160kd的蛋白含量比50kd的少很多，不易检测，你是加的是什么一抗？
有可能是50kd的蛋白把大部分的一抗都结合完了？
分开做是否会好一点？

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有可能！
我在一张膜上同时跑三个样本，一个是lamp蛋白（120kd），一个是Necleocapsid蛋白（45kd），另外一个是Lamp－Nucleocapsid融合蛋白（165kd），我的一抗是抗nucleocapsid蛋白的，结果应该是有一个泳道在165kd处显色，一个在45kd处显色，另外一个是阴性。从理论上将，165kd蛋白的表达两应少于45kd的。
我有做了次western，结果还不错，大分子量蛋白有些降解（估计不是处理标本造成的，可能和Lamp分子的特性有关）。我准备再重复一次，做张更漂亮些的。
谢谢

图片附件: 99592421.jpg (2013-9-6 16:57, 14.56 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18074

作者: NBA 时间: 2013-9-6 16:57

不一定是浓缩胶出了问题，可能是你的缓冲体系的问题，一般的你将胶染色看看分离效果就知道了。

作者: utt0989 时间: 2013-9-6 16:58

我遇到一个问题，昨晚做的有点晚，也是第一次作wb，不小心把一抗稀释液的牛奶浓度由5%升到50%，请教我的一抗能不能结合

道膜上，有没有必要继续显色，急切等待你的回答。

作者: zhezhe 时间: 2013-9-6 16:59

我用的一抗是针对我原核表达的细胞因子的单抗，不是针对载体蛋白的抗体，所以出现杂带才另我不解，不表达的空菌对照也有带，当然与我的目的蛋白不在一个位置，这是另我比较欣慰的。是我的二抗加的太大了吗？

作者: bs4665 时间: 2013-9-6 16:59

请问我要从培养的细胞中提取一个跨膜的蛋白质分子，应该用什么样的裂解液？还是直接用高速离心？膜蛋白的提取方法跟别的蛋白不一样吗？哪里才能找到这方面的资料，我一直查不到，急盼答复，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:00

单抗的筛选是个很复杂的问题，有很多的单抗也有杂带的，这点你要清楚，

你降低2抗的浓度，加强洗脱，非特异的带会减少

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-6 17:00

我的单抗，效价1:1000,你看怎么样

作者: ffooll 时间: 2013-9-6 17:01

按2D凝胶电泳中提取膜蛋白的方法提取的膜蛋白能否用于一般的SDS-PAGE?

作者: fsdd817 时间: 2013-9-6 17:02

转个摘要。不知对大家有用吗？

Electrophoresis. 1992 Jan-Feb;13(1-2):59-64.

High yield electroblotting onto polyvinylidene difluoride membranes from polyacrylamide gels.

Mozdzanowski J, Hembach P, Speicher DW.

Optimal conditions of electroblotting that led to high protein recovery on polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes were determined for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). SDS concentrations in the gel and transfer buffer were found to be the most important factors affecting the amount of protein recovered on the PVDF membrane. The largest loss occurred during the first 10-30 min of transfer due to the relatively high initial SDS concentration in the gel. During this initial stage of transfer, most of the protein passed through the primary membrane and was partially retained on secondary and tertiary membranes. The value of presoaking gels prior to transfer to reduce the amount of SDS was evaluated by quantitating free SDS densitometrically and by correlating the reduced SDS concentration with increased electroblotting efficiency from presoaked gels. Transfer time was evaluated and no "overtransfer" was found even after very long transfer times. These results clearly indicate that proteins electroblotted onto PVDF membranes were tightly bound and could not be released by extending the transfer time. The effects of methanol and SDS concentrations on protein adsorption from solution to PVDF were also determined quantitatively. The results of this study strongly suggest that proteins fully saturated with SDS cannot bind efficiently to PVDF membranes. Since SDS is necessary for high protein mobility, the challenge in efficient electroblotting is to maintain an optimal SDS concentration which is high enough to permit effective removal from the gel and low enough to permit effective binding to the PVDF membrane. For 1.5 mm thick gels containing 0.2% SDS, presoaking the gel for 15-20 min in transfer buffer with 10% methanol prior to electroblotting provided the best recovery on the primary membrane.

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:02

如果是单抗，一般是不太好的，但都到这一步了，就试一下吧。

你是按1：1000稀释的吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:02

从你的实验结果看是你的蛋白转移的问题，

你要是想做个比较漂亮的图，我的建议是，选用10－11％的SDS－PAGE，上样量加大一倍，电泳是尽量小电压，（70-80V），
转移时用衡压，28V-36V ， 4－15小时，一般来说就可以了，

你要有问题可以打给我。你留个电话给我也可以。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-6 17:03

从来没作过，想作。请问国产的仪器好用吗？到哪里可以查到。
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:04

我们从来没有用过国产的仪器，听说六一厂的还可以，你看看我前面的帖子里有提到。

作者: 04906 时间: 2013-9-6 17:04

我想请教个问题,我做过好几次western,但总是显色目的条带又细又浅.我的靶蛋白是27KD的bcl-xl和c-myc 67KD,从理论上来说我做的肿瘤细胞应该是高表达.我每个涌道上50-70ug蛋白,开始用半干转移,后来用湿转14v,16h,用PVDF膜转移.胶转移后染色检测,发现小分子量的基本转移走了,可是为什么条带老是不粗不浓呢?

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:04

1.可能跟你的一抗有关系，还有你说因该高表达，那你做的阳性对照是否是高表达呢，
2.还有跟抗原量相关，你多上点蛋白会好的多，
3.跟显色条件相关

作者: INK 时间: 2013-9-6 17:04

请教前辈：
我准备做大鼠脑子的WB，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:06

1.你可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，

2. 你可以加NaF防止去磷酸化

作者: glass 时间: 2013-9-6 17:06

您好！我想请教一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？

受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

作者: yhz1973 时间: 2013-9-6 17:07

请教前辈：
1. 从心肌组织中提小分子蛋白（8－12KD）能否用下列配方：终浓度0.1mol/l
NaCL,0.01mol/lTris-cl(PH7.6),0.001mol/lEDTA,1mg/l aprotinin,100mg/l PMSF?
2.细胞裂解液应按什么比例加入后匀浆？
3.NC膜和PVDF膜有什么区别？

作者: lxh031 时间: 2013-9-6 17:07

这几天在做western，结果是出来啦，但是杂带太多，有得尽然比我的目的条带还亮。通过减低上样量，加强洗脱，降低二抗浓度（1：3000），缩短曝光时间，还是不行。我的一抗是多抗，除了换抗体，有无其他办法解决此问题。

作者: plaa 时间: 2013-9-6 17:08

最近我在做Western，但结果一直不理想，出来的只是浅浅的带，甚至现在什么条带也没有了！我每次转膜后都用了立春红染色，出现的蛋白条带还是很清晰，唯一的一点是在我需要的分子量附近并没有很清晰的条带出现，只是很模糊的多条带，是不是从这里就可以推断出我的结果就会不理想！郁闷中，请您指教！！！！！谢谢您

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:08

“我想请教一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？

受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？”

一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。

除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:09

请教前辈：
1. 从心肌组织中提小分子蛋白（8－12KD）能否用下列配方：终浓度0.1mol/l
NaCL,0.01mol/lTris-cl(PH7.6),0.001mol/lEDTA,1mg/l aprotinin,100mg/l PMSF?
2.细胞裂解液应按什么比例加入后匀浆？
3.NC膜和PVDF膜有什么区别？

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1. 你提小分子蛋白是来提纯还是来做WB？我觉得怎么都该用点去垢剂。
2. 一般我们不是加裂解液后匀浆的，我们加PBS匀浆，原因自己试试就知道了。
3.NC和PVDF膜的区别你在网上查查资料就知道了。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:09

这几天在做western，结果是出来啦，但是杂带太多，有得尽然比我的目的条带还亮。通过减低上样量，加强洗脱，降低二抗浓度（1：3000），缩短曝光时间，还是不行。我的一抗是多抗，除了换抗体，有无其他办法解决此问题。

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当然有办法了，（公司机密，不能公开）不过我要根据你实验的过程才能决定是否对你的实验有帮助。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:10

最近我在做Western，但结果一直不理想，出来的只是浅浅的带，甚至现在什么条带也没有了！我每次转膜后都用了立春红染色，出现的蛋白条带还是很清晰，唯一的一点是在我需要的分子量附近并没有很清晰的条带出现，只是很模糊的多条带，是不是从这里就可以推断出我的结果就会不理想！郁闷中，请您指教！！！！！谢谢您

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不是的，因该没有问题，要知道大部分目的蛋白含量少因该是看不到的，只要你目的蛋白前后的蛋白转移地都很好就可以了。

作者: H2O 时间: 2013-9-6 17:10

请问您用过BIOTEKEXL800型酶标仪测蛋白标准曲线，请告诉我其设定及检测程序好吗？

作者: ha111 时间: 2013-9-6 17:11

极其郁闷中。来此请教。
WB没有任何结果是怎么回事。
最近做了四次WB，只做出来一次。因为是初学，所以我先按照师兄的方法做的。偶看了一下做的过程觉得也没有太多的技巧，但就是得不到结果。师兄一直做得很好，因此一抗二抗肯定没问题。转膜也没问题，用丽春红染色能明显看到蛋白带。之后，我用双蒸水洗膜三次------5%的脱脂奶粉(PBS中)封闭1小时----加入一抗(5%脱脂奶粉溶解在PBS中)，室温温育2小时------用PBS洗三次-----用Tris-HCl-NaCl---洗一遍-----加入二抗(5%脱脂奶粉溶解在Tris-HCl-NaCl中)，室温温育1小时----Tris-HCl-NaCl洗四遍-----ECL检测,爆光10分钟。另外显影液和定影液也没问题的。
谢谢啦!

作者: mimili_901 时间: 2013-9-6 17:12

这几天在做western，结果是出来啦，但是杂带太多，有得尽然比我的目的条带还亮。通过减低上样量，加强洗脱，降低二抗浓度（1：3000），缩短曝光时间，还是不行。我的一抗是多抗，除了换抗体，有无其他办法解决此问题。

当然有办法了，（公司机密，不能公开）不过我要根据你实验的过程才能决定是否对你的实验有帮助

不是吧？大佬！这样吧，我给你发个email，把我的试验过程告知，恳请能得到你的解答，非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:13

你是没有任何带，还是什么问题？

从你的步骤上看问题不大，一抗2抗的稀释度有可能出错吗，你是跟你师兄用同一种一抗，二抗吗？你的制样有没有问题呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:13

我看了你的步骤，我们的方法对你没有什么用，所以建议你只对目的蛋白爆光。（如果不换抗体的话）

作者: mimili_901 时间: 2013-9-6 17:22

我看了你的步骤，我们的方法对你没有什么用，所以建议你只对目的蛋白爆光。（如果不换抗体的话）

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这段时间我也想这样作，或电泳时间长一些，把我目的条带前面的杂带跑出去，但我总觉的有做假之嫌。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:23

如果你能确定是杂带，那么要怪只能怪抗体不好，跟你实验无关，这可不是作假。

你能确定是杂带，而不是其他什么东西吗？（比方说前体，剪切后的产物之类

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-6 17:24

你是没有任何带，还是什么问题？
从你的步骤上看问题不大，一抗2抗的稀释度有可能出错吗，你是跟你师兄用同一种一抗，二抗吗？你的制样有没有问题呢？

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谢谢NBA稀释度没问题。我现在也怀疑是样品本身的问题。

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-6 17:25

我们刚开始作WESTERN 听说从细胞提取的蛋白浓度比较低想配制6×上样缓冲液我手上只有2×的配方希望高手能告诉我6×的配方不甚感激！

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-6 17:26

最近作了两次WESTERN,不但没阳性结果，显色背景都没有！！！！
烦！电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。
（1）检测GAD--分子量67kd,提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。
（2）一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？
（3）第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。
（4）封闭液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 0.1%，不会是封闭液的问题吧？
western高手，救命啊！！！

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-6 17:26

更正一下：封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,上面是漂洗液！！

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:27

你把你2X的配方乘3就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:27

你可否在下面几个问题上找找原因。
1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）
2. 看看一抗是否能work，降到1：20。
3. 看看2抗是否有问题。

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-6 17:27

谢谢！我试一下。
其实作之前已经在看你给别人解答了，有你在真是我们western新手族的福音。

作者: greenbee 时间: 2013-9-6 17:28

大家有谁知道在做western时间,PBDF膜用甲醇浸泡的目的，不好意思
我不是很懂，问这么幼稚的问题，大家不要见笑。

作者: fei1226com 时间: 2013-9-6 17:29

请教：蛋白变性后可以存放多久？

作者: linlinstar 时间: 2013-9-6 17:30

我是一点都不懂基础研究的，身边没人指导，苦不堪言，有很多问题：
1。细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够WB？提蛋白的东东有现成的KIT吗？
2。我做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求，哪种二抗即便宜又好？
3。同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WB有无影响?
4.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
5。对初学者看什么资料最好？

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:30

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，
做小分子的蛋白转移是多加甲醇也是这个目的。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:33

－80度，一两年没有问题。
最关键两条，
1.不要被蛋白酶水解掉，
2.不要被细菌消化掉(也是被酶水解了）

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:33

1。细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够WB？提蛋白的东东有现成的KIT吗？
一般.5* 10（6）就足够了。
2。我做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求，哪种二抗即便宜又好？
对2抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的2抗。公司就选用ptglab的2抗吧，很好用。
3。同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WB有无影响?
能，没有问题，我们做过。
4.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
当然能了，我们公司可以同时测20种样品
5。对初学者看什么资料最好？
《抗体技术实验指南》

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:34

1.《抗体技术实验指南》
2. antibady

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-6 17:35

我目前研三在读，但课题才刚刚完成模型和整体实验部分，接下来老板又要求采用Western－blot的方法对我所检测的蛋白进行半定量，真是一头雾水,还请前辈千万多帮帮我，本人将不胜感激！
1.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
2.但我还是照着做了，结果是有的，但非常不稳定。有时条带清晰，有时很散,不知为何？
3.我原先采用的显色方法是Ecl，但洗出来的片子有时很清晰，有时又非常糊，或者乱七八糟，不知这和转膜时滤纸的厚度是否有关，或者是因为我的滤纸反复使用，影响了转膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分钟一次，洗三次，TBS。
4.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，不能再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？不知前辈是否有比较成熟的方案以供参考？
sos！sos! sos!

作者: yychen 时间: 2013-9-6 17:36

紧急求助！！！我最近做了一次WB，结果很奇怪，背景是中棕色的，而转上的蛋白带是白色的，与正常显色恰恰相反，我简直是哭笑不得。我买的一抗是单抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做时有目的带，但是由于有杂带，怀疑抗体加多了就将了一下浓度，结果出现了这么怪的问题。请ptglab
高手及其他同志帮帮在下。

作者: uaubc 时间: 2013-9-6 17:38

我目前研三在读，但课题才刚刚完成模型和整体实验部分，接下来老板又要求采用Western－blot的方法对我所检测的蛋白进行半定量，真是一头雾水,还请前辈千万多帮帮我，本人将不胜感激！
1.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
2.但我还是照着做了，结果是有的，但非常不稳定。有时条带清晰，有时很散,不知为何？
3.我原先采用的显色方法是Ecl，但洗出来的片子有时很清晰，有时又非常糊，或者乱七八糟，不知这和转膜时滤纸的厚度是否有关，或者是因为我的滤纸反复使用，影响了转膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分钟一次，洗三次，TBS。
4.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，不能再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？不知前辈是否有比较成熟的方案以供参考？
sos！sos! sos!

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１，上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为１０５ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置．
２，可能原因：样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散；转移缓冲液甲醇浓度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）
３，您指的模糊是说背景高还是条带模糊？
４，不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

作者: uaubc 时间: 2013-9-6 17:39

紧急求助！！！我最近做了一次WB，结果很奇怪，背景是中棕色的，而转上的蛋白带是白色的，与正常显色恰恰相反，我简直是哭笑不得。我买的一抗是单抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做时有目的带，但是由于有杂带，怀疑抗体加多了就将了一下浓度，结果出现了这么怪的问题。请ptglab
高手及其他同志帮帮在下。

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WB所需抗体浓度应按说明书，一般为1：1000左右，有些适于做ELISA的抗体不一定适于做WB，一抗与二抗需配套使用，背景高可能是封闭不够。

作者: uaubc 时间: 2013-9-6 17:40

我所指的是背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡，实在苦恼。另外，我pvdf膜是用甲醇预处理的，但处理后我立刻就将膜放进转膜缓冲液内，不知是否有影响。

作者: gemei0115 时间: 2013-9-6 17:41

我用半干式转移40分钟，为什么分子量大的marker不能完全转上去

作者: gemei0115 时间: 2013-9-6 17:41

"我所指的是背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡，实在苦恼。"

这跟你washing的时间和强度有关，你看看是不是这方面没有掌握好。
显影时间是有范围的，久了肯定不行。

那样处理PVDF膜没有影响。

作者: kuaizige 时间: 2013-9-6 17:43

相信你的建议对我的试验一定有帮助。
另外，我还想请问您是否知道谁的Westernblot是用DAB成色的，另外，采用的是亲和素生物素体系，即一抗，二抗，ABC复合物，DAB显示，如果有，请教一下实验条件或具体步骤，感谢！

作者: biabiade 时间: 2013-9-6 17:44

做wb加阴性对照是否有必要，具体上是不是样品条带与阴性对照没有区别就能说明是非特异条带

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:44

是否加阴性对照要看实验的具体要求，对一些没有预计的条带的解释是大不一样的。

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:45

我们没有用这套系统，我们喜欢用的是HRp＋ECL，

你是否是想将结果放大，增加灵敏度？

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-6 17:45

那么能不能说具体会出现那些情况呢
我是用兔源的一抗孵育，另一份同样的样品加兔的血清
但得出的条带是一样的
我用的蛋白是组织总蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-6 17:45

从这里看，你的一抗因该还不能work,
但是你能否确认，的蛋白样里目的蛋白有，且含量还可以。你有阳性对照吗？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-9-6 17:53

你好，又作了一次，用含5%奶粉TBST封闭，TBST稀释一抗及二抗，漂洗，ECL发光试剂盒检测。显影3分钟。
（1）结果:在70KD附近有很弱的条带。(几乎不能辨别)除了一抗不好，还会有其他什么原因吗？（转膜用100伏80分钟，转膜温度最后70度？蛋白提取有问题？）
（2）还有，背景不是很均匀，这是很正常的吗？能达到均匀一致的背景吗？
（3）TBST中TWEEN-20浓度为0.02%,他们用的是1%，差别大吗？

作者: mamamiya 时间: 2013-9-6 17:53

－80度，一两年没有问题。
最关键两条，
1.不要被蛋白酶水解掉，
2.不要被细菌消化掉(也是被酶水解了）

还想请教，如果在4度放置又可以放置多久？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:12

1。细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够WB？提蛋白的东东有现成的KIT吗？
一般.5* 10（6）就足够了。
2。我做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求，哪种二抗即便宜又好？
对2抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的2抗。公司就选用ptglab的2抗吧，很好用。
3。同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WB有无影响?
能，没有问题，我们做过。
4.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
当然能了，我们公司可以同时测20种样品
5。对初学者看什么资料最好？
《抗体技术实验指南》

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:31

1.《抗体技术实验指南》

2. antibady

作者: leifengta 时间: 2013-9-9 12:43

我目前研三在读，但课题才刚刚完成模型和整体实验部分，接下来老板又要求采用Western－blot的方法对我所检测的蛋白进行半定量，真是一头雾水,还请前辈千万多帮帮我，本人将不胜感激！
1.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
2.但我还是照着做了，结果是有的，但非常不稳定。有时条带清晰，有时很散,不知为何？
3.我原先采用的显色方法是Ecl，但洗出来的片子有时很清晰，有时又非常糊，或者乱七八糟，不知这和转膜时滤纸的厚度是否有关，或者是因为我的滤纸反复使用，影响了转膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分钟一次，洗三次，TBS。
4.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，不能再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？不知前辈是否有比较成熟的方案以供参考？
sos！sos! sos!

作者: jkobn 时间: 2013-9-9 12:44

紧急求助！！！我最近做了一次WB，结果很奇怪，背景是中棕色的，而转上的蛋白带是白色的，与正常显色恰恰相反，我简直是哭笑不得。我买的一抗是单抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做时有目的带，但是由于有杂带，怀疑抗体加多了就将了一下浓度，结果出现了这么怪的问题。请ptglab
高手及其他同志帮帮在下。

作者: flower-201 时间: 2013-9-9 12:45

我目前研三在读，但课题才刚刚完成模型和整体实验部分，接下来老板又要求采用Western－blot的方法对我所检测的蛋白进行半定量，真是一头雾水,还请前辈千万多帮帮我，本人将不胜感激！
1.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
2.但我还是照着做了，结果是有的，但非常不稳定。有时条带清晰，有时很散,不知为何？
3.我原先采用的显色方法是Ecl，但洗出来的片子有时很清晰，有时又非常糊，或者乱七八糟，不知这和转膜时滤纸的厚度是否有关，或者是因为我的滤纸反复使用，影响了转膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分钟一次，洗三次，TBS。
4.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，不能再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？不知前辈是否有比较成熟的方案以供参考？
sos！sos! sos!

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１，上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为１０５ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置．
２，可能原因：样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散；转移缓冲液甲醇浓度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）
３，您指的模糊是说背景高还是条带模糊？
４，不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

作者: flower-201 时间: 2013-9-9 12:45

紧急求助！！！我最近做了一次WB，结果很奇怪，背景是中棕色的，而转上的蛋白带是白色的，与正常显色恰恰相反，我简直是哭笑不得。我买的一抗是单抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做时有目的带，但是由于有杂带，怀疑抗体加多了就将了一下浓度，结果出现了这么怪的问题。请ptglab
高手及其他同志帮帮在下。

=========================================================================================================

WB所需抗体浓度应按说明书，一般为1：1000左右，有些适于做ELISA的抗体不一定适于做WB，一抗与二抗需配套使用，背景高可能是封闭不够。

作者: leifengta 时间: 2013-9-9 12:47

指的是背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡，实在苦恼。另外，我pvdf膜是用甲醇预处理的，但处理后我立刻就将膜放进转膜缓冲液内，不知是否有影响。

作者: moonlight45 时间: 2013-9-9 12:49

我用半干式转移40分钟，为什么分子量大的marker不能完全转上去

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:50

"我所指的是背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡，实在苦恼。"

这跟你washing的时间和强度有关，你看看是不是这方面没有掌握好。
显影时间是有范围的，久了肯定不行。

那样处理PVDF膜没有影响。

作者: leifengta 时间: 2013-9-9 12:51

相信你的建议对我的试验一定有帮助。
另外，我还想请问您是否知道谁的Westernblot是用DAB成色的，另外，采用的是亲和素生物素体系，即一抗，二抗，ABC复合物，DAB显示，如果有，请教一下实验条件或具体步骤，感谢！

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-9 12:51

做wb加阴性对照是否有必要，具体上是不是样品条带与阴性对照没有区别就能说明是非特异条带

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:52

QUOTE:

原帖由 tangxin_80 于 2013-9-9 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做wb加阴性对照是否有必要，具体上是不是样品条带与阴性对照没有区别就能说明是非特异条带

是否加阴性对照要看实验的具体要求，对一些没有预计的条带的解释是大不一样的。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:52

我们没有用这套系统，我们喜欢用的是HRp＋ECL，

你是否是想将结果放大，增加灵敏度？

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-9 12:53

那么能不能说具体会出现那些情况呢
我是用兔源的一抗孵育，另一份同样的样品加兔的血清
但得出的条带是一样的
我用的蛋白是组织总蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-9 12:53

从这里看，你的一抗因该还不能work,
但是你能否确认，的蛋白样里目的蛋白有，且含量还可以。你有阳性对照吗？

作者: Ao7 时间: 2013-9-9 12:56

你好，又作了一次，用含5%奶粉TBST封闭，TBST稀释一抗及二抗，漂洗，ECL发光试剂盒检测。显影3分钟。
（1）结果:在70KD附近有很弱的条带。(几乎不能辨别)除了一抗不好，还会有其他什么原因吗？（转膜用100伏80分钟，转膜温度最后70度？蛋白提取有问题？）
（2）还有，背景不是很均匀，这是很正常的吗？能达到均匀一致的背景吗？
（3）TBST中TWEEN-20浓度为0.02%,他们用的是1%，差别大吗？

作者: bamboo16 时间: 2013-9-9 12:56

－80度，一两年没有问题。

最关键两条，

1.不要被蛋白酶水解掉，

2.不要被细菌消化掉(也是被酶水解了）

还想请教，如果在4度放置又可以放置多久？

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-9 12:57

有的，阳性对照出来了

作者: leifengta 时间: 2013-9-9 12:59

谢谢指教！我的条带已经出来了，使用的是亲和素生物素体系，我想也许是灵敏度提高了的关系，因为我原来没有加ABC复合物，但不满意的是在50~60KD的地方出现非特异条带，不知这是否与我的一抗是多克隆有关，还有其他可能吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:01

（1）结果:在70KD附近有很弱的条带。(几乎不能辨别)除了一抗不好，还会有其他什么原因吗？（转膜用100伏80分钟，转膜温度最后70度？蛋白提取有问题？），你可以降低电压，延长时间，加冰转移。还有可能是你的目的蛋白的含量太少了，有含量较高的目的阳性对照吗？
（2）还有，背景不是很均匀，这是很正常的吗？能达到均匀一致的背景吗？
（3）TBST中TWEEN-20浓度为0.02%,他们用的是1%，差别大吗？
2和3是可能联系起来的，你换用0.2-0.5％tbst试试。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:06

3 months is ok,

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:06

有可能是抗体的问题，但是不会有影响。
也有可能是前体，同源蛋白等

作者: fei1226com 时间: 2013-9-9 13:07

请问膜蛋白用什么做内参，如用胞浆蛋白actin，如何提蛋白，如何加样

作者: 算盘阿星 时间: 2013-9-9 13:07

脑组织中膜蛋白提取，我想做Western。上次做了一次，条带没跑出来，请问有没有什么好的提取方法，用什么裂解液？
急！！！！！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:09

QUOTE:

原帖由 算盘阿星 于 2013-9-9 13:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
脑组织中膜蛋白提取，我想做Western。上次做了一次，条带没跑出来，请问有没有什么好的提取方法，用什么裂解液？
急！！！！！

你用改良的ripa裂解液就很好了，你查一下

作者: utt0989 时间: 2013-9-9 13:11

尊敬的老师:
你好!请求你给予帮助:
首先感谢各位老师将给予我的帮助！近日我用Invitrogen公司的P.methanolica Expression Kit做一个分子量大约是130KD目的基因蛋白质表达。我有问题如下：
一、能够经电穿孔转化后在MD平板上长出的酵母菌落，是否都是或者基本上是已经转化了载体质粒或重组子质粒的转化子？我自己理解应该是这样的，因为载体上有一个ADE2基因，因为它互补了有ADE2基因缺陷的PMAD11感受态酵母细胞，所以只有被电穿孔转化的PMAD11酵母细胞才能在没有腺嘌呤的MD平板上生长。这种理解对吗？
二、按照“表达试剂盒”的说明，用甲醇诱导我已经收集了几批样品，但用Western blot分析，就是检测不到目的蛋白的表达。不知道如何解决？
三、在做WB时，刚开始做的第一二次还能出现Marker，但后来Marker也不出现了，不知何故？
四、在SDS-PAGE电泳时，样品跑得不平齐，不知道如何解决？

我做WB分析是利用融合蛋白C端的V5表位的Anti-V5抗体-HRP，稀释成1:4000~5000来进行检测，一般4°C孵育过夜，用TBS-T洗4*15min,用化学发光分析。
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:12

1. 你说的是对的。
2. 可以尝试换换诱导的条件，多测几个点，后有时否有可能是Wb没有做好，而不是没有表达。wb用的一抗经过检测没有，是否有可能是转移的问题，你的目的蛋白那么大，表达会不会有问题，提蛋白时是否有问题呢?总之排除一些可能性再分析一下。
3.你的Marker是什么？不见了是什么意思？
4. 样品跑的不齐是什么意思？照我现在地理解释：有可能是各个样品间的离子强度不同的

作者: utt0989 时间: 2013-9-9 13:19

我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。所谓“不见了是什么意思？”就是：开始做WB时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。
我是用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做WB时我没有进行丽春红染色，今天我用了此方法，也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。
再就是我是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析。我是用培养基样品进行分析。
没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP)。
但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！

作者: moonlight45 时间: 2013-9-9 13:20

最近又试了两次WESTERN ，结果在转膜这步就卡住了。
我们用的湿式电转移，一次是50V、12小时（转移缓冲液中无甲醇）；丽春红染色无
另一次120V、2小时（加了甲醇）。丽春红染色MARKER有一条带
两次丽春红染色几乎没有蛋白条带（蛋白质上样应没问题，胶用卡马斯亮蓝染色有），转移后的凝胶用卡马斯亮蓝染色也无条带。蛋白质跑哪里去了？
难道转过头了吗？
我曾经用第一种条件转出来过，难道缓冲液有问题？
我的问题是：1，是否必须有丽春红染出较为明显条带才能进行下一步？
2，我的分子量是30KD，用湿式电转移槽（北京六一）转移条件以那种方式最好？
先谢谢各位的帖子，摸索条件太费劲，如能借各位经验少走弯路就好了。

作者: qhyu 时间: 2013-9-9 13:21

请教，我的目的蛋白在总蛋白中的含量极低，约0.1-0.01％。采用一般的多抗－酶标二抗，或单抗－酶标抗体效果均不好。但设置的阳性蛋白却可以有明显条带。请问，有何高招吗？

另我的转膜条件可行否？（１２％　的浓缩胶，　６＊８cm大小，150mA, 约３０ｍｉｎ　）

急盼回复，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:21

你可以适当加大一抗浓度，增大蛋白上样量。更有效的办法是采用酶标三抗，可以放大抗原抗体结合效应。
你的蛋白分子量多大？如果<30kd的话，电流肯定大了。

作者: one 时间: 2013-9-9 13:22

怎么我连marker都转不上呢？我用的是BIO-RAD公司的半干转印仪。公司推荐的条件：
mini-gel 10v for 30minutes or 15v for 15 minutes.
large ge 25v for 30minutes or 15v for 60 minutes.
而且讲：
do not exceed 25v and 3mA/cm2 current for large gels or 5.5 mA/cm2 for mini gels

我过去用10V 45minutes , 现在用恒流 2mA/cm2 ,两块胶113cm2,大约是230mA。
我注意了一下，电压已经25V 了。
我一块胶大约58cm2,应该是mini gel吗？
就是按照我后来改的条件还是连marker都转不上。
恳请百忙中给予指点！

作者: 天蝎座 时间: 2013-9-9 13:23

紧急求救：
一。在大肠杆菌中表达重组蛋白（一种蛋白酪氨酸磷酸酶）经检测缺乏磷酸酶活性，问题：1。是否与蛋白质的纯化方法及其保存条件有关，2。是否与此蛋白因在大肠杆菌中缺乏翻译后修饰有关。
二。PI值大于9的膜相关蛋白无法在2—D凝胶中显示，请问原因。
三。我现在已有亲和素标记的目的蛋白，现在我想采用生物素亲和层析该蛋白，请问如何重新打开亲和素与生物素之间的连接。改变PH？改变盐浓度？。。。。。。

作者: Ao7 时间: 2013-9-9 13:23

我的问题已贴在外面了，就是明明组织含该蛋白，拿该组织电泳却跑不出来，不知是何原因？（我其实是要用细胞做，先用对应的组织摸摸条件，这可以吧？）

作者: www.1 时间: 2013-9-9 13:24

真的很敬佩你的耐心和学识！
我昨天进行Werstern ，用的也是BIO-RAD公司的半干转印仪，仪器适用的条件同
huaiyoumeng 说的是一样的。我同时转了三块膜，一块胶大约68cm2，我用的是恒流
200mA ，2h，但是很不幸的是烧胶了，而且最后电压有30V左右，而开始电压是6V左右，我用的滤纸是自己剪的而不是用的BIO-RAD公司的滤纸，不知道是不是有影响，同时我也猜想是不是滤纸过大，短路了，只有再试了！！！！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:24

1." 我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。所谓“不见了是什么意思？”就是：开始做WB时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。"
有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。
2.“ 我是用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做WB时我没有进行丽春红染色，今天我用了此方法，也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”
转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。
3“ 再就是我是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析。我是用培养基样品进行分析。
没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP)。”
是否检测了表达量，2抗是否是好的，你做了阳性对照？

你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:24

你可以用在第一种缓冲液里加20％甲醇，然后36V 5-15hrs。30KD就可以上去了。
另外，你用的PVDF膜用甲醇活化的吧？你的电极方向没有反吧？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:25

你可否查查你的buffer和过程？
加了甲醇吗？用的什么膜？
还有你用的什么滤纸？ buffer的离子强度对吗？
另外，我们用200mA, (2 gels), 1hr-1.5hr,是可以的。（70-130kd）（但是转移仪不是biorad的，但是这问题不大）

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:26

有几个可能，
1. 你的滤纸不够厚，含水性不好。我们用的 biorad滤纸约1mm一张，我们一次用2张以上（一边）。这样buffer在转移过程中不会干的太快。
2. 一般我们建议膜>＝滤纸。
3. 转移过程太热，（也跟含水性相关），

第一个可能性最大。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:27

如果你用组织蛋白电泳，肯定看不到你的蛋白，很少有蛋白的含量的能用sds-page看到，
你加的裂解液有无问题，是否适合你提蛋白所用？

作者: guagua 时间: 2013-9-9 13:29

今天又重新做Werstern，结果不幸的是因为有人打扰，我将电极接反了，10分钟后才发现，又烧胶了。只好明天再重新来过！！！
不知道是不是一定需要用BIO-RAD的滤纸，因为我没有相应的滤纸，多加几层滤纸会有改善吗？

作者: ii077345 时间: 2013-9-9 13:29

在大肠杆菌中表达重组蛋白（一种蛋白酪氨酸磷酸酶）经检测缺乏磷酸酶活性，问题：1。是否与蛋白质的纯化方法及其保存条件有关，2。是否与此蛋白因在大肠杆菌中缺乏翻译后修饰有关。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:30

不是一定要用biorad的滤纸，多几层肯定会有改善，另外滤纸的吸水性，含水性要好。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:31

你说的两种可能都都有，
1。是否与蛋白质的纯化方法及其保存条件有关，2。是否与此蛋白因在大肠杆菌中缺乏翻译后修饰有关。
也可能有其他的3，你加的标签是否有影响，建议用His－tag的。
如果是第一，三种造成的，你还有可以改进步骤来完成。第二种的困难就很大了。你要多查很多资料，看看有没有什么载体，或宿主菌合适。

作者: zzzz 时间: 2013-9-9 13:32

我想将hbx转到hepg2 细胞里通过检测hbx蛋白的水平来检验转染的效率不知道可不可幸？
此外检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张漠上吗？
谢谢！！！

作者: vera+ 时间: 2013-9-9 13:33

请问跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？
是有的成分不对吗？
昨晚配的那块浓缩胶缩的梳子都没有了

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:34

我想将hbx转到hepg2 细胞里通过检测hbx蛋白的水平来检验转染的效率不知道可不可幸？
可以，但要做好对照。

此外检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张漠上吗？
可以

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:35

我们也遇到过，你是北方的吧，没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。
过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了

作者: xingyi08 时间: 2013-9-9 13:35

请问跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

1 如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包可以（ptglab ）。
2 可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察
3 能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。
我遇到过SDS-PAGE染色后脱色，胶缩的厉害，有时候只有几个厘米见方。后来发现是脱色液中甲醇的含量太高。可能是实验室的人员将甲醇当乙醇选用了。可见实验中最怕的是将试剂弄错，自己不知，还在找理由分析结果。

作者: owanaka 时间: 2013-9-9 13:36

做定量分析的时候，是否一定要有内参，如果没有内参照，人家如何相信你上样的蛋白总量是一样的呢

作者: tuomu45 时间: 2013-9-9 13:37

我遇到过SDS-PAGE染色后脱色，胶缩的厉害，有时候只有几个厘米见方。后来发现是脱色液中甲醇的含量太高。可能是实验室的人员将甲醇当乙醇选用了。可见实验中最怕的是将试剂弄错，自己不知，还在找理由分析结果。

===========================================================================================

胶遇到甲醇就会“缩”吗？
做转印的时候，转印缓冲液不是含有甲醇？
我也发现用转印前用缓冲液来平衡胶后胶整个要缩小，没有想到是甲醇的问题，而且由于是整个胶都缩小，所以也没有介意

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:39

做定量分析的时候，是否一定要有内参，如果没有内参照，人家如何相信你上样的蛋白总量是一样的呢

==========================================================================================================

一般需要内参，如beta-actin, beta2-microglobulin等，如果没有内参的话（Sigma的beta-actin好贵的啊，300美刀呵呵，不过能用很多次的），转完膜用丽春红染色后，一般Beta-actin的条带能看见，在43Kd左右（一般的Marker都有45KD的条带），可以将丽春红染色后的Beta-actin条带作为上样量一致的证据，结果给一张照片一样能说明问题。

丽染Beta-actin条带在文章中还是很多见的。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:40

我想将hbx转到hepg2 细胞里通过检测hbx蛋白的水平来检验转染的效率不知道可不可幸？
此外检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张漠上吗？
谢谢！！

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WB检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好办法，建议还是：
1、最好是带有荧光标签的HBX转染来看转染效率,最可靠
2、其次，HBX和荧光载体共转染，相对说明问题
3、荧光载体单独转染，主要是看细胞好不好转了呵呵
转染效率高低荧光显微镜下一目了然了。有的细胞荧光强，有的细胞荧光弱，有的没有。所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果，不代表转染效率。
磷酸化JNK和总JNK（非磷酸化的JNK能直接测吗？）能在一张膜上检测,检测完总JNK后可以将膜上的一二抗Strip掉，重新检测磷酸化JNK.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:41

今天又重新做Werstern，结果不幸的是因为有人打扰，我将电极接反了，10分钟后才发现，又烧胶了。只好明天再重新来过！！！
不知道是不是一定需要用BIO-RAD的滤纸，因为我没有相应的滤纸，多加几层滤纸会有改善吗？

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你用的是什么转膜方法，就半干转而言，滤纸不大会影响转膜（BIO-RAD太奢侈了吧），我用的就是国产的一块钱一大张的那种滤纸，没有疙瘩的那种就行，一般滤纸上下各三层，注意赶气泡。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:41

我的问题已贴在外面了，就是明明组织含该蛋白，拿该组织电泳却跑不出来，不知是何原因？（我其实是要用细胞做，先用对应的组织摸摸条件，这可以吧？）

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组织的成分比较复杂，有间质和不相关的细胞等不含有目的蛋白的成分存在，所以有时你上样量很大，但真正你想要测的东西实际上很少，可能测不出来（不会是WB条件有问题吧，有阳性对照吧）。如果能用LCM（激光显微切割）先拿到相对纯的你所想要的东西，在做WB可能把握大些，不过LCM不易拿到大量的单一成分。不知道你用的是什么组织？如果肝脏我想问题不大，其他的不好说。细胞是单一成分，应该用来磨条件才对呵呵，是原代的细胞吗？

作者: vera+ 时间: 2013-9-9 13:41

其实我自己也不知道是什么原因，我前几次都是用的国产滤纸，都烧胶了！！！
还想请教一个问题就是膜滤纸胶大小的问题，是不是：
胶>膜>=滤纸
我看了看前面的帖子，结果越来越胡涂了，呵呵！！！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:42

QUOTE:

原帖由 vera+ 于 2013-9-9 13:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
其实我自己也不知道是什么原因，我前几次都是用的国产滤纸，都烧胶了！！！
还想请教一个问题就是膜滤纸胶大小的问题，是不是：
胶>膜>=滤纸
我看了看前面的帖子，结果越来越胡涂了，呵呵！！！ ...

烧了的胶是什么样子？能不能贴张图出来看看，如果你是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。我习惯的大小为滤纸的长宽分别比胶小1－2mm,而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

作者: orangecake 时间: 2013-9-9 13:42

兄弟，你那里有光密度分析软件提供下载吗。小弟也打算做WB ，用的是KPL的化学发光底物，请问一下，那种底物只能用辣根过氧化物酶标记的二抗吗，我只有碱性磷酸酶标记的二抗

作者: pou 时间: 2013-9-9 13:43

多谢指点！
另外，我有时候做两次western的条件基本一样，一次基本没什么杂带，另外一次杂带很多，当然目的条带还是能看见的，一抗的稀释倍数是一样的，是否跟一抗孵育的时间有关系，在最后的图上如果只留目的条带是否能让编辑们接受

作者: pou 时间: 2013-9-9 13:45

还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗
再次感谢老兄指点！

作者: popo520 时间: 2013-9-9 13:46

WB一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始磨条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了呵呵。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复的试了，当然有的不适合WB的怎样也不行。所以真的好的结果不容易，实验者当然是要先求真再求好，编辑们好像更偏重于求好.

作者: loli 时间: 2013-9-9 13:46

昨天做了一次，转成功了，不过用的是BIO-RAD 的滤纸，不过我还是想试一试普通的国产滤纸。我分析了一下我烧胶的原因，主要有这些可能，不知道对不对
1 膜比滤纸小，我感觉电转过程中，膜的电阻是最大了，所以膜一定要比滤纸大，比胶大，有时，为了省膜，把膜剪的很节约是不划算的，呵呵！
2 电流设置太高。BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我还是想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
3 就是两层滤纸不能搭到一起。
我就前几次失败的实验总结出如下经验，请大家帮忙参考！
还有一个问题就是：
我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法！！！
还有就是半干是不是存在蛋白转移不完全的问题？？？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:47

昨天做了一次，转成功了，不过用的是BIO-RAD 的滤纸，不过我还是想试一试普通的国产滤纸。我分析了一下我烧胶的原因，主要有这些可能，不知道对不对
1 膜比滤纸小，我感觉电转过程中，膜的电阻是最大了，所以膜一定要比滤纸大，比胶大，有时，为了省膜，把膜剪的很节约是不划算的，呵呵！

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膜一定要比胶大一些，主要是为了防止上下层滤纸件相互接触短路，电流不通过胶和膜就无法成功转膜。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:47

2 电流设置太高。BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我还是想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？

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恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:48

3 就是两层滤纸不能搭到一起。
我就前几次失败的实验总结出如下经验，请大家帮忙参考！
还有一个问题就是：
我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法！！！
还有就是半干是不是存在蛋白转移不完全的问题？？？

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不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:48

只好说一点体会了，
就WB而言，我觉得最重要的就是制样和转膜了，
半干法对于30kd－100kd左右的蛋白比较方便，小于20kd的容易透过膜，大于130kd的不太容易下来，时间久了，胶容易缩，干。
cloner说的办法(一块胶分两半）是个好办法，

湿法相对来说要稳定一些，条件控制好18kd-150kd都可以下来，但是时间太久，要降温。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:49

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-9-9 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
只好说一点体会了，
就WB而言，我觉得最重要的就是制样和转膜了，
半干法对于30kd－100kd左右的蛋白比较方便，小于20kd的容易透过膜，大于130kd的不太容易下来，时间久了，胶容易缩，干。
cloner说的办法(一块胶分两半）是个好办法，

湿法 ...

就WB而言，过程虽然重要，但我觉得最重要的还是抗体的好坏。

抗体是否适合做WB是决定了结果好坏，有没有人用Sigma的Beta-actin做不出来结果的（Sigh，还有人举手？兄弟，没关系，多看书多做多上丁香园吧）。当然，不同公司的抗体质量不一样，我曾经用某个国内有名的免疫组化厂商提供的抗体去做WB，虽然说明书信誓旦旦的写着可作WB而且我们也不止一次的贪图便宜试用了多种不同的抗体（每支300－500元不等，实在便宜啊），然而反复摸索条件都没有结果，浪费了时间、经费和信心呵呵，得到的只是一个教训。
我现在还是国货的忠实拥护者，但在最短的时间内拿到可靠的结果永远是最关键的！！！

既然同一个抗体的厂家有很多个，那么怎样选用好的抗体？
1、咨询做过同一个抗体的人（当然是要给你说真话的人了，推销试剂的人的话你愿意相信也是可以的赫赫），这肯定是比较快的方法。
2、没有人做过的话，就只有参考文献了，如果有几个不同的Group用的都是同一个来源的抗体或者多数Group用的是某一个来源的抗体而且文章的结果看起来还不错话，我们的方向就有了。
3、没有文献参考的话，宁愿选用好一点的公司，经费让老板想去吧。
4、1／2／3都失效的化，那么运气是我们需要的。

一点体会，不对之处还望不吝赐教。

作者: zhenxin 时间: 2013-9-9 13:51

我在做NF-kappaB，请问：如何比较总蛋白、胞浆蛋白和核蛋白之间量的差别？（我的意思是：确保上样量一致是否就可以了？总蛋白、胞浆蛋白和核蛋白都可用actin作内参么？）
多谢！

作者: lxh031 时间: 2013-9-9 13:52

请问用上样缓冲液提蛋白后，蛋白定量那种方法较好，主要是避免干扰（溴酚蓝、SDS等），谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 13:53

QUOTE:

原帖由 lxh031 于 2013-9-9 13:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问用上样缓冲液提蛋白后，蛋白定量那种方法较好，主要是避免干扰（溴酚蓝、SDS等），谢谢！

不知道，也许下贴对你有帮助。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/500023')

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-9 13:54

呵呵,您需要避免各种去污剂和还原剂的影响吗?那么您最好看一下各种蛋白定量法(如lowry、bradford、BCA等)对各种去污剂的耐受能力，这方面的资料各个生产这些定量试剂盒的厂家都提供（说明书上有），cloner给出的连接里就有这样的例子，在此小弟不作详述，如果您需要精确定量并不受去污剂影响的话，我想在蛋白组学研究中常用的精确定量试剂盒能够满足您的要求，主要生产厂商有AMERSHAM和BIO-RAD。
偶以前回答的问题：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=427173&sty=3&keywords=2D+QUANT')

作者: pengke1983 时间: 2013-9-9 13:54

我做HIF-1 a的检测，材料来自培养皿中的培养细胞，请问该怎样制样？谢谢！！！

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-9 13:55

BIO-RAD的RC-DC试剂盒耐受去污剂的能力及原理,扫得不是很清楚,将就看一下.

图片附件: 64777716.snap.jpg (2013-9-9 13:55, 97.42 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18166

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-9 13:56

我做HIF-1 a的检测，材料来自培养皿中的培养细胞，请问该怎样制样？谢谢！！！

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你的意思是如何避免HIF-1 a在有氧环境中的降解么？因为有文献报道恢复氧环境10min左右HIF-1 a就会开始降解而且降解速度很快。我们在实验中也思考过这个问题，但没有好的解决方法。气体环境和氯化钴刺激模拟的两种缺氧条件下，我们都没有采取特别的方式制备蛋白样品，只是一离开缺氧环境就尽快裂解，可以检测到HIF-1 a及其剂量-时间变化。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 13:56

QUOTE:

原帖由 00无名指00 于 2013-9-9 13:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做HIF-1 a的检测，材料来自培养皿中的培养细胞，请问该怎样制样？谢谢！！！

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你的意思是如何避免HIF-1 a在有 ...

有同感，觉得只有尽快裂解才最有用

作者: xingyi08 时间: 2013-9-9 13:57

我仍然在做6KD肽的WB,经过上清浓缩，凝胶染色后可见相应分子量的蛋白条带，而且条带较宽也较深，我用25V30分钟转膜，转过的胶上没有目的条带，但膜用立春红染色也未见条带（0.2umPVDF membrane），但奇怪的是低分子量Marker上相应大小的条带用同样的转膜条件是成功的，那么我的蛋白转哪儿了？是否有可能我的蛋白带正电，膜应放在较上面？但如果带正电，蛋白在电泳时就跑没了呀？

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-9 13:57

本人拟作心肌组织CAMKII及P-CAMKII的western blot,拟按照分子克隆实验指南第二版上的对组织碎片的处理方法进行样本制备,即以悬浮缓冲液
0.1mol/L NaCI、 0.01mol/L Tris.CI（PH7.6）、 0.001mol/L EDTA（8.0）、1ug/ml aprotinin、100ug/ml PMSF分散组织，尽快加入等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液，然后煮沸及离心。我的问题是该方法所用的蛋白酶抑制剂是否合适，另磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等。盼答，谢谢。

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请问楼主，我做粘膜组织不经过裂解这一步，直接溶于SDS sample buffer可以吗？如果可以是否需要加大SDS sample buffer的浓度，一般在2×以上还有哪些倍数的buffer，可否用10×SDS sample buffer？
另，制备的样本，若不便即时跑胶，可以保存吗？在什么温度下，能保存多久？
谢谢百忙中赐教，小的刚刚涉及，很多细节问题不明白：）

[ 本帖最后由 shenkunjie 于 2013-9-9 13:58 编辑 ]

作者: qumm1985 时间: 2013-9-9 13:59

请教各位高手一问题，我做细胞培养提出的蛋白在－80C能保存多久啊？

直接用裂解液裂解细胞放－80度可以吗？

作者: plaa 时间: 2013-9-9 14:00

我是从事蛋白质组研究的，想做一个质膜上蛋白的Western blotting,我买了Na+-K+-ATPase, 和Actin这两种蛋白质的抗体，做了一次，什么结果也没有，请教实验时的注意事项，一抗和二抗的稀释，时间等。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:00

绝大部分的蛋白是可以，可以直接用Sample buffer 融解，不用再加NaF，或蛋白酶抑制剂。
你可以这么做。
用5X的sample buffer比较好，

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:01

－80至少可以放2年，10年一般都没有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:03

你可以看看抗体说明，上面有稀释度，你按照比较低的稀释度比例做就可以了，如1:100-1:1000,的你就取1：100
但是我觉得你多半是转移和制样上的问题。

作者: okhaha 时间: 2013-9-9 14:03

偶作tgf beta,分子量巨小,偶用15%的胶,0.2的膜.

不可,NBA有何妙法?

谢谢!!

作者: S6044 时间: 2013-9-9 14:03

绝大部分的蛋白是可以，可以直接用Sample buffer 融解，不用再加NaF，或蛋白酶抑制剂。
你可以这么做。
用5X的sample buffer比较好，

==============================================

相比2×，5×的配制是否所有成分浓度加大为5/2倍？
加样时，2×是以与样本等体积加，5×是否只加样本体积的1/4?

另，电泳完毕的胶，若来不及转印，能否保存？怎样保存？
非常感谢你的指点

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:04

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2013-9-9 14:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

偶作tgf beta,分子量巨小,偶用15%的胶,0.2的膜.

不可,NBA有何妙法?

谢谢!!

你的tgf beta 多大？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:05

QUOTE:

原帖由 S6044 于 2013-9-9 14:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
绝大部分的蛋白是可以，可以直接用Sample buffer 融解，不用再加NaF，或蛋白酶抑制剂。
你可以这么做。
用5X的sample buffer比较好，

==============================================

相比2×，5×的配制是否所有成分浓度加 ...

相比2×，5×的配制是否所有成分浓度加大为5/2倍？是的，
加样时，2×是以与样本等体积加，5×是否只加样本体积的1/4?是的
但是我们用时，一般5X的加标本量的1/3，使buffer 保证过量

作者: okhaha 时间: 2013-9-9 14:05

我想做wetern blpt ,但是我是初次要做，不知道需要什么准备，改定那些材料，给我些意见，谢谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-9 14:06

我想做wetern blpt ,但是我是初次要做，不知道需要什么准备，改定那些材料，给我些意见，谢谢

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您有没有查资料或者看一些必要的书籍如分子克隆或抗体实验技术等等,这么大而化之的问题让人怎么回答,

作者: one 时间: 2013-9-9 14:06

14kb

也有文献25kb

我也百思不解。。

谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 14:06

我们做怎么大的蛋白，用15％SDS－page， 0.2 um pvdf membrane ，肯定能做出来，
你看看下面几个方面有没有问题或能否改进。
1 减少转移的时间和电流（电压）。
2 转移效率没有问题的话看看制样上是否有问题。
3 看看抗体（1 2）有无问题。
4 是否是系统灵敏度不够?

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-9 15:48

第3：“看看抗体（1 2）有无问题。”进行补充：
由于在WB实验中，特异的抗体非常关键，涉及对抗体的鉴定，因此
1.直接将一抗点膜（ e.g. 0.2umPVDF membrane,or NC）数块，加入不同稀释度的二抗，显象观察。这样就可知道你的二抗（CONJUGATE）是否良好：蛋白的活性，酶的活性，最适的浓度等。
2.如果你会将抗原或抗体的直接酶标记时，将一抗直接标记做，这种一步法就更直接简单了。
3.最好直接将样品在没有进行电泳前，摸索一个比较合适的一抗和二抗浓度（DOT-ELISA即可），可以避免以后的WB走弯路。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 15:49

tgf beta 多大？
14kb
也有文献25kb
我也百思不解。。

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再查一下是否TGF beta 有种属特异的特点，或是是否有不同 splicing 产物？

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-9 15:49

做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点

作者: ending 时间: 2013-9-9 16:01

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-9-9 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点

必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），鄙人自己没用过小牛血清封闭(ptglab兄应该用过)，一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。

作者: S6044 时间: 2013-9-9 16:01

你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇

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1.加甲醇的目的是什么呢
2.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大呢
3.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下
4.好像前面的全是用半干转，我只有湿转的设备，效果是不是会不好呢，湿转是恒流还是应该恒压

作者: langlang 时间: 2013-9-9 16:02

请教大家，我做WESTERN，目的蛋白是85KD，做了好几次，总是在116KD处出现很强的带，其他有一些带但都很弱。我想请教大家这是我的目的条带吗？我用的是SANTA的多克隆抗体，如果不是目的蛋白，那怎么会有这么强的条带。MARKER应该没问题。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:02

1.加甲醇的目的是什么呢
2.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大呢
3.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下
4.好像前面的全是用半干转，我只有湿转的设备，效果是不是会不好呢，湿转是恒流还是应该恒压

多谢！

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1,加甲醇起着一定的固定作用,因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上,因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)
2,是tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)
Dissolve 8.8 g of NaCl, 0.2g of KCl, and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O.
Add 500ul of Tween-20
Adjust the pH to 7.4 with HCl.
Add distilled H2O to 1L.
Sterilize by autoclaving.

3,均可在室温进行,我们实验室的方法:如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜.
4,湿转的效果也是不错的,但半干转移需要的时间更少;我们通常采用恒压转移,至于电压选择请参见版主以前之阐述,此处不作重复.

作者: u234 时间: 2013-9-9 16:26

我的目的蛋白是17Kd，但在25Kd和45Kd处出现了条带，请教一下诸位高手，帮我分析一下原因。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:27

请教大家，我做WESTERN，目的蛋白是85KD，做了好几次，总是在116KD处出现很强的带，其他有一些带但都很弱。我想请教大家这是我的目的条带吗？我用的是SANTA的多克隆抗体，如果不是目的蛋白，那怎么会有这么强的条带。MARKER应该没问题。

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85KD?好熟悉啊,您做的是PI3K吗?如果是,您的目的蛋白是不是有和其他蛋白结合成复合物的可能性呢?比如说与P85有相互作用的其他信号分子?
小弟觉得您的目的蛋白和其他蛋白结合成复合物的可能性存在哦.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:27

另，电泳完毕的胶，若来不及转印，能否保存？怎样保存？
非常感谢你的指点

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-9 16:28

请教大家，我做WESTERN，目的蛋白是85KD，做了好几次，总是在116KD处出现很强的带，其他有一些带但都很弱。

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文献中有说该种蛋白有二聚体吗？

作者: pencil菲 时间: 2013-9-9 16:29

电泳完毕的胶，若来不及转印，能否保存？怎样保存？

可以泡到无SDS的转移液中。（不加SDS）

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:29

不过应该也不能太久吧？我们也通常放在ptglab兄所说的转移缓冲液中，如果不加甲醇或其浓度太低可能蛋白质条带扩散较快.如果甲醇浓度太高了又会带来转移的麻烦。因为自己做实验也碰到这样的问题，所以觉得有必要向ptglab兄讨教一下
鄙人自己觉得还是尽量控制好时间比较好，电泳结束后封闭，封闭完后一抗先孵育一个小时，然后4度过夜，spicy MM觉得可以安排得过来吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:31

你说的对，也有这方面的问题，但是20％甲醇是没有什么问题，放过夜我都做过，没有问题

作者: lxh031 时间: 2013-9-9 16:32

有可能！
我在一张膜上同时跑三个样本，一个是lamp蛋白（120kd），一个是Necleocapsid蛋白（45kd），另外一个是Lamp－Nucleocapsid融合蛋白（165kd），我的一抗是抗nucleocapsid蛋白的，结果应该是有一个泳道在165kd处显色，一个在45kd处显色，另外一个是阴性。从理论上将，165kd蛋白的表达两应少于45kd的。
我有做了次western，结果还不错，大分子量蛋白有些降解（估计不是处理标本造成的，可能和Lamp分子的特性有关）。我准备再重复一次，做张更漂亮些的。
谢谢

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我再不停地试western，想得到个好的照片，发文章用，真是费了不少的时间。结果还不错，现在再发一张照片。这是用ECL显色系统做的。

图片附件: 51084069.jpg (2013-9-9 16:32, 13.97 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18170

作者: DNA 时间: 2013-9-9 16:34

我欲做WB, 但是查了好些资料，每本资料上讲的蛋白裂解液的成分都不一样，好苦恼。请问预裂解内皮细胞蛋白质，检测膜上及胞浆中的磷酸化蛋白因子，应该用的提蛋白质的裂解液成分最好是什末。ptglab曾说过要加蛋白酶抑制剂NaF, 除此之外呢？

作者: tie8 时间: 2013-9-9 16:35

我做WESTERN，目的蛋白是85KD，做了好几次，总是在116KD处出现很强的带，其他有一些带但都很弱。我想请教大家这是我的目的条带吗？我用的是SANTA的多克隆抗体，如果不是目的蛋白，那怎么会有这么强的条带。MARKER应该没问题。
谢谢大家,我做的是一种核转录因子,没有二聚体,我想知道的是那强的条带是不是我所需要的目的蛋白.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:35

你说的对，也有这方面的问题，但是20％甲醇是没有什么问题，放过夜我都做过，没有问题

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不如按NBA讲的方法一试,然后再把结果告诉大家,大家一同提高嘛.我们也是这样做的,但是没有试过过夜(只放了几个小时,因为胆子有点小,半夜起来继续做转膜,呵呵)

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:36

可以选用改良后的RIPA buffer，然后加入NaF，（如果文献里没有特别说明要加NaF，也是可以不加的，非要加NaF的不多，且NaF很不好买）

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:36

你能否将你的蛋白的相关资料查一下，又很多蛋白因为给种各样的原因，在SDS-PAGE中的分子量跟预想（或计算的）不一样，
我们做过一个蛋白 ICAM2，计算是30多kd，实际跑出来是65KD，
你再看看有无糖基化之类的原因。

作者: DNA 时间: 2013-9-9 16:37

,但我买的抗体说明书上是说85KD大小,我没有计算过.我再查查蛋白资料.

作者: idoww 时间: 2013-9-9 16:37

先多谢啦!
请问怎样做骨组织的western blot啊？谁有protocol吗？

作者: birdfish 时间: 2013-9-9 16:38

请教一下，我们实验室的WB很奇怪！！PVDF膜比硝酸膜更易转透，通过预染Marker可以明显看到。条件是：150mA 15min.
真是不明白，请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？？不胜感激！

作者: jrwyyplt 时间: 2013-9-9 16:38

这位朋友,目前他的原理尚未完全清楚,但认为是以疏水键结合到膜上.

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:39

我们没有做过骨组织的WB，帮不了你
但是我想，你先找提蛋白的方法，其他的都一样。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:39

一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

作者: 49888 时间: 2013-9-9 16:39

我是做western blot 的新手，迫切的想知道从人组织中提取IL-6的western blot 跑出的带子应该出现在什么地方，它是糖蛋白，分子量大概是26kD,是不是就应该在26kD处？可我做了很多次（至少15次），在26KD处没有带，但每次都在60处有很明显的带，这是为什么？我现在很着急，不知道该如何办？求各位老师帮帮我。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-9-9 16:40

你看看60kd左右的带是否是dimer，或是糖基化的作用，
有个办法可以试试看，你做8M urea 的stacking gel, 看看有无改善。

不要客气，有问题可以再问我

作者: wsll 时间: 2013-9-9 16:40

求助！！我的western方法按《蛋白质方法》，一抗1：5000，1：2500，1：2000，都无条带，换成1：1000，4度过夜，有条带可背景很高，煮膜后用此旧一抗，4度8小时，二抗也是旧的，多洗了1次，10分钟，却只剩下背景，条带完全看不到了！！是一抗还是二抗的非特异结合太高了呢？还是抗体只能用新的？？一抗很贵的，都快被我用完了……哭

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:41

你开始用的稀释度是否是过夜的？
还有你一抗是什么呢？多抗单抗？

作者: mamamiya 时间: 2013-9-9 16:42

用一个浓度的胶一般很难跑出MARKER的所有条带，我用梯度胶可跑全MARKER的所有条带，而且分布清楚，可根据分子量的位置进行实验。

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请教：
我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？
胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

作者: xue258 时间: 2013-9-9 16:43

求教：
最近作Western，开始时没加堆积胶，跑出的带宽且有拖尾，但背景还是可以，这次时加了堆积胶，带压得整齐了，但奇怪的是每条泳道上有都好几条深深浅浅的细带（位置一致）目的条带倒是比较深和宽，更奇怪的是，膜上在b-actin的位置上居然日光下能看到棕色条带，就像免疫组化染色一样！，搞不明白是什么，没能拍成照片描述不清，不知道大家有没有遇到过这种情况？是不是没封闭好或是一抗没洗净？
还有在配显影剂时，b液加入a液后液体变得有些乳白色,是不是已经失效不能用了？显色大约需要多少时间呢，我们是用的增强型的等在暗室里看到了条带得显色后才放入胶片盒10s后取出，但今天发现b-actin 的条带很快显色，但目的蛋白怎么也看不出等了很长时间后才作片，结果冲出片子一看，b-actin的已经是过度，目的蛋白得到还看得过去。不知道大家有什么好的经验介绍一下，谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:44

请教：
我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？
胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。
当然梯度胶也是不错的选择

作者: plaa 时间: 2013-9-9 16:44

这段时间做western blot，有时候出带，有时候不出，而操作上没什么差别，不知道ptglab有什么好的建议没有？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:44

你在转移方面多看看是否有什么不一致的地方，看看实验（转移）过程中的条件有没有不一致的。

作者: ritou1985 时间: 2013-9-9 16:45

我用亲和纯化的鼠单抗，用甘氨酸洗脱，然后用10mM 的Tris.HCl pH8.0缓冲液透析，产生沉淀，能告诉我解决办法吗？因为要用来标金，所以盐浓度不能太高。

作者: standbyme 时间: 2013-9-9 16:45

膜蛋白裂解液配方？？
我的配方：
7M 尿素
2M 硫脲
Triton-x-100 0.2ml
新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
1.3亿细胞加1ml裂解液，结果蛋白浓度偏低。

去垢剂有人建议用SDS,说比Triton-x-100 裂解效果好，有这样的说法吗？膜蛋白是否不易裂解？？

作者: lixi559 时间: 2013-9-9 16:46

暴光时间不同，出现的条带数目也不同，是何原因？

作者: glass 时间: 2013-9-9 16:46

好羡慕你可以做那么多次WEATERN BLOT，我做了大概十次吧，已经证实最早几次一抗有问题，就被老板骂的要死。先是嫌我笨，又嫌我花钱，后来嫌我太慢，每做一次就要向他要一次膜，感觉自己像乞丐似的（我无权用自己经费买膜），而且每次就给我两小条（只够做一次），还说必须要出结果。总之在实验室里万分压抑，我都快有心理障碍了。
唉，真的好羡慕你呀。

作者: Ao7 时间: 2013-9-9 16:46

我不知道为什么会沉淀，但是盐浓度会影响蛋白的溶解，
你换一种缓冲体系，如PBS试试，
要不你用梯度透析试试看，不要一下子将盐降的太快。

作者: Ao7 时间: 2013-9-9 16:47

你加1％ triton 100 再加1％ NP40，
裂解细胞时加300－500ul的裂解液。

作者: Ao7 时间: 2013-9-9 16:47

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2013-9-9 16:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

暴光时间不同，出现的条带数目也不同，是何原因？

当然了，暴光时间长，一些很淡，或还未显色的带都出来了，感光时是累计的。

作者: jrwyyplt 时间: 2013-9-9 16:48

能具体介绍一下Western blot ？为什么做？能得出什么结果？

作者: eric930 时间: 2013-9-9 16:48

实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外您听说过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？我上面的配方
7M 尿素
2M 硫脲
Triton-x-100 0.2ml
新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v

是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
在前面我看到您建议用改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl, 50 mmol/L, pH 7.5; NaCl, 150 mmol/L; NP-40,1%; 脱氧胆酸钠, 0.5%; SDS, 0.1%; EDTA, 1 mmol/L; PMSF, 1 mmol/L; Leupeptin, 2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何，您还用过？！此外该方中的EDTA, 是否用做蛋白酶抑制剂？
殷切希望尽快得到您的答复，在下感激不尽！！急啊啊！！！

作者: 子衿青青 时间: 2013-9-9 16:49

关于2D的样品：盐、缓冲液和其它小的离子是制备双向电泳样品要注意的问题。由于这些杂质的存在，使电泳达到等电聚焦的时间延长，而且在第二向电泳时使凝胶上极端pH位置上的电泳结果扭曲，泳数造成电据丢失。参考cuturl('http://www.perbio.com.cn/PIERCE/jindian/2d.htm')
shanying 兄提到，上方中的EDTA, 是否用做蛋白酶抑制剂？我理解可能是：因为很多的蛋白酶作用需要二价金属离子的参与，这里EDTA可能起金属凹合剂使酶的作用消失，因此可以讲其可能是用做蛋白酶的抑制剂。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:49

QUOTE:

原帖由 eric930 于 2013-9-9 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外您听说过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？我上面的配方
7M 尿素
2M 硫脲
Triton-x-100 0.2ml
新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v

是用于 ...

可以用SDS，另外2D电泳的问题你可以去问问其它高手。

作者: eric930 时间: 2013-9-9 16:50

我想这里是否有个原则就是；为了增加蛋白溶解性，可多加一些去垢剂，如triton-x-100.chaps.sds.去氧胆酸钠 np-40等。另外，多加蛋白酶抑制剂。但是这是否有个限度，会不会影响后面westernde 结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:50 标题: 回复 #452 eric930 的帖子

对的，蛋白酶抑制剂你按照标准加就可以了多加一倍是不会有问题的。

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-9 16:51

我有几个问题想请教：
1、从你以前的回贴看到，建议小分子蛋白（我的6KD左右）转膜时，转膜液加20％甲醇和1％SDS，但某位同仁贴的guide中有写转膜的前10－30分钟由于胶中SDS含量较高会降低膜对蛋白的吸附，故胶在转膜前用转膜液平衡15－20分钟洗脱一部分SDS。那么对于我的蛋白，是否应该加1％SDS？（我们实验室一般用不含SDS，10％甲醇的转膜液）

2、从你以前的回贴看到，溴酚蓝和10KD蛋白跑在一起，如果这样，那么电泳时我不能让溴酚蓝跑到玻璃板底部了？因为这样，我的6KD蛋白已经出胶了，但实际上，我每次都让溴酚蓝跑到玻璃板底部，参照小分子marker（1KD－26KD）后发现我的蛋白没有出胶。

3、我看到别人半干15V30‘能转移50KD蛋白，那么我半干10V30’ 或15V20‘转移6KD是否可以？其实，我之前用新配的转膜液半干25V30’或40‘成功转移1－26KDmarker（其中6。5 和3。5KD条带都能在膜上经丽春洪染出），但最近
再用同样的条件，膜经丽春洪染不出条带，转过的胶染色也没有条带，我用0.2PVDF膜，难道透膜了？或是转膜液时间长了？

4、您推荐的《抗体技术实验指南》是那个出版社的？上海有买吗？

经常麻烦，很过意不去，我的6KD蛋白的WB一直作不出，快晕掉了！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 16:51

我给你发过帖子，（可能是你，也是一个要做6kd蛋白的Wb，）我个人觉得做出来的可能性很小，

你实在要试可以改进：
1. 用0.2um的膜
2. 用30％gel
3. transfer buffer 不加SDS或减为原来的25％，加30％甲醇
4. 转移时间用半干（0.2 mA / cm2, 2mins- 10mins)

作者: 研究僧112 时间: 2013-9-9 16:52 标题: 回复 #455 NBA 的帖子

多谢！我已经用的是0.2的PVDF membrane,分离胶用16.5％，由40％丙稀酰胺（37.5：1）灌制，现在我的电泳这步是成功，问题出在转膜，我们的转膜液配方是：Tris-base 3.03 g
甘氨酸 14.4 g
methanol 150 ml
ddwater to 1000 ml
因为用的PVDF膜，所以红宝书上说含15％甲醇，NC膜含20％甲醇，那么将甲醇加到30％的目的是否是增加对蛋白的固定和膜的正电荷，利于对小分子蛋白的吸附？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 16:53

实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外您听说过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？我上面的配方
7M 尿素
2M 硫脲
Triton-x-100 0.2ml
新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v

是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
在前面我看到您建议用改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl, 50 mmol/L, pH 7.5; NaCl, 150 mmol/L; NP-40,1%; 脱氧胆酸钠, 0.5%; SDS, 0.1%; EDTA, 1 mmol/L; PMSF, 1 mmol/L; Leupeptin, 2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何，您还用过？！此外该方中的EDTA, 是否用做蛋白酶抑制剂？
殷切希望尽快得到您的答复，在下感激不尽！！急啊啊！！！

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回答一下你的问题：做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）
对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性（这是有根据的，不是偶自己编的：１，２００２年proteomics上一篇文献曾经报道过２，偶自己做过加或不加cocktail的对比，发现没有显著性差异）
２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法，偶以前发过帖子的，您在版子里搜索一下就可以。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。
此外，您的配方里少了一件必不可少的东西，想一想是什么？希望是键盘误！
ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）
加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。

作者: bs4665 时间: 2013-9-9 16:54

我们用增强化学发光法来做，不知为什么膜泡在显影剂里能看到很亮的条带，可是一旦拿出来，光亮会很快暗淡下去，造成暴光困难，而以前并不是这样的，请问可能会在哪里出了问题？

作者: applebook=213 时间: 2013-9-9 16:55

请问stacking gel中加8M尿素，是指尿素的终浓度为8M，还是加入8M尿素，按什么比例加呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:02

是的，多加点甲醇，有利于小分子蛋白的吸附。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:02

QUOTE:

原帖由 applebook=213 于 2013-9-9 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问stacking gel中加8M尿素，是指尿素的终浓度为8M，还是加入8M尿素，按什么比例加呢？

当然是终浓度了，一般简单一点，你要配多少ml（如4ml）的stacking gel，就加一半的urea（2g）

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:03

是不是显色液放久了，粹灭时间短了。
你看看加如0.1%的H2O2是否有改善

作者: linlinstar 时间: 2013-9-9 17:04

我是新手，问两个问题，大家不要见笑。
1.PVDF 膜是硝酸纤维素膜吗?
2.请问具体用立春红怎么染，立春红是怎么配的，如何脱色？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:04

1. PVDF即带正电荷的尼龙膜 (其实你看看我前面的帖子里有说）
2 '请问具体用立春红怎么染，立春红是怎么配的，如何脱色", 你查任何一般有关蛋白技术的书都有了。不是我不告诉你，只是学会自己找资料才是最重要的。

作者: gmjghh 时间: 2013-9-9 17:05

请教各位大侠，煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久。
有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD,大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？

作者: youyou99 时间: 2013-9-9 17:05

我在这里说说和WB不相关的，减轻NBA的负担，哈哈（少的或不对的请补充）
1 煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。
2 bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有！
3 转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。
4 转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。
5 凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。

作者: prettygirl@ 时间: 2013-9-9 17:06

我的B-actine总是提示我的加样量不一致，可我已经再次测了浓度，加样也十分小心，但仍然不理想，请问可能有哪些因素影响？

再问有何经验能让加样量准确？除了认真以外，有没有其他技术上要注意的细节问题？

请指教，谢谢！

作者: eric930 时间: 2013-9-9 17:07

您14日回帖中提到我的配方中少了“一件必不可少的东西”在下实在驽钝，没看出来，还希望您明言。
此外，我重提一下我的实验目的：我主要是想通过WB的方法，检测一新基因编码的膜蛋白（很有可能）是否在组织中表达。前期工作，该蛋白一定有表达及单抗的制备都没问题。现在我主要是验证该蛋白的表达情况。上周RIPA裂解液抽提的蛋白WB有条带，而尿素配方WB无条带。但是后法所得总蛋白浓度比前者要多，（实验条件相同），我百思不得其解，按理尿素法提总蛋白的效率比不上RIPA 法，而RIPA法提取膜蛋白要比尿素好，结果好象相反？不知我的看法对不对。
现在我关心的是那种方法对抽提膜蛋白比较好，因为我要大量做。
另外向大家请教一事：现在市场上有无专门抽提膜蛋白的KIT，及哪家公司比较好。

作者: TAT 时间: 2013-9-9 17:07

我想问一下那个如果是肠系膜组织，我想提取核和胞内的蛋白来作实验拉，针对液氮冷冻的这种组织怎么样的裂解方法比较合适啊。还有我怎么处理核蛋白和胞质的蛋白比较有效啊，因为我没有很多这方面的经验，请大家多多指教：）

作者: jrwyyplt 时间: 2013-9-9 17:08

相比2×，5×的配制是否所有成分浓度加大为5/2倍？是的，

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是否主要指的是tris、SDS以及用时现加的DTT，而溴酚蓝、甘油保持原来的浓度即可？

作者: yhz1973 时间: 2013-9-9 17:08

您的配方里少了一件必不可少的东西，想一想是什么？希望是键盘误！

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改良的RIPA缓冲液一般是有1 mmol/L DTT帮助裂解细胞, 离心收集上清，然后进行免疫印迹分析。不知道是不是这个

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-9 17:09

一般转移我推荐bio－rad的滤纸，用的很好但是太贵了。

一般要分离“21KD，中至66KD,大致170KD” 最好能分开做，这么广的分布不好转移，

一般建议：

21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge, 湿转36V ， 3－5hrs就可以了，你可以根据你实验室的经验调节。

170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:09

你换种测定方法看看是否可以，另外，实在不行，你可以用β－actin来衡量。

或者分析时直接把β－actin的量做为修正就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:10

你可以用stop buffer来提总蛋白，

或者用ripa提膜蛋白和胞浆蛋白，沉淀不要丢掉，再用stop buffer提核蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:10

是的，
一般很多buffer 都可以如此改造成高浓度的stock，一般注意几个原则就可以了， PH，盐浓度，可溶性，离子强度，等等。

作者: linlinstar 时间: 2013-9-9 17:11

我的细胞裂解液成份含有：NP40,DTT,TRIS-HCL,PMSF,NaCl,aprotinin,NaF,EDTA,不知属于什莫配方名，是RIPA吗？
用此裂解液提取的蛋白进行定量时，以何物作为本底？我用裂解液作本底，结果本底蛋白含量高，甚至高于样品。有人说应该用超纯水作为本底，不知是否正确

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 17:11

您的配方:
7M 尿素
2M 硫脲
Triton-x-100 0.2ml
新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v

偶以前的表述不准,不是必不可少,而是比较重要,裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中,ampholyte起的作用:提供连续的PH梯度,从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)
也不推荐采用SDS,因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变,如果您实在要用,终浓度降到0.1%以下.

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:11

你测蛋白浓度用的什么方法？一般的换一种测定方法就会好一些。
你看看你的裂解液的Ph是否对检测有影响?

作者: kuohao17 时间: 2013-9-9 17:19

一般转移我推荐bio－rad的滤纸，用的很好但是太贵了。

一般要分离“21KD，中至66KD,大致170KD” 最好能分开做，这么广的分布不好转移，

一般建议：
21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge, 湿转36V ， 3－5hrs就可以了，你可以根据你实验室的经验调节。

170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs，

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Thank you very much !
如果用普通滤纸，湿式转移时应用几层，因为我看到前边有人推荐半干转移时用了3层。
您推荐的电压与我原来用的相比有很大差别，原来是用100V，湿转2小时（用冰降温），而且没有考虑过分子量大小，因为我总共也就做了3次，这个时间对小分子来讲，会不会转过？而对170Kd来说，转移时间可能不够？
170kd您推荐使用48V，10hrs－16hrs，常温？还是要采取降温措施，或塞到冰箱里去？
再问一个菜鸟级的问题，我们用的是硝纤膜，转移前应该常温预平衡，还是低温？
企盼回复！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:20 标题: 回复 #479 kuohao17 的帖子

一般我转移时要用2层滤纸。
当然要降温，我们是用冰袋，也可以放到4度冰箱里做。
你的转移条件跟你的实验条件相关，所以你最好参照一下实验室其他人的条件，要是你们的条件还没有建立起来，你可以用我的条件。

最佳的实验条件你可以专门设计个实验来完成，很容易，2天就完了。

作者: lxh031 时间: 2013-9-9 17:22

你测蛋白浓度用的什么方法？一般的换一种测定方法就会好一些。
你看看你的裂解液的Ph是否对检测有影响?

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我用紫外分光光度法，280nm测定。测定裂解液时数值变化较大，不大稳定。裂解液中TRIS的ph是8.0，ph会对检测产生影响吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:24

有些测定方法Ph会对测定有很大的影响，但是你这个因该不会。
你看看是不是测定本身的问题？仪器或操作？
有条件换一种测定方法看看》

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-9 17:25

最佳的实验条件你可以专门设计个实验来完成，很容易，2天就完了。

===================================================================

谢谢NBA的热心帮助！不过偶的水平实在太菜，应该怎样设计实验来确定最佳的条件？

作者: wu11998866 时间: 2013-9-9 17:25

请问大侠，我们做湿法转膜时，转了两块5×8cm的，按照0.65ma/cm2,电压应该为100伏，实际电压仅有40v,已经排除了转移缓冲液的问题，不知道还应该考虑什么其他原因？

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-9 17:26

我们是开始做Western的，转了好几次膜不知为什么都没有转上去，但mark每次都转上去了，用丽春红染膜什么也没有，胶用考马斯亮兰染有时有条带，有时又没。
不知出了什么原因？请多多指教。
不胜感激！

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我和他的问题一样，只能转MARKER，而且MARKER转的也只有几条有，不知该怎样？等会儿用300mA,2.5h试试。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:26

随便说一点，具体的还是要你来想，
1，在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1 个大 well，不插梳子，多上样，）SDS-page 。
2，转移，设定电流或电压。
3，每隔 1（or n）小时，取一点膜染色，看转移效果。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:26

你怎么知道“0.65ma/cm2,电压应该为100伏” 呢？
是否你们原来就是这么多的？
如果是，你看看是不是滤纸的问题？

一般做湿法转移都是推荐用衡压，而不是衡流。
你改用衡压试试。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:27

我们做了这么多，总体感觉是marker比实验中的蛋白要好转，所以只靠marker

来判定有时是不准的。

作者: xue258 时间: 2013-9-9 17:28

谢谢各位，晚上用200mA稳流，2.5h，再做了一次，终于转上去了。
现在用丽春红染后，在摇床上脱色，明天看条带是否还在。
明天准备再重复一次，看看是不是这个条件稳定了，明天见

作者: 8princess8 时间: 2013-9-9 17:28

请问大侠，我们做湿法转膜时，转了两块5×8cm的，按照0.65ma/cm2,电压应该为100伏，实际电压仅有40v,已经排除了转移缓冲液的问题，不知道还应该考虑什么其他原因？

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提高电流及功率。另转膜电压100V太高，40~60V转2~3 h为宜。

作者: xue258 时间: 2013-9-9 17:28

呵呵，下午重复实验做完了，条带的转移情况还不错，条件稳定了。
以后一抗二抗有问题再来找大家聊。
最后谢谢各位热心的帮助～～～

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-9-9 17:29

如果我没记错，半干转移是用恒流。

作者: avi317 时间: 2013-9-9 17:30

我做western跑SDS-PAGE电泳，有好几次电泳出现这种情况：样品在浓缩胶中跑一会儿，在样品下几毫米处就出现一条细细的兰线，好像是某个孔中漏出的样品一样，到最后分离胶中跑的时间长就看不到了，可能扩散了。不知道您碰到过这种情况没有，难道是我灌胶有问题吗，可是我又想不出来我灌胶有什么不对。请指教。谢谢。

作者: zhezhe 时间: 2013-9-9 17:31

请教三个问题：

（1）湿转时是不是没有膜、胶、滤纸的比例限制？
因为“穷” ：（，我一直采用滤纸》胶》膜，似乎还好。

（2）湿转35V持续8个小时会不会把40KD的蛋白质转丢？
我的其他蛋白质表达还行，就是 B-actin 总出不来，不知是否与转的过久有关。

（3）我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9)漂洗15分钟，似乎没什么效果，你有何高招，可否指导一下？

作者: standbyme 时间: 2013-9-9 17:31

多谢各位大侠，转膜的问题解决了，
可是我在做DAB显色的时候又出现了问题，我使用的一抗是自己做的小鼠多抗，本来想做不同的浓度稀释条件的选择，使用了1：200，1：400和1：600，结果是背景很高，目的条带和泳道里的各条带都显色了，是不是我的多抗的特异性很差的结果呢？我使用的二抗浓度、一抗、二抗孵育时间，PBST洗涤时间和别人的都相同，而他们的效果很好啊！

作者: ssonglikihi 时间: 2013-9-9 17:32

多谢各位大侠，转膜的问题解决了，
可是我在做DAB显色的时候又出现了问题，我使用的一抗是自己做的小鼠多抗，本来想做不同的浓度稀释条件的选择，使用了1：200，1：400和1：600，结果是背景很高，目的条带和泳道里的各条带都显色了，是不是我的多抗的特异性很差的结果呢？我使用的二抗浓度、一抗、二抗孵育时间，PBST洗涤时间和别人的都相同，而他们的效果很好啊！

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主要还是要考虑抗体特异性的问题，可以通过加大抗体稀释度来部分解决。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:33

（1）湿转时是不是没有膜、胶、滤纸的比例限制？因为“穷” ：（，我一直采用滤纸》胶》膜，似乎还好。

湿法转移时限制应该没有，我们用的是滤纸》膜》胶，想一下转移的原理就知道了，

2，应该不会丢，不过每个实验室的条件都不一样，你可以尝试缩短时间来看看，

3，你可以加巯基乙醇（loading buffer 一样的浓度），56度， 30mins，看看。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:33

你看看是不是天气干燥，胶缩了，胶和玻璃间，留出空隙了

作者: fox_79 时间: 2013-9-9 17:34

再请教一个问题，我的最终目的是用这个多抗检测细胞膜表面一种蛋白质，因为含量较少，我打算用ECL法，是不是由DAB的方法就可以推测出ECL法的结果会更糟？有没有什么好办法解决呢？郁闷ing!!

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-9 17:35

还有一事请教：
我想在一张膜上同时上两个一抗（鼠抗人）：目的蛋白30KD，阳性CONTROL ，beta-actin40KD，二抗用共同的羊抗鼠，不知是否可行。我打算用百分之十二的分离胶，不知能否分开，有那位对此战友感兴趣，欢迎讨论，更希望得到各位前辈的指导。

作者: glass 时间: 2013-9-9 17:35

请教各位wb高手，我正在做WB，组织裂解液提取总蛋白，目的带100KD，6％分离胶，sds-page条带清晰；湿转100v，1h,丽春红染色后蛋白条带明显；5％脱脂奶粉封闭1h-2h,一抗二抗购自北京中山,一抗1：500低温过夜，PBS洗10min,共3次，TBS10min一次，二抗1：1000，1h,TBS洗10min，3遍，DAB显色，膜上干干净净，连非特异背景都没见到，用二抗检测DAB，没问题。用ACTIN做，也没有结果，且每次转膜均用丽春红染过排除转膜原因，转膜后操作在摇床上进行。请各位帮我分析一下原因，谢谢了！对了，所提取蛋白浓度用Bradford法测过，蛋白上样量绝对

作者: xue258 时间: 2013-9-9 17:40

是不是暴光出问题了，显色液，放时间长了。

作者: IAM007 时间: 2013-9-9 17:40

我用的是别人实验室biorad的湿法转膜，同学用的都是400mA恒流1h转膜，不知道ptglab有什么建议（你似乎说过转膜是恒压？）。另外，原来向你请教的问题现在已经基本解决（提膜蛋白的方法），在此表示感谢。
我现在刚开始做，因为一抗是人血清，所以特异性不是很好，而我要的条带是带有某种残基的糖蛋白，所以显示出来的是不同分子量的一系列条带，现在的问题是条带模模糊糊的有，但背景太深，用大量的Tween洗，又出现条带不均匀的问题，请帮忙解决一下。（抗体的滴度我调了好多次，但不稳定）

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:40

你用来免疫的抗原是什么？用来做WB的抗原是什么？

你是4军医大的吧？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:41

你要确定你的抗β-actin(43kd)的抗体是鼠抗的。

另外如果是肯定可以做出来，12％sds-page.

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:42

你再看看是不是2抗被稀释的太多了，你用1:300试试，

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:42

要是我没有记错，你测的是猪的Gal，
“条带是带有某种残基的糖蛋白，所以显示出来的是不同分子量的一系列条带”
你看看是否做8M urea的上层胶，前面的帖子里有说。

另外湿法转移是衡压，你可以参照我前面的帖子看看。

作者: plaa 时间: 2013-9-9 17:42

我用来免疫的抗原是GST融合的钾离子通道的beta亚基蛋白的胞内段的包涵体，用来作WB的抗原是我的表达蛋白和诱导的空载体，还没有用我纯化的目的蛋白作过，因为比较少啊。
以前几次都是做的ELISA，效价还可以的。，我在FMMU

作者: bgf5 时间: 2013-9-9 17:43

问题一：胰腺腺泡细胞胞核蛋白的提取有什么特别的方法吗？我们提取了几次，在western blot上的着色时有时无，即使有一点也很淡（与其他组织的提取物相比）。是不是因为胰腺腺泡细胞里含有许多酶的缘故？该如何应对？
问题二：我的目的蛋白29KD，但western blot上只有稍大于51KD的地方着色。在积层胶里加了8M的尿素后，29KD的地方出现了较浅的着色，较深的着色仍在大于51KD的地方。我还能怎么改进？
问题三：如果目的蛋白存在ADP-ribosyl moieties修饰，使得其在PAGE胶上的分子量表现发生改变。如何消除这种影响？
先谢过了！！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:44

哪就对了，你免疫的东西里有很多菌体蛋白，免疫产生的血清的里就有相应的抗体，
而你表达的目的蛋白和空载体里有相同的蛋白，所以就有相应的条带了。
你这要做纯化才行

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:45

我只能答第二个问题，
制样时加8M的Urea试试。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:47

问题一：胰腺腺泡细胞胞核蛋白的提取有什么特别的方法吗？我们提取了几次，在western blot上的着色时有时无，即使有一点也很淡（与其他组织的提取物相比）。是不是因为胰腺腺泡细胞里含有许多酶的缘故？该如何应对？

你匀浆时在4度，提取时直接加stop buffer试试看，另外stop buffer不要加多了，尽量使蛋白浓度高一点。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-9 17:47

各位大侠,本人现在在做wb,蛋白是基因转染后在细胞内表达用一般的细胞裂界液裂界后,加上样buffer,电泳,转膜后按照普通的wb方法进行。此蛋白本身是膜蛋白,基因转染后在表达的蛋白还是膜蛋白吗?我不清楚用普通的方法溶解细胞,膜蛋白能检测到吗?几次wb的结果都很相似:与空白对照的条带大小差不多,只有一条带.不知什么原因?是二抗的问题吗? 先谢了!

作者: bring 时间: 2013-9-9 17:49

相关疾病：
甲状腺癌结节性甲状腺肿
我要做bFGF转基因表达，想用western证实蛋白表达，分子量18kd，购买的是CYTOLAB的兔抗人抗体，建议western一抗用1/5000到10000，用这个抗体作了一次甲状腺癌和结节性甲状腺肿的组织裂解后的western，抗体用1/3000，丽春红染色效果很好，可是，最后DAB染色没有任何结果，二抗实验过，DAB显色没问题，中间过程都是按分子克隆的步骤作的，封闭时间也做过调整，还有什么可能的原因呢
之前一个师姐也作过别的蛋白，用另一套抗体和二抗，也与我的结果一样，怎么回事呢？
盼望拉我一把：（
谢了

作者: qumm1985 时间: 2013-9-9 17:50

我的目的蛋白是HBV表面抗原，使用的抗体是小鼠腹水，结果出现了较多的非特异条带，而且显色深，显色时间短。想问一下表面抗原加热和SDS变性后是否影响后面的检测

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:50

具体的蛋白的定位你可以用免疫荧光先定位一下，但是就一般而言，你表达的是个膜蛋白，就最有可能在膜蛋白上。你提蛋白

时可以将总蛋白提出后做个对照。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:51

“购买的是CYTOLAB的人抗兔抗体” 是兔抗人吧？

你如果用组织做，建议不要将一抗用这么高的稀释度，你做1：1000－500试试， DAB不够灵敏，你用用Ecl。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:52

你的单抗检测过吗？特异性好吗？

还有你减少上样量（原来抗原量的30％），减少显色时间看看效果。

作者: caihong 时间: 2013-9-9 17:53

哪种染色方法对NC膜上的蛋白检测最灵敏呀？我怎样从NC膜上洗脱下蛋白，然后进行质谱鉴定？有没有这方面的参考文献吗？谢谢

作者: gogo 时间: 2013-9-9 17:55

我所知的染膜的方法有几种，比如丽春红，考马斯亮蓝等，但是我不知道哪种方法的灵敏度高。还有一个问题是：能不能把western中转到膜上的蛋白给洗脱下来，有没有这方面的参考文献

作者: ritou1985 时间: 2013-9-9 17:56

还记得我么？
上次改变了条件，（50mA过夜）变为（200mA2.5h）后出现了条带，
可是有人告诉我分子克隆上的转移缓冲液是不对的（我用的是biorad的湿转），
给了我一个配方，问师兄他也说那个配方是对的，所以昨天改还了缓冲液，
可是在200mA2.5h条件下转膜后，用丽春红染后没有任何条带，郁闷，
大家看看，我应该哪里改进呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:56

我也知道这两个染膜的方法, 相对而言考马斯亮蓝灵敏度高些.
但是我真不懂如何把膜上的蛋白洗下来.
你为什么要洗膜呢?
是为了省膜吗? 但是这样膜肯定没有用了.
为了提蛋白吗? 可这不需要转膜以后洗脱呀.

作者: bring 时间: 2013-9-9 17:57

今天我把BSA点在膜上，用考马斯亮蓝染色，但是脱色怎么也脱不下来，你能告诉我脱色的方法吗？谢谢

作者: 3648755 时间: 2013-9-9 17:57

WB实验半定量加ACTIN内参，转好模后，是不是两种一抗同时加孵育，两种一抗会不会相互反应？

有没有具体的步骤

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:58

具体的转移方法是根据实验器具的不同有变化的(但是变化不大), 我觉得用什么样的buffer不是特别重要(甲醇含量重要一点), 如果你用过的buffer可以,你就用没有问题.
但是我觉得最重要的还是实验条件. 你改改转移的条件会好一点

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:58

考马斯亮蓝染完以后是脱不下来的吧, 那有脱色方法呀?

作者: NBA 时间: 2013-9-9 17:59

一般情况下可以一起孵育, 但是你要看看两个分子量是否很相近, 太相近显色时倒是会相互影响的.

作者: any333 时间: 2013-9-9 18:00

测同一蛋白总量与磷酸化的量，如何STRIP？
你上次说用二巯基乙醇，能否讲的在具体些，比如配置的具体方法，以及洗膜的方法，谢谢！

作者: INK 时间: 2013-9-9 18:00

一抗可以回收吗?什么时候回收的一抗不能用了?

谢谢

作者: zzzz 时间: 2013-9-9 18:01

怎么STRIP才能使一抗与膜上蛋白分离,因为我需要测干预后同一蛋白质的表达总量与磷酸化的量,且预期二者并不平行,以前做的相互间暴光背景影响太大,你能否介绍种对我的实验而言最为适合的STRIP的方法，谢谢！

作者: lixi559 时间: 2013-9-9 18:18

我也请教众高手几个问题：
1．我的marker带没出全的时候怎么看？（对照说明书从点样孔从大到小吗？我的胶浓度与marker说明书上胶浓度不一致，会不会中间有没出来的，因为有时我做出来的与参考文献该蛋白分子量不一致。）
2．如想重复利用，洗脱液的配方及冼脱方法怎样最好？处理后再做的结果如何？
3．溴酚兰相当于10KD蛋白（在不同凝胶浓度中也一样吗？）我以前听人说过相当于20KD的蛋白，说是分子克隆上说的，不过我没翻到过，我有点懒，没染胶看过。
4．荧光太强，显影时前2，3张X片子还可以，以后的在条带中间有空洞的地方，这是怎么回事呢？（已减低上样蛋白总量很多也出现这种情况）

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:18

strip的方法你可以在帖子里或网上查的到, 有很多种, 我一般推荐用有β-巯基乙醇的方法. 另外我觉得你该用IP测

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:18

可以回收用的, 但是最好是在4度孵育的一抗用来回收,

一般用2到5次就不能用了

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:19

1 根据相对大小来判断, 一般从上到下数,
2 自己多查下资料
3 同上
4 条带中的空洞? 是否是转移时的产出的气泡?

作者: xingyi08 时间: 2013-9-9 18:19

"可以回收用的, 但是最好是在4度孵育的一抗用来回收,
一般用2到5次就不能用了 "
如何回收？我是把一抗加到5/100的脱脂奶粉里，4度孵育过夜的，难道回收就是把加过一抗的过夜奶粉，留下来，继续用？有时间限制吗？如果能这样就太好了，我天天WESTERN 一抗用量很大的，请问，二抗可以回收利用吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:19

是的, 将5%的milk回收用就可以了.(2个月之内没有问题)

2抗也一样的,但是酶活力会下降很多, 一般不推荐用, 2抗很便宜, 你不要回收用,影响结果划不来.

作者: one 时间: 2013-9-9 18:20

你能不能讲具体些，β-巯基乙醇到底怎么用，比如说配方和操作步骤，

再有，IP指的是什么呀？本人水平有限，还请不吝赐教，谢谢！

作者: PCR 时间: 2013-9-9 18:20

我想知道ECL发光剂的组成，我最想知道的是促增剂的成份，我知道的有对碘苯酚，对碘苯硼酸，还有新合成的，但无商品，请大家帮帮

作者: is2011 时间: 2013-9-9 18:21

1.电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。
电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。

2.转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！
做wb时理论上单抗也应该有带，但由于单抗识别抗原结构的单一性，有时候对于抗原的某些结构不识别，因而wb的结果有时候不好。

3.细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？
这个制样步骤没什么问题。

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38mA，100分钟？
我的目标蛋白bcl2的分子量是26kd，我用分子克隆上的200mA，2.5h，
结果nc膜上什么也没有，会不会转过头了啊？

作者: is2011 时间: 2013-9-9 18:22

昨天转膜的胶我用考马斯亮兰然后，发现条带还在上面
转移缓冲液是 3.08g Tris-base, 14.4g甘氨酸， 200ml甲醇，用去离子水稀释到1000ml
nc膜（Hybond），200mA 2.5h

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:22

β-巯基乙醇是用来打开抗体的2硫键的,
IP是指的免疫沉淀.(方法你可以找的到)

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:23

我们用的一直是买的ECL试剂,只知道是鲁米诺和H2O2,还有增强剂,不清楚配方,现在也想找配方,

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:24

"我的目标蛋白bcl2的分子量是26kd，我用分子克隆上的200mA，2.5h，
结果nc膜上什么也没有，会不会转过头了啊"

你要是用的是半干法就转过头了.或者甲醇加的不够.
要是用湿法,建议用36V转移 6-8小时

作者: kuaizige 时间: 2013-9-9 18:24

请问大虾：检测flag M2 的二抗是rat 还是 mouse，我用后者没有条带。难道是一抗有问题，或者根本转染失败。

作者: NBA 时间: 2013-9-9 18:24

QUOTE:

原帖由 kuaizige 于 2013-9-9 18:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问大虾：检测flag M2 的二抗是rat 还是 mouse，我用后者没有条带。难道是一抗有问题，或者根本转染失败。

你用的flag的一抗是小鼠抗体flag 还是大鼠抗flag?
如果是小鼠抗flag 就用抗小鼠的2抗如果是大鼠抗flag 就用抗大鼠的2抗.

作者: kuaizige 时间: 2013-9-9 18:25

一抗的说明如下：The Anti-FLAG monoclonal antibody is a purified igG1 antibody purified from a Murine cell culture. 我不知道是大鼠还是小鼠。

作者: kuaizige 时间: 2013-9-9 18:26

知道国内有卖对碘苯硼酸的吗？luminol 和H2O2没问题，只是瞬间法光，要想延长这种发光时间，关键在enhancer的选择，对吗？

作者: kuaizige 时间: 2013-9-9 18:27

想问一下,如何将MARKER 标记在膜上??

作者: hold住 时间: 2013-9-10 08:41

thank you for your such many answers for the newcomers. And I have some problemswhich I could not found the answer in here.
I am doing the WB with the cell samples. Before you said may be we can use the loading buffer to get the protein from cell, I just want to know what is the loading beffer?Now my protocol is that wash the cell after procedure with PBS once and overlay it ith 2mMEDTA/PBS(-) , incubate 5 min on ice and scrape into the collection tube, centrifuge and discard the supernatant ,then add one kind of lysis buffer into the cell pellet to get total protein samples from total cell. The problem is that I check and found the cells were already
damaged after scrape before adding lysis buffer, so I am worry about if in here the cells were already damaged ,and after centrifuge the protein in
cytoplasma would be lost , so the protein I got finally can not be said total protein, and may be just can be said as total protein in nuclear.But I need the total protein from total cell!

Can you understand my problem?

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-10 08:41

我的抗体是用细胞粗提物做的抗原,做了个Western,只有针对其他蛋白的非特异性的条带出现。我的目的条带,15KD,却没有出现。想请问会不会是我的抗体有问题？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 08:42

QUOTE:

原帖由 dongdongqiang 于 2013-9-10 08:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的抗体是用细胞粗提物做的抗原,做了个Western,只有针对其他蛋白的非特异性的条带出现。我的目的条带,15KD,却没有出现。想请问会不会是我的抗体有问题？ ...

I list a new protorol . You can try it, may be it is useful .

1, washing the cell by iced pbs, more than 6 times , 2mins per times.
2, add 5x stop buffer (10000000 cells add 0.4-0.8ml ), let it cover the cell s , incubate 5-10 mins on the ice.
3, scrape lysis into collection tube.
4, sonicate ( damaged the DNA)
5, centrifuge and discard the pellet .
6, collect the supernatant .
5x stop buffer
20% Glycerol
10% sds
250 mM tris-base
PH=6.7

作者: NBA 时间: 2013-9-10 10:37

不一定是1抗的问题, 你的抗原的目的带太小了, 说不定是你转移的问题导致的目的带不显色.
你看看是否有比你目的带更低的条带显色.

作者: idea2011 时间: 2013-9-10 13:10

我做过很多次SDS-PAGE，可是这一次出了问题：分离胶跑了一段距离才有条带出现，好象是大分子量的蛋白没有跑出来。我想了想，我这次用的甘氨酸换了。各位，不知道是不是换试剂的原因。
还有，我转膜总是转不好，是否也和甘氨酸有关。（用立春红染条带很少，而转膜后的胶用考马斯蓝染条带还很清楚，很明显，蛋白没有转到膜上）
各位请帮帮忙！

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:11

能否告诉我提取组织膜蛋白的裂解液配方？ICAM－1定义为细胞膜表面的糖蛋白，是不是在细胞膜上表达？？胞浆内有吗？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:13

已经作了几次western,转完膜后丽春红染色蛋白带明显，一抗二抗均来自中山，一抗用含1％的奶粉的PBS稀释1：200，（低温过夜）；PBS洗3遍每次10min，TBS洗一遍10min;二抗用含1％奶粉的TBS稀释，1：2000；TBS洗3遍，每次10min,DAB显色，nc膜上什么也没有？actin也没有结果，未转膜的PAGE胶考马斯亮蓝染色蛋白明显，所有转膜后操作及液体配置均按照卢圣栋一书操作，总认为不可能两对抗体同时出问题，且一抗二抗匹配，二抗用DAB试过着色明显，请诸位专家高手帮忙找一下原因，谢谢！我做的ICAM是膜蛋白，组织裂解液是提取总蛋白的，有问题吗，能否一起告诉我提取膜蛋白配方?

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:14

能否告诉我提取组织膜蛋白的裂解液配方？ICAM－1定义为细胞膜表面的糖蛋白，是不是在细胞膜上表达？？胞浆内有吗？

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膜蛋白的提取方子在蛋白版的技术资料区可以找到，或者用搜索功能查找。

如果定义为细胞膜表面的膜蛋白，那当然是在细胞膜表达。不过根据一些膜蛋白的特点，可能在高尔基体里或是细胞质内其它膜组织也有。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:15

你先延长转移时间试试有没有效果。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:15

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2013-9-10 13:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
已经作了几次western,转完膜后丽春红染色蛋白带明显，一抗二抗均来自中山，一抗用含1％的奶粉的PBS稀释1：200，（低温过夜）；PBS洗3遍每次10min，TBS洗一遍10min;二抗用含1％奶粉的TBS稀释，1：2000；TBS洗3遍，每次10min,DAB显色，nc膜上什么也没 ...

能否告诉我提取组织膜蛋白的裂解液配方？ICAM－1定义为细胞膜表面的糖蛋白，是不是在细胞膜上表达？？胞浆内有吗？

你用ripa提取液就可以了，也可以用提总蛋白的提取液。我做过Icam-1， Icam－2的Wb，是检测我们自己的Icam－1，－2，抗体。这两个蛋白的Wb都很好做。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:15

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原帖由 moonlight45 于 2013-9-10 13:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
能否告诉我提取组织膜蛋白的裂解液配方？ICAM－1定义为细胞膜表面的糖蛋白，是不是在细胞膜上表达？？胞浆内有吗？

你把2抗降到1：500试试。

作者: INK 时间: 2013-9-10 13:16

我现在做的也是膜蛋白，用的载体是 pcDNA3.0,SDS-PAGE胶上的目的条带很淡，我想浓缩蛋白，ripa提取液可以吗？能否惠赠配方？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:16

我想做视网膜中的蛋白的western blot ,分子量有24KD。
请问：
1，视网膜剥离后怎么裂解？
2，蛋白上样量是多少？
3，电泳参数设置？
4，转膜参数？
5，谢谢！

作者: okhaha 时间: 2013-9-10 13:17

在各位大侠的帮助下，WB每次都能做出条带，只是美中不足的是ECL显色得到的条带，比较弥散（1-2cm 宽），显得有点模糊不清。我的基本试验流程：RIPA裂解液（含SDS Triton-100两种去垢剂）提取膜蛋白，PAGE电泳是，预染MARKER条带还算细，恒流半干转膜，marker 也转的很好，细细窄窄的。一抗4度过夜，二抗37度1h。作了几次都是如此，比较郁闷，还望高手指点迷津！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:17

“我想浓缩蛋白，ripa提取液可以吗？”你是提取还是要浓缩提取好的蛋白呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:17

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原帖由 okhaha 于 2013-9-10 13:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
在各位大侠的帮助下，WB每次都能做出条带，只是美中不足的是ECL显色得到的条带，比较弥散（1-2cm 宽），显得有点模糊不清。我的基本试验流程：RIPA裂解液（含SDS Triton-100两种去垢剂）提取膜蛋白，PAGE电泳是，预染MARKER条带还算细，恒流 ...

弥散的问题，你看看样品的离子浓度的是否和电泳，转移buffer是否接近。

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:18

这几天因为特殊原因，一直没有上网，看到你提的建议，感激万分！我的裂解液配方如下：
50mmol/L Tris.hcl(pH8.0)
150mmol/L Nacl
0.02% 叠氮钠
0.1% SDS
100ug/ml PMSF
1ug/ml aprotinin
1% Np-40
是提取总蛋白的，请问什么是ripa提取液？能告诉我配方吗？知道你作过ICAM-1，就像住到了救命的稻草一样，前几天怀疑我配的试剂有问题，昨天又找一位专做WB的老师给做了一下，只用了我的组织标本和抗体，还是没有结果，现在是担心抗体，中山的，应该不会吧？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:19

我做的是糖尿病大鼠肾脏组织，你曾做的ICAM-1，是组织还是细胞？另外提取蛋白以后，ICAM-1蛋白保存有什么特殊要求吗？仔细想想我以前的实验，抗体和试剂都换过了(ICAM-1一抗在操作不熟练时用过博士德的，后来用的是中山Santa cruz的),所有试验的共同通路是我的组织和蛋白，组织在液氮保存2月后，因为做RT-PCR取出一直在－80保存至今约四个月，有问题吗？最好能告诉我你的ICAM-1用的哪个公司的抗体！急切等待你的回复！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:20

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原帖由 moonlight45 于 2013-9-10 13:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是糖尿病大鼠肾脏组织，你曾做的ICAM-1，是组织还是细胞？另外提取蛋白以后，ICAM-1蛋白保存有什么特殊要求吗？仔细想想我以前的实验，抗体和试剂都换过了(ICAM-1一抗在操作不熟练时用过博士德的，后来用的是中山Santa cruz ...

你的裂解液配方就可以当ripa来用。没有问题，但是不是提总蛋白的，是提胞浆和膜蛋白的。可能是提蛋白有点问题。你提的浓度太低了。
我做过组织和细胞的Icam1的检测。用的是我们公司自己生产的Icam1的抗体。做的时候很普通，没有特别要注意的地方。
如果你的提蛋白过程没有问题，就看看是不是一抗的问题了。
你会不会测定蛋白浓度有问题，你跑sds-page检测了没有？

作者: tianmei001 时间: 2013-9-10 13:20

请问做免疫印记增强化学发光法：在暗室中我能看到我的膜发出荧光，但没见条带，是不是做的好应该直接可用肉眼看到条带发光？我的背景是不是太高了？谢谢先

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:21

看到你的回复很高兴，多谢了！我提的蛋白用bradford法测过浓度，都在15－25微克／微升，所以上样总蛋白都在150－250微克左右，sds-page胶蛋白条带明显。应该没有问题。抗体是从中山新买的，ICAM-1,actin 都是多抗，同时出问题的可能性很小吧，尤其actin没有结果让我很不理解。带教老师也怀疑一抗有问题但还需要进一步确证。能否告诉我你怎样判断裂解液是提取哪种蛋白的吗，对我这个药理专业的人来说很神秘啊，所提问题可能幼稚请别见笑！

作者: tianmei001 时间: 2013-9-10 13:21

“弥散的问题，你看看样品的离子浓度的是否和电泳，转移buffer是否接近"
我看的不是十分明白，是指总离子浓度吗？但在样品处理过程中，除了RIPA 裂解液，还要加入几种其他试剂，怎么准确衡量其离子浓度，而电泳液在使用过程中，离子有消耗，这都使“离子浓度”存在不确定因素，况且师兄做另外一个蛋白（试验条件基本一样），作出的条带又窄又浓，唯独我这个蛋白，作出的条带，又宽又弥散。
此外，如果是离子浓度接近，该如何调整？调谁的离子浓度容易操作些呢？您还有可行的经验吗？还望 ptglab兄，不吝赐教，我都急死了！

作者: am10 时间: 2013-9-10 13:21

问了你那么多次，我自己都有些不好意思了。可是有些地方我还没弄清楚，还望明示：

（1）STRIP时若用甘氨酸PH值是多少？

（2）若用2-ME，我究竟该怎么配，难道就用TBST配200mM的2-ME？若是的话，TBST的PH值要求是多少？

我真的很迫切需要解决这个问题，请帮帮忙吧，我老板说我年前若出不了好结果就甭回去过年了。：（

作者: fox_79 时间: 2013-9-10 13:22

My stripping buffer recipe:
100mM 2-Mercaptoethanol, 2%SDS, 62.5mM Tris-HCl pH6.7

作者: am10 时间: 2013-9-10 13:22

你的方法我已经试过，似乎太强烈了，STRIP后蛋白质带看不到啦：（

50度30分钟，我应该没有搞错，是不是对不同蛋白质，效果不一样。还是因为我的膜在4度冰箱放了几天，可也应该影响不大呀。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:23

是背景太高了，你先降低背景看看是否能够改善。有时候，背景高了会遮盖条带。
不一定非要肉眼可见的条带，Ecl是很敏感的。

作者: vivian4123 时间: 2013-9-10 13:23

湿转时，用恒压或恒流有什么区别呀？

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-10 13:23

请教转一个分子量1k多的小肽应该注意些什么？做了几次膜上都未留住样品。

作者: 雪花子 时间: 2013-9-10 13:24

wb 条带弥散，谁有好办法？？

谢了先！！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:24

你转移后用丽春红染色看了没有？

“判断裂解液是提取哪种蛋白”你看看分子克隆，里面有说，原则是什么样的去垢剂溶解什么样的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:24

你将样品溶液中的盐浓度降低，为原来的30% 转移时transfer buffer加甲醇至20％，看看又没有改善。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:25

（1）STRIP时若用甘氨酸PH值是多少？
可以用到。3.5-7.6,都可以用。

（2）若用2-ME，我究竟该怎么配，难道就用TBST配200mM的2-ME？若是的话，TBST的PH值要求是多少？
ph=6.7

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:25

我没有颠倒过试试，做好要这么做，我想时为了稳定转移时的效果，才分别根据条件系统的不同，改成这样的。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:26

你很难做出来，这么小的多肽是很难做出。

作者: gogo 时间: 2013-9-10 13:26

我不明白你的意思：（
你觉得恒压和恒流的区别在哪里呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:26

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原帖由 gogo 于 2013-9-10 13:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我不明白你的意思：（
你觉得恒压和恒流的区别在哪里呢？

具体的说恒压是用在tank system，恒流是用在半干法的。
但是具体为什么这么选，我并没有细想过，可能是因为稳定转移才分别选用2中不同的系统吧，希望知道的兄弟给点指导

作者: gogo 时间: 2013-9-10 13:27

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原帖由 NBA 于 2013-9-10 13:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

具体的说恒压是用在tank system，恒流是用在半干法的。
但是具体为什么这么选，我并没有细想过，可能是因为稳定转移才分别选用2中不同的系统吧，希望知道的兄弟给点指导 ...

湿转（bio-rad）时，我用的是恒流，marker都转到膜上了。但是实验室其他人用的是恒压，所以我想知道两者的区别：）

作者: INK 时间: 2013-9-10 13:27

我是新手，WB测药物对p53等蛋白表达的影响
做了一个月了，也没得到较清晰的条带，郁闷中，特来求救。
我的实验全步骤如下：
细胞铲刮取贴壁细胞（约1000000 cells），低速离心收集，PBS离心洗涤一次,
冰浴下加Lysis Buffer 60 ul,涡旋30 min,12000 rpm离心10 min,取上清为蛋白样品液。
Bradford法测蛋白浓度，加5×Loading Buffer,煮沸5 min,
按50 ug蛋白/well上样,12％浓缩胶，mini-gel ，100 V,电泳2 h。
转膜条件：100 V,冰浴，2 h.
Blocking Buffer（1X TBS, 0.1%Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk）封闭1 h、
TBS洗膜10 min X 3，
一抗(Santa Cruz单抗，推荐稀释度1：500－1：5000，选1：1000)孵育，4度过夜、
TBS洗膜10 min X 3，
二抗(Santa Cruz，推荐稀释度1：1000－1：5000，选1：2000)孵育2 h,
TBS洗膜10 min X 3，
ECL显色。
每次转膜后，预染Marker均可全部转到膜上，膜用丽春红染可见清晰条带，
胶用考染，预染Marker泳道未见条带，其余泳道高分子量可见较淡的条带，低分子量无条带。
我共做了7次，只有2次在暗室中可依稀看到膜上条带荧光，压片后，x片上的条带很淡。
我觉得可能原因：
1）Lysis Buffer中少4种成分，请问这4种成分的作用，不加是否有影响？
Lysis Buffer：
150mmol/L NaCl
1mmol/L EDTA
1mmol/L EGTA
1% Triton X-100
100ug/ml PMSF
(没加 sodium pyrophosphate、b-Glycerolphosphate、Na3VO4、Leupeptin)
2）一抗、二抗稀释度过高，
我打算今天把一抗降到1：200、1：500，二抗降到1：500、1：1000，再试试看。
3)一抗失效，
我不知怎么检测一抗是否失效（二抗在暗室中可使ECL发强荧光，应该未失效）

请给些建议，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:28

我觉得最大的可能是一抗被稀释的太多了，你用1：100－200试试

作者: plaa 时间: 2013-9-10 13:29

我的目的蛋白在14K左右，但我跑15%的胶以后，考染发现30KD以下的条带都消失了，转印后，PVDF膜上也看不见，不知道是什么原因造成的！
请多指教！

作者: JK.jon 时间: 2013-9-10 13:29

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原帖由 INK 于 2013-9-10 13:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是新手，WB测药物对p53等蛋白表达的影响
做了一个月了，也没得到较清晰的条带，郁闷中，特来求救。
我的实验全步骤如下：
细胞铲刮取贴壁细胞（约1000000 cells），低速离心收集，PBS离心洗涤一次,
冰浴下加Lysis Buffer 60 ul,涡旋3 ...

可能一抗稀释度过高；一抗失效不大可能，检测方法可用琼脂扩散或ELISA；最后你可做RT-PCR，确证是否表达目的蛋白。
12％浓缩胶？

作者: sunnyB 时间: 2013-9-10 13:30

我前几天做WESTERN，前面几步都比较满意，就是在最后显色的时候遇到一些问题，想请教一下。我用TMB显色，虽然有蓝色出现，但是颜色很浅，而且很快就会退色，用硫酸中止反应，开始是蓝色变成黄色，但是也马上就退掉，无法拍照。请问如果仍然想用TMB显色，如何改进显色方法。

作者: tianmei001 时间: 2013-9-10 13:30

我用一抗1：100试了一下，条带比以前深了一些
我打算再作一次，希望能做得更漂亮些
“12％浓缩胶”写错了，是12％分离胶

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:30

多谢你的建议！我的actin出结果了，icam-1没有，抗体浓度加大，分别为ICAM-1，1：100；actin1:250,二抗1：500（santa cruz产品），目的带没出不知是不是因为表达量低？IH结果不错的。actin背景太深，所有封闭及一抗和二抗的稀释均用PBS-T,封闭过夜，一抗1.5h,，二抗0.5h，DAB显色时间长才出带，老板让我换PVDF膜，是不是用EcL代替DAB会更好一些，如果我的目的蛋白表达丰度低，怎样才能检测出来??

作者: plaa 时间: 2013-9-10 13:31

你看看60kd左右的带是否是dimer，或是糖基化的作用，
有个办法可以试试看，你做8M urea 的stacking gel, 看看有无改善。

不要客气，有问题可以再问我

=============================

dimer是指的什么　？
8M urea 的stacking gel　　怎么做？

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-9-10 13:31

急!急!急! 请问我做western时,先杂交第一个抗体出来了一团东西,内参杂出来很漂亮,再杂第二个抗体就什么条带都没有啦!请教一下这是怎么回事,我可以剥离之后再接着杂吗?多谢!

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-9-10 13:31

还有我的抗体除第一个抗体外均为新买的,Santa Cruz 分装的!

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:32

照道理说15%的胶分离14kd的蛋白没有问题，你看看是不是2个地方出问题了，
1 胶浓度不对，或下缘跑出去了。
2 running buffer里SDS太多了？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:32

我没有用tmb做过wb的显色底物，我只做过Elisa的底物。真帮不了你。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:32

你有条件可以加3抗，这样条带会更明显。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:33

是不是剥离的太厉害了？另外，你具体的实验我没有看，不敢妄下结论。

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-9-10 13:33

那能否请教怎样剥离才能减少损失呢?

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:34

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原帖由 大海啊故乡 于 2013-9-10 13:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那能否请教怎样剥离才能减少损失呢?

你用running buffer or transfer buffer加上100mM β－ME，试试

作者: orangecake 时间: 2013-9-10 13:34

我用western作几种60-80KD的蛋白的半定量。
用的gels是invitrogen的成品Tris-glycine gel，胶的浓度我用过8%和12%的。这种胶厚1mm，10 wells。另外这种胶的stacking gel和separating gel的浓度是一样的，（那这两种胶还有什么区别？是不是两者pH值不一样呢？)，我跑胶用的是130V恒压。

现在我主要的问题是跑胶，跑出来的条带甚至marker经常歪歪扭扭的，有的还有些残缺不全。不同的道的带宽窄还不一样（这点最让人郁闷)。有时候，带跑的还不齐，不同的lane的同一蛋白不在同一个水平。

我分析了一下/
1。是不是我的sample有问题，我是把细胞裂解以后，超声处理，离心，取上清。上样前加loading buffer(主要含BME和dye)，煮沸5 min。
2。上样量过多么？我一般load 30-40 ul，别人用同样的胶load过45ul，都没有问题。
3。胶的pH有问题？我上样前都会拿running buffer洗well，调整well的pH。是洗得不够呢，还是不小心把well冲坏了呢？
4。电压用的有问题么？我用130V，按照说明上作的。
请大家帮我分析一下原因吧，怎么让胶跑的漂亮一些！多谢啊
附上胶的说明。

图片附件: 90394113.snap.jpg (2013-9-10 13:34, 53.67 KB) / 该附件被下载次数 24
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18217

作者: hold住 时间: 2013-9-10 13:35

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原帖由 orangecake 于 2013-9-10 13:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用western作几种60-80KD的蛋白的半定量。
用的gels是invitrogen的成品Tris-glycine gel，胶的浓度我用过8%和12%的。这种胶厚1mm，10 wells。另外这种胶的stacking gel和separating gel的浓度是一样的，（那这两种胶还有什 ...

Check the iron concentration in your samples. Generally if the iron concentration is too high, it can cause the result as you were saying.

作者: orangecake 时间: 2013-9-10 13:35

那如何check和adjust iron concentration呢？

作者: hold住 时间: 2013-9-10 13:36

如果蛋白浓度还可以，试一下稀释样品，如果不行就用三氯乙酸沉一下再上样。一般来说比一下样品里的离子强度与loading 缓冲液里的离子强度，差别大了就要处理一下。我做过的，硫酸铵的影响大一些，尤其是从柱子下来后用硫酸铵处理过的。不过如果要定性也无大碍，要是做WB还是尽量做得漂亮些。

作者: idea2011 时间: 2013-9-10 13:36

you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.
这是指电泳的上样量吧，这么说来，每空上样量很小，考染还然不出来呢，我没说错吧？

作者: 987789 时间: 2013-9-10 13:36

16KD的蛋白是不是只能用0.22孔径的膜,不能用0.45的膜?

作者: avi317 时间: 2013-9-10 13:37

请问ptglab高手:
公司里提供的一抗抗体有几种，有的只适于做WESTERN，有的只适于做免疫组化，而有的两者都适合。我现在手头上的一抗是适于做组化的，而且组化我也做出来了，但我想用它来做WESTERN，试了几次都没有作出，阳性对照也没出来，不知是否抗体不适合，还是有其他什么原因，请予指点。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:37

你理解错了，或者是我没有表说清楚，这里的 you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.
指的是每个单个的条带（或者说对某一个的蛋白，比方说Actin）的最大上样量不能超过0.3ug/mm2 ，否则这个蛋白的电泳条带就会变型。对于一次总蛋白的loading的量来说，15ug-30ug/mm2 ,是可以的，再多也就不行了

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:37

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原帖由 987789 于 2013-9-10 13:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
16KD的蛋白是不是只能用0.22孔径的膜,不能用0.45的膜?

不是做不出来，是不太好做，一般不建议用。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:38

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原帖由 avi317 于 2013-9-10 13:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问ptglab高手:
公司里提供的一抗抗体有几种，有的只适于做WESTERN，有的只适于做免疫组化，而有的两者都适合。我现在手头上的一抗是适于做组化的，而且组化我也做出来了，但我想用它来做WESTERN，试了几次都没有作出，阳性对照也 ...

是一抗不适合，你不用再试了

作者: owanaka 时间: 2013-9-10 13:38

这是我跑的膜，出现了很多杂带，能不能给我提点建议？图中蓝色的是marker,旁边是两条泳道，一条是IP后的产物，一条是IP时用的抗体，DAB显色。

图片附件: 47502086.snap.jpg (2013-9-10 13:38, 12.2 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18218

作者: she 时间: 2013-9-10 13:39

我要分离两个同源蛋白，一个是937个Aa,另一个比其少57个Aa，分子量分别是
105KD和98KD，我想做western blotting ,作出两条带，以验证两种蛋白都存在。
不知能否做出来，如果能，用多大的胶，望指点，谢谢！！

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-9-10 13:39

看到你这么热心地解答大家的问题很高兴也很感激！
我最近刚开始做Western, 做的是NF-kB的表达，第一次没有做出结果，什么都没有，感觉很沮丧。请问可能是哪些环节出了问题？是不是提核蛋白的问题？要有哪些注意事项？你原来做过这个指标吗？能否把你的步骤及经验介绍给我参考？非常感谢！

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-9-10 13:39

再请教,您以前是否做过16KD的蛋白,转膜条件及其他经验能否介绍一下?多谢!

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:40

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原帖由 she 于 2013-9-10 13:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我要分离两个同源蛋白，一个是937个Aa,另一个比其少57个Aa，分子量分别是
105KD和98KD，我想做western blotting ,作出两条带，以验证两种蛋白都存在。
不知能否做出来，如果能，用多大的胶，望指点，谢谢！！ ...

用7.5- 8.0 的分离胶就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:40

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原帖由 xiaoxiaoniao 于 2013-9-10 13:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看到你这么热心地解答大家的问题很高兴也很感激！
我最近刚开始做Western, 做的是NF-kB的表达，第一次没有做出结果，什么都没有，感觉很沮丧。请问可能是哪些环节出了问题？是不是提核蛋白的问题？要有哪些注意事项？你原来做过这 ...

做过这个蛋白，没有什么特殊的方法，你查查你的过程是否有问题，具体的不能排除的地方再来问问我。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:40

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原帖由 大海啊故乡 于 2013-9-10 13:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
再请教,您以前是否做过16KD的蛋白,转膜条件及其他经验能否介绍一下?多谢!

做过，转移时要小心时间，半干法10－15mins就够了

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:41

你的iIP步骤有问题吗？抗体的选择呢？

作者: is2011 时间: 2013-9-10 13:41

1.我的ip步骤是按照我师姐的方法做的，而她曾经做出来过。不过，这是我第三次做ip,实战经验还不足，假如说我的ip步骤有问题，您觉得问题主要会在哪呢？
2.抗体是我们实验室自己制备的多抗。

作者: she 时间: 2013-9-10 13:41

用SDS－PAGE电泳分离3.5KD的小分子多肽，用T =49.5%, C=5%的聚丙烯酰氨凝胶储备液配制4%的浓缩胶；及16.5％的分离胶10ml;，加3.6g尿素，电泳过程中在浓缩胶和分离胶的交界处溴酚兰弥散成一条宽带，过后又逐渐聚在一起；电泳结束后敲开玻璃板发现两种胶界面附近有个约0.5cm宽的楞（和溴酚兰弥散部位一致）。凝胶用考马斯亮兰染色几乎没有蛋白条带，郁闷，有那位高手出手相助一把？多谢！实验做不出来回家都没心情。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:42

0.5cm宽的楞, 是什么？是不是没有凝聚好造成的？

另外 3.5kd 的小肽最好用 25％左右的分离胶

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:42

QUOTE:

原帖由 she 于 2013-9-10 13:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用SDS－PAGE电泳分离3.5KD的小分子多肽，用T =49.5%, C=5%的聚丙烯酰氨凝胶储备液配制4%的浓缩胶；及16.5％的分离胶10ml;，加3.6g尿素，电泳过程中在浓缩胶和分离胶的交界处溴酚兰弥散成一条宽带，过后又逐渐聚在一起；电泳结束后敲 ...

你的信息太少了，我判断不出来。

作者: she 时间: 2013-9-10 13:42

我的ip的步骤是这样的：
1.细胞裂解：收获悬浮细胞约10x7，PBS洗三次，加入冰冷的RIPA 裂解液1ml,然后依次煮沸5min, -70度冷冻5min,循环三次，4度，12000g离心取上清；
2.加入免疫前IgG 10ul,4度混合1.5h；
3.加入20ul proteinA混合1.5h;
4.4度12000g离心5min,将上清转移至另一干净ep管中；
5.4度加入20ul一抗，孵育过夜；
6.4度30ul proteinA混合一天（大于8h）
7.12000g离心1min,取沉淀
8.800ul PBSX4洗涤；
9.40ul 2xSDS重悬2-3min,煮沸5min后,12000g离心1min上样跑SDS-PAGE.(其中30ul 跑胶，10ul 转膜)
10.Western blot 的条件是这样的：
（1）60v,35min,90v跑溴芬兰至底部；
（2）半干式150mA,转膜1h
（3）膜37度封闭2h;
（3）一抗（兔抗小鼠）稀释1：200；二抗稀释1：400
（4）DAB显色。

作者: mickeylin 时间: 2013-9-10 13:43

您好。别人传授给我一个lysis buffer 的配方：Tris.HCl, NaCl, Nonidet 40, Na deoxycholate , EDTA, PMSF(用前加），但是我自己配时，不溶解，据观察好像是 0.5％的Na deoxycholate 不溶解，我不知道为什么？这几种物质混在一起溶解时有先后顺序吗？如果不加Na deoxycholate，对结果有影响吗？

作者: applebook=213 时间: 2013-9-10 13:43

！我做hif蛋白的western 遇到了问题，请不吝指教

我用的是cocl2处理的k562 24小时，提的是总蛋白跑电泳。
预实验中转膜应该是成功的，用氨基黑染过，条带清晰。
按照分子克隆上面的方法加一抗二抗，然后HRP鲁米诺化学发光法显色，x光胶片洗片，结果如下。好象很多条带都被显示出来了，什么原因想不出来？扫描的时候扫的太黑了。另外左面的条带有一大块白色的地方，估计是因为装封闭袋的时候我两次把膜掉在地上了：

图片附件: 40663180.snap.jpg (2013-9-10 13:43, 28.95 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18219

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 13:44

有急事求救！！！
改进各种条件，我的目的蛋白ICAM-1终于有结果了，但是，应该在80～110KD，但实际蛋白条带出现在近40KD左右，重复几次结果依旧，能帮我分析一下原因吗？抗体有问题？蛋白在提取或变性过程中结构改变？如果您曾经作过这个目的蛋白，实际位置是在那儿？急切盼望各位高手的答复！急！急！急！！！谢谢！！！

作者: vcve 时间: 2013-9-10 13:44

你好。收到你的E-mail，你说的不太清楚，我也不知道你的问题出在那里。又在dxy搜了一下你的帖子，就找到这里来了。
看了一下你的图片，跑的胶方向是从下往上，用的Marker是97、66、45、31、20KD吧？好像都有很强的IgG轻、重链的带。我觉得IP做不出来，可以从以下几方面找原因：
1.你的样品中是否有足够的目的抗原存在。
2.所用抗体是否可以用来做IP。
3.抗原蛋白是否降解。
4.IP条件是否合适。
5.裂解Buffer是否太剧烈。
所以，你在跑胶作WB时，还应点几道样品：（1）IP前的细胞裂解液样品，检测样品中的目的抗原，以及是否降解；（2）IP上清，看抗原是否存在于上清中没沉淀下来。
另外，我觉得RIPA的裂解能力已经很强了，为什么还要在孵育后再煮沸、冻融？那样岂不是容易导致Buffer中的蛋白酶抑制剂失活、蛋白降解？

作者: she 时间: 2013-9-10 13:45

1.样品中是否有足够的目的抗原存在？这个问题曾经也困惑我好久，因为我的目的蛋白在正常情况下表达量的确比较低，后来我用一种药物处理三天后，western blot检测，发现它的表达量会增加；于是我做IP时的总蛋白就是从处理三天后的细胞中提取的。尽管如此，但是我不知道我的目的蛋白是否已经达到您所说的“足够”的量？或者说我们怎么来看做IP时的目的蛋白已足够？
2.所用的抗体是否可以用来做IP?说实在的，因为我是蛋白方面的新手，知识比较贫乏，对于这个问题我还从来没有考虑过，能否请土人兄再详细解释一下，什么样的抗体可以做IP;什么样的抗体不能做IP?我的实验的情况是，我师姐曾经用此抗体做过IP,并且成功拉下过目的蛋白，不过我要的目的蛋白与我师姐的目的蛋白分子量不一样，但两种蛋白都能被同一抗体识别。
3.抗原蛋白是否降解？我想这个问题比较好解决，就如您所说，在做WB时多加一条IP之前的细胞裂解液即可。
4.IP条件是否合适？对于此问题我真是知之甚少,能否请土人兄指明主要应该考虑那些IP反应条件？
5.裂解液Buffer是否太剧烈？按照您的意思，RIPA是一很强的裂解液罗，不过我师姐做IP时也是用的这一裂解液呀！
另外，还要非常感谢战友跑WB时的两点提示！太及时了！
最后，说一下裂解细胞时我进行了反复冻融的考虑,不知道有没有道理，还请战友指正：
1.战友说过有的抗体只适合与天然的蛋白结合；而有的抗体适合与变性的蛋白结合。而我不知道我要的目的蛋白究竟适合与那种状态的蛋白结合，但我先前做WB时，发现它（即我做IP使用的抗体）是能与目的抗原结合的。
2.这样使细胞充分裂解。

作者: INK 时间: 2013-9-10 13:45

昨天又试了一次，楞的问题解决了，肯能就是凝的不好造成的。可是新问题又接踵而来，电泳80MV恒压约40分钟，30mA恒流4个半点，（好耐跑啊，而且放在冰里跑的，有必要吗？）买了自显色的Marker（中分子量的19－190的，小分子量的没定到现货），Marker的分离效果很好(同时做了两块胶，加脲的和不加的，加脲的似乎好一些），但是考染后胶的条带很少，而且很细主要是集中在上部分子量较大的区域，怎么回事？您说的25％的分离胶要加其他吗？我想同时做两种3.5KD 和14KD的，是不是用Trincine更好一些呢？试着转了一下膜12V转1小时，没转完全（如果看到Marker没转完全还能接着再转吗？），膜是不是最好用0.22μ的？PVDF膜能用DAB显色吗？（我用的是做组化的抗体,带ABC的）是不是最好用化学发光？试了下丽春红染色，我这里只有丽春红G，用30％三氯醋酸（好容易找到的），PBS配的，没找到璜基水杨酸（和水杨酸钠一回事吗？），不好溶，要过滤吗？我过滤了一下，PH值调到2.5左右，不好用，看不到条带。有劳您侠肝仪胆帮偶支两招吧！多谢

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:46

QUOTE:

原帖由 she 于 2013-9-10 13:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.样品中是否有足够的目的抗原存在？这个问题曾经也困惑我好久，因为我的目的蛋白在正常情况下表达量的确比较低，后来我用一种药物处理三天后，western blot检测，发现它的表达量会增加；于是我做IP时的总蛋白就是从处理三天后 ...

1.你用WB可以检测到抗原，做IP时所用的细胞数量肯定要大得多，而IP本来就是用来富集抗原的，所以，你的抗原量应该是够的。你所做的3也可以回答这一问题。
2.由于抗体所时别的表位不一样，所以有的抗体适合做WB,有的适合做IP。你师姐以前做的IP目的抗原与你的是不同剪接的产物吗，结构、特点差不多吗？如果是，那就应该也可以的。
3.你把你的裂解液取出一点来，与实验组一样放置在4度，只是不加抗体和proteinA。最后和IP的一起做WB。这样可以看出你的操作过程中，蛋白是否降解；还可回答问题1。
4.主要还是Buffer.如果你的目的蛋白特性与你师姐以前做的差不多，可以参照你师姐的条件。
5.RIPA因为是用的三去污剂，所以裂解的条件比较剧烈。你师姐这样做的，那你也就用RIPA，本身应该没有问题。但是，你师姐以前做的时候，有没有裂解后煮沸、再冻融呢？
另外，我觉得，你把样品煮沸，和你做WB时变性，是不一样的——后者把蛋白变成线性了，而前者则不一定。我也没有见过这样的做法，把样品煮沸再做IP。

作者: =菓子= 时间: 2013-9-10 13:46

用PVDF转膜湿转，目的蛋白90kD，marker分子量：212，116，97，66，57，40；
80v 转膜时间1小时40分，丽春红染色只见两个小分子量的marker条带，旁边待检测泳道(PBMC细胞浆或细胞核提取液)也只见两条带子，不甚清晰(其中一个道应该是纯品啊？？晕！！)，暴光胶片无任何条带，背景干净；同时用考马斯亮兰染色，胶上几乎不见条带。
问题：
1。转膜时间长短是否与目的蛋白大小有关？延长时间是否会引起或导致“转过头”？
2。分子量如上的MARKER能否各条带子都同时转好？
3。目的蛋白90kD，应怎样选择转膜条件？WB的其他哪些步骤也可能影响上述结果？
多谢多谢！！！

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-10 13:46

之前我首先构建了一个GFP融合的表达载体，然后采用Lipofectamine2000转染HT1080细胞，同时选择未转的细胞和转染pEGFP空载体作为对照，转染24H和48H后进行WB分析，方法是按照我们实验室成熟的方法进行，当时分别用anti-GFP 的单抗和多抗（1：500）进行检测，显影发现未转的和转染空载体以及转染有GFP融合蛋白的条带是一样的。不知道是为什么原因？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:47

显影发现未转的和转染空载体以及转染有GFP融合蛋白的条带是一样的。不知道是为什么原因？

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Do you mean the size shows same? Did you set a Lane as negative control? What's the size difference between your fusion protein and GFP?

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:47

1。转膜时间长短是否与目的蛋白大小有关？延长时间是否会引起或导致“转过头”？
2。分子量如上的MARKER能否各条带子都同时转好？
3。目的蛋白90kD，应怎样选择转膜条件？WB的其他哪些步骤也可能影响上述结果？
多谢多谢！！！

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1. Closely related. It appears that the trans-membrane is not good enough, most likely the transfer time is not long enough since smaller marker is transferred rather than bigger size marker. For a certain marker, since the MW is not too small, general-used membrane is fine for marker transfer. So in your case, elong the transfer time.

2. sure

3. Your transfer buffer, iron concentration, PH etc are factors to affect the transmembrane.

作者: she 时间: 2013-9-10 13:48

IP中还有些细节还要向大家请教！
1.在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间合适？
2.最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经加入了溴芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？
3.土人兄在第一次回复时，提到膜上和胶上度有很强的IgG轻、重链带，是否是说IP中抗体与Agarose结合的很牢靠呢？另外，需要补充说明的我用的marker分子量是：119；79；46；31；24；19。

这两天我正在重复一次IP,差不多明天可以跑胶出结果！我正急切的期待中！

作者: =菓子= 时间: 2013-9-10 13:48

我们最开始也怀疑转膜时间短，但是为什么考染PAGE凝胶没有明显的带子呢？
是否有这种可能：转膜时间稍微长了些？有些蛋白转到膜的另一侧了，而小分子量的marker浓度较大，仍有部分留在膜上？
问题：PVDF膜一旦蛋白转上，会丢失否？

多谢！！

将原来的情况再贴一次：
用PVDF转膜湿转，目的蛋白90kD，marker分子量：212，116，97，66，57，40；
80v 转膜时间1小时40分，丽春红染色只见两个小分子量的marker条带，旁边待检测泳道(PBMC细胞浆或细胞核提取液)也只见两条带子，不甚清晰(其中一个道应该是纯品啊？？晕！！)，暴光胶片无任何条带，背景干净；同时用考马斯亮兰染色，胶上几乎不见条带。

作者: langlang 时间: 2013-9-10 13:49

我最近做Western 经常转膜MARKER转不上去，而目的蛋白却能够检测得到，不知道是哪里出了问题，哪位高手指点指点，多谢多谢

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:49

我们最开始也怀疑转膜时间短，但是为什么考染PAGE凝胶没有明显的带子呢？
是否有这种可能：转膜时间稍微长了些？有些蛋白转到膜的另一侧了，而小分子量的marker浓度较大，仍有部分留在膜上？
问题：PVDF膜一旦蛋白转上，会丢失否？

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There are two possibilities: one is as mentioned above, time is not long enough for the transmembrane; the other one is the marker. If this result shows again and again even you change the transmembrane time, you could probably consider the problem could be from the marker itself. You could try to ask for a marker from another company or lab to try it it happens again. Generally, small protein can't pass through the membrane if the size is not dramatically small (I can't remember the size number). For maker it is fine. THink about it, even small marker can stay on membrane, it is no possiblity that the bigger marker passing through, isn't it?

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 13:50

我最近做Western 经常转膜MARKER转不上去，而目的蛋白却能够检测得到，不知道是哪里出了问题，哪位高手指点指点，多谢多谢

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Check your marker.

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:50

空白的地方可能是转移过程中的气泡造成的，另外条带多有可能是一抗或2抗的浓度高了，你可以尝试将1抗的稀释度提高一倍，再不行减少一倍的上样量。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:51

你的提取液我知道，因该没有问题，另外Icam Wb出来在103kd左右，（虽然通过计算是115kd），你的一抗是否有问题，转移的

效果要是检测过没有问题你就要检测一下阳性对照是否能出来了？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:51

但是考染后胶的条带很少，而且很细主要是集中在上部分子量较大的区域，怎么回事？本来就是这样的，小分子的蛋白少，
您说的25％的分离胶要加其他吗？不要
我想同时做两种3.5KD 和14KD的，是不是用Trincine更好一些呢？
着转了一下膜12V转1小时，没转完全（如果看到Marker没转完全还能接着再转吗？），膜是不是最好用0.22μ的？肯定要用0.22的，Marker没有转完全可以接着转，
PVDF膜能用DAB显色吗？（我用的是做组化的抗体,带ABC的）是不是最好用化学发光？能用DAB显色，只不过不够灵敏，最好用Ecl。
试了下丽春红染色，我这里只有丽春红G，用30％三氯醋酸（好容易找到的），PBS配的，没找到璜基水杨酸（和水杨酸钠一回事吗？），不好溶，要过滤吗？我过滤了一下，PH值调到2.5左右，不好用，看不到条带。你可以不用丽春红染色，直接做染色就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:51

我也觉得你没有转移完全，你可以先查一下的上样量是否够，直接上样电泳，染色看看条带是否清晰？

作者: 莲花白 时间: 2013-9-10 13:52

我要检测表达的蛋白质，有6His tag的，用6His tag单克隆抗体。请问二抗用什么？有具体的方法吗？谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-9-10 13:52

1.在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间合适？

2.最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经加入了溴芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？

3.在第一次回复时，提到膜上和胶上度有很强的IgG轻、重链带，是否是说IP中抗体与Agarose结合的很牢靠呢？另外，需要补充说明的我用的marker分子量是：119；79；46；31；24；19。

===========================================================================================================

1。不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。

2。加2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次，首先离心稍微长一点，长20秒吧，希望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。

3。他的意思应该就是如此。虽然抗体与胶结合得很强，也很难保证抗体不脱落。

作者: 831226 时间: 2013-9-10 13:53

我要检测表达的蛋白质，有6His tag的，用6His tag单克隆抗体。请问二抗用什么？有具体的方法吗？谢谢！

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一般His tag单抗都是鼠原的。因此可按照：
样品+His 单抗+鼠二抗-HRP 即可！（和一般的方法都一样）

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:53

如果你买了His的单抗， 2抗可以用 HRP（or AP）标记得抗小鼠IgG的抗体就可以了，
如果你还没有买，可以试试亲和纯化的 rabbit anti his tag 的多抗

作者: mamamiya 时间: 2013-9-10 13:54

请问一下，我做western，丽春红显不出色，但看到Marker 转过去了，不知怎么回事？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 13:54

Marker 比胶上的蛋白好转，另外，你上样的蛋白量是否够？你可以试一下，WB结果如果没有带，你再用考染看看

作者: orangecake 时间: 2013-9-10 13:54

我也是做bcl-2和caspase的，请问有人作过吗？我已经摸条件近一个月了！望指教！

作者: orangecake 时间: 2013-9-10 13:55

我做的是cleaved-caspase-3 17kd的，请问有人做过吗？望指点！

作者: 8s5g 时间: 2013-9-10 13:55

QUOTE:

原帖由 orangecake 于 2013-9-10 13:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是cleaved-caspase-3 17kd的，请问有人做过吗？望指点！

Tell more about your experiment. Sample source, antibody, and any results you got.

作者: remenb 时间: 2013-9-10 13:56

我也是做bcl-2和caspase的，请问有人作过吗？我已经摸条件近一个月了！望指教！

Tell more about your experiment. Sample source, antibody, and any results you got.

我用的是缺血再灌注的肝组织，是cell signaling的cleaved-caspase-3 的抗体，BD的bcl-2的抗体，12%的sds-page 5mg/ml的样本浓度，0.2的PVDF膜 0.8mA/cm2的电流，hofe的半干一小时，封闭1小时在室温，一抗4度过夜，二抗1小时室温，每结果！
望指教，谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-9-10 13:56

我用的是缺血再灌注的肝组织，是cell signaling的cleaved-caspase-3 的抗体，BD的bcl-2的抗体，12%的sds-page 5mg/ml的样本浓度，0.2的PVDF膜 0.8mA/cm2的电流，hofe的半干一小时，封闭1小时在室温，一抗4度过夜，二抗1小时室温，每结果！

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Several steps can give you clues. Did you use pre-stained marker? After you transfer, can you see marker on the membrane or on the gel? Did you use HPR-coupled marker, after you do film development, did you see marker? If all of these steps are normal, it could be the problem of your sample or antibody.

作者: 911 时间: 2013-9-10 13:57

请问，
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=130006&sty=3&keywords=%BA%CB%B5%B0%B0%D7')
提取核蛋白后，能不能直接做westenblot，不需要免疫沉淀富集一下吗？另外，提取的产物也能做EMSA吗？

作者: 831226 时间: 2013-9-10 13:57

QUOTE:

原帖由 911 于 2013-9-10 13:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问，
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=130006&sty=3&keywords=%BA%CB%B5%B0%B0%D7')
提取核蛋白后，能不能直接做westenblot，不需要免疫沉淀富集一下吗？另外，提取的产物也能做EMSA吗？ ...

提出的核蛋白做WB没有问题。免疫沉淀一下也可，不过目的就不同了，一般核蛋白免疫沉淀这一步是为了看与目的蛋白结合的其它蛋白是哪些，而不是单纯为了DETECT这种蛋白。

提取的产物做EMSA也没有任何问题。

作者: 911 时间: 2013-9-10 13:57

那么这种方法，在第一步中获得的是胞浆蛋白，第二步获得核蛋白喽。前后两步的提取产物都可以做westenblot,EMSA吗？
如果不行，胞浆蛋白（第一步的产物）还应该做哪些处理？

作者: 831226 时间: 2013-9-10 13:58

QUOTE:

原帖由 911 于 2013-9-10 13:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那么这种方法，在第一步中获得的是胞浆蛋白，第二步获得核蛋白喽。前后两步的提取产物都可以做westenblot,EMSA吗？
如果不行，胞浆蛋白（第一步的产物）还应该做哪些处理？ ...

是的，两步提取物都可以直接做WB。但胞浆蛋白做EMSA没有意义吧，它们不是DNA结合蛋白。

作者: 911 时间: 2013-9-10 13:58

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-9-10 13:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是的，两步提取物都可以直接做WB。但胞浆蛋白做EMSA没有意义吧，它们不是DNA结合蛋白。

我们想做转录因子，探讨它们在跨核这个过程中的变化。也就是说，同样的蛋白为什么在胞浆里不能结合DNA,跑到核里面就行了？已经有人从蛋白的修饰角度做了大量工作，我们想跳出这个老套路，换一个新的角度试试。

作者: abc816 时间: 2013-9-10 13:59

压胶用去离子水即可

作者: utt0989 时间: 2013-9-10 13:59

做投稿用的western图，marker是不是要在跑完胶后就切下来，考染，然后等转了目的蛋白的膜western显色后再拼起来，一起照相？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 14:00

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原帖由 utt0989 于 2013-9-10 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做投稿用的western图，marker是不是要在跑完胶后就切下来，考染，然后等转了目的蛋白的膜western显色后再拼起来，一起照相？

一般不用这么麻烦,在旁边标明分子量就可以了.

作者: tie8 时间: 2013-9-10 14:00

请赐教：我想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？不好意思！一个菜鸟问题！烦请指教。衷心感谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 14:00

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原帖由 tie8 于 2013-9-10 14:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请赐教：我想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？不好 ...

按照你提供的浓度,如果做wb,是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白,wb中要注意的是:
1 转移时的时间,
2 转移时的电流或电压.
3 transfer buffer 中加20%的甲醇.
4 可以用13-15%的分离胶.

作者: qianqin1977 时间: 2013-9-10 14:00

请问，用DAB显色国际上认可吗？我用了beta-actin做内参照，做定量分析的时候，是否要求beta－actin的条带深浅一致？怎样才能准确的定量？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 14:01

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原帖由 qianqin1977 于 2013-9-10 14:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问，用DAB显色国际上认可吗？我用了beta-actin做内参照，做定量分析的时候，是否要求beta－actin的条带深浅一致？怎样才能准确的定量？谢谢！

我不知道是否国际上认可DAB. 因该是不要求深浅一致的,可以通过灰度的不同来修正目的带的值,

作者: zzzz 时间: 2013-9-10 14:01

好，我用GFP载体来表达融合蛋白，在显微镜下发光的细胞有80%以上，但做WESTERN就是没有特异的阳性条带。我的细胞用裂解液煮沸10分钟后上样。其余步骤按Promega kit 进行。一抗是国产的，二抗Promega，同门师弟已用其作出阳性结果。但我为什么不行？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-10 14:02

在此我想请教几个问题:
1、我的目的蛋白在110KD左右，每次转膜100V，2h,将转过之后的胶考染后发现大分子端仍未转干净，能告诉我这种大分子蛋白转膜需要多长时间吗？
2、对于封闭有奶粉或者是BSA，哪种最好？如何选择？

作者: dog002 时间: 2013-9-10 14:02

前一段时间我做HIF抗体118kd，30伏2小时，转膜后，考氏染色后，胶上有好多带，但不影响wb的结果，所以我认为不必太在意胶上的带。

封闭一般都用5%ｍｉｌｋ，一抗有时ｍｉｌｋ，有时用ＢＳＡ，取决于你所用的抗体。　　

作者: 831226 时间: 2013-9-10 17:17

前一段时间我做HIF抗体118kd，30伏2小时，转膜后，考氏染色后，胶上有好多带，但不影响wb的结果，所以我认为不必太在意胶上的带。

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基本同意，主要是看目的蛋白在MARKER的哪个位置，如果不是太大的分子量区，可以不必太在意。如果反反复复做不出来再考虑也不迟。

作者: 831226 时间: 2013-9-10 17:18

你好，我用GFP载体来表达融合蛋白，在显微镜下发光的细胞有80%以上，但做WESTERN就是没有特异的阳性条带。我的细胞用裂解液煮沸10分钟后上样。其余步骤按Promega kit 进行。一抗是国产的，二抗Promega，同门师弟已用其作出阳性结果。但我为什么不行？

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看来是操作的问题了。请问一抗放了多久了？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:18

你能否在提细胞蛋白的环节上查查是否有问题，另外，一抗是否做过检测，稀释度是否不对，我只有这些建议。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:22

建议用8％的胶，湿法 36V， 6－12小时，另外你做的是Icam 1 吗？

可以用5％ milk block。

作者: kuaizige 时间: 2013-9-10 17:23

我真是苦恼，我用化学发光法。背景-----也就是整个膜都发荧光，我曾经在这种背景下出过一次结果：在暗室中能看到条带，压片15‘效果不错。但现在重复不出结果。我是按说明推荐稀释一抗1：200，二抗1：5000，洗膜在表面皿中，每次30ml左右，10分钟，共3次或4次。
目的蛋白分子量在31kd，转膜条件120v衡压，1.5h，丽春红染色显示这个分子量范围的蛋白显色较明显。
请问我的实验问题在哪？背景高是不是一抗或二抗比例不适当，应该怎么改？
哎！另外，我想请教，是不是用低电压长时间转膜，转得更完全，蛋白抗原性更容易保留？
谢谢

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-10 17:23

想请教我养的Hela细胞作Western ，细胞必须裂解后才能做吗？否则结果是阴性的吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:24

现在的条件是否有变化？

你可以提高一抗的稀释度， 1：400试试， 2抗提到1：8000试试，另外提高孵育液中milk的量， 6－7％， washing 用0.5-1%tbst, 试试，这样看看背景是否会被去掉。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:24

你能不能问清楚一点，检测什么蛋白？是上清表达还是胞内表达，如果是上清表达的蛋白，你用control media 做wb就可以了，如

果是胞内就要裂解细胞。

作者: one 时间: 2013-9-10 17:24

我遇到过一次极其诡异的结果：

ECL检测的时候，整个膜上发光的位置与正常相反，也就是背景发光很强，唯有应该压出条带的位置上不发光，压出的片子与正常结果是黑白颠倒的
转膜以后丽春红染色正常，但是染色最深的条带位置也就是压片时候的空白位置
后来把膜strip了重做，结果还是这样
所用的抗体出问题的可能性不大，后来用相同的抗体做同一样品结果是好的，唯有这一次的结果非常诡异
我觉得值得怀疑的是所用的纤维膜，因为是实验室事先统一裁好的，零零乱乱的放在抽屉里，不知道这张膜是否经过了某些处理改变了性质，但是我怎么也想不出在何种情况下这张膜会有这样的结果
虽然对我的实验影响不大，但是很好奇，有没有人遇到过相同的问题？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:25

QUOTE:

原帖由 one 于 2013-9-10 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我遇到过一次极其诡异的结果：

ECL检测的时候，整个膜上发光的位置与正常相反，也就是背景发光很强，唯有应该压出条带的位置上不发光，压出的片子与正常结果是黑白颠倒的
转膜以后丽春红染色正常，但是染色最深的条带位置也就 ...

我遇到过，你看看原来的帖子，里面有解释。不过都是我的推测没有证实。

作者: 101010 时间: 2013-9-10 17:26

我用的试剂盒提供和推荐的2%的蛋白干粉，我试一试提高封闭浓度或干脆换用脱脂奶粉。

作者: pengke1983 时间: 2013-9-10 17:26

我马上要做western，所用的样品是大鼠的脑组织，请问如何处理样品。
我实验室的方法就是用裂解液处理即可，请问您有无其它的建议。具体做法又是如何？谢谢！

作者: mod=8048 时间: 2013-9-10 17:27

我的蛋白是胞浆蛋白，加上样缓冲液煮沸不能裂解细菌吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:27

可以按照你实验室的办法，匀浆后直接加入裂解液，处理过程在低温操作就可以了。

不过要注意的是将血清洗干净再匀浆。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:29

这样当然可以裂解细胞了，不过你如何收集细胞，并且定量呢，最好是先将细胞中的蛋白提出来以后，再加loading buffer 煮沸上样？

作者: plaa 时间: 2013-9-10 17:29

我的实验只是定性，无需定量。一旦定性阳性，我再做免疫荧光，但现在是阴性。可是抗体说明书上写能够与Hela WCL细胞反应
，再请问Hela WCL 与Hela有何区别？

作者: ha111 时间: 2013-9-10 17:30

非常庆幸可以向你这样的高手请教。现在我有个问题想请你指点一下。
我做MKK7的Western blot，用ECL重复做了很多次，摸索了很多条件，X光片上就是没有条带，连Marker条带也没有（我的marker不是pre-stained的）。后来我用与MKK7分子量很接近的SAPK做，除了所加抗体不同外，其他操作与做MKK7时的完全一致，结果条带很清晰。我的MKK7一抗购自cell signaling公司，我怀疑抗体有问题，请问你是否也用过该公司的抗体，评价如何呢？我接下来如何做比较合适呢？
还有一个问题，由于我抗体量不太充裕，每配一次抗体我会重复做一星期，回收后4度保存。我看到前面Barbard说抗体回收后在-70度保藏，请问该在什么条件下融化使用呢？

作者: abc816 时间: 2013-9-10 17:30

那请问裂解时PMSF的终浓度是多少比较合适呢？
因为在裂解细胞时PMSF的终浓度是1mmol/L，而我现在需裂解的是脑组织。
谢谢！

作者: wawa 时间: 2013-9-10 17:31

不知道怎么回事做出如下的结果，Mark没有转上。该蛋白是GST融合，大小在72KD，但在目的蛋白周围也出现条带。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:31

你是否也用过该公司的抗体，评价如何呢？我接下来如何做比较合适呢？
我用过，质量挺好的，我觉得是否是你提蛋白过程中有问题，或是目的蛋白含量太少，你可以提高一抗的浓度，另外看看一抗的应用能否用WB。

还有一个问题，由于我抗体量不太充裕，每配一次抗体我会重复做一星期，回收后4度保存。可以4度保存，3个月左右没有问题

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:32

PMSF1mmol/L，没有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:33

Mark是pre-stained的？你可以说仔细点吗？是不是只有marker没有转上去

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-10 17:33

图中在蓝色的marker旁有两条泳道呈现一片黑糊糊状，不知道是何原因？是不是因为最后重悬后吸进了agarose?（DAB显色，这两条泳道加的是IP之后的产物）

图片附件: 65309062.snap.jpg (2013-9-10 17:33, 14.87 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18243

作者: ffooll 时间: 2013-9-10 17:34

我用的是CST的pERK和ERK的抗体。尽管我很小心测定蛋白量（microplate-SDS-Lowry）后调整蛋白浓度再跑电泳，可转印后的膜上总是一眼就能看出各条带的蛋白量不一致，以致检测pERK水平毫无意义。是否在准备样品或测定蛋白时有一些细节未注意到？
或者我是否可以用stripping buffer洗脱后在同一张膜上得到tERK条带，将pERK/ERK的比值代替MAPK活性的检测？或者有什么更好的方法？

作者: bs4665 时间: 2013-9-10 17:34

总算出来了，谢谢各位和楼主的帮忙。比较了用NC膜和PVDF膜，觉得小分子量（我的31kd）用PVDF膜要好些。我再继续，失败了N次，如果继续重复出来，一定与大家分享经验。

作者: utt0989 时间: 2013-9-10 17:35

最近要做磷酸化蛋白的western blot，想请教NBA等高手几个问题：
1.我用的抗体是sigma的Monoclonal Anti-Phosphoserine antibody produced in mouse ，不知有没有人用过。它推存做WB时用1：500。这个效价太低，那么点有限的抗体一下子就用完了，不知能否有1：1000或者更低的浓度。
2. 我做的是植物蛋白，用TCA沉淀的方法提的(液氮研磨后，用10%TCA丙酮沉淀，再用丙酮洗三遍，沉淀用含用尿素的裂解液溶解，离心后得到蛋白)。在整个提取的过程中，始终处于变性状态，是否还有必要加各种抑制剂(NaF,PMSF等)？另外，在电泳缓冲液、转膜时的转移液、封闭液中是否也要加抑制剂？
3. 与做普通蛋白的WB相比，有没有其他要注意的地方？

非常感谢!

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:35

QUOTE:

原帖由 大尾巴 于 2013-9-10 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
图中在蓝色的marker旁有两条泳道呈现一片黑糊糊状，不知道是何原因？是不是因为最后重悬后吸进了agarose?（DAB显色，这两条泳道加的是IP之后的产物）

应该是Agarose－proteinA 能够结合IgG造成2抗在泳道上沉积，才有这个结果，
另外你看看是否是IP之后的产物能够催化DAB底物，才造成这样的结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:35

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-9-10 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近要做磷酸化蛋白的western blot，想请教NBA等高手几个问题：
1.我用的抗体是sigma的Monoclonal Anti-Phosphoserine antibody produced in mouse ，不知有没有人用过。它推存做WB时用1：500。这个效价太低，那么点有限的抗 ...

1 浓度应该可以在稀释，你要试过才知道，不过我觉得你要的是IP，你看看是否是只作WB就可以了？
2 提取蛋白没有问题

作者: birdfish 时间: 2013-9-10 17:36

我这次做Western blot打算换用厚一点的胶，同时增加一抗浓度试试。在提问时我可能没有讲清楚，我的抗体溶解在封闭缓冲液（TBST+脱脂奶粉）中，回收后置于4度冰箱中一段时间后溶液颜色会改变，我想可能是染耐低温的菌了吧。我很想知道可不可以在抗体溶液中加抗菌的物质呢，这样抗体大约可以用几次呢？

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你是否也用过该公司的抗体，评价如何呢？我接下来如何做比较合适呢？
我用过，质量挺好的，我觉得是否是你提蛋白过程中有问题，或是目的蛋白含量太少，你可以提高一抗的浓度，另外看看一抗的应用能否用WB。

还有一个问题，由于我抗体量不太充裕，每配一次抗体我会重复做一星期，回收后4度保存。可以4度保存，3个月左右没有问题

作者: PPT 时间: 2013-9-10 17:36

请教一个较菜的问题，静脉血中的细胞因子(肝细胞生长因子)能否用Western Blotting来测？2毫升够用吗？另外，组织中的细胞因子能用ELISA法测吗？请各位多多指教

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-10 17:37

应该是Agarose－proteinA 能够结合IgG造成2抗在泳道上沉积，才有这个结果，
另外你看看是否是IP之后的产物能够催化DAB底物，才造成这样的结果。

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多谢指点！您的意思应该是说：我的IP泳道中，吸进了Agarose－proteinA，但是我还是不太明白，Agarose－proteinA能在SDS-PAGE电泳中跑动吗？Agarose不是一粒小珠子吗？还是Agarose与proteinA分开后跑动？
另外您让我看看是否IP后的产物催化DAB底物，这具体怎么做呢？

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-10 17:37

今天有做了张wb膜，结果很糟糕，不知道问题在哪？我感觉转膜的时候电压升高的有点快(11v~21v)。我是半干式160mA,1h.能否请ptglab兄一并解答？
膜是DAB显色。

图片附件: 70186295.snap.jpg (2013-9-10 17:37, 16.28 KB) / 该附件被下载次数 75
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18244

作者: kuaizige 时间: 2013-9-10 17:39

体外真核细胞转染基因后想从细胞中提取蛋白做WB，请问细胞裂解液的配方？样品能保存多久？恳谢！

作者: zsxan1990 时间: 2013-9-10 17:39

我们用的细胞裂解液的配方是：50mmol/l Tris.cl (pH 7.5),150mmol/l Nacl,10% NP-40,0.5%去氧胆酸钠，0.1％SDS，临用前加1mmol/l PMSF（终浓度）
样品加热煮沸处理后保存一周肯定没问题！
不妨一试！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:39

可以加入azide 0.09-0.2％，但是加标记HRP的2抗前要洗干净。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:40

请教一个较菜的问题，静脉血中的细胞因子(肝细胞生长因子)能否用Western Blotting来测？
可以

2毫升够用吗？
够了
另外，组织中的细胞因子能用ELISA法测吗？
也可以

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:42

是在电泳过程中一部分proteinA跟agarose逐步分离开了，甚至是分成了很多小的片段造成的ProteinA进入胶里。造成了你的这个结果。

作者: zsxan1990 时间: 2013-9-10 17:42

看文献好像用Western Blotting测血中蛋白的较少，不知这样别人会公认吗

作者: nut6694 时间: 2013-9-10 17:46

紧急求助：
我要检测细胞是否分泌一种蛋白（分子量29KD）到细胞外，先将处理后的细胞培养基通过超滤管浓缩（MILLIPORE产品），由4毫升浓缩为70微升。12%SDS-PAGE后转膜，转膜用的是硝酸纤维素膜（60V；15小时），结果丽春红染色在目标区见到两条清楚的带，但最后抗体未见任何带，不知是何原因？现向各位同仁请教几个问题：
1：经过浓缩的细胞上清液是否仍在点样时，需和加样缓冲液体在100度加热3-5分钟（我未加热）；从培养基浓缩的蛋白是否在点样前经过什么样的处理？
2：29KD用硝酸纤维素膜还是PVDF膜好，转膜时间和电压如何控制（湿转情况下）？
3：向29KD的目标蛋白如何控制电泳和转膜条件？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:46

我觉得你看到的丽春红染色出的目标区附近的带未必是你的目的带，
你先看看你的WB系统有没有问题，如果系统没有问题，再看看一抗是否有问题（能否做WB），
如果都没有问题，那你的目的蛋白可能含量太少，或根本就没有分泌到胞外（你最好同时做细胞和培养基）
你的过程应该问题不大，毕竟转移成功了。

作者: okhaha 时间: 2013-9-10 17:47

昨天又做了细胞,结果是非特异性带非常多,不知如何处理?

29KD一般转膜条件如何控制?

作者: okhaha 时间: 2013-9-10 17:50

补充一条,我的一抗为单克隆抗体,怎么还会有很多的非特异性带

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:51

你用单抗产生非特异条带多是有几个方面的原因：
1 一抗，2抗稀释比例不对，
2 一抗自身的原因
3 2抗跟你的抗原有结合。

29kd 一般半干法 1.0 mA/cm2 40mins-60mins就可以了
湿法 28－36V 3－6hrs就可以了

作者: avi317 时间: 2013-9-10 17:51

去年做过两个抗体，做了很多次一直没有结果，就暂时没在做了。条件分别如下：标本来源是心肌组织，采用湿转浓缩胶都是4%，0.45umPVDF膜，bio-rad电泳仪
1、Ryanodine receptor (文献说分子量是450KD)：分离胶5% ，因为没有找到这么大分子量的MARKER，不知道什么时候电泳结束才可以让这么大的蛋白跑到合适的位置，我试过溴酚蓝电泳完全出胶后，继续电泳5分钟（160V），转膜400mA恒流，12h，4度。化学发光显影，有模糊的条带，但是自己不敢确定是否为目的带。哪个公司有合适的MARKER？如何设置电泳、电转的条件？
2、FKBP12(分子量是12KD)：分离胶15%，转膜90mA恒流，12h，4度。考马斯亮蓝染色时在12KD左右能看到很好的条带的。MARKER(10-200KD范围)转膜，显影效果很好，但是却看不到自己的目的带。转膜条件怎么设置好？0.45umPVDF膜可以吗？
按照ptglab所说，湿转应该用恒压更好，可惜我们实验室的方法一直用恒流，一般都是90mA恒流，12h，4度。看来需要改进了。
请求帮助！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:51

QUOTE:

原帖由 avi317 于 2013-9-10 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
去年做过两个抗体，做了很多次一直没有结果，就暂时没在做了。条件分别如下：标本来源是心肌组织，采用湿转浓缩胶都是4%，0.45umPVDF膜，bio-rad电泳仪
1、Ryanodine receptor (文献说分子量是450KD)：分离胶5% ，因为没有找到这 ...

你这两个蛋白都是不好做的，你的胶浓度没有问题，我猜问题出在转移和膜上：
1 450kd的估计还没有完全转移，你看看400ma相当于多少V（大概）？一般我们做这么大的蛋白用半干法，另外transbuffer里多加一点SDS，
2 小分子的我们做的是0.22um的膜，这个在膜的说明上都有说明的，一般不建议<20kd的用0.45um的膜。

另外，湿法可以用衡流的，也有人做的很好，但是一般建议用衡压。

作者: yjf1026 时间: 2013-9-10 17:53

我是新手，请教一个低级问题，一抗的终浓度在什么范围？怎样计算和稀释？

作者: greenbee 时间: 2013-9-10 17:53

请教做western时，Lysis Buffer的加样量是根据细胞数来决定吗？可我看好多文献有的细胞数少，加的量并不少，有的似乎有矛盾？

作者: greenbee 时间: 2013-9-10 17:55

请问，我一抗是用多肽做的，但这个蛋白原核表达（连着GST)作Western,去无法被识别，不知为何。

作者: toy 时间: 2013-9-10 17:55

我的提取的是总蛋白，含量是48mg/ml
目标蛋白是bax/bcl-2分子量21kDa
我用10％分离胶和5％浓缩胶分别70V和150V跑电泳
上样是5ul样品＋5ul样品缓冲液
我垫了两层NC膜，用200mA跑了3.5h
完后，胶用考马斯亮兰染色，没条带
NC膜于一抗封闭液中4度过夜（我记笔记错误，用了10％BSA＋0.02％tween-20）
早上，NC膜于4ml1：500一抗溶液(4ml封闭液＋20ul一抗），37度培养箱3h（多了一小时）
弃一抗，于PBS中洗3次，每次10mins
取NC膜于Tris-NaCl中漂洗10mins
NC膜置于塑料封口袋中，加入5ml1：5的二抗溶液（4ml二抗封闭液＋1ml二抗）37度培养箱1h
弃二抗溶液，取NC膜于Tris-NaCl中漂洗3次，每次10分钟
加DAB显色，无任何条带
以上是我的试验记录，请求各位帮助
一抗AKO Polyclonal Rabbit Anti-Human Bax
二抗;Read-to-Use EnVision kit(Mouse/Rabbit)Labelled Polymer
抗体是师兄买的，我也不知道有无问题

作者: toy 时间: 2013-9-10 17:56

看过你的一个关于WB的pdf，其中说nc膜使用前要用甲醇浸泡1～3mins，再用transfer buffer浸泡的。可是我从来没用甲醇浸泡过，这一步的目的是什么，可以跳过么？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:56

一抗的稀释比例是都不相同的，一般根据说明书的推荐来做，有条件的可以做梯度稀释，摸索出自己的条件来。
一般稀释范围在1:100-1:5000, WB.
我做过的极限是1：500000 wb

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:57

是的，裂解液的用量是可以根据细胞数来定的，一般我们用200－500ul的裂解液裂解10000000－100000000个细胞。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:57

这个问题涉及太多东西了，
1 你多肽从设计到免疫的过程如何，
2 产生相应的抗体没有
3 抗体纯化了没有
4 融合蛋白是否真的表达
5 序列是否正确？

等等

作者: NBA 时间: 2013-9-10 17:57

我的提取的是总蛋白，含量是48mg/ml （这么高呀，是不是测量有误?,重新换个方法测测）
目标蛋白是bax/bcl-2分子量21kDa
我用10％分离胶和5％浓缩胶分别70V和150V跑电泳（建议用 12－14％的分离胶，建议最高100V，热量小些）
上样是5ul样品＋5ul样品缓冲液
我垫了两层NC膜，用200mA跑了3.5h（湿法转移？还是半干？半干法就过了）
完后，胶用考马斯亮兰染色，没条带
NC膜于一抗封闭液中4度过夜（我记笔记错误，用了10％BSA＋0.02％tween-20）
早上，NC膜于4ml1：500一抗溶液(4ml封闭液＋20ul一抗），37度培养箱3h（多了一小时）（是1：200还是500？，推荐的浓度呢？）
弃一抗，于PBS中洗3次，每次10mins
取NC膜于Tris-NaCl中漂洗10mins
NC膜置于塑料封口袋中，加入5ml1：5的二抗溶液（4ml二抗封闭液＋1ml二抗）37度培养箱1h（我没有用过这么稀的2抗，是稀释液吧？）
弃二抗溶液，取NC膜于Tris-NaCl中漂洗3次，每次10分钟
加DAB显色，无任何条带
以上是我的试验记录，请求各位帮助
一抗AKO Polyclonal Rabbit Anti-Human Bax
二抗;Read-to-Use EnVision kit(Mouse/Rabbit)Labelled Polymer
抗体是师兄买的，我也不知道有无问题

NC膜可以不泡我原来可能说错了，我用的是PVDF膜

作者: yes4 时间: 2013-9-10 17:58

你好，问个初级的问题。
我打算要做western blot ，我的采集的是人体组织样本，现在在零下80度的冰箱里保存，（样本大约直径0。5-1cm 大小）我想问的是，
如何把样本快速解冻，制成加样液，
我看过有关的书，说要在Douce 匀浆器里，还要用研磨器吹打？吹打是什么意思？
裂解液用什么样的好？

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-10 17:59

最近我做WB实验，显色后膜上有时会出现白斑，应该是电转不好造成的，您知道具体原因和解决的办法吗？我把图样发到你的信箱。

作者: ffaa 时间: 2013-9-10 17:59

你好，我也想用western检测组织中目的蛋白的表达，发现书上给的protocol都不大一样，恳请得到你的帮助，能不能告诉我详细的操作方法。
非常谢谢！

作者: popo520 时间: 2013-9-10 17:59

我做过好多次WESTERN，但是经常会在化学发光的时候，X光片上背底特别深，只有条带没有背底的时候特别少。请问谁能告知一下原因，谢谢。

作者: sunnyB 时间: 2013-9-10 18:00

请问marker跑不出来的原因除了它已经分解了，还有其它原因吗？
并且我们最后转膜也转不上去（用丽春红染色），没有任何条带！
我们所用的转移缓冲液的配方是：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 370mg，甲醇200ml配制成1L的溶液。我们用的湿法，仪器是Bio－Rad，电流为300mA，时间为3h。
请问会不会因为膜的问题而导致转移不成功？
谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-9-10 18:00

谢谢！还是得麻烦你帮我解答一下：
1。能否说说在transbuffer里多加一点SDS，具体加多少，我的transbuffer配方是Tris 2.42g，Glycine 11.26g，甲醇250ml，定容至1000ml。
2。因为电泳仪只能单独显示电压或者电流，无法同时显示，所以我也不清楚400mA时是多大V，有什么计算方法吗？
3。450KD蛋白的marker真的买不到吗，如果没有marker，是不是意味着我没有必要做下去了，毕竟做出条带也不敢确定是不是自己要的目的带？
4。12KD推荐用0.22um的膜，是否必须用这样孔径的膜呢？毕竟marker中的10KD条带用0.45um的做出来了。我这里有国产的0.22um的硝酸纤维素膜，可以吗？
5。这两个分子量能否帮忙推荐一个转膜的湿转的衡压设置条件？实验室没有半干转的条件，我实在是做不出来，没有办法，老板还等着要结果。。。

能有高手相助，心里有了希望。

还有问题，膜你是用甲醇泡，我们用的是95%乙醇，作用机制应该一样吧，哪个效果更好呢？显影时，有的膜在反应盒里加入化学发光试剂后可以见到条带，但是取出膜，准备压片显影时却立刻消失了，一片黑，你有没有遇到过这种情况？你用的电泳液和电转液调PH值吗？

谢谢啦！

作者: daod 时间: 2013-9-10 18:01

我做western重复性也不好。我的样品是噬菌体裂解液，抗原量比较少，胶用考马斯亮蓝染色后条带虽不很浓但还算清晰，可是转膜再杂交后条带时隐时现。我用的是半干式转移，0.67mA/cm2 1.5-2小时,目的蛋白大约30-60kD。我怀疑是否转移过了。你觉得呢？
另外，样品制成之后反复动容是否影响杂交结果呢？严重吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:01

你看看如何在液氮环境下制样就知道了。
另外，你要的蛋白是属于什么蛋白？可以查到什么样的蛋白用什么样的缓冲液提取

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:01

看上去是气泡，做3明志的时候注意一点就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:02

每种蛋白对应的WB的步骤都有一些不一样的地方，所以不一样是很正常的，你要多看一些资料根据自己的实验条件设计出合适自己的步骤。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:02

你要看是否是整个胶片都背景深，如果是，则是胶片在暗室里面被感光。（微光）

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:02

1。能否说说在transbuffer里多加一点SDS，具体加多少，我的transbuffer配方是Tris 2.42g，Glycine 11.26g，甲醇250ml，定容至1000ml。
具体的你要自己试出来，你可以先加跟Running buffer 中一样浓度的SDS试试。

2。因为电泳仪只能单独显示电压或者电流，无法同时显示，所以我也不清楚400mA时是多大V，有什么计算方法吗？
没有计算方法。你看看能否看到电压？（Bio－rad的也不能同时显示电压和电流，但是可以看出来衡流时电压是多少。

3。450KD蛋白的marker真的买不到吗，如果没有marker，是不是意味着我没有必要做下去了，毕竟做出条带也不敢确定是不是自己要的目的带？
你可以查查看，有没有卖的，我也不知道是否有买的，没有Marker也是可以做下去的，毕竟可以估算出目的带的大小
4。12KD推荐用0.22um的膜，是否必须用这样孔径的膜呢？毕竟marker中的10KD条带用0.45um的做出来了。我这里有国产的0.22um的硝酸纤维素膜，可以吗？
你先试试国产的膜吧，

5。这两个分子量能否帮忙推荐一个转膜的湿转的衡压设置条件？实验室没有半干转的条件，我实在是做不出来，没有办法，老板还等着要结果。。。
每个实验室的设备都不一样，所以要自己摸索出来，推荐：
12kd 28V 2－4小时，
450kd 40V－48V 16－20hrs

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:03

我不知道你的胶面积，但很有可能是转过了，看看先减少一半的时间试试，另外加大一倍的上样量

作者: gemei0115 时间: 2013-9-10 18:03

问题：显色结果就像总蛋白染色一样，是何原因？
我春节前曾经做过同样抗原的Western检测，结果很好，在目标分子量处有显色带，没有那么多杂带。可是春节回来却做不出来了。
操作完全相同，样品也有部分相同，一抗和二抗都没有改变，封闭液也是新配的，使用BioRad电源和六一转移槽。
半干法条件：约5＊8cm2(40 cm2)胶，上下各三层滤纸，NC膜和胶大小相同，滤纸比胶长宽分别大约1cm（约6＊9cm2），恒流150mA*20min。
分离胶浓度7.5%，目标抗原MW200kD。
这种条件在春节前做过很多次，结果重复性也不错。
请帮忙分析一下。谢谢！
注：转移时有气泡，但这不是主要问题，请勿就此讨论。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18245

作者: plaa 时间: 2013-9-10 18:04

实验室用的是bio－rad系统，我在做转移的时候准备用100V恒压转90mins
可是设定好电压，启动系统，它会显示87边上是V和A
师姐说有可能是系统不能支持到100V的电流
我就降到80V，启动系统，显示80边上两灯分别为V和V
但是刚才我去看系统显示，有变为XX边上两灯分别为V和A
各位用bio－rad系统的战友，大家是不是也碰到过这样的问题，怎么解决的呢？

作者: plaa 时间: 2013-9-10 18:04

请问marker跑不出来的原因除了它已经分解了，还有其它原因吗？
并且我们最后转膜也转不上去（用丽春红染色），没有任何条带！
我们所用的转移缓冲液的配方是：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 370mg，甲醇200ml配制成1L的溶液。我们用的湿法，仪器是Bio－Rad，电流为300mA，时间为3h。
请问会不会因为膜的问题而导致转移不成功？
谢谢

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甘氨酸2.9g？我记得是190mMol/LGly,大概为29g

作者: kswl870 时间: 2013-9-10 18:05

你看看如何在液氮环境下制样就知道了。
另外，你要的蛋白是属于什么蛋白？可以查到什么样的蛋白用什么样的缓冲液提取

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我要做的是组织蛋白酶,是一种巯基蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶,分子量大约在１５－３０kd,裂解液用trizol 怎么样？　

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-10 18:05

半干转移和湿式转移到底哪种方法好？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:06

1 看看抗原有无被污染，混入了不该有的东西。
2 看看2抗是否因为种种原因，能跟抗原直接结合了
3 看看抗原能否直接催化底物

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:06

你看看biorad的说明书，很简单，上面有说的。我觉得因该是你设定100V时候，它的电流超过的它的电流的最大值。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:06

QUOTE:

原帖由 kswl870 于 2013-9-10 18:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你看看如何在液氮环境下制样就知道了。
另外，你要的蛋白是属于什么蛋白？可以查到什么样的蛋白用什么样的缓冲液提取

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我要 ...

请你查查资料，看看你这种酶的分布，在看用什么裂解液

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:07

QUOTE:

原帖由 89tongzijun 于 2013-9-10 18:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
半干转移和湿式转移到底哪种方法好？

各有各的好处，看你有什么设备了，每种都可以把实验做好。

作者: kulee 时间: 2013-9-10 18:07

我用的是0.45um的pvdf膜，用bio－rad湿法转的膜，100v一个半小时，结果发现膜上无任何条带，（丽春红染五分钟左右）。而胶上染色－脱色后亦无条带发现。而我同时跑电泳的另一块胶上条带则非常明显（同样条件跑得胶）。膜上连Marker都没见到，我用的Marker是cell signaling 公司的。按照其说明书上，小胶加10ul即可，事实上我加了20ul，另一块直接染色的胶上Marker亦不是很亮，至少没我跑得蛋白亮。我的转移液是按照分子克隆第二版上配方配的。（甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 370mg，甲醇200ml配制成1L的溶液）
所以，我想请教高手，
1、到底我转膜哪一步出错了？
2、我要的蛋白分子量在42－44KD,对膜有无特殊要求？是否0.45um的pvdf膜和0.22um的pvdf膜均可？
谢谢！

作者: popo520 时间: 2013-9-10 18:07

我的细胞样品经RIPA裂解液抽提后，加入3×loading buffer制样。为什么样品跑电泳变得如此之宽？——与直接用1×loading buffer制样的条带相比（左边第一道）。难道仅仅是“边缘效应”的原因吗？还是与制样方法有关？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18246

作者: ending 时间: 2013-9-10 18:08

前面看到有人采用生物素标记的二抗－SABC-DAB检测系统做western，我目前也是采用这种方法，但是遇到了一些问题，请教大家了：
1。非特异性的条带和背景高
2。我只是用PBST封闭1h，时间是否太短了，此外用生物素标记的二抗－SABC-DAB，前面有人提到不宜用奶粉封闭，那么有没有人用奶粉封闭过的呢，效果如何
3。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决
4。我的蛋白42KD,Marker选用14kd－96kd的，分离胶采用12/100的，湿转14V恒压过夜转膜
5。sds－page的时候恒压和恒流哪个好？
6.今天做了一次考染，结果很奇怪各泳道均出现重影，marker也是，每个分子量标准均是后面均带有一条稍微弱一点的条带，不知道怎么回事？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:08

1, 从你的实验条件看，问题不大，不过
a 建议用小电压，28－36V， 4－8hrs试试
b 看看你的转移是否接反了正负极
2 2种膜都可以，不过建议用0.45um

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:08

QUOTE:

原帖由 popo520 于 2013-9-10 18:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的细胞样品经RIPA裂解液抽提后，加入3×loading buffer制样。为什么样品跑电泳变得如此之宽？——与直接用1×loading buffer制样的条带相比（左边第一道）。难道仅仅是“边缘效应”的原因吗？还是与制样方法有关？
...

可能是盐浓度不同造成的影响。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:09

前面看到有人采用生物素标记的二抗－SABC-DAB检测系统做western，我目前也是采用这种方法，但是遇到了一些问题，请教大家了：
1。非特异性的条带和背景高
2。我只是用PBST封闭1h，时间是否太短了，此外用生物素标记的二抗－SABC-DAB，前面有人提到不宜用奶粉封闭，那么有没有人用奶粉封闭过的呢，效果如何
3。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决
4。我的蛋白42KD,Marker选用14kd－96kd的，分离胶采用12/100的，湿转14V恒压过夜转膜
5。sds－page的时候恒压和恒流哪个好？
6.今天做了一次考染，结果很奇怪各泳道均出现重影，marker也是，每个分子量标准均是后面均带有一条稍微弱一点的条带，不知道怎么回事？

==========================================================================================================

1。非特异性的条带和背景高
可能性太多了，
a 一抗，
b 2抗
c 封闭的原因。
2。我只是用PBST封闭1h，时间是否太短了，此外用生物素标记的二抗－SABC-DAB，前面有人提到不宜用奶粉封闭，那么有没有人用奶粉封闭过的呢，效果如何
你的封闭是封闭膜吗？可以用BSA试试
3。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决
正常的，另外，是否是你的积层胶有问题。
4。我的蛋白42KD,Marker选用14kd－96kd的，分离胶采用12/100的，湿转14V恒压过夜转膜
没有问题
5。sds－page的时候恒压和恒流哪个好？
都可以
6.今天做了一次考染，结果很奇怪各泳道均出现重影，marker也是，每个分子量标准均是后面均带有一条稍微弱一点的条带，不知道怎么回事？
你的积层胶是否有问题？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-9-10 18:09

我配的电泳缓冲液，5x的是清亮透明的，可一稀释成1x的就变成浑浑的，也不知是啥原因，我侧了ph, 8.6左右，把他加热到50度，还是浑，请教ptglab 究竟是何原因，对蛋白电泳有没有影响，多谢！

作者: jujuba 时间: 2013-9-10 18:10

您好：我的试验计划中包括了western blot，现在正准备买抗体，但是我不知道在众多的抗体产品中如何选择。我想要测的是人细胞中COX-2、PPAR的蛋白表达情况。准备购买Santa cruz的抗体，应该买多少，他们给的数量是200ug/ml，这么多可以完成多少次western？另外，二抗应该如何选择，国内的还是国外的？我并不需要知道绝对量，只要能够看出组间差异就可以，这可以称作是半定量，应该选择内标还是marker?如果用内标，那么内标的抗体是不是需要买国外的，国内的可不可以？或许我的问题很菜，请包含！谢谢！

作者: veiwu 时间: 2013-9-10 18:10

您好，我打算用western做组织的蛋白定量，但是在测定蛋白浓度时，总是不可避免的混进血，导致测蛋白浓度测不准，请问高手如何解决。

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-10 18:11

请教楼上的各位高手，我也碰到这样的问题，从组织中提取蛋白质后，bradford测浓度，上样蛋白总量相等，但每次actin差异很大，另外我的actin是santa cruz 的多抗，ecl后条带弥散，亮度不佳，背景也很深，均为封闭过夜，一抗过夜，二抗1小时，能帮我分析一下原因吗？组织中均存在血液存留的问题，如何去除其对实验的影响？

作者: xyw5 时间: 2013-9-10 18:11

请问提取整个细胞(Jurkat细胞)的蛋白做MAPK通路的研究,用什么裂解液好一些.

作者: u234 时间: 2013-9-10 18:11

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-9-10 18:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问提取整个细胞(Jurkat细胞)的蛋白做MAPK通路的研究,用什么裂解液好一些.

LYSIS buffer 会比较好，这是本人惨痛的教训得出的经验

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:12

我没有遇到过，你看看PH是否有变化？另外你的水有问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:12

我想要测的是人细胞中COX-2、PPAR的蛋白表达情况。准备购买Santa cruz的抗体，应该买多少，他们给的数量是200ug/ml，这么多可以完成多少次western？
有小包装的就买小包装的，但是不建议买Santa公司的抗体，很多人用了感觉都不好，我们一般用就是1：100稀释。
一次5ml左右的孵育液，1ml的抗体 20－30次就没有了。

另外，二抗应该如何选择，国内的还是国外的？我并不需要知道绝对量，只要能够看出组间差异就可以，这可以称作是半定量，应该选择内标还是marker?
2抗可以联系 sean@ptglab.com。Marker是用来指示分子量的，因该用内标，

如果用内标，那么内标的抗体是不是需要买国外的，国内的可不可以？或许我的问题很菜，请包含！谢谢！
beta－actin的抗体可以买便宜的，不过最好是sigma的单抗。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:12

我做过的胎盘组织，我就在低温状态下洗了4个多小时，才制样的，我也没有办法去掉血液的影响，我只能做到尽量的清洗多一些。
另外加2抗的选择要好，要跟人的IgG没有交叉反应，现在背景的问题我们是没有出现过了。

作者: langlang 时间: 2013-9-10 18:13

相关疾病：
头痛
ptglab,又有问题了!我自制的多抗现在怀疑与其抗原分子的另外家族成员有交叉反应，想通过抗原吸收实验来证明。由于改抗原分子在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，而改变诱导条件几乎不能改变表达形式。这是不是意味着做吸收实验的抗原分子一定要经过包涵体变性，复性，纯化的步骤（想来就头疼！！）。或者你还有什么更好的建议呢？

作者: kuohao17 时间: 2013-9-10 18:13

大侠,你是否遇到过这样的现象:

前天制胶的时候使用了新配的两种试剂，一个是30/100的凝胶储备液，一个是配置分离胶8.8的Tris/SDS。但是换了之后麻烦不断。

上样缓冲液的指示剂在积层胶过后呈现很细的一条带，但一到分离胶的时候溴酚兰就迅速弥散，以至于后来我都看不到电泳跑到哪儿了，考染后发现分子量较小的蛋白基本弥散，分子量大的很清楚，我实验重复了两次结果一样。我的一个同学和我同时做的，所不同的是她跑的分离胶是7.5/100，我跑的是12/100的。她没有出现这样的情况。
今天试剂重新配制,依然没有改善,请问这是为什么?

作者: 小荷尖尖 时间: 2013-9-10 18:14

我现在的问题是跑胶时总是不好，溴酚兰总跑歪，不是成笑脸形就是一端高一端低，现在用的是12％的胶，蛋白分子量是16，625。求问影响因素可能有什么？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:14

你说的做吸收实验的抗原分子是你免疫的那个抗原吗？还是它的家族成员？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:14

我没有遇到过这个现象，不过你看看是否是你的样品的离子浓度个胶的离子浓度相差太大？

你可以将你同学的样（跑7.5%的）和你的样同时跑，看看是否有问题？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:15

另外做Wb时选择适当的2抗。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:15

你看看是否是凝胶没有凝好，或是没有将胶混合均匀就灌胶了

作者: langlang 时间: 2013-9-10 18:16

是免疫用的抗原！我查了查资料可考虑用间接ELISA——因为有文章用到了将变性的包涵体作为包被抗原，检测抗体的特异性。具体操作可以指点吗？

作者: loli 时间: 2013-9-10 18:16

关于溴芬兰弥散的现象,你让我注意上样和胶,其实我和我同学用的样品也是一样的.就是有一个现象很明显:随着胶浓度的下降溴芬兰弥散的越慢,浓度一高就迅速弥散,包括小分子的蛋白.
由于这一步都做不好,无法进行下一步实验,十分焦急,盼复

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:17

你能具体的说一下你的实验吗？我还是不太清楚，你如果发现跟其他家族成员有交叉反应，有不能确定，就看看融合蛋白的所表达的序列跟其他的家族成员是否有共同之处，或者做Wb，用融合蛋白做吸收也可以。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:17

那胶溶液中肯定就有影响你实验结果的因素，高浓度就扩散，低浓度就还好，我还是觉得是离子浓度有差异造成的扩散。你可以将你的样品里多加点盐或透析一下，看看效果是否改变或是加剧就知道了

作者: idea2011 时间: 2013-9-10 18:18

你的问题可能出在下层胶上，您配置的下层胶所用的试剂可能有失效的成分，我认为最有可能的是TEMED，建议更换新的TEMDE重新配置SDS-PAGE。

作者: memory 时间: 2013-9-10 18:18

转膜后丽春红染色，整块膜都是红的（去离子水洗了3遍，还是红的），只看到MARK的条带，却看不到蛋白条带，请问为什么？

作者: langlang 时间: 2013-9-10 18:18

,让你费解了，不好意思！！是这样的：我制备了一个家族两成员的多抗，抗原是原核表达的GST融合蛋白，两者之间一级结构有50％左右的相似性（是不是注定会有交叉反应？）。目前免疫组化的结果显示：其中一个抗体A'可以识别该抗原A不应表达的部位（如，小脑），而另一个成员B恰好表达于该部位。对于这样的结果是不是应该用抗原吸收实验处理A抗原的抗体A‘，并用处理过的抗体进行组化染色，以判断是否确实可以识别B。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:19

QUOTE:

原帖由 langlang 于 2013-9-10 18:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
,让你费解了，不好意思！！是这样的：我制备了一个家族两成员的多抗，抗原是原核表达的GST融合蛋白，两者之间一级结构有50％左右的相似性（是不是注定会有交叉反应？）。目前免疫组化的结果显示：其中一个抗体A'可以识别该抗原A不应表达的 ...

如果一级结构有50％的相似性，多半会产生交叉反应，所以你的多抗能识别B抗原是肯定的。

如果要鉴定能够在小脑中识别的蛋白是否就是B抗原，可以用Wb来判定. 你所列的判定方法还是不能确定是否就是B蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:19

从你的结果看是否是没有封闭好造成的，另外是否是抗原蛋白太少了？你写的太简单了，只能判断出来这些，你还是从头好好做一遍实验比较好

作者: okhaha 时间: 2013-9-10 18:19

相关疾病：
腹水
请问,应用亲和层析的方法,从免疫小鼠血液中纯化单抗过程中需要的具体方法及仪器名称,价格方面的资料.谢谢!!!!!!!
多肽合成-----免疫小鼠-------收集血液/腹水
\ /
\ /
多肽与树脂 /
共价结合 /
\ /
层析柱 ---------------/
\
\-----------纯化的单抗

作者: langlang 时间: 2013-9-10 18:20

这么说用间接ELISA也无法判断了！只有通过WB从分子量上进行判断！谢谢！！

作者: tuuu2 时间: 2013-9-10 18:20

牛人，我最近在做wb ，可是上样缓冲液中溴芬蓝好像有问题，在电泳时，只一个半小时溴芬蓝就跑到底了，而拿胶用考马斯亮兰染色是发现蛋白还在上头，不知什么原因，请牛人指教，小弟不胜感激，我得2×缓冲液体系为
80mm Tris-HCL PH6.8
200mm DTT
4% SDS
20% 甘油
0.2％溴芬蓝,
其中每次加样时,总是将DTT临时与其他已经配好底混合液混合,上样量为20微升
没办法,我每次只好在溴芬兰跑完后再跑上两个半小时,那时蛋白才跑开,急盼牛人指点

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-10 18:21

我昨天封闭膜时（37℃，摇床，2小时），培养皿掉下摇床，等到我发现时，液体已经干了，不知什么时候掉下去的，我又重新配了一份封闭液，继续摇了1小时，后面的程序依旧，结果今天洗片出来什么也没有，以前是有条带的。是因为这个原因才导致失败的吗？那又是为什么呢？急盼回音！谢谢！

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-10 18:22

那这是为什么呢，封闭液不就是milk吗？再重新配重新摇怎么就不行了呢？膜干了后蛋白质会有什么变化吗？会没有？还是和一抗结合不上去了？

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-10 18:22

还想向大家请教一个问题：偶跑电泳时，每次都是在1个小时左右时，上槽的缓冲液面逐渐降低（初加时液面都是与高的那片玻璃板平齐的，跑着跑着液面就下降了），到低于低的那片玻璃板时，电路就中断了。我不得不切断电源，或者向上槽中添加缓冲液，或者就把下槽的缓冲液往上槽倒（因为现配的1×电泳缓冲液用完了，懒得再配。而且发现下槽的液体是越来越多），电泳3个半小时得停下来2次。但是电泳、转膜的结果倒没见有多大影响。偶本以为是电流产生的热使水分蒸发了，在外部加冰块降温好象也没见改善，不知大虾们有何高见！否则我得一直在旁边守着，过一个多小时就得去倒腾一下。解决了这个问题，我就有连续的3~4个小时啦，出去透透风也好呀！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:23 标题: 回复 #783 阿凡提的帖子

是你的电泳槽漏buffer（缓慢的），不是热量的问题。你看看能否将电泳的架子上紧点，另外这个问题很普通了，仔细观察一下就可以发现了。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:24

我觉得不是你的溴芬兰有问题，而是你的其他系统有问题，可能出在下面的方面：
1 电泳槽是否有问题？
2 胶是否有交联的问题？
3 样品是否没有没有制备好。

从上而下鉴定。

作者: bohe221 时间: 2013-9-10 18:25

我想知道封闭液5%BSA是不是用PBS配的，如果不是该怎么配，因为我也要做磷酸化的抗体，谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-10 18:25

那这是为什么呢，封闭液不就是milk吗？再重新配重新摇怎么就不行了呢？膜干了后蛋白质会有什么变化吗？会没有？还是和一抗结合不上去了？

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做WB的所有过程中膜都是不可变干的，而且你的情况也不知道已经干了多久了。具体原因我也说不好，只知道干的膜是肯定做不出来的。ptglab 知道吗？

我猜想膜和蛋白都干了，蛋白完全无法复性。蛋白与抗体结合是需要局布复性的，即使一小段AA 序列也应该是有一定空间结构的。不知道这个猜想是否合理。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:25

你们的帖子我都看了，我也不知道为什么southern做不出来结果。
不过可能是膜干了就很难再用我们常用的TBS或PBS浸润，也就结合不上去其他的东西，要想接着用要加甲醇重新浸润。有一点经验我想跟大家分享一下，膜在封闭以后可以干燥保存的，我做过保存了半个月的膜再做实验，效果会略差一点。

作者: qiangren789 时间: 2013-9-10 18:26

电泳槽是一个博士师姐做电泳时留下来的,当时她用她自己的wb系统跑电泳,很正常,四个小时左右溴芬兰到底,我用的系统是临时自己配制的,参照<分子克隆>第二版的配方来得,因为试剂是新配的,是不是要放一段时间用才好一些.样本是细胞株用三去污剂裂解的,但没有经过离心取上清.这一步是否有些问题.再就是配试剂时的ph值是不是一定要很准确,尽管我们当时用了PH计,但估计那个不太准

作者: qiangren789 时间: 2013-9-10 18:28

浓缩胶储存液及分离胶的储存液都是用ph计测量过得,为6.8及8.8 ,还有其他的一些试剂的配制均是按分子克隆上的配方,剂量方面应该不存在问题,不知道还会是什么方面的问题,急盼斑竹回复,小弟不胜感激

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-10 18:29

我是按照常规的步骤再往下做的，不知道用甲醇泡一下就可以“起死回生”了，下次不能轻易就把膜丢了！要用甲醇泡多久呢？泡过以后就可以直接放到一抗里去了吗？另外，还有一次（刚开始时）去放射科曝光，不知道胶片和暗盒还有感蓝光和感绿光之分，结果放错了胶片，自然不感光。知道后马上又重新配了一份显色液，再进行曝光就没有结果了。是不是因为第一次的发光底物已经与二抗结合，后面再加的就结合不上去了，而第一次的荧光又逐渐减弱以至胶片已不能感光了？那有没有什么办法能把前次的发光底物去除，也使它能“起死回生”？
还有那个电泳槽我真没想过是漏buffer，观察太不仔细了！我一直认为那个电泳槽设计的很好呢！（是小日本的）因为灌胶时，它设计的是用一圈胶带夹在两层玻璃板之间，既不漏胶也不漏水，密封的很好！玻璃板装在一个小架子上，然后与中间的支架卡上。要是这个卡子松了，还真没有什么好办法能把它卡紧呢（可能弹簧松了）！

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:29

从你的配方看还是没有问题，PH不要求那么准确，你的做法是可以的。

另外，我觉得可能还是出在下面3个方面：

1 电泳槽是否有问题？

看看别人制好的样和胶在上面跑是否有问题？

2 胶是否有交联的问题？

看看TeMED和APs是否有问题

3 样品是否没有没有制备好。

样品离心后煮沸10mins上样。

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:30

一般浸泡1min就可以了，
一般你的膜重新加显色底物是可以发光的，如果不发光了，可以重新加2抗再显影，或加3抗显影即可。

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-10 18:31

不好意思，我想请教一个比较菜的问题，转膜时何为湿法，何为半干法？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:31

半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统
，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法，
2 用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-10 18:32

那就是说，湿法才需要tank了？
我用的是bio－rad公司的转膜仪，转膜所用的滤纸、胶、膜等均需要，按照阴极－泡沫棉－滤纸－胶－膜－滤纸－泡沫棉－阳极放好固定后，再把整个支架垂直放入电泳槽中（类似于跑胶放置），最后加电泳液，并盖上盖。而且厂家提供一小冰盒要求放在阴极后，是转膜时才用，平时-20度保存。我这种转膜法是否就是所谓的湿法啊？

作者: NBA 时间: 2013-9-10 18:32

QUOTE:

原帖由 tangxin_80 于 2013-9-10 18:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那就是说，湿法才需要tank了？
我用的是bio－rad公司的转膜仪，转膜所用的滤纸、胶、膜等均需要，按照阴极－泡沫棉－滤纸－胶－膜－滤纸－泡沫棉－阳极放好固定后，再把整个支架垂直放入电泳槽中（类似于跑胶放置），最后加电泳液，并盖上盖。而且厂家 ...

这个就是湿法转移

作者: youyou99 时间: 2013-9-10 18:33

请教大侠:
上次问了跑SDS-PAGE时10-12的分离胶会出现弥散的问题,您说是样品的离子强度高了,我现在加样时只加2*上样缓冲液,依然出现弥散,不知道问题出在哪儿?

作者: greenbee 时间: 2013-9-10 18:33

您好，能不能给我一个4Xloading buffer的配方，另外想问一下，不同的loading buffer是否会影响实验结果？
新鲜组织放到－70度冰箱2个月，可否用来做western blot.
谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-9-11 12:13

我做WESTERN 时，跑甘氨酸SDS-PAGE，发现蛋白在堆积胶中跑的比较弥散，没有聚集，因此在分离胶中也没有跑成一条密集的条带，但是做DAB显色，还是看到实验结果，请问ptglab，电泳时胶不积聚是由什么原因引起的，对与WESTERN结果有很的影响么？如何避免啊，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 12:14

因为我看不到具体的情况，只能根据你的描述来看，你能否看看降低或是升高你的样品的离子强度

作者: NBA 时间: 2013-9-11 12:14

我的帖子里有5X的loadingbuffer的配方，你可以参照用

作者: NBA 时间: 2013-9-11 12:14

to duoduo

你看看是否是你的stacking buffer的PH是否不对，凝集的是否不好，另外浓度是否太高，等等。

另外原理方面可以参看sds－page的原来，特别是stack gel 这部分。

至于对wb结果的影响要看具体出现的问题和问题的严重程度而定了，一般是分离不好造成分析困难，条带弥撒，结果不漂亮，等等

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-11 12:15

你好，请教：
我想用western的方法检测目的蛋白的表达。
拟采用的方案：接种8×10（5）的COS-7细胞于60mm的dish里进行转染，72小时后收集细胞。先用PBS洗2遍，用rubber police收集细胞（估计大约能收集200微升），然后加等量2×SBS上样buffer，煮沸5分钟。然后取20微升上样跑PAGE。没有这样做过，不知可行否？样品会不会太浓，太粘稠？
先谢谢了！

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请问 rubber police 是什么东东啊？还有你这样做的效果如何？望指教，谢谢

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-11 12:57

QUOTE:

原帖由 zwsyrt 于 2013-9-11 12:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，请教：
我想用western的方法检测目的蛋白的表达。
拟采用的方案：接种8×10（5）的COS-7细胞于60mm的dish里进行转染，72小时后收集细胞。先用PBS洗2遍，用rubber police收集细胞（估计大约能收集200微升），然后加等量2×SBS上样bu ...

我的老师把他叫橡皮***。就是一种收集贴壁细胞的工具，我们使用的都是一次性的。因为做western，不能用胰酶消化，其实你也可以用其它的机械的方法收集细胞。
听PTGLAB的建议，我现在用6×的loading buffer直接煮样品，然后电泳，效果还好。

图片附件: 44452558.jpg (2013-9-11 12:57, 10.35 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18259

作者: 66小飞侠 时间: 2013-9-11 13:06

我想做细胞核内的蛋白的WESTERN,但是不知道是否需要特殊的裂解液和蛋白提取过程,是否普通的ripa buffer就可以呢
希望高手赐教，能否告知详细的裂解液配方和蛋白提取过程

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-11 13:06

我的老师把他叫橡皮***。就是一种收集贴壁细胞的工具，我们使用的都是一次性的。因为做western，不能用胰酶消化，其实你也可以用其它的机械的方法收集细胞。
听PTGLAB的建议，我现在用6×的loading buffer直接煮样品，然后电泳，效果还好。

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放一张最近的western照片

图片附件: 69096123.snap.jpg (2013-9-11 13:06, 11.15 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18261

作者: caihong 时间: 2013-9-11 13:08

最近在做WESTERN-BLOT，想检测MAPK途径的ERK，JNK和P38磷酸化的情况，但做了几次都没有阳性结果，以下是我的实验条件，请点一下：
1×10的7次方JURKAT细胞，用试剂盒提取，得到浓度为0.7mg/ml蛋白.
选择25ul的蛋白浓度的样品与上样缓冲液6.25ul混合，100度加热3min使蛋白变性，取25ul加样，200V电泳。
电泳后考马斯亮兰染色，脱色后可见明显蛋白条带，目的条带附近位置也有条带出现。

在冷却条件下100V电转60min，转后可见明显的MARKER条带，转膜后的膜（PVDF膜0.4um)用考马斯亮兰染色，无蛋白条带，说明转膜成功。

取下PVDF膜，使用KPL公司的试剂盒进行杂交，
1）在1×Detector Block（封闭液）中4度下封闭4h。
2）分别用磷酸化的JNK（54KD，一抗均为cell signaling公司产品）和总的JNK一抗溶于1×Detector Block中（all in 10ml），放于冰箱4度过夜（未用摇床，cell siganling 公司说明书要求4度轻微摇动过夜，但我没有冷冻室，只能放于冰箱过夜）
3） Wash Solution洗3×5min。
4）加入碱性磷酸酶（AP）包被的二抗 1：500室温共10ml，室温摇床反应1小时。
5） Wash Solution洗3×5min。
6）底物显色。
结果：磷酸化的JNK和总的JNK位置都没有底物显色的条带，实际上什么条带都没有出现，以前做过磷酸化的ERK也没有条带。
请指点一下，为什么我没有阳性结果。
目前主要考虑转膜后的因素，另我的一抗在-80度冰箱里放过一次，结过冰。现在放在普通家用冰箱的冷冻层，这样一抗会有问题吗？

作者: jude 时间: 2013-9-11 13:09

我想请教一下，做核蛋白的WESTERN BLOT，用什么来做内参？还是β-ACTIN吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:09

"我想做细胞核内的蛋白的WESTERN,但是不知道是否需要特殊的裂解液和蛋白提取过程,是否普通的ripa buffer就可以呢
希望高手赐教，能否告知详细的裂解液配方和蛋白提取过程 "

ripa buffer应该不能将核膜溶解，所以核蛋白是不能提出来的，
1 如果胞浆蛋白核膜蛋白对你的实验结果没有影响的话，你可以用stop buffer提取总蛋白。
2 如果胞浆蛋白核膜蛋白对你的实验结果有影响的话，你可以用ripa buffer破细胞膜，离心，丢弃上清（不要胞浆蛋白和膜蛋白），将沉淀用stop buffer 溶解，这就是核蛋白

两种方法最后都要用超声波将DNA打断。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:10

你的wb的图做的挺漂亮的，另外，你收集贴壁的细胞时，如果用 rubber police 不能伸进培养瓶怎么办呢？
我用stop buffer直接加到培养瓶中提取总蛋白，效果也很好，不过细胞培养基要洗的很干净才可以。再就是裂解后会变的很粘稠（DNA），要有耐心。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:10

几个改进的建议：

1 将蛋白的上样量加一倍，（做不到就做浓缩）
2 转膜好的膜用丽春红染色检测是否有条带
3 看2抗在1：500能否work，
4 你同时用的一抗是2种对吗？这两个一抗是否都是一个种属来源？如果不是你加的是同一种2抗吗？
5 一抗室温摇床2小时（另外稀释比例是怎么决定的？加大一倍以上试试（浓一点）

作者: 969 时间: 2013-9-11 13:11

你们好!我前天重新配了一份电泳缓冲液，也调了PH值为8.3(PH计调的)。昨天跑了一块胶，结果胶上什么也没有!因为这次只有电泳缓冲液改变了，其它的都没有改变，所以就想到了PH值调的不准。今天用精密试纸试了一下，约在7.0，差别很大，于是又用NaOH把PH值调到了8.0至8.5之间，今天再跑一次还是什么没有!我想请问，是不是因为再用NaOH把PH值调回去，缓冲系统中增加了钠离子，改变了电泳液中的离子强度，或使蛋白质的荷电减少才导致电泳无结果？我把浓缩胶也一起染了一下，但不知蛋白质在浓缩胶里应该在什么位置，是什么样的表现。我看见加样槽的底边染色较深，这是不是没跑下来的蛋白质？

作者: 土豆potato 时间: 2013-9-11 13:11

最好把图拿来看一下。

试纸有时贮存时间长了差别很大，即使是精密的也容易有问题。如果可以用PH计试一下吧。

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-11 13:12

试纸是新买的，而且先用PH计的标准液测了一下，挺准的。附近的几个实验室的PH计都不太准，我们实验室的也坏了。这样你也认为是电泳缓冲液的问题了？我今天下午又重新配了一份，没有NaOH的，不知明天电泳结果如何。

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-11 13:14

另外，还想再问一下，转膜后染胶是不是一定要胶上无条带才说明转得比较成功？我的理解是只要目的蛋白能转过去就可以了，因为我的目的蛋白只有17KDa，转得过长会不会透过膜去呀(因为有NC膜，就没买PVDF膜)？

作者: #甜# 时间: 2013-9-11 13:15

我看师兄做western,检测酵母表达蛋白，显色反映后膜上竟然没有条带，而且没有颜色，是白色的；用丽春红染色后有条带出现，但洗过几次后条带就消失了。请问是怎么回事？是抗体失效吗？

作者: fox_79 时间: 2013-9-11 13:15

估计是抗体系统和显色有问题，要么没有目的蛋白。丽春红染色能够用水冲掉，否则影响后续的反应。

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-11 13:16

想请问一下，各位做蛋白的高手，偶培养的细胞先用70％乙醇固定做流式后剩余的细胞能不能继续用来提蛋白，做western？企盼高手指点一二，急用，先行谢过了。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:16

我觉得你可能出了一个低级错误，（从你的表述中好象都没有问题,所以我觉得问题出在一般人都不会犯的地方）。

1 你是否检测了蛋白浓度，用什么方法，可否让其他人个你用SDS－page检测一下蛋白。
2 你的样品是否处理完全。
3 你的胶是否是转移再染色的，如果是的话，胶上没有条带可能是转移过量。
4 电泳的电极是否正确？正负极？是否直接导通？
从上往下鉴定。希望你能找到问题

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:16

具体的实验是怎样的呢？没有条带的原因是很多的，你们排除了哪些？从你现在的表述看，实验的每一步都可能有问题（因为你具体的东西什么也没有说，）

你可以把我的原来的帖子看看，很多人碰到过，你看看有没有帮助

作者: fei1226com 时间: 2013-9-11 13:17

请教我的wb结果为什么每个样本的条带都连在一起？条带之间没有任何的间隙。多谢

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:18

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2013-9-11 13:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教我的wb结果为什么每个样本的条带都连在一起？条带之间没有任何的间隙。多谢

有两种可能，
1 转移是扩散了，可以将转移buffer里多加点甲醇，去掉点SDS。
2 电泳时就扩散了。这要你自己多看看（可以电泳完取一部分染色）

作者: star#room 时间: 2013-9-11 13:19

我觉得你可能出了一个低级错误，（从你的表述中好象都没有问题,所以我觉得问题出在一般人都不会犯的地方）。

1 你是否检测了蛋白浓度，用什么方法，可否让其他人个你用SDS－page检测一下蛋白。
2 你的样品是否处理完全。
3 你的胶是否是转移再染色的，如果是的话，胶上没有条带可能是转移过量。
4 电泳的电极是否正确？正负极？是否直接导通？
从上往下鉴定。希望你能找到问题

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1蛋白浓度是用考马斯亮蓝结合法测定的，1.8~3mg/ml，每次上样20或30μg，与2×样本缓冲液等体积(大约)混合，总体积20μ l。
2样本在上样前100℃变性5分钟，离心后取上清加样，未加样的孔加上等体积的上样缓冲液。
3因几次胶上都没有带，所以就不转膜了，电泳结束后直接拿来染。
4每次电泳我都很仔细看过有从下往上的气泡出现才放心，而且都有两人以上进行检查，正负极接反不可能。如正负极接反，溴酚兰不会向下移动吧! 直接导通是什么样的？会出现什么结果？
我觉得你说的上述错误我都没有犯呀，还有其他的原因吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:20

换一种方法检测蛋白浓度，用两种以上的方法检测蛋白。强烈建议，另外将别人测定好的蛋白（用Sds－page跑过，并且染的出带的）点在一起看看别人的蛋白是否有带。（最好上一样的总量，都是20－30ug）

再你的染色液是否配错了？（通过上面的实验是可以判定出来的）

另外直接导通是电泳槽没有装好，（新手常犯的毛病，正负极没有通过胶就直接导通了（通过buffer）

作者: wu11998866 时间: 2013-9-11 13:21

我所提取的蛋白来自于脑区的核团，做的是蛋白的磷酸化CREB，但是该脑区磷酸化的水平据说是比较低的，所以上样量已经加到了每个梳孔（1mm厚的梳子）100mg,是不是上样量太多的情况下也会影响到结果。
是不是说可以通过某些试剂盒把所需要的蛋白纯化从而提高western的效果。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-11 13:21

你好,我最近要做western,可是我的蛋白分子量只有5KD,你说怎么办,谢谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-11 13:22

你好,我最近要做western,可是我的蛋白分子量只有5KD,你说怎么办,谢谢

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这里有详细的讨论：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=505078&sty=3')

作者: JK.jon 时间: 2013-9-11 13:22

你显色用的是什么，ECL 还是DAB,你知道两种方法分辨率相差多少

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-11 13:23

您经验实在太丰富了，佩服！我今天借了别人的marker一起跑了一下（因为我们用免疫荧光法，为了省marker，一直都没用marker），20μg，染胶时发现胶的颜色比原先淡，想想那个染色液也用了有半个月了，而且又是一直放在培养皿中的，体积也越来越少，就换了新的，一染带果然出来了！唉呀，真是笨啊！被这个问题纠缠了有1周才想到，还在那拼命换缓冲液，把我们的甘氨酸都用差不多了!膜也转上了，但是在膜的上半部带还比较清晰，下半部就有不规则的斑片状或象火焰状的图形，不知是什么影响的？带呈波浪形，样本之间的界限也不清楚，象連在了一起（原来的条带都比较清晰而且独立）。我看了你前面的帖子，是电泳时有扩散引起的，那如何防止扩散呢？我们这样的新手给您增加了不少麻烦，在此由衷感谢您！

作者: star#room 时间: 2013-9-11 13:24

SDS-PAGE时用的硅化玻璃怎样处理较好，灌胶前用不用酒精擦一下，硅烷化？
NC膜转印组装前，最好用什么溶液泡？泡多久？
1.5mm的加样孔最好加几ul，多少样品？
多谢了

作者: applebook=213 时间: 2013-9-11 13:24

真高兴能有你这样的高手！我做Western时遇到了一个问题：我用大肠杆菌表达的病毒衣壳蛋白和鱼的病灶组织样品一起点样，一抗为重组蛋白免疫大白兔所得。显色后发现：鱼的病灶组织样品中衣壳蛋白带比重组的蛋白带大一些，不知什么原因。
多谢！
图中，靠近Marker第三条较浓的带是重组衣壳蛋白，大约50kDa,右边的一条是病鱼中的衣壳蛋白，明显大于重组蛋白的条带。

图片附件: 52914396.jpg (2013-9-11 13:24, 3.07 KB) / 该附件被下载次数 27
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18262

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:25

你说的表达量低，是低到什么程度，我们检测一些蛋白都是表达量低的，都检测出来了，问题不大，再就是，你要先wb测一下看看是什么问题。

我不知道什么kit可以纯化目的蛋白的作用。

不过你看CREB这个蛋白在哪里表达（膜，胞浆还是核）如果只在其中的一个地方表达，你就不要用提总蛋白的方法提蛋白就可以了。只提膜和胞浆蛋白或是只提核蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:29

我两种都用，最常用的是ECL， Ecl更灵敏一些，我觉得两个有100倍左右的差距

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:29

“下半部就有不规则的斑片状或象火焰状的图形，不知是什么影响的？带呈波浪形，样本之间的界限也不清楚，象連在了一起（原来的条带都比较清晰而且独立）“

一般小分子的蛋白转移时候容易遇到这样的问题，斑片是否是转移时候的气泡？，转移时多加点甲醇，去掉点SDS，小分子转移会更好一点的。
再就是你要分清楚时电泳时产生的还是转移过程中发生的变化。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:30

SDS-PAGE时用的硅化玻璃怎样处理较好，灌胶前用不用酒精擦一下，硅烷化？
不用，直接倒胶。
NC膜转印组装前，最好用什么溶液泡？泡多久？
PVDF 膜用甲醇泡泡就可以了，2mins， NC膜好象也可以这么处理。
1.5mm的加样孔最好加几ul，多少样品？
你看看我前面的帖子有计算最大上样量的方法。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:30

1 通过计算，你构建的融合蛋白应该有多大？是否跟参照分子量Marker一致？
2 融合蛋白是否是不完全的片段?
3 如果都没有问题，有一个解释是：真核表达的蛋白核原核表达的在修饰上不同，有可能偏大或偏小。

具体的，你可以参照上面分析一下。

作者: IAM007 时间: 2013-9-11 13:38

问一个比较菜的问题，为什么要变性后再离心取上清，我每次变性后总是把它们在混匀后再加样的。有什么不同

作者: hold住 时间: 2013-9-11 13:39

今天第一次做western ,marker 上了10ul的样，电泳完后可见很明显的marker 条带，湿转100v*90分钟后，发现PVDF 膜上只有隐约可见的marker ，滤纸上没有发现转过的痕迹，胶以考染后也没有发现marker 的痕迹，倒是还看得见我的样品似乎还没有完全转到膜上，向您请教为什么会出现这种情况？
谢谢！

作者: windy+++ 时间: 2013-9-11 13:39

我克隆了一融合基因（A＋准备蛋白表达，作western检测，目前只有A蛋白有单抗，因为其是已知蛋白，而B没有，是我设计的新序列，不知用A蛋白的单抗能否作出融合蛋白的western？

作者: finger 时间: 2013-9-11 13:40

我计划用wester-blot检测培养的成纤维细胞的MMP-2（72KD）和MMP-9（90KD），请问细胞裂解液用什么配方好？我有一个配方行不行？
TritonX-100 1mL
脱氧胆酸 1g
SDS 0.1g
溶解于1×TBS中，定容为100ml.
80ml的培养瓶长满细胞，大约需要多少的裂解液？是把培养基倒掉，PBS洗后，直接把裂解液加到培养瓶中吗？还是把细胞刮下来后，再加裂解液？
另外，提取出的蛋白定量哪种方法比较简单？
我们实验室刚成立，我又是第一个研究生，而且导师都没做过WB。所以，请大家多多指教。不胜感激。

作者: kuaizige 时间: 2013-9-11 13:40

我这种原核表达是形成包涵体，为非融合蛋白，而且衣壳蛋白基因是一个完整的开放读码框，表达的重组蛋白也和 Marker 大概一致。我想可能就是修饰的问题了。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:40

不能溶解的东西上样有什么用呢？只能影响你的实验结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:41

你说的是否是没有转移完全（看上去也是这样），你可以相应的延长转移的时间，另外保持冰浴状态对你的转移比较好。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:41

如果是单抗就不太好说，要看这个单抗是否能够做Wb，如果可以，应该是没有问题，可以做为检测融合蛋白的抗体，做的时候注意分子量是否在预定范围内就可以了，另外是先翻译A蛋白还是B蛋白？最好先是A蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:42

mmp2， mmp9，我没有记错的话是分泌蛋白，膜蛋白？如果是的话你的buffer就没有问题，
你的细胞是贴壁长的吗？因该刮下来提蛋白，你可以查到相应的方法，

作者: okhaha 时间: 2013-9-11 13:42

我请教过实验室的老师，可能是转移不完全的原因。不过我的蛋白只有21kD，转移时间过长是否会先转移出去？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:42

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2013-9-11 13:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我请教过实验室的老师，可能是转移不完全的原因。不过我的蛋白只有21kD，转移时间过长是否会先转移出去？

你可以用小电压，长时间，（可以用12％－15％SDS－page，28－36V， 5－8hurs）

作者: okhaha 时间: 2013-9-11 13:43

谢谢!是做western得单抗，而且是先表达A的，那就是说和作A的western是一样的步骤和方法了，只是最后作对照最好用A蛋白在作一次western以便比较是吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:43

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2013-9-11 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢!是做western得单抗，而且是先表达A的，那就是说和作A的western是一样的步骤和方法了，只是最后作对照最好用A蛋白在作一次western以便比较是吗？

yes

作者: S6044 时间: 2013-9-11 13:44

我还想问问转印时要是时间长，会不会是蛋白转丢，因为我发现时间长了，蛋白会转到膜的另一面

作者: S6044 时间: 2013-9-11 13:44

还有封闭剂和抗体稀释剂作为一个体系，应该一个浓度，还是稀释抗体用的浓度低一些。
脱脂奶粉和BSA效果有什么区别
我用的是5%的脱脂奶粉（TBST），这个浓度对抗体有没有影响，会不会影响ECL的结果。我做WB的目的蛋白丰度很低，是不是应该降低封闭剂的浓度，用不用换用BSA.
我在实验中发现加入ECL试剂到二抗稀释液中并不产生荧光，是不是脱脂奶粉太高
一般做ECL所用BSA的浓度是多少？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:45

长时间或是大电流会转移过头的，
我们喜欢封闭剂和抗体稀释剂一致（5％milk），但是可以不一致，封闭剂用5％milk，抗体稀释液用1－2％的milk，如果抗体质量不好这样会增加背景。

“ECL试剂到二抗稀释液中并不产生荧光” 你看看是否是你的2抗有问题？一般是不会这样的。

作者: qqq111 时间: 2013-9-11 13:45

请问你用的脱脂奶粉是哪个厂家的，可以用扬子江的吗？

作者: S6044 时间: 2013-9-11 13:46

不过脱脂奶粉和BSA区别在那里？

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-11 13:46

您真是辛苦了，不如以分子量大小来分组（1-20kd,20-50kd,50-100kd...)来总结一下WB条件（主要是膜（PVDF多大孔径），恒压/恒流大小，时间等）重新发个贴好么？这样很多人就可以不用再问了：）
如果没时间就烦请告我20kd左右的以上几种条件多多谢谢。

作者: 笑弯了腰 时间: 2013-9-11 13:47

请问国内何家公司有进口分装的beta-actin抗体！产品号。

谢谢！

作者: tie8 时间: 2013-9-11 13:47

问个很初浅的问题。我想研究的蛋白属于分泌型的。我把细胞培养上清收集浓缩后，是否加loading buffer后，煮沸变性即可上样？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:48

QUOTE:

原帖由 qqq111 于 2013-9-11 13:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问你用的脱脂奶粉是哪个厂家的，可以用扬子江的吗？

可以用，我们用过。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:48

QUOTE:

原帖由 tie8 于 2013-9-11 13:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
问个很初浅的问题。我想研究的蛋白属于分泌型的。我把细胞培养上清收集浓缩后，是否加loading buffer后，煮沸变性即可上样？

是的，如果浓度不够，可以先将上清浓缩后制样。

作者: plaa 时间: 2013-9-11 13:49

北京中山公司好像有进口分装的beta-actin抗体！我去年买过，明天我再帮你查一下产品号，不过我做过很多次western blot，beta-actin的条带都不理想，有些浅，用进口打包装的actin抗体也是如此。
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:49

如果要买beta－actin的抗体还是建议买sigma公司的，真的很好用。

作者: qhyu 时间: 2013-9-11 13:49

我的结果中背景很深，条带信号很弱，marker泳道条带都会反白，试了很多一抗二抗浓度，都未改观

作者: mamamiya 时间: 2013-9-11 13:50

,请问怎样证明我所提取的蛋白是细胞核里的蛋白？

作者: jujuba 时间: 2013-9-11 13:50

你好，我用PVDF膜做Western 时在转膜后用丽春红无法染上色.但在杂交后能用氨基黑染上, 不知为何,请指教

作者: xue258 时间: 2013-9-11 13:52

您好！
请问如何获得胞膜蛋白作western blot?
谢谢！！！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:52

可以调整抗原的量(上样量），升高上样量会使条带增强。

另外是否是封闭的问题？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:53

不用证明，就用提取方法就可以看出来了，
另外可以找找只在核内表达的蛋白，同时做wb，就可以证明

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:53

1 看看是否是丽春红的问题，

2 是否是抗原量上的少了？

作者: kuaizige 时间: 2013-9-11 13:54

有什么简单方法检测二抗失效？30KD蛋白，湿转120mA恒流,60min会不会转过头？谢谢！！

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-9-11 13:54

为什么我的marker可以转到PVDF膜上，而蛋白转的很少，且大多为大分子量蛋白），能帮帮我吗

作者: DDD 时间: 2013-9-11 13:55

请教高手，做大鼠的骨骼肌，可不可以用beta-actin做内参呀；另外你前面提到要求膜必须大于滤纸吗，我转膜一直转不干净，会不会因为我的滤纸比膜大的原因

作者: DDD 时间: 2013-9-11 13:55

你好，前面我已经发贴给您了，您还没回。我刚开始做western,在做大鼠的骨骼肌，想先用beta-actin做，可是总是不出结果，
1 在一个胶上，别人的出了，而我的却始终不出，我觉得这能说明从跑电泳到最后都没有错。
2 我用的是买得裂解液，别人也用能出，也不象是裂解液的问题，
3 我是用超声打的，始终保持不让其产热。
我实在想不起再上哪儿找原因，麻烦您帮忙。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:56

2抗失效体现在两个方面：
1 酶活力（或其他）丧失，将微量2抗和底物混合看是否能催化反应。
2 不能和1抗结合，做个Elisa或dot就可以了

因该不会转过头，如果是湿法转移的话

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:56

你先看看是否是转移过头了，如果小分子不上去的话，
可以减少电流或电压，缩短时间

另外检查transbuffer 看看成分是否对，膜是否处理，等等地方

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:56

可以用beta-actin做内参，转膜时胶上有残留是正常的，跟上样量，转移时间，转移方法有关，只要大部分都上去（或目的范围内的蛋白大半上去）就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-11 13:57

你的123条的判断都没有错，所以你要看看其他方面有无问题。步骤，操作？转膜发？一抗是否有效等等地方？

作者: orangecake 时间: 2013-9-11 13:57

请问使用尼龙膜或pvdf膜对western的结果有何影响？

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-11 13:58

不知各位大侠有没有做过表皮生长因子受体的western，昨天做了一张膜，条带很清楚，但是就是位置很不对，本来应该在170kd的（第一条marker为180kd），现在居然全跑到100kd上了，170kd处只有几条很淡的条带，如下图所示，不知是什么原因，请高手指点迷津。
另外，再请教一个较菜的问题，不知分子克隆上的三去污迹配方是不是提取总蛋白的配方，能不能提出核蛋白，多谢高手指点。
三去污剂配方如下：
50mmol/L Tris.cl ph 8.0
150mmol/L Nacl
0.02%叠氮钠
0.1％sds
100Ug/ml PMSF
1Ug/ml Aprotinin
1%NP40
0.5%去氧胆酸钠

图片附件: 26899511.jpg (2013-9-11 13:58, 40.38 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18263

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-11 15:13

另外不知这个6×SDS配方用来做western的上样缓冲液对不对：
7ml 4×Tris.cl/SDS PH6.8 （0.28mmol/l)
3.0ml 甘油 30%(v/v)
1gSDS 1%(W/v)
0.93g DTT (0.5mol/l)
1.2mg 溴酚蓝 0.0012%
加去离子蒸馏水至10ml。
其中的还原剂是不是只用DTT或2-βMe中的一种就行了。DTT好像较贵，想用2-βMe来代替。

作者: PINK 时间: 2013-9-11 15:14

土土的问，湿法转移和半干法转移有什么区别呢？
我最近做了WB,半干法转移GST 融合蛋白，电流大概是2mA/cm2吧，转膜2.5h,15%的胶，转膜后染色发现，GST对照转动了，但我的融合蛋白（48kD)几乎没有转动（已做了好几次了），不知是何原因？
现在又要重做，不知该怎么半？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:14

"请问使用尼龙膜或pvdf膜对western的结果有何影响？"

没有什么影响。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:15

上面浅的条带是你要的带，下面的不是的。
另外，提总蛋白的buffer在我的帖子里有，你找找，不能用你的buffer提总蛋白。
可以用2-βMe替代Dtt

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:15

你的转移有问题吧？（你的时间和电流都是没有问题的）还是上样量太少了？另外不要用15％的gel，你用11％的就可以了。

你最好看看前面的帖子，这样帮助会更大些的，最好就具体问题问，因为出问题的地方太多了

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-11 15:16

图中是我的western结果。二抗为AP标记，采用化学生色法显示结果。封闭条件为1％BSA，37℃30分钟，一抗结合先4℃过夜，第二天37℃结合2小时，二抗为37℃结合1.5小时。其中一抗为我向国外研究者索取的，未纯化过，我直接使用的。图中可见所有的蛋白都染上色了。如果抗体不好，蛋白就都能染上色吗？

图片附件: 18708181.jpg (2013-9-11 15:16, 48.26 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18264

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-11 15:16

我刚做WESTBLOT,配分离胶不凝,
用1.6ml蒸馏水,
2.0ml30%丙烯酰氨,
1.3mlTRISHCL(PH8.8)ml,
50微升10%SDS(新配),
50微升10%过硫酸氨(新配),
2微升TEMED,依此顺序加,胶3个小时也不凝,
加入TEMED10微升不凝,再加10%过硫酸氨,不凝
请高手看一下,可能的问题?

作者: =pkchen= 时间: 2013-9-11 15:17

请问67kda的蛋白及46kda,35kda的蛋白各需用多大浓度的丙烯酰胺凝胶?谢谢

作者: one 时间: 2013-9-11 15:17

问题：我用超滤管浓缩无血清1640培养的细胞培养液后，蛋白定量后做WESTERN，发现蛋白上样量较大时，跑电泳则看见该处总跑出一个峰来（严重滞后），而且分离胶似乎有一种被破坏的感觉，后来我用考马亮兰染色发现分子量70-80KD处总有一团很浓的东西，请问该现象到底是什么？不知道1640培养基（无血清）浓缩后是否有蛋白？另外问一下超滤浓缩需要在低温离心机进行吗？常温下离心30分钟会不会降解蛋白？另外问一个问题用2*SDS能否裂解细胞检测一种正常情况主要存在于染色质上的蛋白？谢谢

作者: one 时间: 2013-9-11 15:22

你好，能否告诉我你已经使用过有效的单独提取膜、胞浆蛋白或核蛋白的配方（因为我要检测一种存在染色质的蛋白，它在处理后分泌到细胞外）

作者: mimili_901 时间: 2013-9-11 15:23

请问SDS-PAGE中溴酚蓝的位置相当于

多大分子量的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:23

67kda的蛋白及46kda,35kda都可以用10％或12％的gel

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:33

一般来说，没有纯化过的抗体的特异性是不太好的，但是是可以用的（目的条带着色较深。可以通过抗原和1抗的比例调整强弱。
2抗可能也是问题之一，你先查查2抗能否直接跟你的抗原反应

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:33

跟据叫浓度的不同而不一样，是胶的前缘，相当于胶所不能分离的蛋白分子量的上限。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:34

“能否告诉我你已经使用过有效的单独提取膜、胞浆蛋白或核蛋白的配方”
（因为我要检测一种存在染色质的蛋白，它在处理后分泌到细胞外）

你的这个要求很高，我可回答不了。而且我觉得没有必要这么做。
一般的膜蛋白和胞浆蛋白一起提取，核蛋白单独提。我前面的帖子里有答。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:34

问题：我用超滤管浓缩无血清1640培养的细胞培养液后，蛋白定量后做WESTERN，发现蛋白上样量较大时，跑电泳则看见该处总跑出一个峰来（严重滞后），而且分离胶似乎有一种被破坏的感觉，后来我用考马亮兰染色发现分子量70-80KD处总有一团很浓的东西，请问该现象到底是什么？不知道1640培养基（无血清）浓缩后是否有蛋白？另外问一下超滤浓缩需要在低温离心机进行吗？常温下离心30分钟会不会降解蛋白？另外问一个问题用2*SDS能否裂解细胞检测一种正常情况主要存在于染色质上的蛋白？

你的制样方法是否有问题（最大的疑问）？
另外你是新手吗？是否找个做过很多的人帮你看看，我觉得你犯了低级错误。

可以用2×sds，不过建议用5×的

作者: wsll 时间: 2013-9-11 15:35

我们实验室准备开展Westernblot，但需要买转膜仪，您能否给我们推荐一型经济实惠转膜仪？是不是转膜仪都带有垂直电泳仪（槽）？

急盼指教！谢谢！

WW

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-11 15:37

上面浅的条带是你要的带，下面的不是的。
另外，提总蛋白的buffer在我的帖子里有，你找找，不能用你的buffer提总蛋白。
可以用2-βMe替代Dtt

=================================================================================

再次感谢！
下面的条带很强，而且瞬时显色，不知是什么？是不是降解的蛋白片断，那个三去污迹应该能提取膜蛋白吧？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:38

我们用的都是进口的转膜仪，都比较贵。很难帮你找便宜的又好的。

一般不是一起卖的，转膜仪是转膜仪，电泳槽是电泳槽

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:38

面的条带很强，而且瞬时显色，不知是什么？
我觉得是杂带，不是什么降解带，它离你的主带很远，没有影响。

那个三去污迹应该能提取膜蛋白吧
可以，膜和胞浆蛋白

作者: kuohao17 时间: 2013-9-11 15:47

杂带那么强，而目的条带哪么淡，不知要如何解决？谢谢!

作者: kswl870 时间: 2013-9-11 15:47

我最近准备做westen，想检测加药作用后内源蛋白的表达量有没有升高，不知该注意些什么问题。越详细越好，我以前从没做过westen呀。再次感谢了！

作者: utt0989 时间: 2013-9-11 15:48

请问蛋白提取可以在提完RNA之后进行吗?即用TROZOL提完RNA后再提蛋白

这种提的蛋白用于做WESTERN需特殊处理吗

作者: 小游abc 时间: 2013-9-11 15:48

可以的，我就用ROCHE公司的TRIPURE提过，做过western,只是蛋白浓度有点低。步骤按说明书做，不需要特殊处理，只是步骤太复杂。相比之下裂解液裂解细胞提取蛋白简单且浓度较高。如果为了节约标本再考虑用前一种。
至于TRIZOL，我没用他提过蛋白，我觉得应该跟TRIPURE差不多吧。园子里有人说用TRIZOL提的蛋白溶解困难。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:48

可以在显色前将杂带附近的膜去掉，再显色。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:49

你按照做wb的步骤来就没有问题，
要注意的是：
1 要测定蛋白浓度，上样量一致
2 提蛋白－转膜这一段比较重要，要仔细一些。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:49

可以提，只要样品保存的还好就没有问题。不溶的问题是个例不是普遍现象。

作者: kswl870 时间: 2013-9-11 15:49

多谢多谢，能收到您的回复。如果我在加药前保证细胞数量一致，还用测蛋白浓度吗？还有，内源蛋白的表达一般要求细胞量达到多少？在做的过程中肯定还会遇到不少问题，到时再求教，不胜感激！

作者: nn255 时间: 2013-9-11 15:50

我用的是BD的半干电泳，说明书推荐10v，15min，您觉得这个条件行不行？我试过，可是我用的带预染marker的蓝色条带跑到最下层滤纸上去了，我不知道marker转过了是否代表样品的也过了？我想请问您平常用的marker带预染吗？如果您不用如何使得最后的膜上出现marker？

我要做的是250KD的蛋白，您觉得有什么特别要注意的地方？比如胶的浓度、转移时间等等？谢谢！！！

作者: nn255 时间: 2013-9-11 15:50

我的标本是肌肉组织，用什么方法提蛋白较好？我用的是先加三去污裂解缓冲液，然后在加2×SDS上样缓冲液，100度煮沸10min，在用超声30S，但效果并不好，考马氏染色后条带中发现有好多竖着的带，而且胶显得很脏，蛋白提取液上面浮着一层像膜一样的泡沫，怎么离心也不行，是不是不需要超声？

作者: nn255 时间: 2013-9-11 15:51

我用的是BD的半干电泳，说明书推荐10v，15min，您觉得这个条件行不行？我试过，可是我用的带预染marker的蓝色条带跑到最下层滤纸上去了，我不知道marker转过了是否代表样品的也过了？我想请问您平常用的marker带预染吗？如果您不用如何使得最后的膜上出现marker？

我要做的是250KD的蛋白，您觉得有什么特别要注意的地方？比如胶的浓度、转移时间等等？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:51

还是要测蛋白浓度的，因为加药以后细胞会死一些，并且提蛋白的过程有损失，也无法一致。

作者: pencil菲 时间: 2013-9-11 15:51

我做的指标是细胞内高表达。我的实验组是加处理因素抑制他，当然不是百分之百的抑制，只要能证明处理后有所降低就行。但我转膜后，胶来染色，发现胶上还剩下很多蛋白没有转过去（我用的是BIO－RAD的半干转印仪），而且膜最后用ECL方法，发现实验组和对照组没差别，我就不知到底是处理组无效，还是与转膜不完全有关，我转膜用的电压是15V，150分钟。我蛋白大小大概是40KD。你看我转膜条件如何。还有是不是由于转膜不完全，导致转的蛋白量一致，而不能体现出差别呢。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:52

我用的是BD的半干电泳，说明书推荐10v，15min，您觉得这个条件行不行？
BD 公司的我没有用过，所以不知道。
一般做半干我看重的是电流不是电压。一般我们做半干都是衡流。

我试过，可是我用的带预染marker的蓝色条带跑到最下层滤纸上去了，我不知道marker转过了是否代表样品的也过了？
一般来说Marker过了不能代表样品也过了，但是有一部分样品可能是转移过去了。
我想请问您平常用的marker带预染吗？如果您不用如何使得最后的膜上出现marker
用pre-stained的Marker，用半干法时候，转移条件不要太剧烈，一般我们的时间要1小时左右，你可以将电压减小到5V再转移45－60mins看看

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:53

我的标本是肌肉组织，用什么方法提蛋白较好？

最好用提总蛋白的方法提蛋白。
另外你看到的漂浮物是脂类。
要用超声波。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:53

15V，150分钟，蛋白大小大概是40KD，你看我转膜条件如何？

转移的时间长了，（可能电流小了）建议用我前面帖子里的方式换算一下，半干法一般建议用衡流。

还有是不是由于转膜不完全，导致转的蛋白量一致，而不能体现出差别呢？

不是的，最少转到膜上的蛋白比例是相同的，所以你在其他地方找一下原因吧。

作者: yjf1026 时间: 2013-9-11 15:54

你好，我用GFP载体来表达融合蛋白，在显微镜下发光的细胞有80%以上，但做WESTERN就是没有特异的阳性条带。我的细胞用裂解液煮沸10分钟后上样。其余步骤按Promega kit 进行。一抗是国产的，二抗Promega，同门师弟已用其作出阳性结果。但我为什么不行？

看来是操作的问题了。请问一抗放了多久了？

你好，我的一抗是进口的，santa公司的，我搞错了。一抗的处理是按照比例溶于tbst 中 4 度过夜

作者: ending 时间: 2013-9-11 15:55

有谁可以告诉我免疫共沉淀跟western blot 的区别吗？

作者: duoduo 时间: 2013-9-11 15:55

再次求助，我用12%的胶重新做了，还是转不动，我觉得胶的浓度没多大影响，因为同一胶上的其他蛋白都转动了，而目的蛋白的量是足够的，我怀疑是不是我的融合蛋白的电荷性质的问题，在这一转移buffer (ph8.3)下该蛋白不带电荷，不知是否有这样的可能？你看看我还有哪些问题啊？

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-11 15:55

我想请教下有关WB问题：我将表达产物电泳，转膜后，用丽春红染色发现高分子量的条带都有转过来，而除了我的表达产物位置处有非常淡的轮廓出现外，中间其它低分子量带几乎看不到颜色，作WB显色时，高分子量表达物处有很深的颜色出现，而低分子量表达带处只看到很淡的轮廓，那颜色就像非特异性染色样的，但我的背景颜色几乎没有。
我想问的是：1、转膜时为什么低分子量带总是转不好，不知转到哪儿去了，（胶上面显示已完全转完，而丽春红染色时却显示不出）？
2、如果说有转成功的话，WB显示低分子量带处显色很淡，是否是因为表达的蛋白活性不好，或是由于转到膜上的蛋白量很少的原故？
3、如果说表达蛋白活性很好的话，即时转到膜上的蛋白量很少，是否也能显示出很深的条带？
4、如果表达蛋白活性不好的活，即时转到膜上的蛋白量很多，能否显示出很淡的颜色来？

作者: pencil菲 时间: 2013-9-11 15:56

我今天试了一个方法，先将肌肉组织用组织细胞分离机制作成细胞悬液，然后加裂解液，再加2×SDS上样缓冲液煮沸。跑电泳后条带很清晰，但我总害怕会漏掉些蛋白，你认为还需要再做超声吗？

你能不能告诉我在免疫沉淀过程中，最后需要将抗原与抗体分开吗？如果不分开，岂不是抗原表面的结合位点已经被抗体占了，做WB时，一抗还怎么会结合上去？

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-11 15:57

我最近做Western的时候跑出来的杂带很多，看起来跟marker lander一样的。我是对细胞培养液进行免疫沉淀后再用来做Western的。不知道是那里出了问题，向ptglag请教。谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:57

你提蛋白的方法跟他们有区别否？

另外你的GfP是融合在前面还是后面？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:57

再次求助，我用12%的胶重新做了，还是转不动，我觉得胶的浓度没多大影响，因为同一胶上的其他蛋白都转动了，而目的蛋白的量是足够的，我怀疑是不是我的融合蛋白的电荷性质的问题，在这一转移buffer (ph8.3)下该蛋白不带电荷，不知是否有这样的可能？”

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首先不会是电荷的问题，因为SDS的作用屏蔽了蛋白原来的电荷。（具体原理可以查书）。
你是如何检查你的目的蛋白没有转移过去的，比它大的蛋白转移过去没有？用Wb鉴定了没有？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-11 15:58

我用GAPDH做内参照，但是总是出现GAPDH条带呈空心状，其它条带都挺好，为什么会出现这种现象呢？

请教。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:58

你的样品多半是转过了，建议减少电流或电压，缩短时间。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 15:59

具体的方法的确有很多，但是根据不同的蛋白，样品而定的，最主要的区别在于提蛋白的方法，和沉淀的方法，你沉下心了看上几

篇paper就明白了，不是我不告诉你，只是我告诉你也没有用。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:03

你先不做免疫沉淀，直接用样品做Wb结果怎样？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:04

你可以将内参的抗体少加一点，看看是否是过量了（反白），

再就是看是否有什么将其污染了，使它是不能催化底物？

作者: jkobn 时间: 2013-9-11 16:04

有免疫沉淀的protocol吗?能不能帮忙给我一份!我过去作过血清的WB,但结果不理想,所以要改做WB,谢谢

作者: wmp1234 时间: 2013-9-11 16:07

我用的是细胞的培养液。不做免疫沉淀的话蛋白量很少，没法做WB的。还有一个问题，NC膜用丽春红染色后，红色的条带是不是会退掉？如果退不掉，会影响后面的步骤吗？谢谢！

作者: qumm1985 时间: 2013-9-11 16:08

我的膜是用NBT和BCIP显色的，因为二抗是AP标记的，但为什么膜显色后跟本不变色．一般情况10分钟膜肯定都黑了，可是我的膜一点反应都没有，更别说什么条带出现了。预染marker转的还是很清楚的，而且NBT和BCIP也正常肯定没有失效．是不是封闭的太厉害了？我用２%的脱脂奶粉封闭１８个小时，是不是太久了？谢谢强人．

作者: qumm1985 时间: 2013-9-11 16:09

忘了说封闭是在室温做的

作者: bring 时间: 2013-9-11 16:09

请问有谁知道PPARγ蛋白的分子量大小,及在western blot中应该选用什么样的marker

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:09

如果做IP出现lander状的带,原因有很多种:
最有可能的一个原因是2抗跟抗原(免疫沉淀过的)直接接合,(有可能是 protein A (or G)造成).
或一抗跟抗原产生了非特异结合.

如果用WB没有办法检测,可以尝试浓缩样品, 重新制样,这样也是可以将含量少的样品通过WB检测出来的.

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:10

现在的问题是否是不见带?
问题是:
1 你的一抗经过检测吗?是否原来用过,这次做不出来而以?
2 2抗最近用过没有?是否是好的?
3 封闭结束时是否发现牛奶变质?

还有你是谁呀?

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:10

上NCBI查一下就知道了,

作者: vivian4123 时间: 2013-9-11 16:11

我的实验是观察中药对Hale细胞 p53表达的影响，流程为：收集Hale 提取蛋白电泳转膜杂交定量分析
请教您：1.提取蛋白用哪种方法好？
2.你说做定量或半定量，要用到一个光密度扫描分析软件，请问哪里有卖这种软件的？用扫描一般图片的扫描仪扫描可以吗？先谢谢您！

作者: summerxx 时间: 2013-9-11 16:11

新手请教：
我跑电泳时，条带弯弯的，有点象倒写的隶书“一”字，中间淡，两头浓。这是什么原因啊？

多谢！！

作者: H2O 时间: 2013-9-11 16:12

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很急！！我的蛋白仅在正常小肠粘膜核内表达，国外文献做western blot 剪开肠管，剥离粘膜提取蛋白。可大鼠小肠很细，如果要剥下粘膜层怎么做呀？不取黏膜而直接用整个的肠组织块提取核蛋白行吗？？我是要半定量，请问内参在我的这种提取的核蛋白中有吗？没有怎么来标准化呀？谢谢，盼详细回答！

作者: www.1 时间: 2013-9-11 16:12

谢谢你一直以来给我的帮助！

有问题请教：我用的参照是β－actin，上样前用试剂盒测过蛋白浓度，已经将所有标本的上样量控制得一样了，可是跑出来的各样品中的β－actin还是深浅不一，你说是什么原因？会不会是因为我们的蛋白浓度测得不准？
（我是将β－actin和另一个单抗加在一起孵育的，是不是会因为竞争结合而有影响？）你平时是怎么加的呢？是不是将单抗及相应的二抗都分开做？

作者: duoduo 时间: 2013-9-11 16:12

相关疾病：
肝癌

再次求教啦！我做western前，要把细胞裂解，请问肝癌细胞用什么裂解液，哪里有配方呀？多谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:13

P53 是个核蛋白，所以你用提总蛋白的方法就可以了，

软件可以下载，普通扫描仪就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:13

如果有现成的文献可以直接照做就可以了，我没有做过你说的小肠粘膜的样品，没有办法给你提示或帮助。抱歉!

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:14

如果是actin的差异很大，那么应该是蛋白定量有问题，可以换一种定量方法看看，另外也可以将用过的膜用CCB染色后看看是否真的差异很大。

另外我们加内参都是一起加的不用分开加

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:14

哪要看你的目的蛋白了，

你可以看看前面的帖子，里面有说

作者: am10 时间: 2013-9-11 16:17

请教一个问题，一般内参总是选骨架蛋白，如果我想考察的就是骨架蛋白是否改变的话，应该如何选内参呢？

作者: 土坷垃 时间: 2013-9-11 16:18

我想问一下关于蛋白质电泳时上样液加二巯基乙醇的事情，我知道二巯基乙醇是打开二硫键将二聚体变为单体的作用，我想问的是
1、是不是所有的二聚体蛋白在电泳时都需要用还原性的缓冲液？
2、是不是存再在有二聚体时具有活性如抗原性而变为单体就没有抗原性的情况，比如说二聚体蛋白用抗体检测时（westblot检测二聚体蛋白），打开二硫键对抗原性有没有影响？
3、蛋白质的抗原性在什么情况下容易丢失？

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:18

我的蛋白是核蛋白，是否能用三去污法提取总蛋白来作western blot 呢？？我是要半定量，请问内参在我的这种提取的核蛋白中到底有没有？没有怎么来标准化呀？谢谢，盼详细回答！

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:18

我是问如果是提取核蛋白，该如何找内参？

作者: bgf5 时间: 2013-9-11 16:20

请问做western blot 时蛋白浓度最少是多少？

作者: gemei0115 时间: 2013-9-11 16:20

请教最后显色时DAB配方，我用过华美的DAB浓缩液，效果不佳，自己配DAB不好溶解，而且配方有几种，不知该用哪一种

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:21

P53 是个核蛋白，所以你用提总蛋白的方法就可以了，
软件可以下载，普通扫描仪就可以了

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您真是个牛人啊，您的大多数帖子我都已经拜读，我们太需要您了！在下谢谢了！还有问个菜鸟问题：总蛋白提取方法？那里的试剂好些？

作者: linlinstar 时间: 2013-9-11 16:22

才开始做Western，有以下问题想请教你。
1.丙烯酰胺的储存液出现沉淀了，可以过滤以后再使用吗？会对电泳的结果有影响吗？
2.我需要的是45kd和55kd的蛋白，分离胶浓度10％，用的Bio-Rad mini gel，胶厚0.75mm，恒压150V，曾经跑出来条带，但是现在条带跑不出来了，是在过滤丙烯酰胺以后，一条带也没有了，只是在溴酚蓝的条带下面隐约有一条带。条带跑不出来的原因有哪些呢？是不是有可能蛋白质降解了？另外电压是否偏高？胶的浓度是否合适或是用12.5％的更好？
3.上样缓冲液应该怎么加？用多少的？和样品的比例怎样？

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:22

你如果想测actin 蛋白的变化可以选择house keeping类的蛋白做为内参，即那些可以维持细胞基本生命所需的蛋白，有很多种，但是我说不出具体的来

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:24

一个方法是否适合提取核蛋白要看去垢剂的的具体配方，不过好像传统的三去污剂是不行的，是用来提膜蛋白和胞浆蛋白的。

核蛋白的内参可以选用histone

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:25

你说的最小量是指的什么？是目的蛋白的含量还是总蛋白的含量。

如果用灵敏度较高的检测方法 HRP＋ ECL ，是可以检测出pg级目的蛋白的含量。

总蛋白量是没有意义的。

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:25

不同公司产的DAB底物，具体的配方是不同的，
我可以给你一个我们公司的DAB底物的配方，我们用的挺好的。
明天上午我再贴上来。

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:26

过讲了，

我前面发的帖子里就有具体的提总蛋白的配方（stop buffer）和提取方法，你再到前面找找？

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:29

过滤后可以使用，
45－55kd 用 10－12％gel 都可以，
你要检查下面的东西：
1 是否别人的蛋白也跑不出来电泳了？
2 你测量蛋白浓度是否有蛋白？
3 不该有蛋白比溴酚蓝跑的更快。

作者: ending 时间: 2013-9-11 16:29

细胞被我裂解后，整个变成了胶冻状，任我怎样离心，超声都没用，不知是什么原因?哪位大侠曾遇到过此类问题，请指点一二，谢谢。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-11 16:30

P53 是个核蛋白，所以你用提总蛋白的方法就可以了.

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一个方法是否适合提取核蛋白要看去垢剂的的具体配方，不过好像传统的三去污剂是不行的，是用来提膜蛋白和胞浆蛋白的。

三去污剂是不行,那么并不是提总蛋白的方法就能提核蛋白。您用什么方法可以同时提总蛋白和核蛋白呢？谢谢！

作者: DNA 时间: 2013-9-11 16:30

我也有问题请教！
我的蛋白跑的SDS-PAGE，在还原和非还原的处理方法中都有二聚体，只是还原的方法中二聚体少。是不是我用的巯基乙醇量少了？或者是别的原因？

作者: windy+++ 时间: 2013-9-11 16:30

你好，还有问题请教：

为什么灌胶后老是有不少水从下面流出，或是在凝聚的过程中要漏，聚合的胶看起来比较少？

作者: TNT 时间: 2013-9-11 16:31

我最近新配了一批WESTERN用液，但出现了新问题：无论是12%或10%的胶，都不能将蛋白完全分离开，接近溴酚蓝的小分子量蛋白区，总有厚厚的蛋白层积，并且MARKER也只能跑出3-4条带，而以前我用12%的胶能跑出完整的7条带，我后来又重新配了一批试剂，结果还是一样，试剂的配制方法是按照《分子克隆》第二版来的，现在我不知道是什么地方出了问题，请多多指教，谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-9-11 16:32

土土的问，湿法转移和半干法转移有什么区别呢？
我最近做了WB,半干法转移GST 融合蛋白，电流大概是2mA/cm2吧，转膜2.5h,15%的胶，转膜后染色发现，GST对照转动了，但我的融合蛋白（48kD)几乎没有转动（已做了好几次了），不知是何原因？
现在又要重做，不知该怎么半？

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你的转移有问题吧？（你的时间和电流都是没有问题的）还是上样量太少了？另外不要用15％的gel，你用11％的就可以了。

你最好看看前面的帖子，这样帮助会更大些的，最好就具体问题问，因为出问题的地方太多了

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再次求助，我用12%的胶重新做了，还是转不动，我觉得胶的浓度没多大影响，因为同一胶上的其他蛋白都转动了，而目的蛋白的量是足够的，我怀疑是不是我的融合蛋白的电荷性质的问题，在这一转移buffer (ph8.3)下该蛋白不带电荷，不知是否有这样的可能？”

首先不会是电荷的问题，因为SDS的作用屏蔽了蛋白原来的电荷。（具体原理可以查书）。
你是如何检查你的目的蛋白没有转移过去的，比它大的蛋白转移过去没有？用Wb鉴定了没有？

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我转膜后又将此胶染色，发现除了我的目的蛋白都转动了，Wb结果很差或失败。

谢谢，现在已经解决了，原来是仪器的问题，我以前用的是大连捷迈科贸有限公司的JM-250半干转膜仪（有点老了），现采用amersham 的半干转膜仪TE70，转膜转的很好，WB很漂亮……

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:32

你看看是否胶冻状的东西是否是因为DNA释放出来形成的，不过一般用超声波就可以了，是否是瓦数不够，

再有如果不是上面的问题，另外是否是提出的蛋白质碰到了什么物质变成了胶体了，但是我没有遇到过，不知道如何解决。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:33

DAB配方：

图片附件: 46859565.snap.jpg (2013-9-11 16:33, 40.85 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18266

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:33

你看看是否是多加巯基乙醇可以使2聚体减少，

我们喜欢用8M urea的stacking gel 来打开dimer.

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:34

QUOTE:

原帖由 windy+++ 于 2013-9-11 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，还有问题请教：

为什么灌胶后老是有不少水从下面流出，或是在凝聚的过程中要漏，聚合的胶看起来比较少？

不会吧，这个问题都要问？

漏胶了

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:36

QUOTE:

原帖由 TNT 于 2013-9-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近新配了一批WESTERN用液，但出现了新问题：无论是12%或10%的胶，都不能将蛋白完全分离开，接近溴酚蓝的小分子量蛋白区，总有厚厚的蛋白层积，并且MARKER也只能跑出3-4条带，而以前我用12%的胶能跑出完整的7条带，我后来又重新配 ...

是否是你的胶的原液太稀了，这样配出来的胶浓度就不对。

作者: ha111 时间: 2013-9-11 16:42

我最近新配了一批WESTERN用液，但出现了新问题：无论是12%或10%的胶，都不能将蛋白完全分离开，接近溴酚蓝的小分子量蛋白区，总有厚厚的蛋白层积，并且MARKER也只能跑出3-4条带，而以前我用12%的胶能跑出完整的7条带，我后来又重新配了一批试剂，结果还是一样，试剂的配制方法是按照《分子克隆》第二版来的，现在我不知道是什么地方出了问题。
另外，检测磷酸化抗体时，对样品的处理及随后的电泳、转膜有什么特殊要求吗？
现在，我的实验被卡住了，非常苦恼，一直关注着你的帖子及高见，我们实验室的同事解释不了我的问题，上网首先就向你请教，请多多指正，谢谢！

作者: ii077345 时间: 2013-9-11 16:44

我看了你给别人的帖子，说提取核蛋白只需要按照提取总蛋白就可以了。
我做的实验的问题是，我现在检测的蛋白在胞内有表达，胞核内也有表达，我看了一篇资料说可以用一些连串方法，如低盐，高盐缓冲液，不同转速离心，可以得到核提取物，然后用核提取物来做WEST。
我现在就想做的就是用核提取物来检测，我想问的就是有没有这种核提取物的试剂盒，如果有请告知万分感激！
还有P53这个蛋白不是核蛋白它应该是现在胞浆内表达，然后转位到核内的

作者: lxh031 时间: 2013-9-11 16:45

piercenet有，你上网他们网站查查看
我同学自己配药提取核蛋白，效果也不错，我准备试试，做一下c-fos的western

作者: ii077345 时间: 2013-9-11 16:50

你有这方面的资料吗〉？希望能给我看看，我现在就是因为这个核提取物的制备问题搞得实验不能进行下去。谢谢！

piercenet是人名吗？请指导！谢谢！

作者: Ao7 时间: 2013-9-11 16:50

QUOTE:

原帖由 ii077345 于 2013-9-11 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你有这方面的资料吗〉？希望能给我看看，我现在就是因为这个核提取物的制备问题搞得实验不能进行下去。谢谢！

piercenet是人名吗？请指导！谢谢！ ...

piercenet不是人名，而是美国pierce公司，网址是cuturl('www.piercenet.com')。该公司有专门的核蛋白提取试剂盒。效果很好，但价格很贵，一千多。你可以在园子里搜一下，有很多人提供这方面的方法。

作者: nut6694 时间: 2013-9-11 16:51

你好，有问题要向你请教啦！
我做Western用的是Santa的单抗，推荐的稀释度是1：100~1：1000。先做斑点杂交，发现只有当抗体在1：10稀释时，膜上才看到较浅的点。于是用这个稀释度做Western，结果是出现了很多非特异的条带，而且非特异的比特异的还深，特异性条带很浅。我还换了不同的细胞裂解方法，即剧烈的三去污剂和较温和的单去污剂都尝试了。可对于结果来说，并没有太大的改变。我该怎么办呢？

作者: xyw5 时间: 2013-9-11 16:51

请问WB是否只能定性，很难定量！
我想做STAT3活化测定，能否采用同位素法进行？我查得资料显示，国内STAT3磷酸化水平的测定可能还没有用同位素法测定的，现在我从何处能获得相关资料呢？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:52

我给你发过帖子，我觉得最有可能的是你的gel solution 的浓度变低了，导致胶浓度变低。
你通过实验是否排除了呢？
检测磷酸化抗体没有什么区别，只是最好封闭液用BSA就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:52

你将一抗浓度稀释到1：100－1：200试一下，你用的一抗浓度太高了。再有就是要排除抗原和2抗能直接结合这一可能。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 16:52

WB可以半定量，
另外stat3,我没有研究过，我只做过几个相关蛋白的WB和IHC如：
stat1 ，stat3， stat6，scos3（suppressor of cytokine signaling 3; STAT induced STAT inhibitor 3; cytokine-induced SH2 protein ）（磷酸化）。

我不知道如何检测它的磷酸化水平，但是你可否参考一下Fak的磷酸化水平的检测方法，用Fak的抗体做免疫沉淀，用Py（系列）做一抗，检测fak中tyr磷酸化的水平。不知道用在stat3上是否可行?

作者: mamamiya 时间: 2013-9-11 16:53

在做1：10的时候，同时做1：100了。在斑点杂交中未显示任何阳性的信号，在Western中，只有在大约99kD的位置有两条阳性的条带，而我的目的蛋白是55kD或29kD。
why？？？

作者: plaa 时间: 2013-9-11 16:53

我看了你给别人的帖子，说提取核蛋白只需要按照提取总蛋白就可以了。
我做的实验的问题是，我现在检测的蛋白在胞内有表达，胞核内也有表达，我看了一篇资料说可以用一些连串方法，如低盐，高盐缓冲液，不同转速离心，可以得到核提取物，然后用核提取物来做WEST。
我现在就想做的就是用核提取物来检测，我想问的就是有没有这种核提取物的试剂盒，如果有请告知万分感激！
还有P53这个蛋白不是核蛋白它应该是现在胞浆内表达，然后转位到核

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组织(约250 mg)置于400 μl 冰浴A缓冲液(mmol/L:HEPES 10 pH 7.9,KCl 10、 EDTA 0.1、EGTA 0.1、DTT 1、PMSF 0.5、aprotinin 1和leupeptin 1)充分匀浆。匀浆液冰浴30 min后加入33 μl 10% NP-40并剧烈振荡30 s。匀浆液于4℃ 11000 g离心1 min, 含胞浆蛋白的上清冻存于－70℃。用50 μl 冰浴B缓冲液(mmol/L: HEPES 20, pH 7.9, NaCl 400、 EDTA 1、 EGTA 1、 DTT 1、 PMSF 1、 aprotinin 1和leupeptin 1)重悬沉淀, 并在4℃摇床平台上剧烈摇荡30 min, 然后于4℃ 11000 g离心15 min, 将含核蛋白的上清冻存于－70℃。

作者: duoduo 时间: 2013-9-11 16:54

gel solution是指什么？是丙烯酰胺吗？配胶的各种溶液我都重复了三次，特别是丙烯酰胺我重配了四次，浓度是30%，与以前不同的是试剂生产厂家不同，这次的丙烯酰胺是鼎国的，（sigma分装），Tris是华美的，不知这些有没有影响？
做磷酸化抗体我用BSA封闭过，但杂带太多，由于MARKER标记不清楚，无法分别出目的条带，用脱脂奶粉封闭，一直就没有作出过阳性结果，抗体别人用过，而且用的是同一细胞株，出现阳性结果，应该是没问题，但我的总是做不出，不知问题出在哪里，请你多多指教！

作者: wawa 时间: 2013-9-11 16:55

您好！受到你的回帖很高兴，我想问一下我是用细胞而不是用组织作，你刚写作组织是用约250毫克，如果是细胞有什么要求呢，谢谢！请执教！

作者: remenb 时间: 2013-9-11 16:55

你好！我仔细看了前面所有的贴子，都没有我的问题。我都快被逼疯了。我很明确我的问题出在转移的操作上。转移时，不知是什么原因使我的膜在ECL曝光之后，总在某些地方出现部分模糊的条带，好像被雨淋湿的一行行铅字一样。我用预染的marker作了对照，问题就在转移的操作上。buffer和别人用的一样，配制没有问题。请问，如果转移buffer（三种，A,B,C）在胶膜滤纸之间的不均一分布，是否影响整体转移的条件从而使蛋白转移出现混乱呢？怎样避免这种现象呢？

作者: damingxia0904 时间: 2013-9-11 16:57

您好！受到你的回帖很高兴，我想问一下我是用细胞而不是用组织作，你刚写作组织是用约250毫克，如果是细胞有什么要求呢，谢谢！请执教！

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呵呵，不客气，其实用细胞更简单了，没了前面的匀浆过程，更能避免蛋白损失。具体没有什么要求，最简单的是你可以按平时冻存前的操作把细胞离心收集，然后依次加入适量的A、B缓冲液（多了也不怕，可以浓缩）重悬进行就行了，这个方法主要是根据渗透压来进行细胞裂解的

作者: abc816 时间: 2013-9-11 16:59

请教一下单克隆抗体作为一抗能否做WB，因为我做了几次都没有出来，我采用的是北京六一仪器厂生产的水浴转移电泳仪，请问需要注意哪些方面的问题？

作者: abc816 时间: 2013-9-11 16:59

另外，我用的膜是PVDF膜，在转移后还需要进行紫外交联或其他方法将蛋白质固定吗？

作者: abc816 时间: 2013-9-11 17:00

我用的抗体产品说明上只写了可用于做ELISA和免疫组化，我想请问我的一抗能否用于做WB，我一直用该一抗做ELISA挺顺利的，就是在做WB上一直没能成功过，凝胶方面也做得很好。可就是不出来＞

作者: ending 时间: 2013-9-11 17:02

虽然我还没开始做,但以后肯定有向ptglab老师请教的地方,先向您表示感谢!

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-11 17:02

一抗稀释后可以做几次

我的第二次怎么就很淡了呢

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-11 17:03

我用RIPA裂解培养细胞，离心后除了上清以外，还有粘冻样的东东，是不是DNA？上清无法吸干净，不知如何处理？是不是我的RIPA加的量太少？2×107细胞，我只加了150微升

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:04

有没有多聚体和糖基化影响分子量的可能？如果都没有，看阳性对照是否能出来？不行就怀疑一抗有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:05

separation buffer 和stacking buffer 的PH 调过没有？

如果你用milk可以就用，另外你提蛋白的方法是否正确呢？是否不出结果是出在提取蛋白的环节上？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:05

你所说的transfer buffer 3种是什么意思？

另外你是否每次都出现这样的结果呢？还是刚做了一次就这样？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:06

如果是单抗上说能做IHC 和Ｅｌｉｓａ而没有说能做WB多半就是不能做WB的了。你可以写email去厂家问问。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:07

一般用3－4次是没有问题的，

你可以延长孵育的时间，4度过夜（第一次也要这样）。或者新加一点一抗。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:08

我用RIPA裂解培养细胞，离心后除了上清以外，还有粘冻样的东东，是不是DNA？

应该是DNA，你可以用超声波打一下就可以了。

是不是我的RIPA加的量太少？2×107细胞，我只加了150微升

可以加到300－500ul

作者: DONT 时间: 2013-9-11 17:09

我的sdspage出现了以前所没有的问题，下面是我拍的凝胶图片，
其中第三条为三去污剂裂解buffer，其它几条为三去污裂解剂裂解得到的细胞总蛋白，
考染后发现marker的条带还可以分辩，但样品拖尾现象严重（条带勉强可以分辨），
我看前面的帖子，说是裂解不完全有细胞碎片，是不是还有可能会是其它原因？
我是不是可以用其它师兄的样品和我一起处理来比对一下啊？

回答漏胶的问题：
前段时间，我也遇到了这个困扰，后来总结发现是配制的30％丙稀酰胺浓度不够，还有是APS可能有问题，后来从新配制丙稀酰胺后问题解决了；还有APS最好用进口分装的，价格便宜量又足，平时一天换一管。

图片附件: 73730705.snap.jpg (2013-9-11 17:09, 32.04 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18268

作者: flower-201 时间: 2013-9-11 17:11

为什么western最后会出来这么多条带，我用的一抗是DAKO的单抗，稀释度为1：2000，是单抗的特异性太差了吗？

图片附件: 73861772.jpg (2013-9-11 17:11, 48.27 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18269

作者: langlang 时间: 2013-9-11 17:11

I am doing western blot now. However, when I load sample and begin to run them. There will be smiling effect. Could you tell me the causes

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-11 17:12

为什么western最后会出来这么多条带，我用的一抗是DAKO的单抗，稀释度为1：2000，是单抗的特异性太差了吗？

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刚好看到，不妨说两句，不介意吧
丹麦的这家公司还是可以的。怀疑之前，你不妨再降低使用浓度，同时做上阴性对照。我看你以前的帖子，好象在做什么细胞株的工作，因此，拿空白的样品或者干脆E。coli的煮后上清。看一下，才能下定论。

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-11 17:16

I am doing western blot now. However, when I load sample and begin to run them. There will be smiling effect. Could you tell me the causes.

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smiling effect:只要将胶孔作的齐整些，自然就解决了！
Smearing：导致拖尾效应则有很多的原因了，无论是胶的均匀度和样品量，混有DNA还是蛋白自身的性质，比如PH的改变蛋白有沉降的倾向，同时电泳过程又不断的溶解这些蛋白，因此产生托尾就不足为怪！你看看eclark上张照片，就有些感受了把。

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-11 17:17

刚好看到，不妨说两句，不介意吧
丹麦的这家公司还是可以的。怀疑之前，你不妨再降低使用浓度，同时做上阴性对照。我看你以前的帖子，好象在做什么细胞株的工作，因此，拿空白的样品或者干脆E。coli的煮后上清。看一下，才能下定论。

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我试过1：3000，一点都出不来了。不过你提到的阴性对照我可以试试看，用BSA应该没问题吧，谢谢回复！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-11 17:17

在达到饱和状态下，每克多肽克杰和1.4克去污剂，借助一直分子量的标准参照物，可以测算出多肽链的分子量。

作者: IAM007 时间: 2013-9-11 17:17

各位，晚上好：
我现在做的工作是本科论文，给老板验证基因芯片的表达结果正确性，
主要内容是加药作用后，三个调亡蛋白的表达变化，分别是bax、bcl-2、p53，
检测方法是WesternBlot，使用DAKO公司的抗体，
其中bax兔抗人多抗的说明书上写有WB的推荐稀释浓度为1000，
其他两个mouse antihuman单抗的说明书上根本没有提及WB，
我想请教各位大牛，DAKO公司的抗体到底能作WB么?有没有人做过？
我给DAKO发过邮件，他们回答我的差不多就是说明书上的一堆英文，也没仔细翻译，我就一直用它做，一直没结果，这段时间就这么耗着。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:18

dako的抗体是很好的，你可以试试减少上样量，先减少一倍吧，

另外看看说明看看是否一抗适合做WB，如果没有提能不能做就不要拿它做WB

作者: wsll 时间: 2013-9-11 17:22

你好！
我的BUFFER都用PH计调过，误差不会很大。后来我用别人的丙烯酰胺（以前买的试剂）配了一次胶，效果似乎好一些，估计是这次的丙烯酰胺有问题。
我磷酸化的WESTERN没结果，你的分析很到位，不愧是高手。后来，我在原来的裂解液（Tris 6.8；SDS；EDTA）基础上，加了钒酸钠和PMSF，并且用未经冻融的新鲜蛋白（煮沸10分钟后直接12000g 6分钟，BCA定量）做了一次，其中一种抗体结果还可以，但是另外一种只有一个样品显出了很弱的一条带，其余两个没有带，不知是真的没表达还是样品处理有问题。
如果你有更好的蛋白裂解方案（包括裂解液配方及裂解步骤），特别是针对磷酸化的，请介绍给我，谢谢！
同时，我的上样量是90ug，是不是少了一点，如果加大到150-200ug/孔，不知是否会超载？
从细胞裂解到点样这一过程中，我可能做得还不细致，你能花点时间给我详细的说明那些地方应特别注意的吗？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:23

QUOTE:

原帖由 wsll 于 2013-9-11 17:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好！
我的BUFFER都用PH计调过，误差不会很大。后来我用别人的丙烯酰胺（以前买的试剂）配了一次胶，效果似乎好一些，估计是这次的丙烯酰胺有问题。
我磷酸化的WESTERN没结果，你的分析很到位，不愧是高手。后来，我在原来的裂解液（Tri ...

你的上样量是不错的，90ug已经很好了，一般一个well（biorad， 1.0mm)一次不要上过150ug.

裂解过程尽量在低温环境下处理，在可能的条件下尽量快。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-11 17:24

各位，晚上好：
我现在做的工作是本科论文，给老板验证基因芯片的表达结果正确性，
主要内容是加药作用后，三个调亡蛋白的表达变化，分别是bax、bcl-2、p53，
检测方法是WesternBlot，使用DAKO公司的抗体，
其中bax兔抗人多抗的说明书上写有WB的推荐稀释浓度为1000，
其他两个mouse antihuman单抗的说明书上根本没有提及WB，
我想请教各位大牛，DAKO公司的抗体到底能作WB么?有没有人做过？
我给DAKO发过邮件，他们回答我的差不多就是说明书上的一堆英文，也没仔细翻译，我就一直用它做，一直没结果，这段时间就这么耗着。

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我认为如果application中提到immunoblotting,表明可以用于western blot。
ptglab老师，我有几个问题比较迷惑：
1，为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？
2，如果我的目的蛋白比较小，21和38kd，转膜时（Biorad的湿转仪）时间是否能缩短些？100伏电压，甲醇的量是否也可以相应增加？
谢谢！

作者: flower-201 时间: 2013-9-11 17:24

我现在在做ERK 1/2的WB,检测其磷酸化程度。我象请教个问题，为减少上样的误差，更好保证磷酸化和总－erk的wb条带的可比性，如果我使用同一张膜，请教如何洗膜，即洗膜的程序和配方如何？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:25

1 浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。
2 如果是小蛋白可以用小电压28V－36V，4－6hurs，（4度）。
甲醇10％－20％就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:25

关于复用膜的方法如下：0.1M甘氨酸，PH2.9，每次用20ml甘氨酸溶液，
将检测过的膜置于其中，室温下摇床20min，TBST洗2次，再封闭30min，重新加所要检
测的一抗。待检蛋白的分子量最好相差10KD，一抗为单抗效果较好

作者: flower-201 时间: 2013-9-11 17:26

同一个转移电泳槽内，放两个三明治，同时转移两张膜。这个时候的转移电压要不要×2？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:26

QUOTE:

原帖由 flower-201 于 2013-9-11 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

同一个转移电泳槽内，放两个三明治，同时转移两张膜。这个时候的转移电压要不要×2？

你是用的是tanksystem or semidry system？如果是tanksystem 不用加倍，

如果是semidry 要让电流加倍（同时电压也就加倍了）

作者: jrwyyplt 时间: 2013-9-11 17:27

我马上就开始做weastern了，听说很难的，有几个问题想请教高手：
1 抗体的选择：比喻说，我做的人VEGF，该选择什么样的抗体做为合适，效果最好。
2 硝酸纤维膜有选择性吗？
3 能帮忙提供正规的protocol吗？
4 我在看人家做的时候，发现胶上有条带，却没有转到膜上，而marker却有，请分析一下原因。

作者: finger 时间: 2013-9-11 17:30

你好关于你说的那个网站的制备核提取物的试剂盒我想问一下中国的代理公司有哪些？谢谢！因为我们是校园网，不能进去你说的那个网站。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:31

如果想提取核蛋白不用那么复杂，可以自己做，很简单，
1 用ripa buffer（最好的改进的配方)裂解细胞，或组织
2 离心，留沉淀。（上清是胞浆和膜蛋白）
3 用stop buffer溶解沉淀。
4 离心，留上清。

具体的条件我就不发了，自己跟查一下就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:32

1 能用单抗的情况下用单抗，
2 最好用PVDF膜
3 自己查，具体条件具体分析，
4 marker比蛋白更容易吸附到膜上。这个很正常。

作者: qumm1985 时间: 2013-9-11 17:32

你好！我前几天看了别人做了个WESTERN BLOT ，对步骤有了大体的了解，但是对用到的试剂的作用，为何用这些试剂还不是很了解，你能给我写一个各个试剂的作用的表吗？非常谢谢！

作者: 白白的 时间: 2013-9-11 17:32

你好．我要做ＷＥＳＴＥＲＮ　ＢＬＯＴ　分析，我是一个本科学生，老师让我自己查资料，你能告诉我全过程，并且相关试剂在哪里买．谢谢．急切盼望中！

作者: tie8 时间: 2013-9-11 17:35

我作是磷酸化的抗体，是否一定要用BSA封闭，感觉作出来效果没有奶粉好，怎么办，BSA加到10％可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:35

不一定要用BSA，一般的磷酸化抗体的检测都可以用Milk，除非有文献报道说milk中有影响的蛋白。
有时候milk中的磷酸化蛋白会影响你的实验结果，但是很少见。
我们检测了很多磷酸化的抗体，都用的milk。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:36

建议你们还是先收集一下相关资料，多看点文章，另外一些试剂公司的目录的后面有WB的过程，你可以看看。

另外我前面的帖子里有提到几本书，你们可以看看特别是英文版的antibody

作者: mimili_901 时间: 2013-9-11 17:36

请问这里有没有用血清做western的？怎么做？谢谢指教

作者: eric930 时间: 2013-9-11 17:36

我今天买的抗体到货了。结果发现订货的时候错把Myc-tag antibody订成anti c-Myc 的抗体了。说明书上说 is not recommended for Myc-tagged融合蛋白的检测。
我在联系看能不能换货，要是换不了的话，

请教：是否绝对不能用anti c-Myc antibody来检测Myc-tagged融合蛋白？？如果用来做westeren，会检测不到吗？谢谢

作者: wu11998866 时间: 2013-9-11 17:37

您好，你能告诉我检测蛋白含量的方法吗？前面好像你提到过用sds-page但是我还是不是很明白，这个原理是怎么样的。用细胞裂解液作westblot要求每孔上样的蛋白含量基本一致，用什么方法可以保证。谢谢！因为是不同细胞得裂解液作对照。谢谢!
请回复！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:38

你可以根据anti c-Myc抗体免疫源来判断是否是可以用在Myc-tagged融合蛋白蛋白上。

作者: avi317 时间: 2013-9-11 17:39

相关疾病：

肿瘤

大家好！我是个新手，从来没有做过相关实验，请大家多帮忙！

我最近想做肿瘤细胞的P53的表达，请问能否帮忙设计一个具体方案呢？
不胜感激！

作者: windy+++ 时间: 2013-9-11 17:39

您好，你能告诉我检测蛋白含量的方法吗？前面好像你提到过用sds-page但是我还是不是很明白，这个原理是怎么样的。用细胞裂解液作westblot要求每孔上样的蛋白含量基本一致，用什么方法可以保证。谢谢！因为是不同细胞得裂解液作对照。谢谢!
请回复！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:40

做法跟普通的Wb是一样的，不过用2抗时就要小心了，因为有的2抗会跟血清中的IgG有交叉反应，
再不能用actin做内参。

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:40

一般检测蛋白浓度用分光光度计就可以了，高级一点的可以用酶标仪来读数。
也可以用现成的Bradford试剂盒来检测。

但是有时候这样检测的结果有偏差，结果会不理想，遇到时，可以先按原来的测量浓度等量上样量以后，跑sds－page看看整个lane的蛋白浓度做为check.

有条件的话上内参。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-11 17:40

我做的是GST融合蛋白的WESTERN BLOTTING，一抗是抗GST的多抗。用GST做的对照组没有非特异带，而其它融合蛋白却有非特异条带，且非特异条带的数量随着上样量减少而减少，是否融合蛋白有降解？如果继续减少上样量而消除了融合蛋白的非特异带是否可以认为是假阳性？另外我是湿转4度过夜有没有影响。谢谢！

作者: lixi559 时间: 2013-9-11 17:41

做法跟普通的Wb是一样的，不过用2抗时就要小心了，因为有的2抗会跟血清中的IgG有交叉反应，
再不能用actin做内参。

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谢谢，再请教几个问题：
请问如何能避免或者减少2抗和IgG的交叉反应？
我的目的蛋白在核、胞浆、膜、胞外均有表达，能选择什么内参？是不是需要浓缩后上样？

我还处于技术准备阶段，还没有买抗体，请问贵公司代理吗？（我实在也不知道那个公司的好）

我是专业学位的，从来没有做过实验，问题可能很幼稚，请见谅。再次谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:42

QUOTE:

原帖由 taoshengyijiu 于 2013-9-11 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是GST融合蛋白的WESTERN BLOTTING，一抗是抗GST的多抗。用GST做的对照组没有非特异带，而其它融合蛋白却有非特异条带，且非特异条带的数量随着上样量减少而减少，是否融合蛋白有降解？如果继续减少上样量而消除了融合蛋 ...

1 要分清楚非特异条带和降解条带
a 选择全菌体（或带GST的空载体）和融合蛋白一起孵育，看看“非特异”条带是否一致。
b 我们有Gst抗体，质量很好，万一你抗体有问题可以跟我联系。
2 '如果继续减少上样量而消除了融合蛋白的非特异带是否可以认为是假阳性？"

不是的，我觉得上样量太大肯定会有非特异条带的，合适的上样量是个合理的做法。

3 湿转4度过夜有没有影响

作者: NBA 时间: 2013-9-11 17:43

to cyl，

'我的目的蛋白在核、胞浆、膜、胞外均有表达，能选择什么内参？是不是需要浓缩后上样"

血清里是没有细胞的，都是分泌蛋白。你的目的蛋白是什么？

"如何能避免或者减少2抗和IgG的交叉反应？"

我们有可以跟其他物种IgG很少交叉反应的2抗

作者: okhaha 时间: 2013-9-11 17:43

你好?我有一个问题想请教.我在做18KD的蛋白(分离胶浓度15%)的WESTERN, 一抗用1:1000,DAB显色后,膜上什么也没有,用1:500的,膜上出现很多非特异性条带.这些条带位置与我的目的蛋白不相关(MARKER位置不对).请问我应如何调整实验方法.我的其他实验部分曾做出过40KD的WESTERN,考虑蛋白分子量小,我已调整了胶的浓度,但效果不理想.谢谢

作者: c86v 时间: 2013-9-11 17:45

相关疾病：
自身免疫性疾病

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'我的目的蛋白在核、胞浆、膜、胞外均有表达，能选择什么内参？是不是需要浓缩后上样"

血清里是没有细胞的，都是分泌蛋白。你的目的蛋白是什么？

"如何能避免或者减少2抗和IgG的交叉反应？"

我们有可以跟其他物种IgG很少交叉反应的2抗，

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我还要做细胞培养提取胞浆蛋白的，故有此一问，
我做自身免疫病，患者的血清中有很多的自身抗体，是不是会出现很多的干扰条带？如何解决这个问题？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-12 12:56

1 你的非特异条带的大小是多少，有没有18kd左右的带，如果没有,是否都比18kd高？
2 用PVDF膜做低于18kd时都要看蛋白是否转移上去了。普通的PVDF膜做20kd以下的蛋白都要小心转移过头的问题。
3 孵育1抗时是否加了bsa or milk?

作者: NBA 时间: 2013-9-12 12:57

相关疾病：
自身免疫性疾病

“我的目的蛋白在核、胞浆、膜、胞外均有表达，能选择什么内参？是不是需要浓缩后上样”

如果在胞外都有表达我就不知道用什么内参了，如果只在核、胞浆、膜表达是可以用actin的。

“我做自身免疫病，患者的血清中有很多的自身抗体，是不是会出现很多的干扰条带”

如果2抗选择的好是不会造成影响的，抗体制样以后都一样，只有跟2抗或一抗发生反应时才会有影响。

另外我没有收到你的邮件。

作者: NBA 时间: 2013-9-12 12:58

不是我不公布步骤，只是公布了也没有什么用，这个步骤到处都是的，每个蛋白都因该有其特顶的Wb的步骤（包括提取办法，电泳转移条件，一抗浓度，等等），你们可以多查资料，定出自己的步骤，有问题了再问

作者: guagua 时间: 2013-9-12 12:59

想请教一些关于抗体制备的问题:我的抗原分子量大小预计为10－17kd，目前手头有his和GST标签的两套原核表达载体，不知道如何选择？我想GST的分子量比目的片断还大，在制备单抗时会不会有影响；选his标签的载体产生的目的蛋白会不会因为大小的问题影响抗原的免疫原性？实在搞不清楚，请赐教！！

作者: star#room 时间: 2013-9-12 12:59

湿转时，电压与电流哪个更重要？我用新鲜配置的电转液电压能达到100v，但相应的电流才200多mA。而重复两次后，电压比较低，80v左右，但电流就能达到340mA...我要做小分子的蛋白质，10kd左右，是否在这两种不同情况下转膜时间也应该不一样？

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:00

如果筛选单抗体，用his or 用gst表达系统都各有好处，我建议可以用两套表达系统，如果都能表达出来，则用gst的融合蛋白做免疫，用his的蛋白做筛选就可以了。
如果只有一套系统表达的出来（或表达的好）就只有用表达出来的免疫了。

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:01

做湿法转移是一般是衡压转移，所以我认为电压是重要的。

如果转移小分子的蛋白<20kd, 一般电压28V－32V，转移2－4小时就可以了。

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-12 13:01

也开始做Western了，因为是新手，而且我的蛋白比较少，所以我很珍惜，不敢放手去做，先后做了两次，条带是出现了，但是胶片非常得难看，明明是同一张膜，暴光以后发现上面一半发黑，下面一半发白，这是什么原因呢？我的蛋白分子量大约为100KD。还有想请教一下，这些结合过的PVDF膜应该怎么保存，如何重复利用呢？

作者: duoduo 时间: 2013-9-12 13:02

各位大侠好，最近一直有个问题没有解决。我想做卵母细胞中的phosphorylated cyclin B1的western，各位有什么具体意见吗？我也做了几次，都没出结果。我的问题主要有以下几个：
1：裂解液中怎样添加磷酸酶抑制剂，浓度多少合适。
2：封闭成分用什么比较好，脱脂奶粉还是BSA，浓度多大？
3：膜用那种好些，PVDF还是NC膜？
谢谢各位大侠！

作者: u234 时间: 2013-9-12 13:03

在下不才，在各位高手面前，班门弄斧了“
我的经验，仅供参考：
1.磷酸酶抑制剂，可以百分之一的体积比加，当然，在一定范围内，多一些更好。
2.封闭，我常用百分之五的脱脂奶粉，效果很好。
3.至于用什么膜，PVDF和NC膜都可，要看你用什么方法显色，我用ECL显色，用NC膜，感觉满好。
就我的经验，WESTERN作不出来，好像与你提的几个问题，关系不大，应该把重点放在蛋白裂解，比如说裂解液，以及抗体的质量和浓度上。

以上意见仅供参考！！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-12 13:04

我是新手，请问一下有谁知道大鼠怎样裂解细胞？

让我佩服一下。

作者: 131415 时间: 2013-9-12 13:04

1 你的非特异条带的大小是多少，有没有18kd左右的带，如果没有,是否都比18kd高？
2 用PVDF膜做低于18kd时都要看蛋白是否转移上去了。普通的PVDF膜做20kd以下的蛋白都要小心转移过头的问题。
3 孵育1抗时是否加了bsa or milk?

===========================================================================================================

1 我的非特异条带的大小都比18kd高,但在18KD处没有条带
2我用的NC 膜,丽春红染色时20KD以下有4个条带据MARKERZAI 14-20 KD之间
31抗用BSA配制,加了少量迭氮钠
据你的提问,你好象已经知道原因了,是吗?能否排除我要检测的蛋白根本没有?我又做了一次,丽春红染色依旧正常,但无条带.是否1抗不合适,我用的是单克隆抗体.谢谢!

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:05

1 你要分清楚是否是胶片爆光了（黑的部分）如果不是的，就是膜被污染了。

2 PVDF膜复用的方法可以参考我前面的帖子，用strip掉上面的抗体。

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:06

"我是新手，请问一下有谁知道大鼠怎样裂解细胞？让我佩服一下。"

=============================

"大鼠怎样裂解细胞?"
我想是通过消化系统吧，哈哈，
以后问完问题最好看看有没有错

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:07

问题应该出在3个方面，
1 膜没有结合你的目的蛋白。
2 目的蛋白量太少
3 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）

因为Pvdf膜孔径的关系，18kd以下的蛋白很容易转移过头，转移是候要小心。

作者: mickeylin 时间: 2013-9-12 13:08

请问高手：120kD,半干转印：1mA/cm2,1.5hour,可以吗？
还有：yeast protein extract 有何技巧提高产率？裂解buffer：urea 8M,SDS 5%,Tris-HCl 40mM,EDTA 0.1mM,Bromophenol blue 0.4mg/ml,beta-mercaptoethanol 10ul/1.13ml,protease inhibitor solution; 采用glass beads机械vortex 裂解，收集yeast cell 后在-70度冻融，但western blot 没检测到目的蛋白，请予指点，thanks a lot!

作者: cocacola 时间: 2013-9-12 13:09

问题应该出在3个方面，
1 膜没有结合你的目的蛋白。
2 目的蛋白量太少
3 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）

因为Pvdf膜孔径的关系，18kd以下的蛋白很容易转移过头，转移是候要小心。

==========================================================================================================

1抗买的是做WESTEN和ELASA的,说明书上已经指明,你的意思" 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）",我不太明白.能解释一下吗.谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:09

QUOTE:

原帖由 cocacola 于 2013-9-12 13:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
问题应该出在3个方面，
1 膜没有结合你的目的蛋白。
2 目的蛋白量太少
3 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）

因为Pvdf膜孔径的关系，18kd以下的蛋白很容易转移过头，转移是候要小心。

================================ ...

问题应该出在3个方面，
1 膜没有结合你的目的蛋白。
2 目的蛋白量太少
3 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）

因为Pvdf膜孔径的关系，18kd以下的蛋白很容易转移过头，转移是候要小心。

1抗买的是做WESTEN和ELASA的,说明书上已经指明,你的意思" 一抗不适合做WB，（可以同过看说明出发现）",我不太明白.能解释一下吗.谢谢"

是说这有3个可能性，而且你说“是否1抗不合适,我用的是单克隆抗体.谢谢!"
如果说明书上有说能做Wb就不用怀疑这一条了。

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:10

是关于cd45的WB

“我没有做过你的是个蛋白但是我做过200kd的蛋白的WB，如果你方便可以留下电话，我明天打给你讨论你的这个实验”

作者: sunnyB 时间: 2013-9-12 13:13

我刚刚开始做western，遇到好多问题哦，想请教请教

重复性很差，同一张膜，用strip buffer洗掉以后，用一模一样的条件都杂交不出来

我的strip buffer的配方是
2% SDS
100 mM beta-mercaptoethanol
50 mM Tris, pH 6.8

50° C水浴1hr，然后用PBS洗3次，每次8分钟
然后还是block、一抗、二抗，但是没东西啊！

作者: gmjghh 时间: 2013-9-12 13:14

我的western已经做出来了，但现在有个问题就是我跑的带不直，五一前都还是直的，过完节后再做带就不直了，在积层胶还是很直的，到分离胶就会出现扭曲，电压和电流变化不大，请教
1 跟上样buffer有关吗？我以前用的是巯基乙醇，现在用DTT配的。
2 可不可能跟玻璃有关，两块玻璃与胶不紧密，电泳液从间隙中过，而不是从胶中过，从而影响条带？
还有就是蛋白聚合不好，是不是积层胶宽度不够？

作者: gmjghh 时间: 2013-9-12 13:16

你用这个strip buffer 的配方试试
62mM/L trisbase
2% sodium lauryl suffare PH6.7
0.6% beta-mercaptoethanol
37° 放2h，然后用PBS洗3次。然后再封闭、一抗、二抗。可以做出来，但效果没有原始膜好，有点淡。

作者: gmjghh 时间: 2013-9-12 13:17

复用膜的方法如下：0.1M甘氨酸，PH2.9，每次用20ml甘氨酸溶液，
将检测过的膜置于其中，室温下摇床20min，TBST洗2次，再封闭30min，重新加所要检测的一抗。待检蛋白的分子量最好相差10KD，一抗为单抗效果较好
这个方法和用strip buffer 的效果一样吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-12 13:18

1 你将下层胶的配方重新检查一下，
2 看看是否是灌胶时不均匀。
3 玻璃的是否没有洗干净。
4 胶没有凝集好

我的配方跟strip buffer的作用差不多，我试过比strip buffer要好一点

作者: gmjghh 时间: 2013-9-12 13:19

1 灌胶时不均匀是怎么回事？怎么形成的？

2 我今天发现玻璃有一点漏，最下面有一个1-2毫米的无胶条带，这个空气条带会不会影响条带不直？

作者: mogu 时间: 2013-9-13 09:48

我刚做wb，很多不懂，先问几个菜鸟级的问题

1. 要做的蛋白分子量很大，450KD，用什么样的protocal；
如有困难，就我所知，此蛋白是4聚体形式的通道蛋白，能不能先将4聚体打开，降低分子量做？有这样的试剂来实现吗；
另外，我买的一抗是多克隆抗体，如果将其打开会不会影响一抗的识别。

2. 要达到两组蛋白表达的差异，先要对所提的组织总蛋白定量，使之总蛋白加样量相等才有比较意义，用什么快速儿又简便的方法实现？

作者: ffooll 时间: 2013-9-13 09:48

我做膜蛋白，分子量35KD，RT-PCR时条带就很弱的，western时，marker是cell signal的，30KD条带特宽，竟然是30KD与40KD条带间距的3倍，而我压片压了1h，仅在marker 的30KD条带的上缘发现了一条带，师兄告诉我目的条带和marker相差4-5KD是可以接受的，而且仅有这一条带在总蛋白样本中也存在。

请问，这是我的目的条带吗？
多谢！

作者: zzzz 时间: 2013-9-13 09:49

胶上的蛋白条带很明显，转膜后却没有了条带，但有marker的清晰条带，请问是为什么？

作者: DONT 时间: 2013-9-13 09:57

1 "灌胶时不均匀是怎么回事？怎么形成的？"

在加入APS和temed后，没有充分混匀就灌胶了。

2 不会影响的

作者: NBA 时间: 2013-9-13 09:58

Marker比自己提的蛋白好转移，所以很多时候参照marker是没有用的，最好自己转移完后染胶，做完Wb后染膜。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 09:58

要判定是否是你的目的蛋白，可以加上阳性对照和阴性对照（可以在网上找到表达的组织和不表达的组织或细胞株，同时做，看看符和否，来判定是否是目的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:00

1， 450kd的蛋白很不好做WB，我最大做过300kd的，所以我也没有相应的protocol, 就是有，也可能不适合你用，只适合我们的实验设备。
可以做8M urea stacking gel，可以打开多聚体结构。
2 如果是多抗要看免疫源是什么，但是一般是可以识别单体的。

作者: ffooll 时间: 2013-9-13 10:00

相关疾病：
肿瘤
请问，肿瘤组织中VEGF检测，蛋白提取时用匀浆器匀浆后，离心取上清液就可以？（见蛋白质技术手册），不用再加裂解液么？
急盼回音！

作者: mamamiya 时间: 2013-9-13 10:01

以下是我做的Phospho-P38的,总共加了6个样,未刺激孔1个样,其它是PMA刺激及其加药孔，结果：未刺激孔无条带，但刺激孔的条带又细又模糊，上次做了一次Phospho-Erk1/2也是这样，只是条带稍微清淅一点，总是没有文献中的那么清楚。我用的是碱性磷酸酶显色法，加了显色液后直接显色，不用胶片曝光照相。以下是我的protocol，附件中有图,请您帮着看看哪里出了问题。
1、Jurkat细胞1×106/ml，共10 ml（即1×107个细胞），0.2%FBS 1640过夜，PMA（40ng/ml）刺激30min。
2、试剂盒提取细胞浆蛋白：离心去培养液，加PBS/Phosphatase inhibitor 8ml洗一次，500ul hypotonic buffer 吹打数次，冰上孵育15min，加25ul detergent 破膜，辅助注射器抽吸或超声破碎3次，所有步骤冰上操作。
3、分光光度计计蛋白浓度，约为1.3mg/ml.
4、100度蛋白变性,每孔上样约30ug/ml蛋白，10%的丙烯酰胺分离胶，200mV 30min。
5、低温转膜（硝酸纤维素膜）。
6、封闭液封闭1h。
7、Cell signaling 一抗1：1000 4度摇床过夜。
8、洗液5min×3次；
9、1：500二抗孵育1h；
10、洗液5min×3次；
11、底物显色。

作者: moonlight45 时间: 2013-9-13 10:04

可以做8M urea stacking gel，可以打开多聚体结构。

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谢谢楼主的回答，问问这8M 尿素积层胶如何来配，急盼回复

作者: am10 时间: 2013-9-13 10:05

我想做western blot，但不知道怎么将脑内核团精确取出，以及后续的制样工作，如匀浆时加的蛋白酶抑制剂怎么选取？我做的是一种即早基因蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:07

我没有做VEGF，分泌蛋白是否应该分泌到血液中去，组织匀浆后有没有我不知道，不敢瞎说，如果你可以在文献上查到这么做应该就是可以的

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:08

看了你的步骤，没有什么问题，
要想达到你的目的
建议：

1 换用HRP标记的2抗＋ecl，这个比AP的灵敏度会高很多。强烈建议
2 增大上样量（不过我看了要增大也不大可能了，除非重新提蛋白）
3 换用HRP标记的2抗＋DAB，这个也是直接显色的，比AP要灵敏。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:10

简单的很，在stacking gel 中加8M urea就可以了，在加APS和TEMED前加入即可。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:11

你说的我没有涉及过，帮不上忙，蛋白酶抑止剂可以选用一些广谱的抑止剂如PMSF等

作者: nut6694 时间: 2013-9-13 10:11

"你还可以用phospho-marcks 来测定PKC的活力，不用做同位素。你可以到XXXXXXXX上看这个抗体的介绍。"

我上不了你给的网站，你能把资料给我一份嘛，我也要做这个

作者: rxcc33 时间: 2013-9-13 10:11

各位大侠：

偶为一实验室新手，需做Western,拟用人b-actin蛋白为内参，但未找到

其具体信息（分子量，特性……），不知哪有？

十二分感谢！

作者: mingming0638 时间: 2013-9-13 10:12

好，我准备做WB，可是我想了解更多的有关这方面的知识，不知道哪里有比较系统的东东介绍这个WB的文章或者资料。，比方原理，方法，受测蛋白分子量等等。谢谢!

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-13 10:12

各位大侠：
偶为一实验室新手，需做Western,拟用人b-actin蛋白为内参，但未找到
其具体信息（分子量，特性……），不知哪有？
十二分感谢！

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你做内参的目的是什么？
Western的内参照不是外加的吧，一般是作为辅助证明跑电泳的上样量各个lane是一样的。至于actin的特性，你上个卖抗体的生物公司网站（如scbt, sigma)，看看他们有关actin抗体的说明书，里面都会有介绍的
All eukaryotic cells express actin, which often constitutes as much as 50% of total cellular protein (1-6). Actin, a 42 kD peptide chain, assumes two physical forms: globular actin, which may serve as a cytoplasmic storage pool, and fibrous actin, which, in conjunction with myosin, generates muscle contraction filaments . While lower eukaryotes, such as yeast, have only one actin gene, higher eukaryotes have several isoforms encoded by a family of genes (1,4). At least six types of actin are present in mammalian tissues and fall into three classes (5). Alpha actin expression is limited to various types of muscle, whereas beta and gamma are the principle constituents of filaments in other tissues . Members of the small GTPase family regulate t he organ ization of the actin cytoskeleton. Rho controls the assembly of actin st ress fiber s an d foca l ad hesion, Ra c r egulat es a ctin f ilament accumulation at the plasma membrane and Cdc42 stimulates formation of filopodia (7).

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 10:13

你好，我准备做WB，可是我想了解更多的有关这方面的知识，不知道哪里有比较系统的东东介绍这个WB的文章或者资料。，比方原理，方法，受测蛋白分子量等等。谢谢!

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这方面的书籍比较多，在群里可能就能找到，超星里面也有相关的书，可以进去找找，在生物学里
最近有一本：汪家政范明（eds）蛋白质技术手册。科学出版社

[ 本帖最后由 8princess8 于 2013-9-13 10:15 编辑 ]

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 10:16

Marker比自己提的蛋白好转移，所以很多时候参照marker是没有用的，最好自己转移完后染胶，做完Wb后染膜。

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转移完后染胶是检测有没有转过去，“做完Wb后染膜”什么意思？能染出带带么？不是都被封闭了么？
我倒是觉得转移完后用丽春红或快绿染一下比较好，注意要在封闭之前染才行. 染色后观察或拍照，然后用水洗去再封闭

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 10:16

以下是我做的Phospho-P38的,总共加了6个样,未刺激孔1个样,其它是PMA刺激及其加药孔，结果：未刺激孔无条带，但刺激孔的条带又细又模糊，上次做了一次Phospho-Erk1/2也是这样，只是条带稍微清淅一点，总是没有文献中的那么清楚。我用的是碱性磷酸酶显色法，加了显色液后直接显色，不用胶片曝光照相。以下是我的protocol，附件中有图,请您帮着看看哪里出了问题。
1、Jurkat细胞1×106/ml，共10 ml（即1×107个细胞），0.2%FBS 1640过夜，PMA（40ng/ml）刺激30min。
2、试剂盒提取细胞浆蛋白：离心去培养液，加PBS/Phosphatase inhibitor 8ml洗一次，500ul hypotonic buffer 吹打数次，冰上孵育15min，加25ul detergent 破膜，辅助注射器抽吸或超声破碎3次，所有步骤冰上操作。
3、分光光度计计蛋白浓度，约为1.3mg/ml.
4、100度蛋白变性,每孔上样约30ug/ml蛋白，10%的丙烯酰胺分离胶，200mV 30min。
5、低温转膜（硝酸纤维素膜）。
6、封闭液封闭1h。
7、Cell signaling 一抗1：1000 4度摇床过夜。
8、洗液5min×3次；
9、1：500二抗孵育1h；
10、洗液5min×3次；
11、底物显色。

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看你前面制备样品没有什么问题,我觉得有几个地方要注意:
1)转移条件 P38的分子量比较小,你转移的时间多长?有没有转过了? 其次,用的NC膜孔径多大? 0.45微米的有点危险,用0.2的膜试一试
2)一抗好用么? P38我不知道, Phospho-Erk1/2的PROMEGA的最好,随便来个人显的都特好. 另外你用的是哪家的二抗啊?只有1:500的稀释度?Sigma 的可以用到1：10000-20000的
3)看你的照片背景特深,用什么东西封闭的啊? 我建议用3%BSA(fraction V)-TBST

作者: one 时间: 2013-9-13 10:17

感觉真的很有提高。因为实验室只有我一个人在做这方面的东西，很多现象不知如何解释，对不知为何对，错不知在那里，闷头做了2个月多，仍然很郁闷，没有做出漂亮的图。毕业在即，心急如焚。
请教：
我用的是DAB染色，时间短了，条带不明显，显色时间延长后，则背景几高，变脏，整个白摸变成了虹膜。请问有什么高招吗？是否应换成ECL染色？你有没有推荐的ECL？

谢谢你无私的帮助。周末愉快。

作者: orangecake 时间: 2013-9-13 10:17

DAB一般是用于免疫组化显色用的，不大适合WB
常用的显色方法有Radioactive；Colorimetric ；Chemilumine-scent；Fluorescent 四大类，推荐使用ECL和化学显色（常用NBT/BCIP，promega有的，Cat No：S3771）。使用不同显色方法，所用的二抗标记也不一样。用NBT/BCIP的话，二抗标记的是AKP。

作者: XYZQ 时间: 2013-9-13 10:18

多谢兄弟们的热心指教!
我用的膜是KPL公司0.45um的,一抗是Cell signaling 的,封闭液和二抗是KPL公司的pretain detecter western blot kit中自带的,用HRP 和TMB底物显色.我一定要用ECL和化学显色吗?在目前的基础上还有什么改进的措施?谢谢!

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:19

转移完后染胶是检测有没有转过去，“做完Wb后染膜”什么意思？能染出带带么？不是都被封闭了么？
我倒是觉得转移完后用丽春红或快绿染一下比较好，注意要在封闭之前染才行. 染色后观察或拍照，然后用水洗去再封闭

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Wb做完以后当然试可以通过考染将膜上的蛋白条带染出来的，2－5mins就够了，然后脱色，可以看的很清楚。丽春红染色通常不清楚，很多时候是无法判断的，当然也WB后用考染也是无法提前判断的，只是用来排除可能出问题的地方.

作者: hustwb 时间: 2013-9-13 10:19

想做一种核内蛋白的western，查了一下文献，有用整个细胞的蛋白提取物，也有用核蛋白的提取物做的。我并不关心该蛋白是否在核内还是核外表达，只关心细胞中（当然也要包括核内）总的表达量，到底用哪一种裂解液，盼高手赐教

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-9-13 10:20

脱脂奶粉究竟对ABC系统有什么影响？
最近Dot blotting采用ABC法，但发现即便采用3％或5％的BSA封闭，背景均较高。反而当采用5％脱脂奶粉封闭时，背景很白，不过点的信号强度也随之下降。据说脱脂奶粉中是含有biotin的，那么它究竟对ABC法造成什么样的影响呢？使背景高吗？还是会中和部分streptavidin-HRP呢？
向高手求教。

作者: ROSE李 时间: 2013-9-13 10:23

蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适。谢谢

作者: mimili_901 时间: 2013-9-13 10:23

我想问,用福尔马林保存的组织能否提蛋白做WESTEN.?马上要做,谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:24

用总蛋白的提取液就可以了，提整个细胞的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:24

QUOTE:

原帖由 ROSE李 于 2013-9-13 10:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适。谢谢

可以用28V， 5－8小时。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:25

我没有怎么做过，但是从原理上说是没有问题的。

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-13 10:26

1）请问哪里有对半干法和湿法转移比较详细的介绍？半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？
2）看前面的帖子在做wb时最好要有marker作对照，我们一般用的marker根本就不可能显色，请问你们公司是不是有这种产品

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-13 10:27

蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适。谢谢

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分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了
干转的话，用2.5 A/cm2, 30min就应该够了
湿转,按照bio-rad的说明,用100mA,也得要半个多小时吧.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 10:29

1）请问哪里有对半干法和湿法转移比较详细的介绍？半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？
2）看前面的帖子在做wb时最好要有marker作对照，我们一般用的marker根本就不可能显色，请问你们公司是不是有这种产品

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半干转的电流大小是按照面积来算的,时间是根据蛋白分子大小定的;而湿转的话电流是恒定的,时间也是根据分子量而定.
marker有很多预染的啊,如Sigma 的SDS-7B,共有7个分子量. sant cruz有彩色的marker,直接在凝胶里和NC膜上就能看见.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 10:57

我没有怎么做过，但是从原理上说是没有问题的。

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我觉得恐怕不行, 抗原被破坏了吧,至少磷酸化是测不出来了.

作者: tudou85 时间: 2013-9-13 10:58

我前几天做了次western结果是目的蛋白显带,而actin却什么都没有,
目的蛋白的二抗和Actin的二抗是一样的.如此说来好像只有一抗出了问题
但是同实验室的师兄师姐做的挺好了
都找不出原因.
特来请教.
还有
不知如何才能防止细胞所提蛋白降解
谢谢!

作者: 7437654 时间: 2013-9-13 10:58

在strip过程中蛋白会有损失的,条件越严格,损失量越大.因此你的蛋白如果表达量偏低是有可能杂交不出的。建议用IP.

作者: NBA 时间: 2013-9-13 10:59

建议湿法转移还是定衡压好，很多书上给的参考步骤中用的都是衡压。这样条件好摸索一些。（衡流也可没有什么问题），其他的可以参照windcmt给的建议

作者: langlang 时间: 2013-9-13 10:59

我是做western的新手，目前还没有作出结果，很郁闷。我们买了低分子量marker,应该出6条带，不幸的是我们只看到3条！起初以为是marker有问题，可是用了同学的照样是3条带，不知有人碰到过这种情况没有？请指教！我们用的是Bio-rad公司的电泳仪，10％的分离胶。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:00

你的marker条带有哪几条？
你用10％的胶，很多小分子量的marker就分不开，就在一起。所以你看不到所有的带。

作者: ququer787 时间: 2013-9-13 11:00

请问做WB的垂直电泳仪哪个公司的比较好呢？
还有就是请问半干转印仪哪个公司的比较好呢？是买国内的还是买国外的呢？
另外半干转印所需的电流一般是多大呢？
我们实验室现在正在打算买有关仪器，但是不知道什么的比较好，还请高手指点，先谢谢了！

作者: JK.jon 时间: 2013-9-13 11:00

请问高手：

我想用24孔板做WB，如何收集细胞，大约需要多少孔就能检测出表达的蛋白质。

作者: ii077345 时间: 2013-9-13 11:01

请问半衰期短的蛋白作WB时有些什么注意事项？核蛋白的提取有特殊要求吗？我是新手，作了几次没结果，很急，希望各位多多指导！！！

作者: vcve 时间: 2013-9-13 11:01

请问:单克隆抗体的使用量为1:?

四甲基联苯胺如何使用?量及如何溶解?

作者: nvdabing 时间: 2013-9-13 11:01

非常感谢楼主，请教几个问题，先谢谢了：
1。为什么PVDF的膜用之前要用甲醇浸泡一下，这是必须的步骤吗？原理是什么？
2。关于转移的时间和转移缓冲液的问题？我们这里转移缓冲液一般是把电泳缓冲液不同倍数稀释，从把电泳缓冲液稀释两倍到稀释十倍都有，但是分子克隆上面似乎转移缓冲液配方是固定的，所以我们这种简单的做法会不会对转移的效率产生影响。（还有tris和gly在缓冲液里各有什么作用？）

多谢大家!

作者: c86v 时间: 2013-9-13 11:02

前几天做western，marker只出了3条，多谢ptglab 指教，原因找到了，正如你所说，我们的胶配稀了，本来应该定容到100ml，结果我们加了100ml水，差了20多ml.非常感谢ptglab ！
我的目的蛋白是17KD，用湿法转移能做出来吗？转膜条件？谢谢指教！

作者: tie8 时间: 2013-9-13 11:03

请问从组织提取的蛋白有絮状沉淀，离心去处会不会影响蛋白浓度？

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:03

请问做WB的垂直电泳仪哪个公司的比较好呢？
最好能用bio-rad 的，我用过很稳定。
还有就是请问半干转印仪哪个公司的比较好呢？是买国内的还是买国外的呢？
有经费最好买国外的，象millipo的， owl的(z这个公司的很好用）

另外半干转印所需的电流一般是多大呢？
一般一块胶在100mA左右。

我们实验室现在正在打算买有关仪器，但是不知道什么的比较好，还请高手指点，先谢谢了！
我们公司的研发部搬到国内来了，有不少多的设备，挺新的，可以便宜出让

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:03

要看目的蛋白的表达量来计算，你可以查资料看别人怎么做的，多少细胞提了多少ul蛋白，用了多少，就可以了。
不建议这么做，每次的蛋白量太少了无法重复实验

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:04

提蛋白是重点，防止目的蛋白降解就可以了。
1 时间快，
2 低温
3 加蛋白酶抑制试剂
4 快速是目的蛋白变性（加stop buffer，见前面的帖子）

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:04

请问:单克隆抗体的使用量为1:?

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可以看抗体说明，如果没有安照 1－2ug/ml稀释

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:05

1。为什么PVDF的膜用之前要用甲醇浸泡一下，这是必须的步骤吗？原理是什么？

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是的，活化上面的基团，利于蛋白的结合。另外不用甲醇之类的无法浸润PVDF膜。

2。关于转移的时间和转移缓冲液的问题？

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我们这里转移缓冲液一般是把电泳缓冲液不同倍数稀释，从把电泳缓冲液稀释两倍到稀释十倍都有，但是分子克隆上面似乎转移缓冲液配方是固定的，所以我们这种简单的做法会不会对转移的效率产生影响。
可以这么用我就是这么做的

作者: summerxx 时间: 2013-9-13 11:05

请问检测猪提取的蛋白的一抗到哪找到？一般都是人兔鼠的。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:06

我的目的蛋白是17KD，用湿法转移能做出来吗？转膜条件？谢谢指教！

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能，但是要多摸索条件，17kd是0.45um的PVDF膜的检测下限了，建议的转膜条件是：
28V 5-6hours, transbuffer 要加20％的甲醇。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:07

你加够了去垢剂了吗？如果加够了去垢剂是没有问题的，不能溶解的部分不是你要的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:07

你可在网上多找一下，抗猪的抗体不多，运气好是可以找到的。

作者: bs4665 时间: 2013-9-13 11:09

1。PVDF的膜用之前要用甲醇浸泡一般多长时间，一定要纯的甲醇吗？转移缓冲液里也含20％甲醇，是否可以替代？
2。跑胶的时候，样品中蓝色染料的表观分子量大概是多少，以前只知道作为指示剂，分子量小，但是具体多少不知？
3。在电泳是改变电泳缓冲液里tris和gly的浓度，对跑胶的结果是否有影响？
4。还有就是上样缓冲液有还原型和非还原型，我跑的时候一般用非还原型，就是不加巯基乙醇的那种，但是好多书上都常规跑还原型的那种，一般做实验到底应该用那一种，谢谢。

作者: ero11 时间: 2013-9-13 11:14

各位高手：
我是一新手，欲做一膜蛋白的Western，抗体为单克隆的,拟用beta-actin单抗为内参，但问了一下sigma的要三千以上，不知那有便宜一点的？北京中山到是有actin抗体，但是是多克隆的，不知可用否？？？
另：比较ca与正常组织蛋白量的表达一定要设内参吗，可否只控制上样量即行
多谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:14

1,2,3,都自己可以在书上或网上找到，这些都是很基本的常识，希望你能自己找相关的资料看看。
这里主要是解决问题的。
4 建议用还原型的。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:16

内参最好用sigma的单抗，
如果文章发表不要求内参，可以通过平均上样蛋白量来控制。

作者: pengke1983 时间: 2013-9-13 11:17

培养细胞做westen blots都对细胞量有一定的要求，若我成比例减少裂解液的量（够上样）是否可以...

作者: is2011 时间: 2013-9-13 11:19

有2个问题请教楼主
1．电转后丽春红染色PVDF膜不显蛋白带。什么问题？具体操作：半干电转10伏40分钟，丽春红按分子克隆二版配制，对电转后的胶考马撕亮蓝染色并与未转胶比较发现蛋白带少了许多。这种情况还能进行下一步实验吗？
2．电转过程电流是否有问题？开始时70mA左右结束时20-10mA，PVDF膜为5*4cm，PVDF膜甲醇浸泡20秒。

作者: fsdd817 时间: 2013-9-13 11:20

我准备做Western 　但我的难题是　导师要我做２ＤＥ后再转膜杂交，而且２ＤＥ凝胶要染色后进行脱色转膜，现在我还只知道丽春红染色后能够脱色，是不是不固定蛋白质的染料都能转膜啊？请你赐给我一些高见！谢谢了！

作者: fsdd817 时间: 2013-9-13 11:21

2DE凝胶转膜做蛋白质杂是不是难度很大，而且要染色后再转膜，因为我同时需要2DE凝胶图谱。染料除了丽春红还有那些可选啊？最好是用何种啊？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:22

估计不行，Wb检测的下限跟目的蛋白的含量有关。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:23

建议半干法用衡流，如果0.8mA-2.0mA/cm2, 一般来说是50－100mA/胶（60cm2），

转移时间是40mins－90mins，根据目的蛋白大小不同而不同。

如果你的膜只有20cm2，那么电流可以是20MA－50mA，建议延长一些时间。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:24

我准备做Western 　但我的难题是　导师要我做２ＤＥ后再转膜杂交，而且２ＤＥ凝胶要染色后进行脱色转膜，现在我还只知道丽春红染色后能够脱色，是不是不固定蛋白质的染料都能转膜啊？请你赐给我一些高见！谢谢了！

不是，我说知道的只有丽春红是可以这么用的。

“我想请教ptglab，2DE凝胶转膜做蛋白质杂是不是难度很大，而且要染色后再转膜，因为我同时需要2DE凝胶图谱。染料除了丽春红还有那些可选啊？最好是用何种啊？谢谢！”

我从来没有做过这个，我也不知道是否可行，反正染料是个关键。

作者: gogo 时间: 2013-9-13 11:24

我最近开始做WESTERN BOLT了，之前已经用DOT BOLT试过，能够做出来，而且显示结果非常明显。但几次WESTERN BOLT却都没有出结果。
我转膜的条件是30V（40mA）过夜，最终电流为50－60mA，5％milk 37度封闭2小时，一抗1:5000 37度2小时，二抗1:2000 37度2小时。
现在出现过这样几个问题：
1、在转膜时似乎电流小了点，因为在相关的实验手册上看到，一般转膜过夜的终端电流会达到90mA，而且在转膜结束后发现使用的预染MARKER在膜上只明显显出1－2条带，一般都是低分子量的那几条。其他的（35KD以上）一般都只能在对光情况下看得清楚。老板说MARKER条带不明显可能是转膜时间长扩散所致，另外这样的条件和情况会不会影响转膜的效果？
2、在5％milk 37度封闭过程中出现封闭液凝结现象，最夸张的一次在实验平皿底部平整的结一层，在膜上也结了一层。这样会不会造成膜被封的太厉害，1抗都结合不上去？

希望楼主能够提供指导，谢谢。因为现在还不能很确定目的蛋白的具体大小，所以急切希望能通过WESTERN BOLT定出其实际大小。

作者: S6044 时间: 2013-9-13 11:32

我做wB ,ECL工作液反应5min后，曝光时发现荧光淬灭的特别快，3min左右蛋白带就成空白了，我想问一下是因为上样量太大还是工作液的问题

作者: plaa 时间: 2013-9-13 11:33

请问PVDF膜需要用甲醇泡多长时间？
加一抗、二抗的时间是不是要严格按照要求呢？时间过长会不会影响效果？

再问您有没有用PVDF膜做过斑点杂交呢？有什么关键要注意的问题呢？
我最近两次都失败了，样品制备应该是没问题的。

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-13 11:33

我的western blot 没有条带，条件是目的蛋白17kd，sds page条带较好，转膜100v 50分，转膜后胶用考马染色无条带，一抗用1：200 过夜二抗1；400 2小时封闭10%脱脂奶粉 2h ,pvdf 膜 biorad的电泳转膜一体机。显色用中山的浓缩DAB试剂盒。很闷。

作者: bring 时间: 2013-9-13 11:33

你好，我是一个新手，我那个实验有一部分要求用Western blot，标本是低温保存的人肝癌组织，请问蛋白样品的制备和总蛋白的测定是怎样的？我查的资料都很笼统，所以希望您能给与详细的指导。还有想问作50例3种蛋白的测定，3种蛋白可以同时测定吗，请帮忙估计一下大概要多少钱。
谢谢！！

作者: u76mp 时间: 2013-9-13 11:35

我用的是BIO—RAD的TANK 是不是湿法？这种方法对膜胶纸的大小有要求吗？另外一个很菜的问题是丽春红染色前是否要用甲醇过一下，否则是不是染不上去？染色完后是不是要把它冲得干净后才能进行封闭？

谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:36

我转膜的条件是30V（40mA）过夜，最终电流为50－60mA，5％milk 37度封闭2小时，一抗1:5000 37度2小时，二抗1:2000 37度2小时。
现在出现过这样几个问题：
1、在转膜时似乎电流小了点，因为在相关的实验手册上看到，一般转膜过夜的终端电流会达到90mA，而且在转膜结束后发现使用的预染MARKER在膜上只明显显出1－2条带，一般都是低分子量的那几条。其他的（35KD以上）一般都只能在对光情况下看得清楚。老板说MARKER条带不明显可能是转膜时间长扩散所致，另外这样的条件和情况会不会影响转膜的效果？

如果你的系统电流只有这么大建议你转移用下面的方法试试:
30V 3hours 48V－63V 10-14hours (4度转移）
“老板说MARKER条带不明显可能是转膜时间长扩散所致，”
你老板可能说错了，如果是他说的原因，那么小分子的也会扩散掉的。
你可以把做过WB没有结果的膜用CBB染一下看看大分子的蛋白染上去没有

2、在5％milk 37度封闭过程中出现封闭液凝结现象，最夸张的一次在实验平皿底部平整的结一层，在膜上也结了一层。这样会不会造成膜被封的太厉害，1抗都结合不上去？

是否是你的milk里的buffer蒸发了造成的现象，建议用4度加盖子封闭4hours左右。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:44

两种可能都有，可以逐一排除。
但是我个人觉得是上样量太多所致。建议至少减少到原来上样量的1/3.

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:47

我的western blot 没有条带，条件是目的蛋白17kd，sds page条带较好，转膜100v 50分，转膜后胶用考马染色无条带，一抗用1：200 过夜二抗1；400 2小时封闭10%脱脂奶粉 2h ,pvdf 膜 biorad的电泳转膜一体机。显色用中山的浓缩DAB试剂盒。很闷。

如果做17kd的蛋白，用PVDF膜就要小心，建议不要用太剧烈的条件转移。
你可以用28V ，3－5hours试试。

如果确信转移效果良好，（最好在WB后用CBB染一下膜，看看目的范围内的蛋白是否转移的好），而无结果，建议加倍上样量，和用Ecl法

你的第二个问题可以看看前面的帖子，里面都有讲。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:47

请问PVDF膜需要用甲醇泡多长时间？

1min就够了

加一抗、二抗的时间是不是要严格按照要求呢？
不用。
时间过长会不会影响效果？
不会有本质的影响。

再问您有没有用PVDF膜做过斑点杂交呢？
有
有什么关键要注意的问题呢？
点膜是关键，其他都还好。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:48

建议还是要多查一下资料，书上和网上肯定有详细的资料。查资料是个很好的实验准备过程，建议不要去忽略了。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 11:51

还有想问作50例3种蛋白的测定，3种蛋白可以同时测定吗，

”同时“？是否是指在一条lane上测三个蛋白？如果是的话，要看这三种蛋白的性质而定。一般不建议在WB不熟练的情况这样做。

请帮忙估计一下大概要多少钱。”

不算1抗的话，要10000元（保守估计）。

你检测什么蛋白？

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-13 11:51

相关疾病：
白癜风
菜鸟求助啦！
我刚做了western，遇到好多问题，恳请高手赐教！
1。我的蛋白大概80kd，采用半干法转PVDF膜，按0.8mA/cm2衡流转膜2h。转完膜后发现膜上出现好多白斑？
2。封闭采用含3%BSA的TBS封闭了近三个小时。然后一抗过夜，二抗孵育了大概六个小时。用碱性磷酸酶的显色方法按分子克隆做的。显色后的膜竟然与电泳结果相似，甚至可以看到泳道？就像刚转完的膜用丽春红染了一样。

作者: gogo 时间: 2013-9-13 11:52

我转膜的条件是30V（40mA）过夜，最终电流为50－60mA，5％milk 37度封闭2小时，一抗1:5000 37度2小时，二抗1:2000 37度2小时。
现在出现过这样几个问题：
1、在转膜时似乎电流小了点，因为在相关的实验手册上看到，一般转膜过夜的终端电流会达到90mA，而且在转膜结束后发现使用的预染MARKER在膜上只明显显出1－2条带，一般都是低分子量的那几条。其他的（35KD以上）一般都只能在对光情况下看得清楚。老板说MARKER条带不明显可能是转膜时间长扩散所致，另外这样的条件和情况会不会影响转膜的效果？

如果你的系统电流只有这么大建议你转移用下面的方法试试:
30V 3hours 48V－63V 10-14hours (4度转移）
“老板说MARKER条带不明显可能是转膜时间长扩散所致，”
你老板可能说错了，如果是他说的原因，那么小分子的也会扩散掉的。
你可以把做过WB没有结果的膜用CBB染一下看看大分子的蛋白染上去没有

2、在5％milk 37度封闭过程中出现封闭液凝结现象，最夸张的一次在实验平皿底部平整的结一层，在膜上也结了一层。这样会不会造成膜被封的太厉害，1抗都结合不上去？

是否是你的milk里的buffer蒸发了造成的现象，建议用4度加盖子封闭4hours左右。

======================================================================================================

是的，我也觉得会发生蒸发。我上次做成DOT-BOLT的时候就是用4度封闭3小时的。
昨天我又做了转膜，用的是100V，不过电流狂大，起始就有240MA，终端有360MA呢，好像太大了，液体都蛮烫了，真怀疑转的又不好了。

作者: bamboo16 时间: 2013-9-13 11:57

请问用碱性磷酸酯酶标记的二抗，最后显色底物溶液的用量是如何计算的？是根据膜的大小如何换算的吗？
在显色底物溶液中，NBT和BCIP的浓度是多少的？

作者: flower-201 时间: 2013-9-13 11:57

请问：我的裂解液中要用到原钒酸钠，能否用ＰＭＳＦ代替呢？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-13 11:59

谢谢啦，

再请教一个问题，样片加上上样缓冲液100℃加热5min后来不及电泳，怎样保存，可以保存多长时间

作者: gemei0115 时间: 2013-9-13 12:00

求助：
我想用westenblot测定缺氧诱导视网膜色素上皮细胞bFGF的表达，不知应该选用哪种内参照好，请大虾指点，多谢！

作者: daod 时间: 2013-9-13 12:00

你好：我正准备做Western，能得到高手的指点太好了！我要测的TGF-bata1的浓度用ELISA测定只有几百个pg/ml,不知能否得到阳性结果？听说可以将样本浓缩后检测，但不知如何进行，又如何保持各样本浓缩倍数的一致？请指教。

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我正好做这个！我说说我的一点看法！
我的ELISA蛋白包被浓度最低到200pg/ml。OD值达到1.5左右！具体包被浓度需要用方阵滴定来确定。其实我认为做ELISA不需要浓缩，因为其需要（一般的）稀释很多倍！也就是说每次提纯蛋白浓度不同，用方阵滴定来确定（直到你的理想浓度）即可！OK？

作者: lxh031 时间: 2013-9-13 12:01

按膜面积加入0.1ml/cm2的生色底物混合物。在10ml70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5gNBT；在10ml100%的二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP（均有多个厂家可提供NBT和BCIP商品）。10ml碱性磷酸酶缓冲液，加66μl NBT（氮蓝四唑）和33μl BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸），这一生色底物混合液应在30min内使用。

作者: jkobn 时间: 2013-9-13 12:01

如果做17kd的蛋白，用PVDF膜就要小心，建议不要用太剧烈的条件转移。
你可以用28V ，3－5hours试试。

如果确信转移效果良好，（最好在WB后用CBB染一下膜，看看目的范围内的蛋白是否转移的好），而无结果，建议加倍上样量，和用Ecl法

to plglab:
您好！
CBB的配方是什么?染色过程如何?是染的膜吗?我在论坛里找不到确切的答案.
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:02

相关疾病：
白癜风

1。我的蛋白大概80kd，采用半干法转PVDF膜，按0.8mA/cm2衡流转膜2h。转完膜后发现膜上出现好多白斑？
是否是气泡？

2。封闭采用含3%BSA的TBS封闭了近三个小时。然后一抗过夜，二抗孵育了大概六个小时。用碱性磷酸酶的显色方法按分子克隆做的。显色后的膜竟然与电泳结果相似，甚至可以看到泳道？就像刚转完的膜用丽春红染了一样。

出现这样的结果有几个可能。如下：
a 一抗的特异性不好。
B 一抗的稀释度太低了（要多稀释一抗）
C 2抗可以跟抗原直接结合。
D 2抗没有洗干净。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:03

请问用碱性磷酸酯酶标记的二抗，最后显色底物溶液的用量是如何计算的？是根据膜的大小如何换算的吗？可以这么说，你加的底物能够cover膜就可以了。

在显色底物溶液中，NBT和BCIP的浓度是多少的？

见上面网友的帖子

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:03

请问：我的裂解液中要用到原钒酸钠，能否用ＰＭＳＦ代替呢？

可以。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:05

样片加上上样缓冲液100℃加热5min后来不及电泳，怎样保存，可以保存多长时间？

其实可以常温保存，但是建议－20度，我们做一次制备，放到－20度保存了2年都没有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:06

我不知道你说的这个蛋白，不过难道不能用细胞骨架蛋白做内参吗?

作者: NBA 时间: 2013-9-13 12:06

你的说的都是对的，谢谢，但是“文心”问的是几百pg的蛋白量是否可以做出WB的结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 14:53

可以做出来，但是建议选择： HRP ＋ Ecl

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:38

CBB是考马斯亮兰。就是你的染胶的液体就可以了，直接染膜。1－2分钟可以脱色了

作者: ending 时间: 2013-9-13 17:39

2。封闭采用含3%BSA的TBS封闭了近三个小时。然后一抗过夜，二抗孵育了大概六个小时。用碱性磷酸酶的显色方法按分子克隆做的。显色后的膜竟然与电泳结果相似，甚至可以看到泳道？就像刚转完的膜用丽春红染了一样。
出现这样的结果有几个可能。如下：
a 一抗的特异性不好。
B 一抗的稀释度太低了（要多稀释一抗）
C 2抗可以跟抗原直接结合。
D 2抗没有洗干净。

您帮我分析的结果，我又想了一下。一抗是个多克隆抗体按照1:670稀释（不过可能放的有点久了，师兄说刚买回来是粘的，现在不粘了。）一抗是兔抗人的多抗，而二抗是羊抗兔碱性磷酸酶，这样会直接结合吗？还有，二抗孵育完也是用TBS洗膜三次，每次10min呀。我是做western的新手，还望多多帮助，谢谢！

作者: xue258 时间: 2013-9-13 17:40

我近日要做western, 蛋白分子量为53KD,用半干转膜法，请教用多大的电流和时间。谢谢。

作者: standbyme 时间: 2013-9-13 17:40

我做17KD蛋白的WB，湿转28V，5.5小时，转移效果不好，MARKER都没完全转上去。我就用270mA,转了1.5小时，用的是两层膜，结果第二张膜上也有marker，而且还很清楚，用ECL显色没有蛋白条带（两张膜都显）。请问是不是转过了，可我平时作大于20KD的蛋白都是用此条件转膜的。请问作小分子量的蛋白有没有更好的转膜方法？

作者: bluelake 时间: 2013-9-13 17:41

紧急求助！
先谢了！

用Cell Signaling Technology 的磷酸化抗体做Western,做了多次均无条带。三去污提取细胞蛋白质（内含叠氮钠），上样量15~40ug。
1.样品没有条带（一抗1：1000，1：500，1：250，说明书推荐1：1000）
2.阳性对照没有条带
3.Marker（非预染）没有显色
4.显色后的膜漂洗后丽春红s染色有红色条带
5.用下法做ECL发光实验：
（1）同一Ep管内Blocking Buffer（TBST+奶粉，据说明书）1:2000稀释二抗HRP-conjugated secondary antibody, 1：1000稀释三抗HRP-conjugated anti-biotin antibody（据说明书）
（2）置入一0.5cm硝酸纤维膜
（3）5min后取出硝酸纤维膜，滴加ECL，
无荧光

（4）取一1.5cm膜，滴二抗（1ul）、三抗（1ul）、二抗+三抗（1ul+0.5ul）三个印迹
（5）5min后滴加ECL
仍然无荧光

请教：1. 我的ECL发光实验有问题吗？
2. 我的问题到底在哪里——样品？试剂？缓冲体系？

作者: yhz1973 时间: 2013-9-13 17:41

我是新手，问题简单请不要笑。我有两个蛋白，一个32KD，一个14KD，能同时转膜吗？转膜条件如何设定？一抗是不是单抗或多抗都行，浓度如何调节？二抗做ELISA时为1：4000稀释，做WESTERN时应该如何稀释？由于做SDS－PAGE时，蛋白经过煮都已变性，如果抗体是用复性好的蛋白制备的，还能与膜上的蛋白结合吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:41

"我又想了一下。一抗是个多克隆抗体按照1:670稀释（不过可能放的有点久了，师兄说刚买回来是粘的，现在不粘了。）一抗是兔抗人的多抗，而二抗是羊抗兔碱性磷酸酶，这样会直接结合吗？还有，二抗孵育完也是用TBS洗膜三次，每次10min呀。我是做western的新手，还望多多帮助，谢谢！"

???
你可以按照我给你的：

a 一抗的特异性不好。
B 一抗的稀释度太低了（要多稀释一抗）
C 2抗可以跟抗原直接结合。
D 2抗没有洗干净。

按照顺序依次排除，（排在前面的建议出现可能性较大）。剩下的说不定就是你的问题所在。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:42

“我近日要做western, 蛋白分子量为53KD,用半干转膜法，请教用多大的电流和时间”

可以用这个条件试试：
衡流 1.2mA/cm2 60mins-75mins

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:42

“请问作小分子量的蛋白有没有更好的转膜方法？”

有，可以换用PSQ的膜。
即为0.22um的膜。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:43

“我有两个蛋白，一个32KD，一个14KD，能同时转膜吗？转膜条件如何设定？一抗是不是单抗或多抗都行，浓度如何调节？二抗做ELISA时为1：4000稀释，做WESTERN时应该如何稀释？由于做SDS－PAGE时，蛋白经过煮都已变性，如果抗体是用复性好的蛋白制备的，还能与膜上的蛋白结合吗”

一般建议做19kd一下的蛋白都要用特殊的步骤或特殊的膜PSQ。

一抗可以用多抗和单抗都可以。浓度可以按照说明书的推荐来做。

如果Elisa只能做1：4000。那么做WB最少要做1：400，甚至1：200。

“由于做SDS－PAGE时，蛋白经过煮都已变性，如果抗体是用复性好的蛋白制备的，还能与膜上的蛋白结合吗”

能！

作者: wood533 时间: 2013-9-13 17:43

有用western blot 测定过线粒体细胞色素氧化酶(CCO)、琥珀酸脱氢酶（SDH）的大虾么？

不是搞分子生物学的，请指教

作者: =pkchen= 时间: 2013-9-13 17:44

我最近要做WB，实验室只有湿转的设备，不知道湿转的条件。查了书，有的用恒流，有的用恒压。不知到底用什么，及其电压/电流的条件，转膜的时间？多谢指点。

作者: =pkchen= 时间: 2013-9-13 17:48

还有一个问题：如果同一块膜我想同时检测1种以上的蛋白，不知如何进行？我看这边实验室每次只作一种蛋白检测，但听说有地方同时检测几种抗原，不知如何进行？多谢

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-13 17:49

我做Western 膜转的非常清楚，但ECL未显色。
一抗：推荐是1：100---1：400，我用了1：400。
二抗：-20度放置了10个月，原来做其他的Western 出过结果，用的1：1000。
Ecl液2005年到期。
片子未暴光。
请问如何检测二抗是否过期？
一抗二抗效价不同有影响吗？
我要检测的蛋白是酶，是否要特殊处理？
明天我还要做，能尽快回复吗？
谢谢

作者: plaa 时间: 2013-9-13 17:49

我做wetstern也碰到了好多问题，请教高人：
1 我的蓝色的mark（sigma）什么痕迹都没有，还是刚买的，上样量6ul，
2 我的目的蛋白，caspase－3，前体32kd，每次都有结果，18kd的裂解一直都没有
3 76V转膜3～4小时，立春红染色膜上半部很清楚，下1/3很模糊基本没有
4 但考马斯亮蓝染转过的胶，依然存在淡淡的条带
5 我用的三去污的裂解液，文献报到可以出裂解带，不知有没有更好的方法，还是我其他存在问题

作者: kuaizige 时间: 2013-9-13 17:51

我想问一下大家做WB时用的ECL是哪家公司的，有订货的电话号码吗？

作者: ii077345 时间: 2013-9-13 17:51

to joshua:鼎国公司的，挺好用。

021-62837819

作者: ii077345 时间: 2013-9-13 17:51

我用0.22um的硝酸纤维素膜4度转膜过夜，ECL显影仍未出来条带。
我要测的蛋白是caspase的活化形式，分子量为17KD,19KD.有到凋亡后，用流式检测效果很好，我做了它的前体表达量很高，可活化形式怎么也做不出来，请大家帮我分析一下是什么原因。
多谢了！！

作者: windy+++ 时间: 2013-9-13 17:52

你的说的都是对的，谢谢，但是“文心”问的是几百pg的蛋白量是否可以做出WB的结果。

可以做出来，但是建议选择： HRP ＋ Ecl

==========================================================================================================

不好意思！把他的意思搞错了！
我认为：
几百pg的蛋白量跑块胶看一下只要可以看见目的条带就可做出WB的结果。当然这需要你调整一抗与二抗的比例！我建议一抗1：50稀释，二抗1：2500稀释。具体的还要自己摸索！OK？

作者: cocacola 时间: 2013-9-13 17:52

请教：
准备做蛋白杂交，新手，请关照！
WESTERN BLOTTING 中用的抗体选单抗还是多抗，有区别吗？
那种效果好？

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-13 17:53

我想做的是核组蛋白，一直没有好的方法提核蛋白，Western要求的蛋白量很大我总是达不到，能告诉我怎么样查这方面的资料或有什么现成的好方法可以让我试试呢！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-13 17:53

我想请问一下，我转膜后用丽春红染色可以看到条带都转到膜上了，可是做完DAB染色后，膜上所现的条带和丽春红染膜时一样，看不见特异性条带，不知哪出错了，高手帮忙分析一下吧！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-13 17:54

请教：
准备做蛋白杂交，新手，请关照！
WESTERN BLOTTING 中用的抗体选单抗还是多抗，有区别吗？
那种效果好？

我觉得应该选单抗，多抗有时会有非特异性条带，可能会有其他蛋白也与多看起反映

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:54

湿法转移的时候我推荐用衡压，你可以度看看我前面的帖子，里面有说不同的蛋白大小用什么样的转移条件。

“如果同一块膜我想同时检测1种以上的蛋白，不知如何进行？我看这边实验室每次只作一种蛋白检测，但听说有地方同时检测几种抗原，不知如何进行？”

有好几个方法可以做，前提是目的蛋白相差10kd以上。
1 可以根据prestained marker将目的蛋白的附件的膜剪下来，分别跟目的蛋白的抗体孵育就可以了。
2 可以不用剪膜，将整个膜中加复合一抗（同时加2种以上的一抗）孵育。前提是一抗质量好，无杂带。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:55

“我做Western 膜转的非常清楚，但ECL未显色。
一抗：推荐是1：100---1：400，我用了1：400。
二抗：-20度放置了10个月，原来做其他的Western 出过结果，用的1：1000。
Ecl液2005年到期。
片子未暴光。
请问如何检测二抗是否过期？“将2抗取1ul， PBS稀释1000倍，取2ul，在暗室中加入ECL底物200－400ul，看是否发光”
一抗二抗效价不同有影响吗？
我要检测的蛋白是酶，是否要特殊处理？”

可以将1抗稀释到1：100， 2抗做1：200－400再试试，估计就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:55

“1 我的蓝色的mark（sigma）什么痕迹都没有，还是刚买的，上样量6ul，
2 我的目的蛋白，caspase－3，前体32kd，每次都有结果，18kd的裂解一直都没有
3 76V转膜3～4小时，立春红染色膜上半部很清楚，下1/3很模糊基本没有
4 但考马斯亮蓝染转过的胶，依然存在淡淡的条带
5 我用的三去污的裂解液，文献报到可以出裂解带，不知有没有更好的方法，还是我其他存在问题 ”

你的实验步骤问题不大，但是如果你要做18kd及其以下的蛋白最好换用0.22um的膜，其实问题就在于此。如果没有0.22um的膜，你有条件想试着做的话可以这样试试，
15％SDS－page，电泳，在transbuffer 里加20％的甲醇，（最高可以到25％），转移时用28V的电压，先转移3小时，换到36V,再转移3－5小时，，你可以看看是否可以同时做出来18kd的蛋白和30kd的蛋白）

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:56

可以，但是说不定要调整2者直接的比例。
不建议你这么做，不如老老实实的按照步骤做。只多1小时而已

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:56

你用28V，4－6小时转移试试。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:58

不错，你提的建议可以。但是“几百pg的蛋白量跑块胶看一下只要可以看见目的条带就可做出WB的结果。”几百pg的蛋白量跑SDS－page是看不出来的。
：）

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:58

“WESTERN BLOTTING 中用的抗体选单抗还是多抗，有区别吗？”

都可以，
其实做WB用多抗的效果是不差的，我做过很多都不错，不要单纯的迷信单抗，我做过一些单抗的WB也有杂带，有的还很强，所以可以看看厂家的说明，另外看看文献上的推荐，选择自己需要的抗体。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 17:58

“我想请问一下，我转膜后用丽春红染色可以看到条带都转到膜上了，可是做完DAB染色后，膜上所现的条带和丽春红染膜时一样，看不见特异性条带，不知哪出错了，高手帮忙分析一下吧！ ”

你可以看看我前面的帖子，里面有说。可以按照顺序逐一排除。

作者: 49888 时间: 2013-9-13 17:59

我做western是新手，还请您多多指教。我用ECL方法，可是结果不是很好。在胶片的上部背景总是很高，而其它的部位就很好，而且重复性也很好，总是在固定的位置上背景很高，我实在想不出是什么原因，请您帮个忙，指点一下。十分感谢！

作者: 49888 时间: 2013-9-13 17:59

与制胶或是封闭有关系吗？我也弄不清楚究竟是什么原因！

作者: biabiade 时间: 2013-9-13 18:00

我做了两次western，均出现了竖条带。我的样本是菌体沉淀破碎后的蛋白。在加上样缓冲液煮沸10分钟后，用最大转速离心1-2分钟。是否时间太短？我从同一板胶上切下染色的其他泳道的样本和marker都没问题。特此请教。谢谢。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-9-13 18:00

请问：对于用western检测蛋白磷酸化的变化，有什么要特别注意的吗？
比如：裂解液中的成分，需不需要加一些抑制蛋白脱磷酸的成分？
分离胶的浓度，多大的浓度才足以将差别一个磷酸的蛋白分开？
多谢

作者: 薄荷侠 时间: 2013-9-13 18:01

我的工作是将人的基因转入植物中表达,现想做定量,已试过多种抗体,western时总有杂带,且很强,请问这种情况下怎样做ELISA定量,western定量的结果可行吗?能在国外的杂志上发表吗?
ECL化学发光法能定量吗?

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-13 18:02

我想请问一下，cleaved caspase-3（17KD，19KD）总出不来是否与裂解液有关呢？我用的是1XSDS裂解液，而说明书上建议的是chaps extraction buffer,不含SDS。
多谢！

作者: koook5695 时间: 2013-9-13 18:03

我有几个问题感到很困惑
几天前我转了一张膜，立春红染色，膜条带很好，发光什么都没有，没有背景。昨天我又做了一张，立春红染膜，10kd的蛋白都很清楚，发光依然什么都没有，有明显的背景。但是几天前的那张膜我洗了洗，重新孵育二抗居然出来了，两次一样的一抗caspase－3，二抗，但两次mark都没有出来。但前些日子mark，蛋白都有条带。我找不到明显的条件改变，除了我的一抗换了厂家。真的搞不明白为什么，请多多指教!

作者: zhihui小新 时间: 2013-9-13 18:03

我做的是磷酸化抗体。转膜后丽春红染色是有条带的，显影时就什么都没有。我已把所有的液体都换过了。还是不行。请大侠指点。

作者: lxh031 时间: 2013-9-13 18:03

我也在做caspase-3，ECL显色一直没有条带，我想请问一下您做的是caspase-3的前体还是裂解后的，您用的是那个公司的产品？多谢！

作者: 白白的 时间: 2013-9-13 18:04

请问在制备抗体时，两个或多个蛋白的序列相似性达到多少时能够产生交叉反应？有没有一个确定的百分数。谢谢！

作者: yonger 时间: 2013-9-13 18:04

麻烦了，我做相同处理条件下不同时相点心肌组织中hsp90的表达，为何ECL后始终只有两个时相点的条带，其它时相点无条带，难道是提取组织蛋白时蛋白降解了吗？可我考染时对应MARKER的hsp90的条带都很清楚啊，急盼答。谢谢了。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:05

“我用ECL方法，可是结果不是很好。在胶片的上部背景总是很高，而其它的部位就很好，而且重复性也很好，总是在固定的位置上背景很高，我实在想不出是什么原因，请您帮个忙，指点一下。十分感谢！ ”

“与制胶或是封闭有关系吗？我也弄不清楚究竟是什么原因！”

不否是你样品中有些杂质可以跟2抗或底物结合，
或是电泳液没有换，
或同时电泳的其他东西对你的实验有影响，
或滤纸有问题，你检查一下

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:06

是DNA没有打断造成的问题，你可以看我前面的帖子。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:06

对于用western检测蛋白磷酸化的变化，有什么要特别注意的吗？
要加NaF,其他可以参照文献做。

分离胶的浓度，多大的浓度才足以将差别一个磷酸的蛋白分开？
分不开，做不到的。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:07

如果杂带很强，你要确定的是杂带是否对你的实验有影响，另外你这个情况只能做Wb定量，不能做elisa定量。
“能在国外的杂志上发表吗?”我不知道。
Wb能做到的是半定量，ecl显色法也不例外。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:13

“cleaved caspase-3（17KD，19KD）总出不来是否与裂解液有关呢？我用的是1XSDS裂解液，而说明书上建议的是chaps extraction buffer,不含SDS。”

应该不是这个问题，我觉得要么是你目的蛋白含量的问题（可以用5X的SDS提，这样蛋白浓度会高一点），要么是转移的问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:14

to AtCDC5

“请问在制备抗体时，两个或多个蛋白的序列相似性达到多少时能够产生交叉反应？有没有一个确定的百分数。谢谢！”

你所问的这个问题现在没有定论，要具体情况具体分析。甚至要做了以后才知道结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:14

1 是一抗的问题。
2 是底物和2抗的问题。

你可以根据我前面的帖子里说到的东西来排除。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:15

1 提高抗原量
2 提高1抗量
3 提高2抗量

其实我前面的帖子里都有，希望你能看看

作者: one 时间: 2013-9-13 18:15

I detected two preoteins using western blot (one protein is 68KD, and another is actin, which is 42KD) , but I found every protein has two bands, and the two bands are very near( two bands are around 68KD, and the other two bands are around 42KD). The background was clear. I don't know why it happened.
thanks a lot!

作者: bring 时间: 2013-9-13 18:15

我用R&D的caspase－3单抗有条带但没有裂解带，换成santacruz的多抗连前体也作不出来，我也很困惑，希望与你一起进步。
感谢ptglab！

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-13 18:16

你好：
非常佩服你的雷锋精神，我有个问题请教，就是转膜的问题，我一直按照分子克隆的方法，半干法，但我以前也不是很注意，经常剪完滤纸就往缓冲液里一扔，然后铺三明治，这样是不是影响结果，半干的正确操作能否指点一二，把滤纸蘸一下就行了，不能泡吗？
麻烦你真不好意思。

作者: greenbee 时间: 2013-9-13 18:16

我想请问一下
1.蛋白浓度一般达到多少就算比较高了？我的蛋白浓度一般是5-11ug/ul,我用50ug蛋白上样。
2.PSQ膜是指哪种膜？0.22um的硝酸纤维素膜是不是PSQ膜呢？

我用starcruz的多抗倒是能作出前体，现在用的是cell signaling的，只识别裂解带的，怎么也做不出来，郁闷呀。

作者: newway 时间: 2013-9-13 18:16

DAB染色后，膜上所有的条带都出来了，一样深浅，还很清晰。已经封闭过夜了，还有什么办法呢？

作者: bs4665 时间: 2013-9-13 18:17

问一个很菜的问题：
a.为什么跑电泳时溴芬蓝跑不整齐或者溴芬蓝跑得很弥散;
b.为什么经电泳、转膜后，Marker经氨基黑染色后最小分子量的条带没有；样品孔经DAB显色后没有出现条带但将其用氨基黑显色后可看见明显的蛋白条带？

作者: yjf1026 时间: 2013-9-13 18:18

已转到膜上得蛋白会被TBS-T洗掉吗？

作者: XYZQ 时间: 2013-9-13 18:18

我的蛋白是20KD左右，二聚体形式是50KD。
我转膜用的是150mA，2小时。结果膜上没有条带。请问是不是电流过大，时间过长，蛋白转穿了？
应该用多大的电流多少时间合适？谢谢！

作者: TAT 时间: 2013-9-13 18:18

您好，请问如何提高丙烯酰胺凝胶中蛋白质的显影度（浓缩样本蛋白的方法除外），从而使蛋白转膜后显影更清楚一些？

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:19

如果你的beta－actin都是两条带的话，你看看是否是在转移过程中胶和膜之间有滑动，或变形。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:19

你可以这么做，没有问题，我们也是这么做的。
我们将滤纸泡在buffer里3－10mins的，用的时候也没有问题。

当然滤纸的选择也是个关键，选用较厚的滤纸，如biorad公司的

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:20

1.蛋白浓度一般达到多少就算比较高了？我的蛋白浓度一般是5-11ug/ul,我用50ug蛋白上样。
我最多上过150ug/well，但是你的这个蛋白浓度已经很不错了，你可以将总蛋白上到80－100ug试试。

2.PSQ膜是指哪种膜？0.22um的硝酸纤维素膜是不是PSQ膜呢？
PSQ是PVDF膜，是0.22umPVDF膜的商品名，你可以用0.22um的硝酸纤维素膜替代。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:20

可以在下面几个方面改变：
1 一抗浓度
2 2抗浓度
3 抗原量

你最好能参考一下前面的帖子，有不懂的再问

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:21

“已转到膜上得蛋白会被TBS-T洗掉吗？ ”

不会

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:21

我的蛋白是20KD左右，二聚体形式是50KD。
我转膜用的是150mA，2小时。结果膜上没有条带。请问是不是电流过大，时间过长，蛋白转穿了？
应该用多大的电流多少时间合适？谢谢

你是用半干法的吗？
你可以自己检测一下是否是转移过头，转移完了，染一下胶，看目的蛋白是否是转移出来了，再染一下膜，看模上是否含有目的蛋白，这样就可以判断出来了。

不过从你的描述的条件上看很有可能是转移过头了。

建议用这个试试： 0.8mA/cm2 30mins then 1.2mA/cm2 40mins.

作者: H2O 时间: 2013-9-13 18:21

还有一个问题，检测磷酸化蛋白中，NaF是需要用时加，还是可以在配制裂解液时就加进去。
多谢

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:22

“a.为什么跑电泳时溴芬蓝跑不整齐或者溴芬蓝跑得很弥散;
b.为什么经电泳、转膜后，Marker经氨基黑染色后最小分子量的条带没有；样品孔经DAB显色后没有出现条带但将其用氨基黑显色后可看见明显的蛋白条带？ ”
你问的问题前面的帖子里都有，你最好能参考一下前面的帖子，有不懂的地方再问。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:22

请问如何提高丙烯酰胺凝胶中蛋白质的显影度（浓缩样本蛋白的方法除外），从而使蛋白转膜后显影更清楚一些？

1 可以多加一抗，提高一抗的浓度。
2 提高2抗的质量（比较难，要换新的好的2抗）
3 提高转移效率。

作者: lagua123 时间: 2013-9-13 18:23

请问：我的蛋白分子量为5KD左右，应该用百分之几的胶呢？配方为何？因为我查的胶最大为15%，分子量在12---43KD。谢谢啦！

作者: orangecake 时间: 2013-9-13 18:23

郁闷，WESTERN就是没有带
做了好几次，就是没有带。不知道问题出在哪，和我在一起做实验的同学除了一抗和蛋白提取物和我不同外，其他都一样，可人家的带就好好的，我的片子连一个杂带杂点都没有，就象一块光洁透明的玻璃。为了分析没有带的原因，SDS－PAGE跑完后用考马斯亮兰染
色，可见清晰的蛋白带。转膜后，在膜上预染marker也清晰可见。二抗和ECL试剂盒和显色曝光系统肯定也没有问题，因为同时也有人在使用，而且效果不错。
我的主要实验过程：
1制备蛋白质样品
2 蛋白质定量
3电泳开始设为80V恒压，样品前端离开积层胶设为100V恒压
4转膜－湿转100v转印1个半小时左右
5杂交封闭液置于摇床缓慢摇1hr，1：200一抗四度过夜，1：200比例稀释的二抗，摇床上杂交1hr
6ECL反应
将PVDF膜夹于吸水纸中间，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。
将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1min。镊起PVDF膜，夹在吸水纸中间吸去多余液体。
用保鲜膜包好PVDF膜，固定于片夹内，准备曝光。
洗片
裁好底片，大小与膜相当，压片。
显影3min，水中漂洗几次，定影清水冲洗
不知道为什么就是做不出来，ptglab帮助分析一下，先谢谢了

作者: nvdabing 时间: 2013-9-13 18:23

我这个学期只要是做凋亡相关蛋白的Western检测。每次基本都有条带，但是不是背景太高，就是条带很淡，无法使用.
真对条带太淡我以加大了蛋白量，从三瓶细胞增到8瓶；
真对北景太强，我发现新陪的显影和定影液好，可使背景很清晰；
这里我想问几个问题：
1）蛋白提取时都要加PMSF嘛？煮沸后要注射器抽吸多少次？需要200次嘛？储存于－20度，每次使用都要再加 DTT嘛并煮沸嘛？
2）电泳完成看到溴芬蓝涌出凝胶多久就应该终止？是否小的片断容易被电流冲走？（比如十几KD的蛋白）
3）转膜（PVDF）我一般用恒流119mA2－2。5小时，可以嘛？我要检测的蛋白从最大112kd到最小14kd。
4）封闭我一般是3－5％BSA ，RT 1h。
5）一抗我多用1：1000多克隆Ab 4过夜（12－16H）。
6）二抗1：2000 多克隆抗体 RT 2h 或4度12h。
7）ECL，曝光20s，30s，40s，50s, 1m，1.5m。前天重暴一个用到了10m。
请多指教！谢谢！！！

作者: qumm1985 时间: 2013-9-13 18:24

请教高手。我现在做的Western结果让我很郁闷。因为我的目的条带呈现月牙形，且连成一条，加样孔之间的间隔消失。我的蛋白上样量大约为70ug左右，积层胶80V，分离胶100V。目的蛋白分子量30KD。转膜14V，15小时。试剂没有问题。请问高手这是怎么回事？怎样解决？谢谢！

作者: qumm1985 时间: 2013-9-13 18:24

还有我的标本来源是血清，是不是血清中白蛋白的影响。如何去除血清中的白蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:25

"检测磷酸化蛋白中，NaF是需要用时加，还是可以在配制裂解液时就加进去"

用的时候加进去。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:25

“我的蛋白分子量为5KD左右，应该用百分之几的胶呢？配方为何？因为我查的胶最大为15%，分子量在12---43KD。谢谢啦”

5kd 的蛋白做Wb很困难，建议你不要试了。
如非要做的话25％的胶才可以。
用25％的胶，你要配的试剂全都不同，至少要做40％的gel stock ， 5－10X的buffer。
配方我也没有，其实你根据你能查到的配方，改一下就可以了，前提是你能读通配方。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:26

我这个学期只要是做凋亡相关蛋白的Western检测。每次基本都有条带，但是不是背景太高，就是条带很淡，无法使用.
真对条带太淡我以加大了蛋白量，从三瓶细胞增到8瓶；
真对北景太强，我发现新陪的显影和定影液好，可使背景很清晰；
这里我想问几个问题：
1）蛋白提取时都要加PMSF嘛？煮沸后要注射器抽吸多少次？需要200次嘛？储存于－20度，每次使用都要再加 DTT嘛并煮沸嘛？
PMSF是蛋白酶抑制剂，提蛋白时最好加，但是用stop buffer提蛋白时，就不用加了。
我们是用超声波破碎DNA的，你可以感觉到DNA链断了就可以了。
一般提蛋白提好以后，加DTT煮沸后就可以存放－20度，每次用的时候其实不用再加DTT就可以了，我习惯于加热后再上样，当然不用加热也可以。

2）电泳完成看到溴芬蓝涌出凝胶多久就应该终止？是否小的片断容易被电流冲走？（比如十几KD的蛋白）
我们的习惯是溴芬蓝到底部时就停止了，
不是是否小的片断容易被电流冲走，是在转移时容易透过膜。

3）转膜（PVDF）我一般用恒流119mA2－2。5小时，可以嘛？我要检测的蛋白从最大112kd到最小14kd。
转膜条件时根据不同的蛋白大小调整的，你可以根据你的实验条件摸索一下条件。我建议不要用一种条件转移所有的蛋白。

4）封闭我一般是3－5％BSA ，RT 1h。
封闭用5％的milk就可以了（用bSA太浪费了），封闭RT 2hs， or 4度过夜。

5）一抗我多用1：1000多克隆Ab 4过夜（12－16H）。

6）二抗1：2000 多克隆抗体 RT 2h 或4度12h。

7）ECL，曝光20s，30s，40s，50s, 1m，1.5m。前天重暴一个用到了10m。
请多指教！谢谢！！！

如果出不了结果，或是条带不够明显，一抗可以尝试加多一点，用到1:500试试， 2抗RT 1h就够了。
背景强可能时因为一抗，2抗孵育时间太久，或加的太多了。你可以试试调整一下稀释比例。

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:26

你的步骤我仔细看了，的确不好分析，

我问你几个问题：
你的目的蛋白有多大？
细胞中目的蛋白的含量是否多？
另外，你多少个细胞提了多少ul的蛋白？
转移后的膜是否用丽春红染色？（pre-stained的marker比真实的蛋白要容易转）

作者: NBA 时间: 2013-9-13 18:27

“请教高手。我现在做的Western结果让我很郁闷。因为我的目的条带呈现月牙形，且连成一条，加样孔之间的间隔消失。我的蛋白上样量大约为70ug左右，积层胶80V，分离胶100V。目的蛋白分子量30KD。转膜14V，15小时。试剂没有问题。”
你看看上样缓冲液是否有问题，另外在loading buffer里多加一些甘油试试

“还有我的标本来源是血清，是不是血清中白蛋白的影响。如何去除血清中的白蛋白？”
一般用血清蛋白做WB是要去掉里面的高丰度蛋白，如白蛋白，IgG等。
白蛋白可以用蓝色琼脂糖凝胶做，具体的可以到蛋白技术讨论版中的“ 蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持，”里问楼主，就说是我推荐来的，他有办法去掉IgG和白蛋白。

作者: 嗅嗅 时间: 2013-9-14 15:13

请教，许多同学说 protein marker 不准，请问是这样吗？因我做的蛋白有多种异构体形式，所以特别要依赖marker ，您能提供好的解决办法吗？
我做的另一种蛋白，是多克隆抗体，western 结果是除两条清晰的条带外，无任何其它的条带，但又与 marker 不符，您能帮我分析结果吗？谢谢！

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-14 15:14

请教大侠,怎么做定量或半定量western?或者哪里可以获得其参考资料?

作者: niangao1980 时间: 2013-9-14 15:14

如果ECL试剂已过期，用什么方法延长荧光萃灭时间。是否可以加过氧化氢，具体加多少？

作者: niangao1980 时间: 2013-9-14 15:15

NC膜与尼龙膜相比各有优缺点，但转膜时间相差很多。

作者: youyou99 时间: 2013-9-14 15:16

我想请问一下，针对某种细胞的一种蛋白做western 的话，细胞裂解到上样之前都应该做哪些工作，是半定量的，希望看到给药前后该种蛋白量的变化（也就是看western的条带粗细有无变化）。如果要测定总蛋白浓度再上样，一般用什么方法测定好，上样量为多少？盼复！多多感谢！

作者: duoduo 时间: 2013-9-14 15:16

问题一
PVDF膜和硝酸纤维素膜在使用选择上有什么不同？和蛋白的大小有关么？如果400-500KD的蛋白应该选用哪种膜比较好？
问题二
4％和5％的积层胶效果上有什么不同，能否提供4%积层胶的配方？
问题三，
对于400-500KD的大蛋白，做western时应当注意什么？

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-14 15:17

我也需要WESTERN半干转膜的操作PROTOCOL

20KD的蛋白，蛋白浓度是4.65mg/ml，用12%的分离胶合适吗？蛋白提取后不煮沸直接放-20度能放多长时间降解或变性？

作者: okhaha 时间: 2013-9-14 15:17

我想请问一下各位高手，不知道有没人用过amersham的仪器typhoon进行ECL发光的膜进行扫描的，这样就可以不用到暗房用X光片显影、定影一系列的工作的，但我扫了两次，按照说明书上的说明进行扫描参数设置，扫出的图都不象机器软件带的样板清楚，请问有谁知道该具体怎样条那台仪器吗？

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-9-14 15:18

请教大家：
我的目的蛋白是 200KD ,我想问一下半干法转膜的条件，提高转膜效率

作者: avi317 时间: 2013-9-14 15:18

蛋白质用丙酮浓缩沉淀后用裂解液不溶,怎么办?

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:19

请教，许多同学说 protein marker 不准，请问是这样吗？
Protein marker所指示的分子量肯定是准的。

因我做的蛋白有多种异构体形式，所以特别要依赖marker ，您能提供好的解决办法吗？

我做的另一种蛋白，是多克隆抗体，western 结果是除两条清晰的条带外，无任何其它的条带，但又与 marker 不符，您能帮我分析结果吗？谢谢！

如果说跟你预期的分子量不复合，可以看看是否是你的蛋白有什么修饰的问题，另外分子量差异10％都是没有什么问题的，你要多查别人的文献看看分子量实际跑出来是多大

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:19

“请教大侠,怎么做定量或半定量western?或者哪里可以获得其参考资料? ”

可以到google上查，或者到生物期刊上查，你查了有什么不懂的再问我可否？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:19

“如果ECL试剂已过期，用什么方法延长荧光萃灭时间。是否可以加过氧化氢，具体加多少？ ”

这个要看是什么试剂过期了，如果是含有H2O2的过期了，可以通过加H2O2来实现，好像量是0.1%.

如果不是，就没有用了。

作者: qqq111 时间: 2013-9-14 15:20

今天做了一次WB，但结果很奇怪。除了目的蛋白以外，其他很多非特异性条带也能显色。最夸张的就是用来做对照的一个样品居然也差不多所有的条带都能显出色来。可是在之前我做过相同的DOT-BOLT，当时显示这个对照样品是不含有特异性蛋白的。
请问楼主，究竟是哪些步骤或者因素可能造成这样的“奇怪”结果！

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:21

“请教阁下，本人的实验中，非特异条带（在97KD附近）很浓，但是目的条带（20KD）却非常浅。我的一抗是单克隆抗体（1：1000），二抗（1：5000），这是怎么回事？怎样消除非特异条带，增加目的条带的亮度呢？
继续您的指点！万分感谢！”
1 你要确定上面的97kd的带不是你要的目的条带的任何其他的构形，
2 可以看下面的方法是否可行。

还有一个疑问，我的目的蛋白（20KD），用BIO-RED的半干电转仪恒压20伏，15分钟，是不是合适呢？是不是造成电转过度，从而导致目的条带不亮的主要原因呢？谢谢，请予以解答。
可以将转移条件改到 0.8mA-1.2mA/cm2 30－40mins.
其实我前面的帖子里都有说。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:22

"我想请问一下，针对某种细胞的一种蛋白做western 的话，细胞裂解到上样之前都应该做哪些工作，是半定量的，希望看到给药前后该种蛋白量的变化（也就是看western的条带粗细有无变化）。
只要做好做WB的普通的工作就可以了，没有什么特殊的，一定要做蛋白定量。

如果要测定总蛋白浓度再上样，一般用什么方法测定好，上样量为多少？"

可否查看站里的帖子，里面有说。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:22

问题一
PVDF膜和硝酸纤维素膜在使用选择上有什么不同？
没有什么不同，建议用PVDF。
和蛋白的大小有关么？
没有关系
如果400-500KD的蛋白应该选用哪种膜比较好？
一定要做的话，建议用PVDF

问题二
4％和5％的积层胶效果上有什么不同，能否提供4%积层胶的配方？
可以将5％的积层胶通过变化就可以得到4％，提示减少gel 的量，提高水的量。

问题三，
对于400-500KD的大蛋白，做western时应当注意什么？
这么大的蛋白做Wb很难做，要选用合适的胶浓度，要摸索合适的转移条件，要找到相应的protein Marker，（我所知道找不到）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:22

“能不能发给我一份WESTERN半干转膜的操作PROTOCOL!!”

可否自己找一下呢，站里有，另外不是我不给你，是给你也没有什么用，我的步骤是适合我的实验条件（设备和试剂），另外找资料也是实验的一个很重要的部分。

（上面的话已经发过很多遍了，希望新做WB的能自己多查点资料，其实只要看过本站的帖子的站友，基本上都不用问什么问题了，该出现的问题都出现了。）
另外我paste上来比我打这么多字方便多了，希望大家还是能自己查查资料，摸索一下条件。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:23

“20KD的蛋白，蛋白浓度是4.65mg/ml，用12%的分离胶合适吗？
合适

蛋白提取后不煮沸直接放-20度能放多长时间降解或变性？”

要看情况而定，不能一统的说，不管怎样，建议提取蛋白后马上加loading buffer煮沸

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:24

“我的目的蛋白是 200KD ,我想问一下半干法转膜的条件，提高转膜效率”

看我前面的帖子里，有说过。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:24

可以将SDS的浓度提高到2％

作者: 04906 时间: 2013-9-14 15:25

可我的裂解液中SDS浓度为10%

作者: TAT 时间: 2013-9-14 15:25

紧急求助:
都说nf-kbp65好做，可我做了好几次都没结果，不知是不是制样有问题？我用的是全细胞裂解液（三去污），难道核蛋白的提取一定要用专用的细胞裂解液？
核蛋白该用什麽定量呢？Actin是不行的？
盼答复！不胜感谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:25

可以用sds 含量高于5％的buffer提蛋白，我们做过效果很好，而且这个的WB很好做。

裂解buffer 你也可以用我前面贴子里的stop buffer.

作者: TAT 时间: 2013-9-14 15:26

我们做铝致神经细胞凋亡中的 caspase3 , NF-κB, Cyt-C蛋白的表达用western blot，请问一下，需不需要用β-actin, 在哪里能买到它，多谢

作者: ALALA 时间: 2013-9-14 15:26

我查阅了相关文献，5KD的分子量的基因也有不少人做WESTERN BLOTTING，有人用12%的胶，也有人用15%的胶，他们也都做出结果了，真纳闷，

还是国外的。郁闷，上哪找25%的胶的配方啊？

作者: uuooii 时间: 2013-9-14 15:27

请教NBA：
我要测得目的蛋白分别60kd、 57kd 、40kd，三个抗体都是羊抗的，我所能找到的β-actin只有42 和43kd的。请问在同一泳道里43kd的能与40kd 的分开吗？或您能知道那家公司有较合适大小的β-actin吗？
我这三个目的蛋白都用12%的胶合适吗？

作者: gogo 时间: 2013-9-14 15:27

请教一个关于湿转的问题。以前做湿转时，用的是biorad的系统，转的是7*7的小胶，转膜buffer为: Glycine 39 mM ，Tris-base 48 mM ,methanol 20% ，转膜条件为恒流200mA 2h30min。
现在需做15*15cm胶的转膜，用的是amersham的TE62。请问转大胶时，我是否要增大转膜电流，延长转膜时间？transfer buffer 的配方是否要改变？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-9-14 15:27

你在抗体孵育时不用塑料袋封装，用的是什么容器，怎样才能既节省抗体又方便操作呢？

作者: pencil菲 时间: 2013-9-14 15:28

我想请教一点：以后想做Western的组织标本例如肝组织在做之前需要做什么处理吗？例如清洗一下，因为肝组织含血太多，还是直接取出后就放入液氮，谢谢，我比较急，你能快点告诉我吗？

作者: #问号# 时间: 2013-9-14 15:28

请问，抗survivin的一抗用什么产品好些？二抗用什么较好，哪个公司的产品好些？

作者: any333 时间: 2013-9-14 15:28

请问高手，我要做WB，蛋白是大小两个亚基，一抗购买是要两个亚基和在一起好，还是只要其中一个亚基的抗体就行了，有人说蛋白变性后如果用两个亚基和在一起的抗体要求精确度高，我该选哪个？感谢。

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-14 15:29

请问高手：
我在做Western的时候碰到了一些问题。我要检测的蛋白是分泌型蛋白，60KD。我用RIPA裂解细胞，提蛋白，蛋白浓度为5－6ug/ul。上样50ug，分离胶10％。电泳和转膜用Bi-rad mini。转膜350mA,1.5-2h.转膜后丽春红染色，条带清楚。一抗和二抗都是chemicon公司（新的）的，一抗1：750，二抗1：1000，ECL发光。但只是在开始时做出过两次阳性条带，后来就一直没做出来。抗体说明书建议用BSA封闭，但我用BSA封闭一直出现“转膜”条带，就是有很多条带，背景也很深。用脱脂奶粉封闭，则是白板，或没有条带有背景。我的样品做别人的抗体，没问题，说明系统没问题。后又买了santa cruz的抗体，但是做了几次，一直白板，一抗试过1：100，1：200，1：500、二抗1：1000。二抗为1：500时有背景。实在是不知道问题所在，希望得到指点，谢谢！！

作者: 131415 时间: 2013-9-14 15:29

1 转膜后丽春红染色发现在β-actin前方小分子区域有均匀雾状染色,Why?
2 电泳时发现溴酚蓝越跑越宽,转膜染色后发现蛋白条带与溴酚蓝电泳不同步.蛋白条带有效距离短，约为溴酚蓝的二分之一。
3 电泳时发现电流强度小且下降速度快。电流强度开始为15mA/80V,后为9-10mA/80V.
4 浓缩胶与分离胶交界处溴酚蓝界面宽。
问题较多，急盼给予解答，谢谢！

作者: 131415 时间: 2013-9-14 15:29

我已做了几个月的WB,一直以来比较顺,条带也比较漂亮。可是二个月前因丙烯酰胺和Tris-HCl用完，换用另一家公司试剂后发现电泳时电流很不正常，下降特别快，另外电泳速度变快，原先电泳须五个小时（浓缩胶一个半小时，分离胶三个半小时），现在全程三个小时就到底了，转膜后丽春红染色发现条带没分开，而且小分子量蛋白成了一片均匀的红染，其余试剂及操作同前，但没再出现条带。换回原先厂家试剂还是无济于事，折腾了两个月，真是身心俱疲。盼高手给予指导。不胜感谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:30

"我们做铝致神经细胞凋亡中的 caspase3 , NF-κB, Cyt-C蛋白的表达用western blot，请问一下，需不需要用β-actin, 在哪里能买到它，"

需不需要做内参是实验和文章决定的，如果需要做的化可以买sigma的actin，不错。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:30

我的蛋白分子量为5KD左右，应该用百分之几的胶呢？配方为何？因为我查的胶最大为15%，分子量在12---43KD。谢谢啦”

5kd 的蛋白做Wb很困难，建议你不要试了。
如非要做的话25％的胶才可以。
用25％的胶，你要配的试剂全都不同，至少要做40％的gel stock ， 5－10X的buffer。
配方我也没有，其实你根据你能查到的配方，改一下就可以了，前提是你能读通配方。

"我查阅了相关文献，5KD的分子量的基因也有不少人做WESTERN BLOTTING，有人用12%的胶，也有人用15%的胶，他们也都做出结果了，真纳闷，还是国外的。郁闷，上哪找25%的胶的配方啊？"

肯定不能用12％和15％的做5kd的WB，配方可以看下面的提示。
其实你根据你能查到的配方，改一下就可以了，前提是你能读通，读懂配方。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:31

我要测得目的蛋白分别60kd、 57kd 、40kd，三个抗体都是羊抗的，我所能找到的β-actin只有42 和43kd的。请问在同一泳道里43kd的能与40kd 的分开吗？或您能知道那家公司有较合适大小的β-actin吗？
我这三个目的蛋白都用12%的胶合适吗？
1 所有β-actin都是一样大的，42或43kd，
2 如果选用11％的胶是可以区分的开这3个蛋白的

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:31

请教一个关于湿转的问题。以前做湿转时，用的是biorad的系统，转的是7*7的小胶，转膜buffer为: Glycine 39 mM ，Tris-base 48 mM ,methanol 20% ，转膜条件为恒流200mA 2h30min。
现在需做15*15cm胶的转膜，用的是amersham的TE62。请问转大胶时，我是否要增大转膜电流，延长转膜时间？transfer buffer 的配方是否要改变”

如果做湿法转移建议用衡压，这样膜的大小改变是不会影响转膜条件的，
如果你有现成的条件，你可以看看相应的电压是多大的，可以调到一样的电压试试转移条件。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:32

你在抗体孵育时不用塑料袋封装，用的是什么容器，怎样才能既节省抗体又方便操作呢？ ”

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可以用培养皿或者方的平底塑料盒（超市里可以买到）。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:32

“以后想做Western的组织标本例如肝组织在做之前需要做什么处理吗？例如清洗一下，因为肝组织含血太多，还是直接取出后就放入液氮，谢谢，我比较急，你能快点告诉我吗？ ”

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需要用冰的PBS将组织中的血尽量的冲洗干净，再制样或放入液氮。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:33

我不清楚你这个蛋白的性质，如果是在制样过程中（一直到loading）这两个亚基都是不会分开的，那么就是可以只买一个抗体就可以了，没有必要买2个抗体，
如果分开就买2个抗体

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:33

“请问高手：
我在做Western的时候碰到了一些问题。我要检测的蛋白是分泌型蛋白，60KD。我用RIPA裂解细胞，提蛋白，蛋白浓度为5－6ug/ul。上样50ug，分离胶10％。电泳和转膜用Bi-rad mini。转膜350mA,1.5-2h.转膜后丽春红染色，条带清楚。一抗和二抗都是chemicon公司（新的）的，一抗1：750，二抗1：1000，ECL发光。但只是在开始时做出过两次阳性条带，后来就一直没做出来。抗体说明书建议用BSA封闭，但我用BSA封闭一直出现“转膜”条带，就是有很多条带，背景也很深。用脱脂奶粉封闭，则是白板，或没有条带有背景。我的样品做别人的抗体，没问题，说明系统没问题。后又买了santa cruz的抗体，但是做了几次，一直白板，一抗试过1：100，1：200，1：500、二抗1：1000。二抗为1：500时有背景。实在是不知道问题所在，希望得到指点，谢谢！！”

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你可以试试用chemicon公司的抗体，1：300，用3％牛奶封闭，试试，
如果没有条带可以用chemicon公司的抗体1：1200－2000， 1％bsa封闭，看是否还是出现电泳状条纹。

另外看看2抗是否有问题，让别人给你测测。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:35

1 转膜后丽春红染色发现在β-actin前方小分子区域有均匀雾状染色,Why?

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没有见过这个现象，你是否是每次都出现这个问题？如果是不能重复的问题就不用去追究了
剩下几个问题可以看看下面的解答
a 看几个buffer的PH是否正确，
b 看是running buffer总中加了SDS
c 看样品的盐浓度是否太高或太低？

作者: vera+ 时间: 2013-9-14 15:35

我刚刚在我的上一贴对我的情况做了补充说明，可惜是在您答复之后了。第一个现象正常情况下没有出现，是更换试剂后才出现的，所以我不得不追究。在出现问题后，我非常注意几个buffer的PH值，应该没问题。电泳缓冲液我的配方如下：Tris碱9克，甘氨酸43.2克，SDS 3克，用去离子水稀释至600ml，为5×贮存液。使用时用去离子水稀释成1×。另外，我的细胞是用1×SDS凝胶加样缓冲液+1μg/ml aprotinin、100μg/ml PMSF裂解，2×配方如下：100mmol/L Tris-Hcl(PH6.8) 4%SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油。在煮之前加上200mmol/L DTT，不知是否存在盐浓度太高或太低？盼答复！谢谢！

作者: wu11998866 时间: 2013-9-14 15:36

请问哪有western专用提核蛋白的细胞裂解液出售？
请问：转膜后丽春红染色显示溴酚蓝条带颜色很深，但蛋白条带很淡，是否因为蛋白太少导致？
谢谢！

作者: feima+ 时间: 2013-9-14 15:36

我一直想打听关于427KD分子量的western好不好做？听说我师兄几个月都没做出来，最后不得放弃了，请问在我做之前要做什么特殊准备工作？以后可以多向你请教了，太好了！
谢谢！

作者: shanzhapia696 时间: 2013-9-14 15:36

我做western已经快2个月了，但是一直没有很好的结果，有以下几个问题，麻烦您解答：
1）有几个一抗一直做不出来，是不是有一种点杂交的方法，可以直接把蛋白点在膜上，和一抗、二抗反应？
能具体告诉我做法么？

2）我的目标蛋白有四种，两种是核蛋白（CREB和磷酸化的CREB）以及两种胞浆蛋白，因此我用了RIPA buffer
提取总蛋白，蛋白酶抑制剂只用了1mM PMSF,1mM NaF,Na3VO4以及 EDTA。请问这样可以么？

3）磷酸化的CREB抗体是从sigma公司定的，可是一直没有出结果，还有一种胞浆蛋白也没有出结果。但是同一张膜上b－actin有很好的结果，我转膜用的是bio－rad的mini湿转，冰浴，100V,60min，我看了电流，大概在250
mA到500mA之间，一抗4℃过夜，二抗室温1小时，TBST为0.07%TWEEN20。请问，湿转时横流好，还是横压好？有的师兄用的是100V，90min，时间该如何确定？我的目标蛋白分子量为40-70KD.

4)用的MARKER应该有六条带(分子量最大为118，最小为26和20），同实验室的人用12％的胶可以都跑出来，而用10％的胶只能跑出5条，请问是不是最小分子量的没有出来？

作者: daod 时间: 2013-9-14 15:37

我的实验蛋白是转染后的细胞总蛋白（用BCA测过浓度，WB总上样量约120微克）
我的目标蛋白35KD（细胞内源性表达）和15KD（转染的质粒表达）的2条带，能被同一一抗识别。
跑胶：15%SDS-PAGE 分离胶（先10mA恒流，后20mA恒流）
电转：100V， 1.5小时，冰浴 PVDF湿转
封闭：5%脱脂牛奶（4度过夜）
一抗：多抗，（室温，2小时）（5%牛奶稀释）
二抗：室温，2小时（5%牛奶稀释）
显影：PIECE 的SuperSignal® 系列

结果：转染的细胞什么条带都没有（内源性的35KD和外源质粒表达的15KD的带都没有），而未转染的细胞显示一条27KD左右的带，看上去特异性还不错。
marker条带：175 83 62 48 33 25 17 7共8条带，都能分得很清楚。但电转后PVDF膜上7KD的带往往很淡。
立春红染色细胞总蛋白条带就特别少。但当时没想到用考马斯亮蓝染一下胶看一下有没有目标条带。转染和WB都已经重复过一次了，结果都这样
我不知道是我转染细胞这一步还是WB有问题。
想请你看一下WB有没有问题。

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-14 15:37

太谢谢你了，照你的建议，我做出了血浆中的蛋白条带。这让我在黑暗中看到了曙光。但是奇怪的是检测细胞总细胞样品中却没有。蛋白样品做别的抗体出条带。那这是不是因为我检测的是分泌型的蛋白，所以细胞总蛋白里就没有我的蛋白了。可是我的师兄做免疫组化时在细胞中检测到了这个蛋白的呀。还有一个问题，我用santacruz的一抗 1：100，1：200，1：500都不能做出条带，（二抗没问题），连血浆标本也没有条带，这是不是可以认为这个一抗有问题呀？
谢谢你！！

作者: youyou99 时间: 2013-9-14 15:38

我用BI0-RAD的电泳和转膜仪，用国产普通超滤滤纸转膜，但就是转不上去，难道一定要用BI0-RAD的原配滤纸吗？

靠，BI0-RAD真TMD狠，一张滤纸要接近10刀。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:38

你光看纸上的buffer 配方是没有用的，你如果可能重新配一遍，或重新购买试剂看看有改善否？
你的buffer如果没有问题，就不会出现你所说的“转膜后丽春红染色发现在β-actin前方小分子区域有均匀雾状染色,”现象了
另外你看你的gel stock是否有问题，
建议你查查你的试剂，看看什么地方是否出了问题，

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:38

可以看我帖子里的stop buffer的配方，可以用来提核蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:39

"我一直想打听关于427KD分子量的western好不好做？听说我师兄几个月都没做出来，最后不得放弃了，请问在我做之前要做什么特殊准备工作？"

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如果做300kd以上的蛋白的Wb，都不好做，但是只要做的多，也都做的出来的，没有什么特别难的地方，就是在电泳和转移条件上要掌握好。

如果你要做，最好是从现在开始就做WB，熟悉其过程，这样才能做的好。特殊的准备工作都没有。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:40

1 ”有几个一抗一直做不出来，是不是有一种点杂交的方法，可以直接把蛋白点在膜上，和一抗、二抗反应？
能具体告诉我做法么？“
可以做Dot blot来检测，大致步骤是：
1 将蛋白点在膜上，要不断的，在同一个地方点上蛋白，重复7－10次（膜的处理跟WB一样）
2 封闭，
3 后面跟WB一样。

2 ” 我的目标蛋白有四种，两种是核蛋白（CREB和磷酸化的CREB）以及两种胞浆蛋白，因此我用了RIPA buffer
提取总蛋白，蛋白酶抑制剂只用了1mM PMSF,1mM NaF,Na3VO4以及 EDTA。请问这样可以么？“
问题可能就在这里，RIPA好像是不能提核蛋白的，你要换stop buffer提总蛋白，配方你可以在我的帖子里找到
蛋白酶抑制剂没有问题。
另外，你另一个胞浆蛋白做不出来，有可能是制样制的太稀了（说不定这个蛋白本身的含量就很低，）如果你能加大一倍以上的上样量，或重新制备样本再试试

3 ”磷酸化的CREB抗体是从sigma公司定的，可是一直没有出结果，还有一种胞浆蛋白也没有出结果。但是同一张膜上b－actin有很好的结果，我转膜用的是bio－rad的mini湿转，冰浴，100V,60min，我看了电流，大概在250
mA到500mA之间，一抗4℃过夜，二抗室温1小时，TBST为0.0720。请问，湿转时横流好，还是横压好？有的师兄用的是100V，90min，时间该如何确定？我的目标蛋白分子量为40-70KD.”

湿法转移最好是衡压，你做的是对的，你这个条件比较适合快速的转移。也用喜欢用低电压长时间的。

4 “用的MARKER应该有六条带，同实验室的人用12％的胶可以都跑出来，而用10％的胶只能跑出5条，请问是不是最小分子量的没有出来？”

没错，10％的胶应该分不开24kd一下的条带，它们都跑到一起去了。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:40

我看了你的信，几个问题你要去查清楚，

1 你的目的蛋白是推算出来是35kd还是实验出来是35kd（有别人的paper证明）？
2 你的一抗用的时候是否加了阳性对照？
3 你可以看你的一抗说明上是否有WB图，也可以向一抗公司索取，你看看2者的分子量是否一致（27kd左右）
4 你是否染膜看了15kd左右的蛋白是否转移上去了（不是marker,marker比一般的蛋白好转）？如果你用的PVDF膜（0.45um)的，是很难检测出15kd大小的蛋白的。

从你的实验步骤上看，估计是15kd的带你无法做出WB的结果，而且27kd的带很可能就是你的目的带，

不过你要自己查一下，跟具上面的排除掉一些可能

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:40

“我用santacruz的一抗 1：100，1：200，1：500都不能做出条带，（二抗没问题），连血浆标本也没有条带，这是不是可以认为这个一抗有问题呀？”

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如果你能找到阳性的标本，做出来的结果也是空的话，是可以认为这个抗体不work.

细胞做不出来看是否是：
1 目的蛋白量很少，WB检测不出来，
可以提高上样量，或重新制备样本，做更高浓度的蛋白样品。

2 是否是ihc是假阳性结果？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:41

“我用BI0-RAD的电泳和转膜仪，用国产普通超滤滤纸转膜，但就是转不上去，难道一定要用BI0-RAD的原配滤纸吗？。”

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最好买biorad的，其他几个进口的滤纸如3M的也能用“

作者: zhezhe 时间: 2013-9-14 15:41

我想请教一个问题，我做WB的背景总是特别脏，可我洗的时间和次数都不少呀。我用的是TBS+TWEEN-20(0.5%),洗五次以上一个半小时。封闭用的是5％牛奶＋TBS+0.1%Tween20一小时。一抗1：1000。二抗1：4000。谢谢

作者: fei1226com 时间: 2013-9-14 15:42

我有几个问题：
1。我用的一抗是人血清1：50稀释，二抗三抗加了生物素放大，最后ECL发光，为什么背景总是不干净，我用的膜很大，15*20厘米，有时候膜上就象画了一棵枝杈纵横的大树。但是我不加一抗后，只用二抗三抗背景就特别干净，请问是什么原因？
2。我这张大膜转膜应该用多大的电压，多长时间呢？

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 15:42

我的目的蛋白分子量为28KD，actin为43KD，电泳及转膜采用bio-rad公司产品。做了20几次WB，结果不稳定。

请教：
1、电泳加样缓冲液用6x或2x应该对结果无影响，对吗？

2、bio-rad产品说明书上介绍的转膜缓冲液，一种为Tris-gly系统，另一种为碳酸钠缓冲液，请问这两种哪一种效果好？

3、转膜时要不要加甲醇，若加，请问加多少？

4、转膜条件为湿转100v，1.5h与36v，3h，哪一种效果好？

作者: uaubc 时间: 2013-9-14 15:42

我查了一下，用的是amersham 的0.45um的PVDF (Hybond-P), 但网站上说可以小到2KD，且Hybond-P系列只有一种孔径。
另外Hybond-Ecl 系列有0.2um 的
我不知道是怎么回事

作者: greenbee 时间: 2013-9-14 15:43

用石蜡固定的组织作western blot 可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:43

"我想请教一个问题，我做WB的背景总是特别脏，可我洗的时间和次数都不少呀。我用的是TBS+TWEEN-20(0.5%),洗五次以上一个半小时。封闭用的是5％牛奶＋TBS+0.1%Tween20一小时。一抗1：1000。二抗1：4000。谢谢"
你可以看看下面几个方面是否有问题：
1 你孵育一抗，2抗时是否加了milk，如果没有加请加5％的milk?
2 一抗稀释多一些（做到1：2000，or 3000）
3 电泳和transferbuffer是否是新的？
4 转移用的滤纸是否是新的？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:43

1。我用的一抗是人血清1：50稀释，二抗三抗加了生物素放大，最后ECL发光，为什么背景总是不干净，我用的膜很大，15*20厘米，有时候膜上就象画了一棵枝杈纵横的大树。但是我不加一抗后，只用二抗三抗背景就特别干净，请问是什么原因？
1 你孵育一抗，如果没有加请加5％的milk。
2 一抗稀释多一些（做到1：100，or 200）
3 电泳和transferbuffer是否是新的？
4 转移用的滤纸是否是新的？

2。我这张大膜转膜应该用多大的电压，多长时间呢？
半干法转移的话，可以看我前面的帖子，里面有说，
湿法转移的条件是跟小膜没有什么区别的。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:44

1、电泳加样缓冲液用6x或2x应该对结果无影响，对吗？
如果加上样buffer前的样品的量是一致的，则无影响。

2、bio-rad产品说明书上介绍的转膜缓冲液，一种为Tris-gly系统，另一种为碳酸钠缓冲液，请问这两种哪一种效果好？
我们习惯用tris-gly,建议你也使用这个系统

3、转膜时要不要加甲醇，若加，请问加多少？
你的实验时最好加，10％－20％的甲醇

4、转膜条件为湿转100v，1.5h与36v，3h，哪一种效果好？
我们习惯于低电压长时间，如果是你的实验的话， 28kd和43kd，我建议用36V，4－8小时

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:44

“我查了一下，用的是amersham 的0.45um的PVDF (Hybond-P), 但网站上说可以小到2KD，且Hybond-P系列只有一种孔径。
另外Hybond-Ecl 系列有0.2um 的
我不知道是怎么回事 ”

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如果是0.45的膜，millipo公司的说明书上说最低到10kd，但是同时有说，如果分子量低于20kd就不建议用0.45um的膜了，建议用PSQ的膜，我们实际做的也一样，最低用0.45um做过15kd的蛋白，但是转移条件很苛刻，不好重复，一般做到18kd就最低了，

作者: kuaizige 时间: 2013-9-14 15:45

我做western blot 是主要是要能拿出梯度，结果做来做去都不行。
测蛋白浓度老是负值，已经在不同的仪器上用不同的标本都试过了，不知是怎么回事？
我是用裂解液稀释50倍后做对照，各个蛋白同样稀释50倍后测的。
我转膜都是用400mA，恒流，2小时，用丽春红染色是有条带的，可是有时最后还是会没有结果，狂郁闷！！（用0.75的梳子，10ul蛋白+10ul 2*上样buffer 100度煮10分钟）
请给予指导，多谢！！

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-14 15:45

做了好几次WB（检测Nf－kb），丽春红染色都只在溴酚蓝附近有条带，其他蛋白带很淡，显影（ECL法）后就啥也没有，难道所提蛋白量太少？我已用了3种提蛋白的配方（都经过证实有效），可我就做不出结果，难道配方都不适合？
我准备按你提供的方法5Xstopbuffer试试，但有点问题：
1. 20％的甘油是用去离子水配的?
2. ph6.7 是对250mM tris-base的要求，还是指整个buffer?
3. buffer中要不要加蛋白酶抑制剂？加多少？
急盼！谢谢！

作者: guagua 时间: 2013-9-14 15:45

看到你的消息让我兴奋不已，我已连续做了3个星期的Western了，没有结果啊！我表达了GST融合蛋白，SDS-PAGE可见目的条带，可是在w时，我的抗GST一抗1：500稀释，二抗1：1000稀释，只有许多非特异条带而没有目的条带，如果一抗1：1000，二抗1：2000，则是白片，转膜都是好的，那么问题出在哪呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:46

"测蛋白浓度老是负值，已经在不同的仪器上用不同的标本都试过了，不知是怎么回事？“

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可能是你的裂解液里的PH，或某种成分会影响你的检测，你可以换几种buffer测一下会好一点。

我转膜都是用400mA，恒流，2小时，用丽春红染色是有条带的，可是有时最后还是会没有结果，狂郁闷！！（用0.75的梳子，10ul蛋白+10ul 2*上样buffer 100度煮10分钟）"
目的蛋白的分子量多大？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:46

1 1. 20％的甘油是用去离子水配的?
是的

2. ph6.7 是对250mM tris-base的要求，还是指整个buffer?
整个buffer

3. buffer中要不要加蛋白酶抑制剂？加多少？
不要加

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:47

”我已连续做了3个星期的Western了，没有结果啊！我表达了GST融合蛋白，SDS-PAGE可见目的条带，可是在w时，我的抗GST一抗1：500稀释，二抗1：1000稀释，只有许多非特异条带而没有目的条带，如果一抗1：1000，二抗1：2000，则是白片，转膜都是好的，那么问题出在哪呢？ ”

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1 GST抗体是否验证过？
2 做这一步时是否加了5％milk 一起孵育。 “抗GST一抗1：500稀释，二抗1：1000稀释，只有许多非特异条带而没有目的条带”。
3 另外，是否特异条带一直没有出来，1：200都没有出目的条带吗？
4 是否是可以用1;1000的一抗和1：1000的2抗试过吗？

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-14 15:47

您好！谢谢您无私地帮助，让我重新找到了希望！
今天我配完stopbuffer后（液体是清亮的，少许杂质）放在4度保存，但从冰箱拿出摇一摇后，发现液体变成奶白色（这种现象正常吗？），但按步骤做完离心后，上层液体还是清亮的。这一过程正常吗？
再次感谢您！

作者: superboy 时间: 2013-9-14 15:48

"我想请教一个问题，我做WB的背景总是特别脏，可我洗的时间和次数都不少呀。我用的是TBS+TWEEN-20(0.5%),洗五次以上一个半小时。封闭用的是5％牛奶＋TBS+0.1%Tween20一小时。一抗1：1000。二抗1：4000。谢谢"
你可以看看下面几个方面是否有问题：
1 你孵育一抗，2抗时是否加了milk，如果没有加请加5％的milk?
2 一抗稀释多一些（做到1：2000，or 3000）
3 电泳和transferbuffer是否是新的？
4 转移用的滤纸是否是新的？

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谢谢你的解答,我上次是用的别人的号上的，这个是我自己的号。
1 我孵一抗时用了5％的牛奶＋TBS，二抗时直接用的TBS
2. 电泳和转膜用的buffer均是新的
3.转移用的滤纸不是新的，但是实验室其它人用的好像还好嘛，这个也有影响吗，原理在哪里呢？

另外还有个问题，参考文献和书上裂解液配方中Tris后面的括号中标的PH值是指Tris的PH值还是整个裂解液的PH值，我请教了很多人，都不是很清楚，有的这样说有的那样说，我觉得应该是Tris的PH值，可是我看你的帖子好像说是整个buffer的PH值，你能确定吗？要是那样的话为什么PH值都是标在Tris的后面？

再次谢谢你的帮助。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:48

配stop buffer如果出现沉淀，是sds析出的结果，不是其他的问题。加热一下就好了

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:48

“谢谢你的解答,我上次是用的别人的号上的，这个是我自己的号。
1 我孵一抗时用了5％的牛奶＋TBS，二抗时直接用的TBS
你是否可以改成2抗1：1000，加5％milk同时孵育。

2. 电泳和转膜用的buffer均是新的
3.转移用的滤纸不是新的，但是实验室其它人用的好像还好嘛，这个也有影响吗，原理在哪里呢？”
我们在用半干法转移时如果滤纸用久了，会出现背景深的现象。我们认为是滤纸被污染以后有，在电场和buffer作用下可能会污染膜，

另外还有个问题，参考文献和书上裂解液配方中Tris后面的括号中标的PH值是指Tris的PH值还是整个裂解液的PH值，我请教了很多人，都不是很清楚，有的这样说有的那样说，我觉得应该是Tris的PH值，可是我看你的帖子好像说是整个buffer的PH值，你能确定吗？要是那样的话为什么PH值都是标在Tris的后面？
那可能是我写错地方了，是整个buffer的PH值，没有问题

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-14 15:49

求助]western-基质金属蛋白酶mmp3
急急急！

请教：

我拟用western blot 定量检测基质金属蛋白酶（mmp3)。有人建议对此蛋白不进行变性处理，从而与抗体结合。1）此种说法是否正确？2）对于mmp3的检测，western过程是否有其特异性（与其他蛋白质相比，实验步骤还有其它变化吗？）

作者: nn255 时间: 2013-9-14 15:49

我想请教一下，如果用WESTERN 检测转录因子NFkB 和E2F-1的活化表达，需要提取磷酸化的蛋白，那么应该选用什么样的细胞裂解液呢？

作者: @花开花落@ 时间: 2013-9-14 15:49

我从华美买的0.22孔径的PVDF膜，可是他们没有给我说明书，请问这个孔径的能做42KD的蛋白吗？

另外，我看到有用0.22孔径的PVDF膜做蛋白测序的，说明书上也写着适合做蛋白测序，我想知道这是不是一种膜，还是另外的一种PVDF膜？

作者: DNA 时间: 2013-9-14 15:50

我转膜都是用400mA，恒流，2小时，用丽春红染色是有条带的，可是有时最后还是会没有结果，狂郁闷！！（用0.75的梳子，10ul蛋白+10ul 2*上样buffer 100度煮10分钟）"

目的蛋白的分子量多大？

我的蛋白分子量有20KD, 185KD.235KD这样三个

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 15:50

在检查了各种试剂及配方后发现我的电泳缓冲液配方与分子克隆第二版的配方有差别,主要是甘氨酸含量偏低（我以前用的缓冲液是我师兄配的，近两个月是我自已配）,在改用其配方后电泳基本正常,转膜后丽春红染色条带清晰,可是一抗、二抗孵育后，点上luminol显影时胶片曝光没有出现条带，单独做β-actin条带却很清晰，可能是什么原因呢？难道是我的一抗或二抗失效了？我用的一抗是CST公司的，二抗是北京中山的，今年4月购买的，5月份我一抗浓度用1：1000，二抗1：1000，条带清晰，而且没有非特异性条带，可现在我加大一抗、二抗浓度胶片上也没条带，只有与膜一样大的灰色影，太令人伤心了！快帮帮我吧！

作者: mimili_901 时间: 2013-9-14 15:50

请教
如何在黑暗中摸索胶片的正反面？

作者: zhenxin 时间: 2013-9-14 15:51

请教版主：
我做WB，最后显色结果只有非特异条带，而没有特异条带。而同样的样品做ELISA则得到强的阳性结果。还有一个奇怪的现象，就是在目的条带处膜上反而出现白斑，不知是何原因？
先谢谢啦！

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-14 15:51

请问！你做转膜的时候有没有用过“预染蛋白Marker”如果用到过那么有没有碰到Marker转出膜外的情况？还有你用的是什么膜？孔径是多少？

作者: junhun 时间: 2013-9-14 15:51

您好！非常感谢您给我的建议，我还有几个问题想请教：
1、  我的目的蛋白是28kd，β-actin的分子量为43kd，蛋白质的上样量为120ug。您给我的转膜建议是36v，4-8小时，我按您的指示分别于4小时、6小时、8小时取膜与胶，分别将其染色，胶用考染，nc膜用丽春红s染色。发现胶上4-5marker（48-33kd）之间仍有条带，另外，膜上相应位置的条带不清晰。
2、  转膜8小时的膜用5%的脱脂奶粉封闭（将奶粉溶于TBST中，TBST的配方为29g Nacl，pH7.4的tris base20ml，tween-20 0.5 ml）1小时。封闭结束后TBST洗15min。
3、  一抗设浓度1：200，1：500（说明书上建议1：200-1：500）一抗用含3%脱脂奶粉的TBST封闭，一抗1h后TBST1x15min，2x10min洗。二抗1：5000（说明书上建议1：5000-1：100000），二抗1h后TBST1x15min，4x10min洗。
4、  ECL显色，曝光。
5、  结果胶片仅有几条浅浅的非特异性条带。目的条带相应位置无条带出现。　

我想导致实验失败会不会是以下的原因：
1、  您用的膜是pvdf膜而我用的是nc膜？（问题：若是pvdf膜能否用丽春红s染色？）
2、  我转膜时的电压采用恒压36v，显示的电流基本上为65mA，功率为1-3 w，是否转膜缓冲液配制有问题导致电流与功率过低？（转膜缓冲液：tris base：3.028g,glycine:14.414g,methanol:20%）请问您转膜时采用36v恒压，电流与功率控制为多少？
3、  TBST配制中盐浓度过高，洗脱太过？（因为我看到有的TBST的配方中Nacl为8.8g）
另外，一抗孵育用TBS好还是TBST好？
4、我曾尝试过采用高电压快转膜的方法以缩短试验周期，采用100v恒压1.5h，发现目的条带相应位置全部空白，请问若采用高电压的缩短转膜时间方法会不会有好结果？

请您帮我参谋一下，我好改进，争取下一次出好结果。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:52

"我想请教一下，如果用WESTERN 检测转录因子NFkB 和E2F-1的活化表达，需要提取磷酸化的蛋白，那么应该选用什么样的细胞裂解液呢？"

可以用一般的方法提取蛋白，没有问题，不过要注意的是，裂解液要能提取核蛋白。（可以用stop buffer）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:52

我从华美买的0.22孔径的PVDF膜，可是他们没有给我说明书，请问这个孔径的能做42KD的蛋白吗？
能做。

另外，我看到有用0.22孔径的PVDF膜做蛋白测序的，说明书上也写着适合做蛋白测序，我想知道这是不是一种膜，还是另外的一种PVDF膜？
我没有做过蛋白测序的工作，我想可能是一种材料做的，但是膜的厚薄可能不同。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:52

我转膜都是用400mA，恒流，2小时，用丽春红染色是有条带的，可是有时最后还是会没有结果，狂郁闷！！（用0.75的梳子，10ul蛋白+10ul 2*上样buffer 100度煮10分钟）"

我的蛋白分子量有20KD, 185KD.235KD这样三个
如果是这上蛋白一起转的话会有电问题，建议分开做，20kd单独做，12％sdspage，转移时间衡压（湿法） 36V 4-6hours，
剩下两个用6-7%一起做，衡压，36V14－16hours
.

作者: mogu 时间: 2013-9-14 15:53

我转膜后，可见到预染marker已经到了膜上，但最后显色压片后，x片上一片空白，连生物素marker都没有，我以前做过的，从没有出现过这个问题。但最近做过几次，结果都是这样。请高手帮我分析一下。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:53

“在检查了各种试剂及配方后发现我的电泳缓冲液配方与分子克隆第二版的配方有差别,主要是甘氨酸含量偏低（我以前用的缓冲液是我师兄配的，近两个月是我自已配）,在改用其配方后电泳基本正常,转膜后丽春红染色条带清晰,可是一抗、二抗孵育后，点上luminol显影时胶片曝光没有出现条带，单独做β-actin条带却很清晰，可能是什么原因呢？难道是我的一抗或二抗失效了？我用的一抗是CST公司的，二抗是北京中山的，今年4月购买的，5月份我一抗浓度用1：1000，二抗1：1000，条带清晰，而且没有非特异性条带，可现在我加大一抗、二抗浓度胶片上也没条带，只有与膜一样大的灰色影，太令人伤心了！快帮帮我吧！”

如果仅仅是甘氨酸少，不过造成你的结果。
我现在觉得：
1 检测一下2抗（可以要别人给你做），或将2抗1：300再试试。
2 “β-actin条带却很清晰，可能是什么原因呢” 你用的抗鼠的二抗吧？
你是否将2抗用混了？
如果2抗有效，就可以判断一抗可能出现了问题

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:53

如何在黑暗中摸索胶片的正反面？

胶片应该没有正反面之分吧？随便那一面都可以。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:54

“我做WB，最后显色结果只有非特异条带，而没有特异条带。而同样的样品做ELISA则得到强的阳性结果。还有一个奇怪的现象，就是在目的条带处膜上反而出现白斑，不知是何原因？”

Elisa 和Wb 是不一样的，它是区分不了特异和非特异的，你的Elisa的强阳性结果不一定就是你的目的蛋白造成的。

如果你的目的条带处出现空白或白斑，则可能：
1 是做转移时，三明治没做好，气泡造成的白斑。
2 是反应太强造成的，你可以看我原来的帖子里，有说。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:54

“你做转膜的时候有没有用过“预染蛋白Marker”如果用到过那么有没有碰到Marker转出膜外的情况？还有你用的是什么膜？孔径是多少？”

转移条件剧烈，时间长了就会出现。我用的是PVDF膜，孔径 0.45um
我用0.22um时条件比较轻柔，没有发生转移透过的现象

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:54

如果36V ，8小时的转移都不行的话，

可以尝试用63V， 5－8hours，转移效果的好坏通过染色出来。

你可以摸索一下最好的转移条件。

从你的描述上看，我觉得转移方面的问题可能是影响你实验结果的原因。

建议你用1：200（一抗），和1：3000（2抗）做出目的条带后，再多稀释一点。

一抗2抗孵育我用的都是tbst＋5％milk。你可以先用你的步骤。

作者: 算盘阿星 时间: 2013-9-14 15:55

我制胶时在分离胶的地方有好多泡泡，浓缩胶的地方没有。
有什么办法可以解决呢？

作者: 30moonriver 时间: 2013-9-14 15:55

请问已经干掉的膜还能做strip吗？
急，谢谢

作者: ROSE李 时间: 2013-9-14 15:56

加完一抗或者二抗之后，洗膜的次数和时间是不是对结果很有影响？
我转膜后条带很明显，丽春红染色也很清楚，但还是没有结果，请问问题出在什么地方？一抗1：1000，2hr。TPBS洗10*3。二抗1：10000，2hr。TPBS洗10*3，PBS*1，ECL显色，曝光20分钟。
唉，都做了2个月了，还是做不出来。

作者: tuuu2 时间: 2013-9-14 15:56

怎样封闭人白蛋白单抗包被板? 欲采用双抗夹心法检测人尿白蛋白, 用BSA封闭不行, 肯定是BSA与anti－HSA有交叉反应，我还试了用明胶加蔗糖,结果还是有非常高的本底.
我该怎么办?

作者: 印花铅笔 时间: 2013-9-14 15:56

我也问个问题：转膜时我设定为100v恒压1h，但是出现不能恒压，显示的是恒流，而且数值随着时间的推移逐渐变小，请问这是什么原因造成的？
（转膜buffer配方：gly144g，tris30.3g，配至1L，使用时取100ml，加200ml甲醇，定容至1L）
2天前我用过，转膜时没出现这个问题，怎么现在会有这个现象呢？
ps：转膜结束时感觉buffer有点热，冰盒内的冰块已经溶解完了，但是槽外面的冰水还是很泠，还有冰块剩余。

作者: popo520 时间: 2013-9-14 15:57

我做的蛋白分子量是45kd，我想找内参照，一抗必需是兔抗兔的（我做的是兔子，二抗买了是羊抗兔的）。不知道如何去找比较合适，谢谢！

作者: gogo 时间: 2013-9-14 15:57

相关疾病：
神经胶质瘤

想您请教个问题,我用western blots方法测定人神经胶质瘤组织中nos1的含量,目的蛋白分子量为155kd,分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为4%,电泳时电压为120v,电流40mA,电泳时间1.5小时,各样品槽总蛋白含量为15ug,用nc膜转膜时电压为100v,电流120mA,转膜2小时,使用的转印缓冲液为(tris碱+甘氨酸+甲醇+去离子水),转印后nc膜用立春红染色,可见各泳道均有蛋白带,用封闭液(5%地脱脂奶粉+TBS)封闭过夜,次日用TTBS漂洗后,用一抗封闭液[(nos1R-20:sc- 648)+3%叠氮钠+1%BSA]常温孵育2小时,再用TTBS漂洗三次,每次8分钟,再用二抗封闭液(1%BSA+辣根酶标记山羊抗兔IgG)常温孵育2小时,后用TTBS漂洗3次,进行ECL反应,洗片后发现x光片各泳道均有非特异性蛋白带,无法判断哪一条是目的蛋白,请问原因何在?谢谢
补充:一抗稀释比:1:500(参考范围1:200---1:1000)
二抗稀释比:1:5000(参考范围1:5000----1:10000)一抗.二抗均于04年6月20日购于北京中山公司(santa cruz biotechnology,inc.的代理)

作者: wu11998866 时间: 2013-9-14 15:58

您好！再次请教：
stop buffe提蛋白（nf-kb 65kd），湿转（北京六一产转膜仪）60v5小时立春红染色，仅在小分子侧发现很浅的一个条带，改用36v7小时30分，可见6个点样孔中1号孔用较多的蛋白条带，2，3号孔无任何条带，4－6号孔仅小分子侧有教深的条带。针对这种情况继续实验可否改为36V6hr?1-2小时的转膜时间对实验会有很大的影响吗？
不胜感谢！

作者: 大尾巴 时间: 2013-9-14 15:58

请教几个问题。
1我做WB用3%BSA/TBS封闭NC膜2小时，最后X光片暴光处一片漆黑，是否用BSA封闭不行？
2做WB用什么牌子的脱脂奶粉好。
3做酪氨酸磷酸化的WB有那些要注意，不能用脱脂奶粉封闭对吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:58

"我制胶时在分离胶的地方有好多泡泡，浓缩胶的地方没有。
有什么办法可以解决呢？"

你要观察一下是在什么环节出了问题？这样才好解决。
我们遇到过拔梳子没做好，出了气泡，
你是什么原因呀？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 15:59

“请问已经干掉的膜还能做strip吗？”

短时间没有问题，如果长了就不行。
不过干的膜要重新浸润。

作者: eric930 时间: 2013-9-14 16:00

我也问个问题：转膜时我设定为100v恒压1h，但是出现不能恒压，显示的是恒流，而且数值随着时间的推移逐渐变小，请问这是什么原因造成的？
（转膜buffer配方：gly144g，tris30.3g，配至1L，使用时取100ml，加200ml甲醇，定容至1L）
2天前我用过，转膜时没出现这个问题，怎么现在会有这个现象呢？
ps：转膜结束时感觉buffer有点热，冰盒内的冰块已经溶解完了，但是槽外面的冰水还是很泠，还有冰块剩余。

==========================================================================================================

应该是电泳仪的问题，你看一下你的电泳仪说明书，最大电流是多少，如果在电压小于你设定的100v时，电流已经达到允许的最大值就会出现由恒压自动变成恒流的现象。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:00

“加完一抗或者二抗之后，洗膜的次数和时间是不是对结果很有影响？
我转膜后条带很明显，丽春红染色也很清楚，但还是没有结果，请问问题出在什么地方？一抗1：1000，2hr。TPBS洗10*3。二抗1：10000，2hr。TPBS洗10*3，PBS*1，ECL显色，曝光20分钟。
唉，都做了2个月了，还是做不出来。”

1 洗膜的次数和时间对结果的影响不大，
2 我觉得你的问题可能出现在下面几个方面
a 一抗的稀释比例不对，你做的太稀了
b 2抗的稀释比例不对
C 蛋白没有提取对，是否提取到你的目的蛋白？
d 一抗失效
E 2抗失效

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:01

“怎样封闭人白蛋白单抗包被板? 欲采用双抗夹心法检测人尿白蛋白, 用BSA封闭不行, 肯定是BSA与anti－HSA有交叉反应，我还试了用明胶加蔗糖,结果还是有非常高的本底.”

用了牛奶没有？另外anti-HSA也有有很多种，有的跟BSA没有交叉反应，你试一下看看结果如何？

不行可以用重组的Gst蛋白

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:01

“ 我也问个问题：转膜时我设定为100v恒压1h，但是出现不能恒压，显示的是恒流，而且数值随着时间的推移逐渐变小，请问这是什么原因造成的？
（转膜buffer配方：gly144g，tris30.3g，配至1L，使用时取100ml，加200ml甲醇，定容至1L）
2天前我用过，转膜时没出现这个问题，怎么现在会有这个现象呢？”

你看看是否是你的仪器的操作没有掌握好，
1 你是在衡压状态下看的是电流的变化
2 100V时，最大的电流已经超过power supply的最高值，所以它只能降低电压，
你可以看看说明书就明白了，另外这个问题前面的帖子里有说过，你看看

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:02

“我做的蛋白分子量是45kd，我想找内参照，一抗必需是兔抗兔的（我做的是兔子，二抗买了是羊抗兔的）。不知道如何去找比较合适，谢谢！ ”

一般来说很难找到兔抗兔的抗体（除非被打出了免疫缺陷），
你可否再查一下，确认了再说
另外你可以用β-actin做内参，sigma的一个产品，单抗可以识别兔的beta actin

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:02

相关疾病：
神经胶质瘤

“想您请教个问题,我用western blots方法测定人神经胶质瘤组织中nos1的含量,目的蛋白分子量为155kd,分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为4%,电泳时电压为120v,电流40mA,电泳时间1.5小时,各样品槽总蛋白含量为15ug,用nc膜转膜时电压为100v,电流120mA,转膜2小时,使用的转印缓冲液为(tris碱+甘氨酸+甲醇+去离子水),转印后nc膜用立春红染色,可见各泳道均有蛋白带,用封闭液(5%地脱脂奶粉+TBS)封闭过夜,次日用TTBS漂洗后,用一抗封闭液[(nos1R-20:sc- 648)+3%叠氮钠+1%BSA]常温孵育2小时,再用TTBS漂洗三次,每次8分钟,再用二抗封闭液(1%BSA+辣根酶标记山羊抗兔IgG)常温孵育2小时,后用TTBS漂洗3次,进行ECL反应,洗片后发现x光片各泳道均有非特异性蛋白带,无法判断哪一条是目的蛋白,请问原因何在?谢谢

补充:一抗稀释比:1:500(参考范围1:200---1:1000)
二抗稀释比:1:5000(参考范围1:5000----1:10000)一抗”

你的过程看上去问题不大，当然出现杂带有很多原因。
你可以从下面几个方向去排除，改进看看是否有改进：
1 是否是一抗，2抗的稀释比例不对？
将稀释度做的更大一些（特别是一抗），建议做到1：1000或以上

2 目的蛋白是否是转移上去比例太低？
看看目的蛋白分子量范围内的是否转移效果好，

3 目的蛋白的含量低？

4 目的蛋白是否是提取出来，裂解液是否对？

5 一抗2抗孵育时改用5％的milk，杂带会少一些。

6 加大loading的上样量，并将一抗2抗的稀释度再做大一些

7 看看2抗是否能跟抗原直接结合？

供你参考

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:02

“stop buffe提蛋白（nf-kb 65kd），湿转（北京六一产转膜仪）60v5小时立春红染色，仅在小分子侧发现很浅的一个条带，改用36v7小时30分，可见6个点样孔中1号孔用较多的蛋白条带，2，3号孔无任何条带，4－6号孔仅小分子侧有教深的条带。针对这种情况继续实验可否改为36V6hr?1-2小时的转膜时间对实验会有很大的影响吗？”

可以延长时间，如果你可以进一步做实验的话，可以继续延长转移时间，

你试试转移 36V 10－12小时看看。或转移过夜。

湿法转移，小电压，低温，时间长一点问题不大

作者: windy+++ 时间: 2013-9-14 16:03

请问用丽春红染色溶液的配方是怎样的，我几次用其染色都无法看到全部的条带！

作者: veiwu 时间: 2013-9-14 16:19

都说pvdf膜比NC膜好使，可是我用NC膜做出来的结果，用PVDF膜反而作不出来了，一抗二抗都没有换，试剂就换了TBS，其余的都没有变，前几天还用NC膜做出来了呢。我不知道是不是我的PVDF膜使用有错误：我都是按说明说操作的（甲醇浸泡1分钟，水里浸泡2分钟，转移缓冲液泡3分钟），我的蛋白是42KD，PVDF膜孔径是0.45，用的是DAB显色。

作者: bluelake 时间: 2013-9-14 16:19

"我制胶时在分离胶的地方有好多泡泡，浓缩胶的地方没有。
有什么办法可以解决呢？"

你要观察一下是在什么环节出了问题？这样才好解决。
我们遇到过拔梳子没做好，出了气泡，
你是什么原因呀？

我在加分离胶后开始可能没气泡，等胶凝了以后会有小气泡，还会变大！
还有分离胶中有浓度不均匀的地方，怎么办？

作者: eric930 时间: 2013-9-14 16:20

你真是个热心人，谢谢你的宝贵意见，我会逐一验证。
另外，
一，目的蛋白分子量范围内多条蛋白带清晰，是否意味转移效果好？
二，我的裂解液配方为:
1)12.1g Tris+浓Hcl 9ml+ 去离子水至100ml后，从中取出2ml溶液
2）EDTA 760.4mg +20ml去离子水，从中取出2ml溶液
3）EGTA 760.8mg +20ml去离子水，从中取出10ml溶液
4）氟化钠 0.4g
5) 加入去离子水86ml，配后用NaoH调PH至7.5。不知是否正确？
三，我用的一抗是多克隆抗体，封闭液用5%脱脂奶粉好，还是1%BSA好？
请指教，谢谢！

作者: idoww 时间: 2013-9-14 16:21

请教：
谢谢你的耐心回答，我还有一些问题：
1。在转膜做三明治时，怎样才能尽量不将胶弄破，有时胶粘在滤纸上在挪动地方的时候，胶就破了。
2。膜、滤纸和胶的大小，有人说膜最大，其次是胶，然后是滤纸。膜和滤纸是事先剪好，还是放了胶以后再剪呢？
3。电转：100V， 1.5小时，冰浴nc膜湿转，转过的胶上还有条带，特别是高分子区，是不是转移不够？
4。显影：PIECE 的SuperSignal® 系列ECL试剂可以在光线下操作吗，加了试剂后在暗室里看到整张膜都是光亮的一片，是不是ECL试剂没有吸干的缘故？是否应在保鲜膜覆盖前将滤纸覆在膜上吸干多余液体？

作者: yonger 时间: 2013-9-14 16:23

我最近也在做WESTERN，想请教一下Marker在NC膜上怎么显色，国产的Marker能转到NC膜上吗？MARKER转到膜上后与一抗没有反应性如何显色。另外，跑SDS-PAGE胶时蛋白都已变性，变性的目的蛋白可能与一抗不结合，也可能一抗与细胞中其它蛋白结合，这样是否会出现目的条带未显色而非特异条带显色的情况，即一条泳道上出现多条非特异带。

作者: jingling845 时间: 2013-9-14 16:25

最近做wt时遇到了一些问题。
1.电泳时发现蛋白有些扩散。开始怀疑是丙稀酰氨不行了，换了之后好了一阵子。但最近觉得又不行了。溴酚蓝明显扩散。10％SDS新配的，顺便问一句，SDS需要调到PH7.2吗，我们原来从没有调过，我们实验室的去离子水偏酸，我测过，大概6点多。我怀疑我们的tris碱有问题。因为我们用的是TRIZMA base，但它的影响应该不会太大。不知是什么缘故？
2.用上述胶转膜时到还行，立春红染色可以看到蛋白都转到膜上了，但杂出来的是光板。我原来杂过这个指标，出来过的，只是不漂亮。
请高人帮忙分析一下，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:25

你用的配方应该没有问题，你看看考染是否能都出来呢？我想是你的胶的浓度选择的问题吧

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:26

“都说pvdf膜比NC膜好使，可是我用NC膜做出来的结果，用PVDF膜反而作不出来了，一抗二抗都没有换，试剂就换了TBS，其余的都没有变，前几天还用NC膜做出来了呢。我不知道是不是我的PVDF膜使用有错误：我都是按说明说操作的（甲醇浸泡1分钟，水里浸泡2分钟，转移缓冲液泡3分钟），我的蛋白是42KD，PVDF膜孔径是0.45，用的是DAB显色”

你的PVDF膜的使用都没有问题，
你看看是否是转移条件有问题，（NC膜和PVDF膜的转移条件有差异）。
你根据转移的效果看看，调整一下转移的时间和电流，电压。

另外如果转移条件是好的，你就要注意一抗，和2抗了，检查一下是否有问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:26

“"我制胶时在分离胶的地方有好多泡泡，浓缩胶的地方没有。

我在加分离胶后开始可能没气泡，等胶凝了以后会有小气泡，还会变大！
还有分离胶中有浓度不均匀的地方，怎么办？

如果是这样的话，你就检查你的配方吧。和试剂吧，如果配方没有问题，就重配试剂好了。

“还有分离胶中有浓度不均匀的地方，怎么办？ ”
你灌胶前将胶充分混合就可以解决了

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:27

1 “一，目的蛋白分子量范围内多条蛋白带清晰，是否意味转移效果好？”
是的

2 二，我的裂解液配方为:
1)12.1g Tris+浓Hcl 9ml+ 去离子水至100ml后，从中取出2ml溶液
2）EDTA 760.4mg +20ml去离子水，从中取出2ml溶液
3）EGTA 760.8mg +20ml去离子水，从中取出10ml溶液
4）氟化钠 0.4g
5) 加入去离子水86ml，配后用NaoH调PH至7.5。不知是否正确？
你的去垢剂加在那里了？光用水如何破细胞？

三，我用的一抗是多克隆抗体，封闭液用5%脱脂奶粉好，还是1%BSA好？
一般建议用5%脱脂奶粉

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:28

1。在转膜做三明治时，怎样才能尽量不将胶弄破，有时胶粘在滤纸上在挪动地方的时候，胶就破了。
小心，另外多加buffer。

2。膜、滤纸和胶的大小，1。在转膜做三明治时，怎样才能尽量不将胶弄破，有时胶粘在滤纸上在挪动地方的时候，胶就破了。。膜和滤纸是事先剪好，还是放了胶以后再剪呢？
可以先剪好，
另外“有人说膜最大，其次是胶，然后是滤纸。

不见得，膜稍大一点，滤纸和胶差不多就可以了”

3。电转：100V， 1.5小时，冰浴nc膜湿转，转过的胶上还有条带，特别是高分子区，是不是转移不够？
你最重要的是看膜上，你的目的蛋白附近的蛋白是否转移成功了。

4。显影：PIECE 的SuperSignal® 系列ECL试剂可以在光线下操作吗，加了试剂后在暗室里看到整张膜都是光亮的一片，是不是ECL试剂没有吸干的缘故？是否应在保鲜膜覆盖前将滤纸覆在膜上吸干多余液体？
如果是“整张膜都是光亮的一片”不是ECL试剂没有吸干的缘故，而是你的背景沈的原因，解决办法可以看我原来的帖子

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:28

我最近也在做WESTERN，想请教一下Marker在NC膜上怎么显色，国产的Marker能转到NC膜上吗？MARKER转到膜上后与一抗没有反应性如何显色。另外，跑SDS-PAGE胶时蛋白都已变性，变性的目的蛋白可能与一抗不结合，也可能一抗与细胞中其它蛋白结合，这样是否会出现目的条带未显色而非特异条带显色的情况，即一条泳道上出现多条非特异带。"

1 国产的Marker能转到NC膜上.
2 除非是预染的marker或交联了荧光的marker，否则不能显色
3 一抗的说明上会说明是否能用于wB上，如果有说，那么就没有问题。非特异条带出现的原因很多，你可以看看我前面的帖子。

另外建议多看一下Wb原理方面的书。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:28

1.电泳时发现蛋白有些扩散。开始怀疑是丙稀酰氨不行了，换了之后好了一阵子。但最近觉得又不行了。溴酚蓝明显扩散。10％SDS新配的，顺便问一句，SDS需要调到PH7.2吗，我们原来从没有调过，我们实验室的去离子水偏酸，我测过，大概6点多。我怀疑我们的tris碱有问题。因为我们用的是TRIZMA base，但它的影响应该不会太大。不知是什么缘故？
你看看loading buffer 是否换过了，
如果不是最好看看你的gel buffer的PH是否跟书上的一致。

2.用上述胶转膜时到还行，立春红染色可以看到蛋白都转到膜上了，但杂出来的是光板。我原来杂过这个指标，出来过的，只是不漂亮。
请高人帮忙分析一下，谢谢

看看一抗是否出了问题，少稀释一点，另外loading时多上样一倍。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:29

不要向我要WB的步骤，我的步骤给你们也没有用，跟根据实验材料，目的的不同其中的条件时要变化的。
另外，我觉得查找资料，收集资料是个很好的过程，随便过去损失的更多。

作者: okhaha 时间: 2013-9-14 16:29

重新购买了二抗后,按1:300稀释,现在条带很漂亮,非常感谢!
我总结了一下我的失误:1、没有测电泳缓冲液的PH值，我按照一本参考书的配方，上面写按此配PH值即为8.3，不须调PH。我在换了不同厂家Tris后再按此配方，PH已发生了改变，所以导致电泳不正常。2、没有及时更换试剂，在条件不变的情况下，β-actin有结果而目的条带不显现首先要考虑一抗、二抗的问题。现在问题终于解决了，我要开始大量生产了。

作者: birdfish 时间: 2013-9-14 16:30

您好，又有事情要麻烦您了。我构建的载体表达大约50aa的bcr-abl片断，转染COS-7细胞后，想证实一下它的表达，想拿个wenstern－blot的结果，以前我用bcr－abl－KLH免疫小鼠血清做western，有很多的杂带，现在不用了。现在我在bcr－abl后面加了个c－Myc tag，加了c－myc tag后的蛋白的分子量也才6.75 kDa，所以又有麻烦了！我知道小分子量的western不好做，我把前面的帖子全看了一遍，还是决定试试。
我在6孔板里转染，然后直接收细胞，溶到6*loading buffer里，终体积120ul。
10ul上样，15%PAGE（5-10kDa的彩虹marker可以跑开），半干转膜（15v，30分钟，marker中大分子转的不好，小分子还好），转膜用0.2um的pvdf膜（Bio-rad）。

作者: zhihui小新 时间: 2013-9-14 16:30

我用的是半干转膜，35kd,恒流1mA/cm2，为什么电压越来越小？

作者: jujuba 时间: 2013-9-14 16:30

我刚开始转膜，电泳没问题，考马斯染色后条带很清楚，想要40左右的蛋白，但是转膜后的膜上什么也没有，还不均匀，一块一块的，像是烧焦了，我的膜是6×6的，恒电流40mA，1.5小时，不知道原因在哪里，请指教！

作者: memory 时间: 2013-9-14 16:32

请问有没有将胰岛素标记过氧化物酶的方法？

作者: daod 时间: 2013-9-14 16:32

我是重复师姐的一个western，她的结果很漂亮，一条带很特异，但是我做的就好像电泳一样，有无数条带还很亮，怎么回事呢？蛋白样是卵子匀浆液，我的一抗（多抗），二抗及比例都和她一样，我重复了不下十次非特异性带还是很多，难道是抗体放久了？可是是从－80度刚拿出来的呀，请指教

作者: qhyu 时间: 2013-9-14 16:33

教：某某基因表达的天然蛋白大小是35KD，我用它前面300bp做了一个真核表达载体，现在要做一个wb检查转染的目的蛋白是否有表达；我做的是稳定转染，用G418筛选过，但是是混合克隆，目的蛋白的分子量估计在12KD，抗体是自己实验室做的多抗，针对蛋白的前面部分，就是说理论上是可以匝出我得蛋白的；请教一下应该注意什么问题。
之前做过一次，用15％的sds－page，转摸后用力春红染了，看见很多蛋白条代，但是blot之后，没见到目的条代，也没看见细胞内源性表达的35KD条带；师兄用抗体作出来了的。我用的是师兄的条件
蛋白大小是否适合用15％的胶进行分离？跑胶跑到何种程度适合？是不是应该先做一个考马司亮蓝染色？谢谢！

作者: gogo 时间: 2013-9-14 16:34

【请教】
1）单克隆抗体蛋白质是否需要变性？
2）磷酸化蛋白有何特殊要求？
3）我做Western检测磷酸化细胞外信号调节激酶，裂解液中加氟化钠，蛋白变性，5％milk封闭三小时，一抗（santa cruz 1；300小鼠单克隆igG）孵育2.5小时，二抗（1：5000）孵育75分钟。发光结果：膜所在区域无条带，全黑，请问如何改进？万分感谢！

作者: windy+++ 时间: 2013-9-14 16:34

请问细胞可以直接做WESTERN吗？是细胞用上样缓冲液悬浮吗？
我想要的目标蛋白在胞浆和胞核表达
如果可以的话，细胞上样数目有何要求？越多越好吗？上样体积还是不要超过20ul？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:36

“终体积120ul。”
收集体积应该尽量小，这样蛋白才会更浓。

”10ul上样“，
上量样尽量大，细胞中小分子量的蛋白本来就少，应该尽量多上。

”15%PAGE（5-10kDa的彩虹marker可以跑开）“
可以用15％的，但是建议20％的（如果麻烦要重配buffer 就算了）

”，半干转膜（15v，30分钟，marker中大分子转的不好，小分子还好）“
另外要注意的是marker比真实的蛋白要好转，转移后不能光评pre-stained marker的结果判断转移效果，最好能用丽春红染一下。

，转膜用0.2um的pvdf膜（Bio-rad）。
一定要用0.2um的膜，关键的关键。

祝你成功，

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:38

”我用的是半干转膜，35kd,恒流1mA/cm2，为什么电压越来越小？“

我还没有遇到过，应该是电压越来越大，你是否用transbuffer泡过所有的东西，如滤纸，膜等，并且是充分的。
另外你的buffer没有问题吧？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:38

”我刚开始转膜，电泳没问题，考马斯染色后条带很清楚，想要40左右的蛋白，但是转膜后的膜上什么也没有，还不均匀，一块一块的，像是烧焦了，我的膜是6×6的，恒电流40mA，1.5小时，不知道原因在哪里，请指教！“

你的膜转移后用考染一下，看看是否你所说的”一块一块的“都是蓝色的？
我觉得你有可能是三明治没有做好，是气泡造成的，另外，你是否检测过转移后的胶呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:39

"有没有将胰岛素标记过氧化物酶的方法？ "

应该是很简单的事情，有现成的kit，或者用across linker完成这个，最好是用kit，里面的HRP是处理过的，但是连接后胰岛素是否有活力就不知道了。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:39

to 遥望
”某某基因表达的天然蛋白大小是35KD，我用它前面300bp做了一个真核表达载体，现在要做一个wb检查转染的目的蛋白是否有表达；我做的是稳定转染，用G418筛选过，但是是混合克隆，目的蛋白的分子量估计在12KD，抗体是自己实验室做的多抗，针对蛋白的前面部分，就是说理论上是可以匝出我得蛋白的；请教一下应该注意什么问题。
之前做过一次，用15％的sds－page，转摸后用力春红染了，看见很多蛋白条代，但是blot之后，没见到目的条代，也没看见细胞内源性表达的35KD条带；师兄用抗体作出来了的。我用的是师兄的条件
蛋白大小是否适合用15％的胶进行分离？跑胶跑到何种程度适合？是不是应该先做一个考马司亮蓝染色？“

可以用15％的胶，但是最好用20um的膜做转移，但是如果你用丽春红染色证明是好的，则可以继续往下做。
可以用更浓的一抗来杂交试试，提高1－2倍，（比方说原来是1：1000，现在做1：500，或1：300试试）。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:40

1）单克隆抗体蛋白质是否需要变性？
什么需要变性？可否说清楚一点？

2）磷酸化蛋白有何特殊要求？
一般没有要求。最好看看相应的文章，看是否你那个蛋白要特殊的步骤。

3）我做Western检测磷酸化细胞外信号调节激酶，裂解液中加氟化钠，蛋白变性，5％milk封闭三小时，一抗（santa cruz 1；300小鼠单克隆igG）孵育2.5小时，二抗（1：5000）孵育75分钟。发光结果：膜所在区域无条带，全黑，请问如何改进？

1 用BSA封闭试试。
2 加强清洗

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:40

”请问细胞可以直接做WESTERN吗？

可以，但是不建议这么做。
是细胞用上样缓冲液悬浮吗？
是用上样液直接提蛋白。

我想要的目标蛋白在胞浆和胞核表达
如果可以的话，细胞上样数目有何要求？越多越好吗？上样体积还是不要超过20ul？
一般我都上2×10（5）个细胞以上。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-14 16:41

丽春红染色后洗不掉，对结果有影响吗？

作者: 紫烟 时间: 2013-9-14 16:42

我正在困扰着呢,我现在正在做的一抗是人抗的,在做组织的标本时,做出来的条带很漂亮,也很干净,可是现在做人的细胞蛋白时,每次都要压膜压很长的时间,压出来的条带很多,象MARK一样,我认为这是非特异性的条带,目的带根本没有出来,可是换了几种裂解液,也试了几种抗体浓度,始终是这样,令我百思不得其解,肯请赐教,救小女子于水深火热之中,感谢之至!

作者: kuaizige 时间: 2013-9-14 16:42

小生做P21一个月了，反复做没有结果，尝试了很多方法：
开始以为是细胞内常规表达，所以就用了转染的细胞直接做，未果。
增加上样量，最高时用到70ug的蛋白质，未果。
查文献，加诱导剂可以增加其表达，用了诱导剂，收了处理不同时间段的细胞WB，还是未果。
由于P21是胞核表达，所以分析可能是要提核蛋白，但后来查了文献，老外的文章都是用的"total protein",而且用30ug的蛋白就能跑出很漂亮的条带。
怀疑是抗体的原因，可用的是santa的原装抗体啊，1ml的，不会连santa的原装抗体都有问题吧？现在准备抽提加药处理的细胞的核蛋白做WB。
具体细节如下：
细胞用PBS洗涤一次后，加三去污100ul（临用前加AP和PMSF），冰上孵育20min后，用刮子刮下细胞，12000g，4度，20min离心。定量。
120V，电泳（bio-rad槽），350mA，2.5h,湿转膜,5%的脱脂奶封闭1h,一抗孵育过夜(4度),二抗37度孵育1h,碱磷酶显色,可每次都没有条带.
一抗和二抗用过不同浓度,从1:1000到1:250都用过,结果一样.
ptglab兄,请帮我分析一下是什么原因导致反复做都失败!不胜感谢!

作者: DONT 时间: 2013-9-14 16:46

我想做western,购买一抗(抗内质网蛋白)时遇到选择麻烦:

1.抗体有抗N和C端两种
2.抗体有来源于兔和山羊两种
3.抗体的初始推荐稀释比例有:1:100与1:200两种

请问:如何选择?

谢谢!

作者: wmp1234 时间: 2013-9-14 16:47

我是从动物模型中取组织做WESTERN，是要提取组织核蛋白后做吗（目的蛋白在核内）？提取后要定量核蛋白然后再加样吗？

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-14 16:50

我按照你的方法做了，膜上考染也什么都没有。胶用考马斯染了一下，还有条带，只是比较模糊了，就是没有转上。重新处理了一下，现在可以了，谢谢你，我已经开始下一步了，另外，国产的ECL试剂哪里有卖的？
还有，预染的MARKER是不是就是那种直接可以电泳的，不用加上样缓冲也的东西。

作者: 831226 时间: 2013-9-14 16:51

我最近做了个westren，目的蛋白为45Kd和55Kd，采用的是santa cruz的多抗。100V转膜一个半小时，丽春红染色显示转膜效果良好。用含5％脱脂牛奶的TTBS室温封闭了2小时，随后将一抗按1：200稀释，将膜封入塑料袋中，加入一抗稀释液，4度孵育过夜（8小时），而后TTBS洗脱4次（每次15分钟），加入1：2000稀释的二抗反应液，室温下孵育1小时，同样用TTBS洗脱四次（每次15分钟），将膜取出后表面滴加Amarcia的化学发光反应液，室温下反应5分钟，暗室曝光15分钟，就得到了下面这两张图。
从结果上看，实验好像失败了，因为到处都是发光的条带，基本上什么蛋白都出来了，毫无特异性可言。以前我也在别人实验室用同一支一抗也做该蛋白在培养细胞中的表达，结果就非常好，条带非常特异，没什么杂带。为什么换了个实验室就出不来好的结果呢？！！
我分析下原因，可能有以下几点：
1.封闭液中脱脂牛奶的浓度太低，封闭效果不好
2.一抗稀释度太低，应该增加如1：500
3.一抗是一个多抗，而非单抗
4.发光反应液与膜作用时间太长
不知道有没有分析到点子上去，还请各位指点，看看我下一步最应该从那方面着手改进，才能在最短的时间里获得最好的试验结果。我准备把这次的膜strip一下，然后再做一遍，大家看可行吗？
另外还有个小问题要请教：我将一抗稀释液都收集起来放在4度冰箱里了，这样存放的抗体能保存多久，下次我作western的时候还能拿来再用吗？我现在剩下的一抗不多了，有没有钱买新的，郁闷啊：（
先谢谢各位了

作者: lxh031 时间: 2013-9-14 16:52

我是从动物模型中取组织做WESTERN，是要提取组织核蛋白后做吗（目的蛋白在核内）？提取后要定量核蛋白然后再加样吗？

===========================================================================================================

如果有能直接从组织细胞中提取核蛋白做，那最好。其实PIERCE的该产品也不贵。如果没有那个条件，我认为做全细胞提取物（膜蛋白，浆和核蛋白)直接上样也是应该可以的

作者: xingyi08 时间: 2013-9-14 16:54

我做的同一样品,一种一抗是x-200,1:500稀释,
室温过夜,37度1.5小时,二抗抗羊室温1.5小时；
另一种是beta-actin,1:2500稀释,二抗抗鼠,室温1.5小时.
DAB显色,但x-200的条带没有,只有beta-actin,请问是否因为
x-200浓度过低?

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:54

"丽春红染色后洗不掉，对结果有影响吗？"
没有影响，但是要尽量洗掉。（应该不会洗不掉吧），最少加2抗时是什么都没有了。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:54

“我正在困扰着呢,我现在正在做的一抗是人抗的,在做组织的标本时,做出来的条带很漂亮,也很干净,可是现在做人的细胞蛋白时,每次都要压膜压很长的时间,压出来的条带很多,象MARK一样,我认为这是非特异性的条带,目的带根本没有出来,可是换了几种裂解液,也试了几种抗体浓度,始终是这样,令我百思不得其解,肯请赐教,救小女子于水深火热之中,感谢之至!

我觉得是不是下面几个原因，你逐个排除一下，看看有无帮助？
1 你换了2抗没有？（建议用组织样品和细胞样品同时做）
2 提组织蛋白和提细胞蛋白的方法不同？
3 目的蛋白的含量是否在组织中的含量要远远高于细胞样品中的。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:55

我看了你的实验步骤，而且我做过P21的检测，用我们公司自己的P21抗体检测，也是用提的总蛋白做出来的，
这个蛋白很容易检测，你可以看看是不是出了下面的问题：
1 没有将核蛋白提出来，你的三去污配方是否能够裂解核膜？
2 santa用的稀释度用高了，你降到1:100试试。
3 Ap酶的灵敏度不高，换HRP+Ecl试试。

如果这几个检测了以后还是不出条带，再怀疑一抗的问题，但是我个人认为一抗出问题的可能性不大

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:55

选择一抗时可以看看下面几个标准：

1 选择一家较好的公司。
2 抗体能够满足你的实验要求。
3 价格上有优势。
4 如果是多肽免疫的多抗，抗原决定簇最好用N端 or C端的。

如果你这个抗体是同一家公司的，
你可以比对一下你的蛋白的N端和C端，看看哪端的特异性好一点，如果差不多，可以选则建议稀释度为1;200的兔抗（如果1：200的建议稀释度是羊抗，则选羊抗。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:55

不用客气，我已经给你发邮件了，国产的Ecl我也不知道那里有卖的，我们用的都是进口的，
另外预染的Marker是电泳是不需要染色就有条带指示的Marker，它在电泳前是不用loading buffer 的

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:56

你好，我看了你的实验步骤和分析结果，我觉得你分析的挺好的，但是我给你将可能性排个序，你从上往下排除:
1 一抗稀释度太低，应该增加如1：500

2 你原来也是4度过夜吗（一抗）？如果不是还是用室温一小时好一点。
2 爆光时间过长。

3 你的loading 的量是否是增加了？是不是比原来的上样多了。
4 2抗换了吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 16:57

”我做的同一样品,一种一抗是x-200,1:500稀释,
室温过夜,37度1.5小时,二抗抗羊室温1.5小时；
另一种是beta-actin,1:2500稀释,二抗抗鼠,室温1.5小时.
DAB显色,但x-200的条带没有,只有beta-actin,请问是否因为
x-200浓度过低“

不能肯定，但是你可以看看我前面的一些，里面有分析的方法，你看看是否适合？

作者: daod 时间: 2013-9-14 16:57

提出大鼠肝微粒体后，想提出蛋白直接跑SDS-PAGE胶分离蛋白，特别是想把P450蛋白（内膜蛋白）分出来，lysis buffer如何选择，还需要注意什么。

作者: mamamiya 时间: 2013-9-14 16:58

我的western 结果上总有一条非特异的带，在四种不同的一抗中都会出现，大小是50Kd左右。更要命的是这条带的变化趋势刚刚是我所期望的。不知道这条带是什么？除了IgG 有没有别的可能？

作者: avi317 时间: 2013-9-14 16:59

我做得目的蛋白是电穿孔转染后细胞分泌的细胞因子,分子量为10-20KD之间,分离胶浓度为12.5％,电泳30分钟,转膜1.5小时,ECL显色,一抗(单克隆)购自晶美.我重复了许多次,但做不出来,请问有可能是什么原因?

作者: standbyme 时间: 2013-9-14 16:59

我们实验室有一个人最近做WESTERN，目的蛋白组的条带都很淡，三个条带都在一直线上，但是阳性对照组和阴性对照组（阴性组居然也能出条带）的条带却不跟处理组在一直线上，这是怎么回事呢？是非特异性蛋白的干扰吗？
WESTERN条件：SDS-PAGE 120V 20 MIN+160V 40 MIN
转膜滤纸>胶=膜膜大概5x6 cm2 电流0.3 mA 转膜80 MIN
封闭液 5%脱脂奶粉 1.5小时
一抗 1：2000 加入2.5%脱脂奶粉液中室温2-2.5小时 4度过夜
二抗 1：400 加入2.5%脱脂奶粉中室温1小时

作者: standbyme 时间: 2013-9-14 17:01

电流写错了，是30mA

作者: TNT 时间: 2013-9-14 17:01

我做的蛋白是NFIκB－α和NFIκB－β的磷酸化和非磷酸化形式，方法是按照protocol来的，蛋白裂解液都是直接买的，一抗用的分别是santacluz公司的sc－847和sc－945，我师兄以前用每一种抗体就可以把一个蛋白的非磷酸化和磷酸化同时做出来，我做的条件都和他的一模一样，但我每一个抗体就只能作出来非磷酸化形式，不知道怎么回事，请帮我参详一下。各位大虾还有谁做过这两个蛋白的?结果怎么样？

作者: owanaka 时间: 2013-9-14 17:02

我做的蛋白分子量是427KD,很难做，我听说要用200伏电压50分钟电泳，6％的胶会不会太高？梯度胶怎么做？转膜时需要注意什么？对电流和时间又什么影响？另外还有什么注意事项？
非常感谢！

作者: utt0989 时间: 2013-9-14 17:02

请问跑蛋白胶时过了堆积胶蛋白还没堆积起来,为什么?是不是我上样总体积太大了?
谢谢了

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:05

你的这个结果要具体情况具体分析，
你描述的太简单了。
你用的抗原是什么，
4种不同的一抗都是什么？
另外，你的目的2抗是否能跟抗原直接结合？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:06

做得目的蛋白是电穿孔转染后细胞分泌的细胞因子,分子量为10-20KD之间,分离胶浓度为12.5％,电泳30分钟,转膜1.5小时,ECL显色,一抗(单克隆)购自晶美.我重复了许多次,但做不出来,请问有可能是什么原因? ”

Wb做不出来的原因很多，我前面的帖子里有具体分析过，你看看前面的帖子，看看是否能逐一排除一些可能性，这样再问要好一点。

作者: 12xunmei 时间: 2013-9-14 17:08

请问:
1. 跑蛋白胶时过了堆积胶蛋白还没堆积起来,为什么?是不是我上样总体积太大了?
2. 用立春红染色时间有点长,膜呈微红色,会不会影响后面上抗体显色?
3. 相邻泳道的蛋白条带跑得粗细很不一样,是不是因为上样体积大的跑得特别粗,上样体积小的跑得特别细,快挤没了.有什么解救的办法吗?

谢谢了

作者: IAM007 时间: 2013-9-14 17:09

我这次又提了一次蛋白，跑胶后丽春红染色后转膜是成功的，这次P21用的是1：100的浓度，二抗用的是HRP的二抗（santa cruz），浓度用的是1：1000
ECL和DAB显色都试过，还是没有阳性结果。

作者: 莲花白 时间: 2013-9-14 17:09

最近我一直在做WB,结果不太理想,我的样品是诱导表达的GST融合蛋白,是裂解未纯化的总蛋白,测蛋白浓度为1.5MG/ML,10UL样品,一抗为抗GST 1:8000,二抗1:1500,用四氯萘酚显色可见目的条带,但有许多非特异带子,不知为什么?
同时在用ECL显色时可见非特异带子,但目的条带处总是白片?

作者: wu11998866 时间: 2013-9-14 17:09

请问，我在同一张PVDF膜上做完一种抗体后（阳性结果，很好），用TBS洗了30分钟，重新封闭后，又做了actin的抗体，却完全没有结果了，这个是怎么回事呢？actin的一抗和二抗一星期前用过，没有问题的。

作者: wu11998866 时间: 2013-9-14 17:10

请问，我在同一张PVDF膜上做完一种抗体后（阳性结果，很好），用TBS洗了30分钟，重新封闭后，又做了actin的抗体，却完全没有结果了，这个是怎么回事呢？actin的一抗和二抗一星期前用过，没有问题的。

是因为膜在室温下放的太久，蛋白融解了么？有什么技巧可以在一张膜上标记多个抗体呢？

谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:10

"我们实验室有一个人最近做WESTERN，目的蛋白组的条带都很淡，三个条带都在一直线上，但是阳性对照组和阴性对照组（阴性组居然也能出条带）的条带却不跟处理组在一直线上，这是怎么回事呢？是非特异性蛋白的干扰吗？"

如果目的条带都很淡则可以通过加大上样量或提高样品浓度来解决，

但是如果阳性对照跟样品组不在一条直线上，你可以看看是不是你的阳性对照跟处理组的蛋白不一样（原核表达的阳性组？或真核表达的，但是没有加修饰，）这样来解释不是同一条直线的原因。

另外如果阴性对照组里（是什么？要具体分析，有时候重组的菌里有杂蛋白会有干扰。
我觉得这个问题，你要具体分析，毕竟我对你的实验是一无所知。

WESTERN条件：SDS-PAGE 120V 20 MIN+160V 40 MIN
转膜滤纸>胶=膜膜大概5x6 cm2 电流30mA转膜80 MIN
封闭液 5%脱脂奶粉 1.5小时
一抗 1：2000 加入2.5%脱脂奶粉液中室温2-2.5小时 4度过夜
二抗 1：400 加入2.5%脱脂奶粉中室温1小时 "

你的转移后是否染色做了鉴定？
另外，蛋白提出来是否检测过浓度？
其他的步骤问题不大，可以参考我前面的建议。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:11

“，我做的蛋白是NFIκB－α和NFIκB－β的磷酸化和非磷酸化形式，方法是按照protocol来的，蛋白裂解液都是直接买的，一抗用的分别是santacluz公司的sc－847和sc－945，我师兄以前用每一种抗体就可以把一个蛋白的非磷酸化和磷酸化同时做出来，我做的条件都和他的一模一样，但我每一个抗体就只能作出来非磷酸化形式，不知道怎么回事，请帮我参详一下”

你是否处理细胞或组织的方法跟呢师兄都一样呢？是否加了NaF呢？如果做的条件都一样（是不是指后面的实验条件）？那么看看前期样品的处理上是否有不同吧。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:11

"我做的蛋白分子量是427KD,很难做，我听说要用200伏电压50分钟电泳，6％的胶会不会太高？梯度胶怎么做？转膜时需要注意什么？对电流和时间又什么影响？另外还有什么注意事项？"

如果可以，最好做5％的SDS－PAge，另外电泳就按照一般的电泳就可以了。

如果转移，建议用湿法转移，长时间，摸索一下条件，（建议63V 16－18hrs）

我觉得最难的就是转膜了。你要多摸索条件。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:13

1. 跑蛋白胶时过了堆积胶蛋白还没堆积起来,为什么?是不是我上样总体积太大了?
应该不是吧，你看看关于staking gel的原理，找一下是不是什么地方没有注意，比如PH？
另外你如何知道过了堆积胶蛋白还没堆积起来？
说不定只是考马思亮蓝扩散了。

2. 用立春红染色时间有点长,膜呈微红色,会不会影响后面上抗体显色?
不会，后期会被洗掉的。

3. 相邻泳道的蛋白条带跑得粗细很不一样,是不是因为上样体积大的跑得特别粗,上样体积小的跑得特别细,快挤没了.有什么解救的办法吗?
你看看是否是两个样品的盐浓度不一样，
或再将样品上样量小的Well里加上loading buffer 补足一样的体积试试

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:14

是pierce公司的，我不知道北京那个公司代理？不过如果你们用的多，我们这里有pierce Ecl kit 500ml(250ml*2)的，比较便宜，可以跟我联系。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:15

你把蛋白和抗体都拿到我公司来吧，我来给你检测就可以了。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:15

“最近我一直在做WB,结果不太理想,我的样品是诱导表达的GST融合蛋白,是裂解未纯化的总蛋白,测蛋白浓度为1.5MG/ML,10UL样品,一抗为抗GST 1:8000,二抗1:1500,用四氯萘酚显色可见目的条带,但有许多非特异带子,不知为什么?

一般的用抗体检测“融合蛋白”，出现非特异条带的原因是：抗原量上的过大了，你可以将上样量减少到 5ul， 3ul ， 1ul，试试看看结果有没有好转。

同时在用ECL显色时可见非特异带子,但目的条带处总是白片? ”

你这个问题，前面有人问过，我也很详细的解答了，所以看看前面的帖子，你就知道了，（跟上样量大有关系）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:16

我在同一张PVDF膜上做完一种抗体后（阳性结果，很好），用TBS洗了30分钟，重新封闭后，又做了actin的抗体，却完全没有结果了，这个是怎么回事呢？actin的一抗和二抗一星期前用过，没有问题的。

是因为膜在室温下放的太久，蛋白融解了么？有什么技巧可以在一张膜上标记多个抗体呢？

你这个做法，我做过，是可以做出来的，而且都不是你说的原因，
你看看是否你的这个样品是否可以直接做出来actin。
如果可以做出来，可以试着上样量加大，另外你的actin一抗，2抗使用浓度可以加大一倍试试

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-14 17:16

"你的转移后是否染色做了鉴定？
另外，蛋白提出来是否检测过浓度？"

转移后对胶做了染色鉴定，处理组基本没有条带，对照组有一些，但是膜上对照组也有条带。
他们是直接用细胞煮过后上样的，没有提取蛋白也没有检测浓度
这有影响吗？

处理组是带有目的基因的质粒转染的真核细胞，对照组有两个，一是未转染的同一种细胞，还有一个是明确表达目的蛋白的另一种细胞。不知道转染后表达的蛋白是否有可能与天然表达的蛋白有差异而造成条带不在一直线上？

作者: qumm1985 时间: 2013-9-14 17:17

我做WT，转膜后用丽春红染色，发现不同样品的条带浓度相差很大。我是作过蛋白定量的（BCA法），按相同的蛋白量上的样，为什么还会出现这种情况呢？请各位高手不吝赐教啊。谢谢。

作者: 阿k 时间: 2013-9-14 17:18

我想请教一下做western 时如何选择内参。我现在提取线粒体蛋白，想检测分子量为32kd的蛋白质，应该选择何种蛋白作为内参照？我在文献上看到国外有用cytochrome c的，还有用cytochrome c subunit Ⅰ或者Ⅲ的，这几种有什么区别吗？它们都是在线粒体中含量稳定的蛋白质吗？另外，内参只起到“标示出各泳道上所加蛋白质的量相同”的作用吗？可否用其定量？定量的具体方法如何？我想选用上述三种内参中的一个，加入相应的抗体（必须为单克隆吗）检测，然后用待测蛋白光密度/各自泳道上内参光密度，以对照组为100％，进行比较，这样做对吗？

作者: cocacola 时间: 2013-9-14 17:18

我做western总是出现奇怪的现象，换了actin的一抗，出来条带了，可是PVDF膜只有半边有结果，（共加了8个泳道的样，只有一边的4个泳道有结果），别的抗体也是如此。
是我转膜出错了么？

另外，PVDF膜和NC膜的转膜条件一样么？胶的厚度对转膜时间有无要求？
我用的是pvdf膜，胶的厚度是1.5mm，实验室里有两种转膜液的配方：
1000ml:tris 3g，glycine14.4g, methol100ml
和tris5.8g，glycine2.9g, methol200ml
请问我该用哪种？

作者: Ao7 时间: 2013-9-14 17:19

大虾，你好！请问120KD的蛋白湿转的标准是什么？你的贴子里几乎都是干转的。我们80mA转了3h，结果却还是令人失望。谢谢！

作者: uaubc 时间: 2013-9-14 17:19

大虾，你好！
请问如何做脑脊液中的30KD的蛋白的Western Blot，谢谢。

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-14 17:21

你好！
我最近做140KD的蛋白，总是做不出来。我用的是8％的胶，跑胶了以后Marker都看不太清楚。是不是胶制的有问题？（我用的是60V， 30min. 120V, 60min. 电泳缓冲液是新的）转膜了以后就更看不清楚了（350mA,55min)，郁闷！虽然加大了上样量还是没做出来（30微升），你能指教一下吗？谢谢！

作者: youyou99 时间: 2013-9-14 17:21

４００mA 2-2.5小时即可（１０％甲醇）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:25

"转移后对胶做了染色鉴定，处理组基本没有条带，对照组有一些，但是膜上对照组也有条带。
他们是直接用细胞煮过后上样的，没有提取蛋白也没有检测浓度
这有影响吗？"

我说的是染膜，看膜上的转移效果，这样可以看到是否是上样量不均衡，转移效果不好造成的，不过最好是控制上样量。另外，你可以看看我前面的贴子。

带不在同一条线上，可能有你说的原因，另外，还可能是你上样的时后，有少量阳性的标本溢出到阴性标本的Well上了。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:27

“我做WT，转膜后用丽春红染色，发现不同样品的条带浓度相差很大。我是作过蛋白定量的（BCA法），按相同的蛋白量上的样，为什么还会出现这种情况呢？”

如果出现你说的问题，我觉得你可以换一个蛋白定量的方法来做检测。另外可以用actin来校验每一种的上样量

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:28

"我想请教一下做western 时如何选择内参。我现在提取线粒体蛋白，想检测分子量为32kd的蛋白质，应该选择何种蛋白作为内参照？我在文献上看到国外有用cytochrome c的，还有用cytochrome c subunit Ⅰ或者Ⅲ的，这几种有什么区别吗？它们都是在线粒体中含量稳定的蛋白质吗？"

可以用细胞色素C做为内参，而且这个是很容易买的一抗。

另外的几个问题，你可以在论坛里找到。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:28

你看看那4个样品是不是出了问题，你重新电泳，染胶看看是不是样品降解了。

如果不是这个问题，看看是不是转移过程中的问题，或是转移仪的问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:29

“请问120KD的蛋白湿转的标准是什么？你的贴子里几乎都是干转的。我们80mA转了3h，结果却还是令人失望。谢谢”

不会吧，我的帖子里有很多的是用湿法转移的问题，你再看看吧，
80mA 3h 是肯定不行的。
另外可以参考“snower1122 ”

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:29

“请问如何做脑脊液中的30KD的蛋白的Western Blot，”

除了提蛋白以外，其他的跟普通的Wb没有区别。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:30

1 看看试剂配方有没有问题（loading buffer，running buffer，做胶的一套buffer）
2 看看是不是样品的问题，可以电泳后染色。
3 胶没有凝集好就上样了，建议胶制备好了以后多放一会再电泳。

作者: 7437654 时间: 2013-9-14 17:30

积层胶70~80V,电流一般在10mA左右,分离胶120V,转膜350mA,时间80~90分钟,时间可以自己摸索,膜正面的Marker比背面要强.

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-14 17:34

RIPA lysis buffer中的各成分分别是什么作用啊？
NP-40:
Na-deoxycholate:
EDTA:
有些文献是加了0.1%SDS的，有什么作用，加不加有什么优缺点吗？SDS可能会影响BCA测蛋白浓度吧？

作者: flower-201 时间: 2013-9-14 17:34

你好，我想问你几个问题：
我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白。
1.膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法。
2.42kd的蛋白分子量算不算大，在这里经常看到大家讨论大分子量，小分子量的问题，我一直分不清楚。
3.转膜的时候是控制恒压还是恒流，昨天我做实验，发现我们的仪器好象一直是恒流的。电压设好预设值60v，但一直上不去，停留在42v的样子。不知道是怎么回事？我最后转了1小时，预染marker转过去了，是不是表示转膜已经可以啦？
谢谢

作者: kuaizige 时间: 2013-9-14 17:36

DTT用去离子水配和用乙酸钠配有什么区别吗？请问，谢谢

作者: am10 时间: 2013-9-14 17:40

我用重组蛋白制备多抗，已经好几个月了，想检测抗体质量。用重组蛋白做抗原，抗血清稀释100-200倍，western检测有很暗的目的条带，背景很干净；但用动物细胞抽提蛋白做抗原，western检测没有目的条带。我用丽春红染色膜上有很清晰的蛋白带谱，没有降解，没有拖带，说明动物细胞蛋白做抗原没问题。

那么是一抗与抗原的比例不适合还是一抗根本不行。我想请教的是，有没有一个辅助办法优化多抗稀释倍数（我是参照别人稀释的100倍）？我以前做ELISA可以一次平行做许多稀释，但做western如果那么做很麻烦，有没有其他办法？

我还想请教的是，有没有其他可靠的方法判断抗体的质量？

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-14 17:40

我才开始准备做Western，请教几个问题：
1.我想从肺组织中同时提取胞浆蛋白和核蛋白，检测p38、ERK1/2、NF-KB,从网上找到一个配方，请帮忙看看行不行：
胞浆裂解液 100ml
10mM HEPES 238.4mg
10mM KCL 74.5 mg
0.1mM EDTA 2.9 mg
0.1mM EGTA 3.8 mg
0.5mM DTT 7.7 mg(临时加，1M DTT 49.8µl)
0.2mM PMSF 3.4 mg(临时加，100mM PMSF 195.4µl)
（提取过程中加纯NP-40）

配胞核裂解液 8M 尿素 20ml
9.6096g 尿素加水至 20ml

如不行，除了Pierce的试剂盒外有无其它方法可行。

2. 我只想检测刺激后三种蛋白表达是否增加，这种情况是否一定需要actin，因为我原有的三种蛋白的一抗来源不同，若再用不同的actin费用增加太多。

谢谢

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:41

1 如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Wb就可以了。
2 如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。
3 转膜的问题你可以看看我前面的帖子，里面有详细的论述。
4 42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:41

如果用重组蛋白做多抗，可以用2种方法检测：
1 用融合蛋白做抗原，用Elisa做检测，一般我们用融合蛋白的抗原免疫得到的的抗体可以做到1：1000000
2 用含有目的蛋白组织或细胞做Wb，我们的起始稀释度是1：1000。

作者: remenb 时间: 2013-9-14 17:42

有点小小的建议：我自己做ＷＢ还算顺利，在你的贴子里也可以学到好多东西，可是看贴有点累。所以建议：１、书上明显有的就不要回答了（比如上样buffer怎么配的问题），因为有的人就是想拾个便宜，你说了也是害了人家（你现在说了，保准以后要做的时候他又忘记了），我觉得我们先要主动学习，不要被动接受。２、你以后针对性回贴的时候最好用quote这个引用按钮好吗？因为这样更清楚你回答的是什么，我们看起来也一目了然。对你来说也方便，不用复制粘贴的。——————　只是一点我的看法哈

作者: xue258 时间: 2013-9-14 17:42

你好
我要作的蛋白的分子量是40和60dk，条件是10*6个细胞裂解蛋白，10%分离胶，SDA-PAGE后条带比较清晰，但是量不是太大，转膜用NC膜，100V恒压转1.5小时，发现转移缓冲液温度很高，有80-90度，立春红染色无条带，
不知道原因是什么，我用的系统是Bio-rad的湿转，分析原因：1.增加蛋白量2.PVDF膜3.专膜电压太大，不合适。
湿转好还是半干转好？根据蛋白的分子量的大小选择吗?pvdf膜与NC相比较差别很大吗？我用0.45的可以吗？转膜时到底恒压还是横流阿?条件怎么选择？

作者: IAM007 时间: 2013-9-14 17:54

蛋白样品怎么浓缩呢？什么浓缩呢？甲醇还是丙酮，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:55

我想从肺组织中同时提取胞浆蛋白和核蛋白，检测p38、ERK1/2、NF-KB,从网上找到一个配方，请帮忙看看行不行：
胞浆裂解液 100ml
10mM HEPES 238.4mg
10mM KCL 74.5 mg
0.1mM EDTA 2.9 mg
0.1mM EGTA 3.8 mg
0.5mM DTT 7.7 mg(临时加，1M DTT 49.8µl)
0.2mM PMSF 3.4 mg(临时加，100mM PMSF 195.4µl)
（提取过程中加纯NP-40）

配胞核裂解液 8M 尿素 20ml
9.6096g 尿素加水至 20ml

可以用这个配方,

"我只想检测刺激后三种蛋白表达是否增加，这种情况是否一定需要actin，因为我原有的三种蛋白的一抗来源不同，若再用不同的actin费用增加太多。"

加不加actin是你文章要求的, 实验的角度上是可以不加内参的. 另外好像sigma有个beta-actin 的抗体可以用在很多的物种上面, 你不用去买3种不同的actin抗体.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:56

有点小小的建议：我自己做ＷＢ还算顺利，在你的贴子里也可以学到好多东西，可是看贴有点累。所以建议：１、书上明显有的就不要回答了（比如上样buffer怎么配的问题），因为有的人就是想拾个便宜，你说了也是害了人家（你现在说了，保准以后要做的时候他又忘记了），我觉得我们先要主动学习，不要被动接受。２、你以后针对性回贴的时候最好用quote这个引用按钮好吗？因为这样更清楚你回答的是什么，我们看起来也一目了然。对你来说也方便，不用复制粘贴的。——————　只是一点我的看法哈，我只希望这个帖子越办越好，没有别的任何意思。向黎老师学习！！！

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采纳你的建议,不过其实我在前面很多地方都说了,基本的问题就不要问了,也不要问我要protocol, 查资料是个实验里很重要的部分,多花时间有好处.以后我就吧你的帖子做个连接发给大家.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:56

你好
我要作的蛋白的分子量是40和60dk，条件是10*6个细胞裂解蛋白，10%分离胶，SDA-PAGE后条带比较清晰，但是量不是太大，转膜用NC膜，100V恒压转1.5小时，发现转移缓冲液温度很高，有80-90度，立春红染色无条带，
不知道原因是什么，我用的系统是Bio-rad的湿转，分析原因：1.增加蛋白量2.PVDF膜3.专膜电压太大，不合适。
湿转好还是半干转好？根据蛋白的分子量的大小选择吗?pvdf膜与NC相比较差别很大吗？我用0.45的可以吗？转膜时到底恒压还是横流阿?条件怎么选择？

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我觉得不是上样量的问题, 应该是转移条件没有控制好,
如果你用湿法转移试试用小电压长时间会好一点, 具体的条件你可以看看我前面的帖子,另外可以自己摸索转移条件,每次转移完了以后都用立春红染膜,同时染一下胶看看效果.

你其他的都没有问题,湿法转移最好用衡压.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 17:56

蛋白样品怎么浓缩呢？什么浓缩呢？甲醇还是丙酮，谢谢！

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**** 本内容跟帖回复才可浏览 *****

作者: one 时间: 2013-9-14 17:57

我用干燥的聚丙烯酰胺颗粒浓缩蛋白可不可以？需要几次？

作者: niangao1980 时间: 2013-9-14 17:57

可以用冰丙酮沉淀,另外可以用透稀带浓缩,可以用冷冻干燥能都行,

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主要是看你目标蛋白的用途，然后采用不同的方法。

作者: uuooii 时间: 2013-9-14 17:58

问老大一个问题
WB，ECL,电泳转膜均正常。立春红染色可见条带，条带正常
PBST 封闭过夜，1抗1：1000 2h,4度。PBST洗3次，5min/次。
2抗1：2000。PBST洗20min
ECL显色，背景很高。高分子量处有杂带。类似于立春红染色一样
问如何可以解决？或有什么方法可以改进？

作者: fox_79 时间: 2013-9-14 17:58

我的SDS－PAGE老是跑不好，经常出现各个条带之间相互干扰的现象，使得条带不直，这个问题如何解决？

作者: 079777chao 时间: 2013-9-14 17:58

我是新手，正准备做western blotting,请问一抗用多抗好还是单抗好？用电转膜还是自然转好？谢谢。

作者: any333 时间: 2013-9-14 18:00

我的SDS－PAGE老是跑不好，经常出现各个条带之间相互干扰的现象，使得条带不直，这个问题如何解决？

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调整上样量，使各泳道蛋白量接近一致，这样就不会影响。

作者: remenb 时间: 2013-9-14 18:00

我做Western时，经常发现胶配好后，上样孔里有不少胶丝。请问如何解决。谢谢

作者: jkobn 时间: 2013-9-14 18:00

我觉得不是上样量的问题, 应该是转移条件没有控制好,
如果你用湿法转移试试用小电压长时间会好一点, 具体的条件你可以看看我前面的帖子,另外可以自己摸索转移条件,每次转移完了以后都用立春红染膜,同时染一下胶看看效果.

你其他的都没有问题,湿法转移最好用衡压.

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为什么最好用衡压？能给个解释吗？国产的湿法转移槽可否用100V衡压赚1-2小时？谢谢，你每次都没有回答我的问题.......sigh~~~~~~~`

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:01

真不好意思，又来问问题！
我的WB的过程是这样的，目的是做B-ACTIN,40KD,用一整瓶细胞200UL裂解液提取蛋白，SDS-PAGE的条件是先0.01mA,再0.02mA,共1小时20分钟，考染条带清晰，但是条带相对别人的细些。切胶根据MAKER。
转膜条件：NC膜，湿转60v1.5小时，丽春红染色条带清晰，余胶考染仍有细弱条带，说明转膜成功但不充分。
B-ACTIN1：400稀释，4度过夜，二抗1：4000，1小时，ECL各50微升混合孵育1min,曝光5min.
问题是：上次做时看到多个条带，非特意性染色深，考虑是抗体作用时间16小时太长，二抗1：4000 2小时也太长，所以这次严格了一抗和二抗的作用时间，并稀释二抗1：6000，但是这次的结果是第一张背景很深，条带不清；第二张只看到微弱的条带，但是条带不是有一个加样孔那么长，而是很短，有一截一截的感觉。不知道原因是什么。
我想再做，但是原因不明
蛋白量是不是小？
一抗没有问题，曾经有人用过，出结果的。
洗液加了5/1000的TWEEN20，二抗是不是稀释的太高了？
是不是换用pvdf膜？
请你给于指导，谢谢，急!

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:01

我的sdspage出现了以前所没有的问题，下面是我拍的凝胶图片，
其中第三条为三去污剂裂解buffer，其它几条为三去污裂解剂裂解得到的细胞总蛋白，
考染后发现marker的条带还可以分辩，但样品拖尾现象严重（条带勉强可以分辨），
我看前面的帖子，说是裂解不完全有细胞碎片，是不是还有可能会是其它原因？
我是不是可以用其它师兄的样品和我一起处理来比对一下啊？

回答漏胶的问题：
前段时间，我也遇到了这个困扰，后来总结发现是配制的30％丙稀酰胺浓度不够，还有是APS可能有问题，后来从新配制丙稀酰胺后问题解决了；还有APS最好用进口分装的，价格便宜量又足，平时一天换一管。

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请问你用的MARKER是那种？为什么我的MARKER总是跑不全？或是隐约能判断6条，但是有2-3条非常弱。我买的是上海的，只有70元。请指教。

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:01

您好！
我又作了一遍，前天提蛋白时没有加PMSF,今天跑蛋白电泳会不会没有条带？昨天跑的时候一切正常。我真不知道没出结果的原因究竟是什么？

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:02

这次的转莫成功，但是立春红染膜条带不浓，余胶还有蛋白条带，专膜条件我调整为横压65v2小时。5%牛奶封闭液4度过夜，一抗1：400，室温2小时，二抗1：4000，室温1小时。

现在是不是要增加蛋白量呢？我是提1整瓶50ml细胞培养瓶的细胞，大约有2*106个；蛋白浓缩这样行吗?冷丙酮沉淀4度过夜，1：4体积，离心后晾干，直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?或是裂解液中？

不好意思，问了这么多的问题。

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:02

请问你有RIPA提取膜蛋白的protocol吗？我按以下方法提取的，请问是否正确？
离心获取细胞后，溶于有蛋白酶抑制剂A液中，冰浴超声10s×3；5000转4度离心10分钟，去除核及未裂解的细胞；取上清，12000转4度离心，取上清即可。
A液：1mM kcl, 3mM Nacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, 0.05%二巯基乙醇，0.5ug/ml Leupeptin, 20uM pmsf, 1% Triton x-100.
ptglab大好人，麻烦百忙之中回答我，谢谢！！

作者: H2O 时间: 2013-9-14 18:02

我的12%的胶考马思量蓝染后，条带为啥很细很淡（上样量50ug）。抽屉蛋白可不可仪先消化细胞。PBS洗后离心凑足了足够的细胞后再抽屉，不是直接在培养瓶里列解；我乡这样回浓一些。

作者: rxcc33 时间: 2013-9-14 18:03

你好！我准备做western-blotting检测SP和CGRP，分子量分别为1380和3800道尔顿。请问能分开吗？我需要多大浓度的胶呢？另外这么小的Marker谁家公司有售？万分感谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:03

我用干燥的聚丙烯酰胺颗粒浓缩蛋白可不可以？需要几次？

=====================

你换用PEG系列就可以了

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:03

问老大一个问题
WB，ECL,电泳转膜均正常。立春红染色可见条带，条带正常
PBST 封闭过夜，1抗1：1000 2h,4度。PBST洗3次，5min/次。
2抗1：2000。PBST洗20min
ECL显色，背景很高。高分子量处有杂带。类似于立春红染色一样
问如何可以解决？或有什么方法可以改进？

================================

你可以查下面的改进办法：
1 提高一抗的稀释度，做到1：2000试试。
2 转移时间减少一些。
3 加强洗的时间
4 提高2抗的稀释度。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:04

我做Western时，经常发现胶配好后，上样孔里有不少胶丝。请问如何解决。谢谢

可以多凝集一会，或是过滤，另外这个是基本问题，可以自己多看看书来解决。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:04

为什么最好用衡压？能给个解释吗？国产的湿法转移槽可否用100V衡压赚1-2小时？谢谢，你每次都没有回答我的问题.......sigh~~~~~~~`

国产的湿法我没有用过，你其实看了我前面的帖子就知道了，转移的条件最好是根据实验设备，自己来摸索，试几次就出来了。如果是开始做，最好是用小电压，长时间，这样条件温和一些，容易控制结果。

湿法用衡压可以保证再单位面积上的电压都相同，保证转移的稳定。（当然电流是在变化的），
还有，不是一定要衡压，用人用衡流都转移的很好，两个的区别不大。（你如果看我前面的帖子就会发现这个我也写了很多遍了。sigh）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:04

请问你有RIPA提取膜蛋白的protocol吗？我按以下方法提取的，请问是否正确？
离心获取细胞后，溶于有蛋白酶抑制剂A液中，冰浴超声10s×3；5000转4度离心10分钟，去除核及未裂解的细胞；取上清，12000转4度离心，取上清即可。
A液：1mM kcl, 3mM Nacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, 0.05%二巯基乙醇，0.5ug/ml Leupeptin, 20uM pmsf, 1% Triton x-100.
ptglab大好人，麻烦百忙之中回答我，谢谢！！

可以，没有问题。另外，还可以用改良的Ripa提，你这样提的是膜蛋白加胞浆蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:05

这次的转莫成功，但是立春红染膜条带不浓，余胶还有蛋白条带，专膜条件我调整为横压65v2小时。5%牛奶封闭液4度过夜，一抗1：400，室温2小时，二抗1：4000，室温1小时。

现在是不是要增加蛋白量呢？我是提1整瓶50ml细胞培养瓶的细胞，大约有2*106个；蛋白浓缩这样行吗?冷丙酮沉淀4度过夜，1：4体积，离心后晾干，直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?或是裂解液中？

不好意思，问了这么多的问题。

你还可以延长转移的时间，如，冰浴条件下，转移， 65V 3－4小时，看看这样的转移效果。

你的Wb结果出的那个问题，我们也出现过，原因我们也没有找到。重复做一次就消失了。

另外，β-actin 是很好做的，不用上很多样就能做的很好的，建议你用一个别人做提的蛋白（提了胞浆蛋白的样）做成control看看结果是否好

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:05

我的12%的胶考马思量蓝染后，条带为啥很细很淡（上样量50ug）。抽屉蛋白可不可仪先消化细胞。PBS洗后离心凑足了足够的细胞后再抽屉，不是直接在培养瓶里列解；我乡这样回浓一些。

当然可以先用胰酶消化细胞，离心收集细胞，再加裂解液制样，这样应该会好提多，另外，50ug的蛋白样已经不少了，你做WB基本上够了

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:05

你好！我准备做western-blotting检测SP和CGRP，分子量分别为1380和3800道尔顿。请问能分开吗？我需要多大浓度的胶呢？另外这么小的Marker谁家公司有售？万分感谢！

不那能用Wb检测这么小的蛋白，建议你不如用质谱做。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:06

不那能用Wb检测这么小的蛋白，建议你不如用质谱做。或用Elisa做

作者: leifengta 时间: 2013-9-14 18:06

只用一个单克隆抗体做一抗行吗？

作者: IAM007 时间: 2013-9-14 18:07

我最近刚开始做western，前两次结果还可以（内参相对好做），这次在转膜上出了问题...marker转的不好，大分子的97.4kd没转上留在胶上，小分子的条带20.1kd，31kd，43kd在膜上和胶上都没有，系统和上两次差不多，只是用了新配的电泳缓冲液...因为这次做时泳道增加了两条，膜的面积有原来的3.7*6cm2变为5.0*6cm2，故增加了恒流转膜的电流由原42mA增加到45mA

转膜条件：45mA, 2h，半干转膜（24*2滤纸的那种），电泳过程中电压15v～52v NC膜
转膜缓冲液（参照CST公司的protocol）：转膜缓冲液（PH 8.5）：25 mM Tris ，0.2 M 苷氨酸，20% 甲醇；
目的蛋白为：磷酸化stat3，分子量87kd

我想问一下我的问题出在哪？有的转膜缓冲液中含有SDS作用是什么？在我的现有转膜条件下是不是大分子蛋白不好转？有什么改进的措施吗？电泳过程中电压的变化能说明转膜的好坏吗？以前有人做过电压上升到250v和我的相差太多...

作者: zhenxin 时间: 2013-9-14 18:07

相关疾病：
宫颈癌
你好，我是刚刚接触western的新手，想请教你几个问题。
我做的是宫颈癌caski细胞，你认为用什么样的方法裂解细胞比较好？
我用的是1*sds凝胶加样缓冲液直接裂解的，离心后把细胞移如一个小的ep管中，pbs漂洗细胞以后，加1*sds凝胶加样缓冲液，少量（我没有查到用多少量，是师姐以往的经验），总有一些pbs去不干净，会不会稀释sds？
我这里没有超声处理仪，不做超声剪切可不可以？
样本蛋白量是否一定要测？？
先谢过了！！！

作者: okhaha 时间: 2013-9-14 18:08

帮我看看这张结果吧，问了很多人都不知道怎么回事。同一张膜做actin结果很好。谢谢了！！！

图片附件: 80787107.snap.jpg (2013-9-14 18:08, 26.57 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18366

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:08

只用一个单克隆抗体做一抗行吗？

实在不懂你在问什么？如果是做WB，当然可以用单克隆抗体做。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:08

我最近刚开始做western，前两次结果还可以（内参相对好做），这次在转膜上出了问题...marker转的不好，大分子的97.4kd没转上留在胶上，小分子的条带20.1kd，31kd，43kd在膜上和胶上都没有，系统和上两次差不多，只是用了新配的电泳缓冲液...因为这次做时泳道增加了两条，膜的面积有原来的3.7*6cm2变为5.0*6cm2，故增加了恒流转膜的电流由原42mA增加到45mA

转膜条件：45mA, 2h，半干转膜（24*2滤纸的那种），电泳过程中电压15v～52v NC膜
转膜缓冲液（参照CST公司的protocol）：转膜缓冲液（PH 8.5）：25 mM Tris ，0.2 M 苷氨酸，20% 甲醇；
目的蛋白为：磷酸化stat3，分子量87kd
我想问一下我的问题出在哪？有的转膜缓冲液中含有SDS作用是什么？在我的现有转膜条件下是不是大分子蛋白不好转？有什么改进的措施吗？电泳过程中电压的变化能说明转膜的好坏吗？以前有人做过电压上升到250v和我的相差太多...

看了你的方法觉得问题不是太大，建议，开始用 30mA的电流，转移40mins，之后将电流提高到 55mA，时间80mins ，如果这样不行，你可以将transfer buffer中的甲醇含量降低到10％，另外加0.1%SDS在transfer buffer里，再试试条件。

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:09

你好，我是刚刚接触western的新手，想请教你几个问题。
我做的是宫颈癌caski细胞，你认为用什么样的方法裂解细胞比较好？
我用的是1*sds凝胶加样缓冲液直接裂解的，离心后把细胞移如一个小的ep管中，pbs漂洗细胞以后，加1*sds凝胶加样缓冲液，少量（我没有查到用多少量，是师姐以往的经验），总有一些pbs去不干净，会不会稀释sds？
我这里没有超声处理仪，不做超声剪切可不可以？
样本蛋白量是否一定要测？？
先谢过了！！！

建议你把我前面的帖子看看，你问这些都有。

“样本蛋白量是否一定要测？？” 不检测如果平均上样量，跟做内参是一样的。

作者: okhaha 时间: 2013-9-14 18:09

分两步电流有什么好处吗？为什么这么做？

我的另外几条小分子marker不在胶上，也不在膜上，有没有可能透过NC膜跑掉了？或者是其它的什么原因...

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:09

帮我看看这张结果吧，问了很多人都不知道怎么回事。同一张膜做actin结果很好。谢谢了！！！

看了这个结果，提点建议，看是否能改善：

1 将转移过程中的滤纸都换新的。
2 换新的电泳液，transfer buffer。
3 将样品在4度情况下用超声波打一下，离心，留上清。

这个问题我们曾经遇到过，也是将上面的三个条件换了，就好了，你也试试一下

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:10

分两步电流有什么好处吗？为什么这么做？

我的另外几条小分子marker不在胶上，也不在膜上，有没有可能透过NC膜跑掉了？或者是其它的什么原因...

就是透过膜了，所以要你分2次不同的电流转移

作者: babybabe 时间: 2013-9-14 18:10

请问设立阳性对照有什么讲究？我现在选择的是β－actin，但我在sigma公司查到好些anti－β－actin，不知怎么选。

作者: linlinstar 时间: 2013-9-14 18:10

谢谢，我的actin已经作出来了，你说的对不需要太多的蛋白，就很亮的。我换了转摸条件，选用了PVDF膜。
我开始做目的蛋白了，分子量是60KD和28KD，用一块胶，PVDF膜，转移65V 2.5小时，立春红染色发现摸上有蛋白但是不明显，最后的结果是暴光后，条带很弱，两次都是这样。不知道应该怎样改进？
分析原因：蛋白量不够；转膜不完全；一抗的效价低（放了一年了建议1：100-1000，我用的1：100）；还是这种蛋白本来的含量就是低？我该怎样改进？
再就是很想问问怎样检测一抗的效价，做个比较简单的实验？

谢谢

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-14 18:11

请问您有没有做过环氧合酶COX的western！我现在actin每次都能做出来，但是按照同样的方法，COX的一直作不出来，不知道哪个环节出问题了，请帮忙解答一下，万分感谢！

作者: ii077345 时间: 2013-9-14 18:11

我做了几次WESTERN用的半干转膜仪(上下各六层滤纸),采用的是恒流,但从转膜开始到转膜结束电压就没有升高过,我想问问究竟是怎么回事?

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-14 18:11

我最近做14KD的蛋白，最后做出来的结果发光后有清楚的条带，但是不在目的条带处（我的分子量为14，跑出来的结果为40KD左右，条带很清楚，不像一般的非特异性条带）我看到书上说分子量小的蛋白是有可能出现不同步现象，不知你见过这种情况吗或者说有可能会出现这么大的差异吗?谢谢！

作者: any333 时间: 2013-9-14 18:12

今天刚做完WB,也是第一次做,转膜转的很好,蛋白最后大部分都转上去了,但做到最后却出现了问题,我用DAB显色,临时配的DAB,师兄说应该是浅红的,但我加了双氧水后就变成黑的了,配方如下20ML)

18ML0.01M/L的Tris-Hcl(PH7.6)

0.012gDAB

2ML0.3%的氯化钴

20UL双氧水

不知有人遇到我这种情况没有,如何解决呀?

作者: gemei0115 时间: 2013-9-14 18:12

做western，考虑到价格，内参买的是sigma的anti-actin，没买beta-acitn，请问anti-actin是否也可以作为衡量蛋白量的标准？与beta-actin做出来的结果差别大吗？

作者: gemei0115 时间: 2013-9-14 18:12

我的试验也要用到WB，最近在学习这方面的东东，在靶蛋白的检测时，看到有说：由于在SDS-PAGE中蛋白质是变性的，因此选择抗变性蛋白质的多克隆抗血清或单克隆抗体混合物作为一抗可能效果更好，仅用某一单克隆抗体可能会出现一些不相关的反应假象，使试验结果难以解释。我没有经验，请教高手，为什么会这样？实际操作中会怎样？

作者: kulee 时间: 2013-9-14 18:13

加PMSF多了，对抽屉的蛋白有影响吗？？

作者: kulee 时间: 2013-9-14 18:13

加PMSF多了，对抽屉的蛋白有影响吗？

b-actin　的分子量是多少呀？？

作者: orangecake 时间: 2013-9-14 18:13

蛋白在组织中表达较低，我该怎样改善条件才能有助于出条带？
另外立春红染色后红色不能完全洗尽会不会影响后面上抗体？另外是什么原因导致我立春红洗不干净呢？谢谢

作者: orangecake 时间: 2013-9-14 18:14

另外我的组织蛋白跑胶时无法堆积？溴酚兰呈水平上下两条，不知是什么原因？

作者: any333 时间: 2013-9-14 18:14

我还想请教一下，将45mA 2h和改进为30mA 40min，55mA 80min比较，后者的电流55mA 80min，有没可能将小分子转掉...

作者: ero11 时间: 2013-9-14 18:15

我转膜得时候用丽春红染色条带非常浅，但是胶用考马斯亮兰染色条带清楚，滤纸和电转BUFFER都是新换得，我不知道是什么原因，做了好多次都这

样！转膜总也转不好，用得是湿法转膜100V ，1hr

作者: lixi559 时间: 2013-9-14 18:15

今天的结果是除了目的条带有很多的非特异性带，而目的条带也不是非常清晰，我应该稀释一抗和二抗，还是两者都稀释呢？但是目的条带怎样才能更清楚那？

作者: finger 时间: 2013-9-14 18:15

最近实验很不顺利，开始的时候因为二抗有问题根本就没有条带。现在开始步入正轨。但是还是疑惑重重。
我是拿取卵病人的卵泡的液体直接收集细胞，颗粒细胞。（未计数）要做的目的蛋白是膜蛋白，借鉴电泳杂志上的去污剂抽提Triton X 100的方法，每次获蛋白量约120ug，每次上样30UG。电转后丽春红染色，条带清晰。然后封闭2小时左右，santa的一抗羊抗1：100封闭4度过夜，TBST洗膜5－5－5－5－5－5，二抗1：4000一小时半，洗膜后用santa的ECL显色。
发现条带很多，但是均比较淡，几乎不能分辩哪条特别亮。
请问，我提蛋白的方法是否有问题？另外在调整抗体浓度方向应该怎么改善？
附，抽提方法是 A液：10mM PIPES 300mM sucrose 100mM NaCl 3mM MgCl2 5mM EDTA B液，就是A 液基础上加了0.5% v/v Triton X 100。
在细胞中加300ul A液，480G离心5分钟。然后，沉淀加B液150ul 30分钟，再5000G离心15分钟。吸上清。

谢谢您的解答！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-14 18:16

相关疾病：
头痛

现在我开始做Western,有些头痛的问题,特来请教.
我听说了一些身边人的建议,并看了一些书,觉得有几处细节不详:
1、我要测几株细胞某一蛋白的表达量差异情况，这样要用actin做内参，可是目的蛋白的一抗／二抗及actin的一抗／二抗应该怎样加（即按怎样的顺序）。
　２、目的蛋白的分子量在４０ＫＤ左右，这样胶的配方、转膜时间电流大小应该多少为宜？
　３、裂解液可以反复冻溶使用吗？是否必须加酶抑制剂？用ＰＭＳＦ可以代替酶抑制剂吗？
　４、封闭、一抗反应及二抗反应时间应各为多长？
　　　有人说封闭要在４度过夜，一抗反应３小时，二抗反应１小时，　　　　可以吗？

作者: avi317 时间: 2013-9-14 18:16

你好！我现在已经开始了Western blot的实验，可是我的转膜效果不是很好，转膜使用的电压为27伏，转膜2：45分；使用立春红染色好象大分子量的那一块转的效果不好。而且在转膜的时候开始使用恒压36的，但是因为电流太大的缘故一直没有能够升到36，只好使用27，使用的电流为85ma，是否可以提高电流？
我想了解一下你们是如何驱赶样品袋里面的多余气泡的，我弄了好久还是有很多的气泡、请问如何才能很好的驱赶气泡。
在做转移的时候是否需要割掉浓缩胶？
可否使用在超市里面卖的脱脂乳来做封闭和抗体稀释。

作者: avi317 时间: 2013-9-14 18:17

忘了说了，我表达的目的片段为1035bp，使用PET32的表达载体，那么我使用的饿转膜时间是否太短了，可否在提高电流和电压呢？

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:17

请问设立阳性对照有什么讲究？我现在选择的是β－actin，但我在sigma公司查到好些anti－β－actin，不知怎么选。

你要看那些抗体是应用实验,是否能做WB,另外是否适合用在你所需要的源属的actin蛋白上,. sigma 其实里面有重复的,我也找过, 发现有好几个都合适

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:17

谢谢，我的actin已经作出来了，你说的对不需要太多的蛋白，就很亮的。我换了转摸条件，选用了PVDF膜。
我开始做目的蛋白了，分子量是60KD和28KD，用一块胶，PVDF膜，转移65V 2.5小时，立春红染色发现摸上有蛋白但是不明显，最后的结果是暴光后，条带很弱，两次都是这样。不知道应该怎样改进？
分析原因：蛋白量不够；转膜不完全；一抗的效价低（放了一年了建议1：100-1000，我用的1：100）；还是这种蛋白本来的含量就是低？我该怎样改进？
再就是很想问问怎样检测一抗的效价，做个比较简单的实验？

谢谢

延长转移的时间,另外转移完了请染一下胶,看看上面是否有残留的目的范围内的蛋白,如果不多就证明转移的还不错了.
一般的蛋白含量很低话会有文献报道的,一般不要考虑这个.

一抗的效价是可以通过做梯度来检测出来的, 用1:50, 1;100, 1;200试试

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:18

请问您有没有做过环氧合酶COX的western！我现在actin每次都能做出来，但是按照同样的方法，COX的一直作不出来，不知道哪个环节出问题了，请帮忙解答一下，万分感谢！

我做过COX的WB,而且很好做,你看看是否是提蛋白上和一抗方面出了问题?

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:18

我做了几次WESTERN用的半干转膜仪(上下各六层滤纸),采用的是恒流,但从转膜开始到转膜结束电压就没有升高过,我想问问究竟是怎么回事?

如果你的转移效果不错的话,唯一的解释,就是你的滤纸好,或者有短路的地方

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:19

我最近做14KD的蛋白，最后做出来的结果发光后有清楚的条带，但是不在目的条带处（我的分子量为14，跑出来的结果为40KD左右，条带很清楚，不像一般的非特异性条带）我看到书上说分子量小的蛋白是有可能出现不同步现象，不知你见过这种情况吗或者说有可能会出现这么大的差异吗?谢谢！

1 看看是否是3体,或双体,可以用8M urea的stacking gel来解决.
2 有时候,有些蛋白的SDS-PAge分子量是跟计算出来的分子量相差很大的
3 另外,你也要多考虑那个是杂带的问题,14kd的蛋白不好做Wb

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:19

我的试验也要用到WB，最近在学习这方面的东东，在靶蛋白的检测时，看到有说：由于在SDS-PAGE中蛋白质是变性的，因此选择抗变性蛋白质的多克隆抗血清或单克隆抗体混合物作为一抗可能效果更好，仅用某一单克隆抗体可能会出现一些不相关的反应假象，使试验结果难以解释。我没有经验，请教高手，为什么会这样？实际操作中会怎样？

还是只用单抗或多肽检测就可以了,如果检测结果跟逾期的步一致再换另一个抗体,.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:19

蛋白在组织中表达较低，我该怎样改善条件才能有助于出条带？
另外立春红染色后红色不能完全洗尽会不会影响后面上抗体？另外是什么原因导致我立春红洗不干净呢？谢谢

浓缩蛋白,或多上样.
另外立春红染色后红色不能完全洗尽会不会影响后面上抗体,一般是不会出现的,过夜就干净了,洗不干净有可能是那里的膜的性质不用了.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:20

蛋白在组织中表达较低，我该怎样改善条件才能有助于出条带？
另外立春红染色后红色不能完全洗尽会不会影响后面上抗体？另外是什么原因导致我立春红洗不干净呢？谢谢

浓缩蛋白,或多上样.
另外立春红染色后红色不能完全洗尽会不会影响后面上抗体,一般是不会出现的,过夜就干净了,洗不干净有可能是那里的膜的性质不用了.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:20

我转膜得时候用丽春红染色条带非常浅，但是胶用考马斯亮兰染色条带清楚，滤纸和电转BUFFER都是新换得，我不知道是什么原因，做了好多次都这样！转膜总也转不好，用得是湿法转膜100V ，1hr

转移电压减少,延长转移时间

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:20

今天的结果是除了目的条带有很多的非特异性带，而目的条带也不是非常清晰，我应该稀释一抗和二抗，还是两者都稀释呢？但是目的条带怎样才能更清楚那？

可以增大上样量, 稀释一抗,2抗同时也做2种,稀释和不用稀释的.

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:21

最近实验很不顺利，开始的时候因为二抗有问题根本就没有条带。现在开始步入正轨。但是还是疑惑重重。
我是拿取卵病人的卵泡的液体直接收集细胞，颗粒细胞。（未计数）要做的目的蛋白是膜蛋白，借鉴电泳杂志上的去污剂抽提Triton X 100的方法，每次获蛋白量约120ug，每次上样30UG。电转后丽春红染色，条带清晰。然后封闭2小时左右，santa的一抗羊抗1：100封闭4度过夜，TBST洗膜5－5－5－5－5－5，二抗1：4000一小时半，洗膜后用santa的ECL显色。
发现条带很多，但是均比较淡，几乎不能分辩哪条特别亮。
请问，我提蛋白的方法是否有问题？另外在调整抗体浓度方向应该怎么改善？
附，抽提方法是 A液：10mM PIPES 300mM sucrose 100mM NaCl 3mM MgCl2 5mM EDTA B液，就是A 液基础上加了0.5% v/v Triton X 100。
在细胞中加300ul A液，480G离心5分钟。然后，沉淀加B液150ul 30分钟，再5000G离心15分钟。吸上清。

谢谢您的解答！

1 可以将提取时的体积至少减少一倍,相当于浓缩样品,
2 或者增加上样量,加大一倍, 无效果就按照1做.
3 稀释1抗参照上面的帖子

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:23

现在我开始做Western,有些头痛的问题,特来请教.
我听说了一些身边人的建议,并看了一些书,觉得有几处细节不详:
1、我要测几株细胞某一蛋白的表达量差异情况，这样要用actin做内参，可是目的蛋白的一抗／二抗及actin的一抗／二抗应该怎样加（即按怎样的顺序）。
　２、目的蛋白的分子量在４０ＫＤ左右，这样胶的配方、转膜时间电流大小应该多少为宜？
　３、裂解液可以反复冻溶使用吗？是否必须加酶抑制剂？用ＰＭＳＦ可以代替酶抑制剂吗？
　４、封闭、一抗反应及二抗反应时间应各为多长？
　　　有人说封闭要在４度过夜，一抗反应３小时，二抗反应１小时，　　　　可以吗？
　　

1 如果你的目的蛋白跟actin的分子量相差很大，可以直接把两种一抗一起都加到溶液中，如果一抗的来源不同，如鼠源和兔源，就在加二抗的时候加进去两种2抗的混合物就可以了。
如果一抗来源相同就简单了。

2 3 4 5 请见我的帖子，里面说了很多遍了

作者: okhaha 时间: 2013-9-14 18:23

你好！
上次稀释了一抗，二抗的浓度没有变，结果什么也没有？
转膜用PVDF膜，60v 2.5小时，立春红染色条带可见，牛奶封闭过夜，一抗37度2小时，二抗1小时，可是为什么结果非常干净，什么也没有？
真奇怪，你看应该怎么再改进呢？矫枉过正？

作者: langlang 时间: 2013-9-14 18:23

最近要做小分子的western。请问一下有什么好的建议吗？
我试着半干转了几次（北京六一仪器）。30mA*45min。感觉10kd以下转得不好。20～40转得还可以。我想湿转就更不行了。
据说10kd一下的小分子蛋白电泳容易跑丢，请问怎么才能做出来啊？

作者: PCR 时间: 2013-9-14 18:24

我在western blot中碰到以下情况，请ptglab 帮我分析一下。谢谢。
转膜条件一：预置70V，147mv，时间2h，
转膜条件二：预置60v，200mv，时间1h，
设置以上条件时，电泳仪自动为恒流，不知为何？
条件二比条件一效果好，但电泳仪很热，并且膜上预染marker条带比胶上淡很多，并有扩散现象，很不清晰。您觉得转膜条件哪个比较好，或者有什么可以改进？
转膜后，剪其中一泳道，用立春红染色，有清晰条带，其他部分加入一抗二抗曝光后，因无条带，又将该膜用立春红染色，结果无蛋白条带，请问为何？

作者: 2541 时间: 2013-9-14 18:24

你好！又要请教你了。我现只做出内参。做的是肾上腺素受体（七次跨膜蛋白）。
我怀疑是否蛋白提取出问题。做之前精美公司说他们的核蛋白提取试剂盒什么都能提，我就买了，说明书介绍方法提有提胞浆蛋白，核蛋白、总蛋白的提取。我按照总蛋白提取得放法。加了烈解液后12000g/min离心20分钟取上清。请问该试剂盒能用否，或哪里需要改进的。

作者: kuaizige 时间: 2013-9-14 18:25

我说说我最近的W-B所出现的问题，请高手赐教？
（一）电泳的时候，loading buffer指示剂压缩不好，并不是一条直线，而是一条较宽的曲线。
（二）最后用DAB显色时，几乎所有的条带都显色，连阴性对照都显。
有没有高手遇到过这样的情况的？？

作者: idoww 时间: 2013-9-14 18:25

我是新手，对weateron 一点不懂，但是又要马上做，所以很想得到最基本的操作流程，越详细越好。但是我从各种书上得到都太简单。所以想请您帮忙，看我现在应该看什么书，或着从那里能得到我的最需。万分感谢。

作者: any333 时间: 2013-9-14 18:25

你好！又要请教你了。我现只做出内参。做的是肾上腺素受体（七次跨膜蛋白）。
我怀疑是否蛋白提取出问题。做之前精美公司说他们的核蛋白提取试剂盒什么都能提，我就买了，说明书介绍方法提有提胞浆蛋白，核蛋白、总蛋白的提取。我按照总蛋白提取得放法。加了烈解液后12000g/min离心20分钟取上清。请问该试剂盒能用否，或哪里需要改进的。

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我和你的实验内容差不多哦，也要一个提取G－蛋白偶联的膜蛋白，请问你知道你购买的核蛋白提取试剂盒裂解液配方吗？我想与我的配方比较一下。谢谢。

作者: any333 时间: 2013-9-14 18:26

要检测一抗性质（能否与二抗结合，以致最后显色），可不可以用如下办法：将一抗点于空白膜上（时间，条件？），然后用5％牛奶封闭，洗膜，再加二抗，洗膜30min×3，ECL显色，若点样部分曝光显色，其他部分无色，是不是表示一抗正常。

作者: tudou85 时间: 2013-9-14 18:26

我做western用丽春红染色出来了,可是加一抗二抗后,用DAB显色却什么都没有,可能是什么原因呢?和marker对目的条带应该有啊,一抗二抗以前都用的很好,疑惑!

作者: standbyme 时间: 2013-9-14 18:26

问个问题噢
之前我做WB的时候几次下来怎么都没有条带，后来选用了PVDF膜实验，但相应的问题也来了。几次做下来都有很多非特异性条带出现，开始以为是目的蛋白降解所致，但上周的一次实验结果更为离谱，不仅非特异性带能够显色，居然连原来PAGE胶上的溴酚蓝的带也显出来了，这好像已经不能用目的蛋白降解来解释吧。听同事说以前用PVDF膜做WB的时候非特异性也很厉害，不知道是否真的跟膜的选用有关，请楼主帮忙出出主意。

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-14 18:27

楼主和高手们.都来解释一下这种非特异显色的问题吧,真的很急!

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-14 18:27

我想做心内膜细胞内的eNOS（140KD），PAI-1的western（50KD）左右，目的看表达是否有改变，是半定量吧。标本是保存在液氮里的，是否能放在-70冰箱保存，期限呢？要不要内参，还是只要marker就行。检测这两种东西条件有没特殊不同的地方，请指点，谢谢！

作者: 小游abc 时间: 2013-9-14 18:27

12%的胶，50ug的上样量，跑完电泳，靠马思量蓝染后脱色，啥都没有了，MARK很清楚。原因何在？？一定是制样出问题了吗？？可是测蛋白含量还可以呀？？

作者: gogo 时间: 2013-9-14 18:28

1。考染未转的那一半胶，条带清晰
2。考染转过的那一半胶，没有任何条带
3。丽春红染膜，仅见膜最下方（和胶中最前方溴酚蓝的位置相对应）有条带，而其上方均无条带。
我用的是200mA，1h，有冷却系统的bio－rad。怎么回事？

作者: fei1226com 时间: 2013-9-14 18:28

我最近做western时，有些问题，请教以下：
1.背景有许多小斑点，以前没有的，条件也没有变，可能是什么原因，如何解决？
2.western 出现较多的非特异条带是什么原因，如何解决？（一抗没有换，以前挺好的）

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:29

你好！
上次稀释了一抗，二抗的浓度没有变，结果什么也没有？
转膜用PVDF膜，60v 2.5小时，立春红染色条带可见，牛奶封闭过夜，一抗37度2小时，二抗1小时，可是为什么结果非常干净，什么也没有？
真奇怪，你看应该怎么再改进呢？矫枉过正？

可能是稀释的过大了，你做的时候上样量增大一倍没有，如果是的，那么将稀释度向回调一点

作者: NBA 时间: 2013-9-14 18:29

我在western blot中碰到以下情况，请ptglab 帮我分析一下。谢谢。
转膜条件一：预置70V，147mv，时间2h，
转膜条件二：预置60v，200mv，时间1h，
设置以上条件时，电泳仪自动为恒流，不知为何？
条件二比条件一效果好，但电泳仪很热，并且膜上预染marker条带比胶上淡很多，并有扩散现象，很不清晰。您觉得转膜条件哪个比较好，或者有什么可以改进？
转膜后，剪其中一泳道，用立春红染色，有清晰条带，其他部分加入一抗二抗曝光后，因无条带，又将该膜用立春红染色，结果无蛋白条带，请问为何？

如果是湿法转移，可以用小一点的电流，上时间，（可以参考我前面的帖子）有条件一定在冰浴条件下转移，

转膜后，剪其中一泳道，用立春红染色，有清晰条带，其他部分加入一抗二抗曝光后，因无条带，又将该膜用立春红染色，结果无蛋白条带，请问为何
改用考染看看如果，另外这个如果每次都能重复出来在有意义问，偶尔出现一次，重做就可以了

作者: PCR 时间: 2013-9-14 18:29

电泳时，如果电流加大除了会加快电泳速度以外，还会导致怎样的结果；我的分子量在21kd左右，用了15%的胶，跑出的带在底部。如果胶的浓度再大一点的话，那我的蛋白带会在胶的中间还是在更底部

作者: 33号 时间: 2013-9-14 18:30

您好！我现在的困扰是我能作出actin的条带，但是我所需的cox条带一直做不出来！我的实验步骤大致是这样的：
1. 提取组织蛋白，100mg组织用1mlRIPA细胞裂解液＋10ul PMSF，用玻璃匀浆器在冰霜中匀浆，12000g 2-8度离心30min，取上清，用BCA法定量。
2. 10％SDS-PAGE电泳，（40ug/Lane）80V 30min，150V 60min。
3.BIORAD半干转印10V 1hr。（转印前把凝胶和NC膜放入转印缓冲液中浸泡15min，说明书中要求！）
4.用5％脱脂奶粉/TBST封闭1小时，TBST洗膜15min×3次。
5. 一抗（1：500）37度，孵育1小时或4度过夜。TBST洗膜15min×3次。
6. 二抗（1：5000）37度，孵育1小时。TBST洗膜15min×4次。
7. ECL显色。
我用的marker是低分子蛋白marker（14-97KD），转印效果还可以，只有第一条会在凝胶中残留，但膜上可见明显的六个条带！我的目的蛋白（cox蛋白）分子量为70KD！一抗是山羊抗大鼠的抗体（Santa cruz公司），二抗是兔抗山羊IgG（北京中山公司）！
我很困惑，为什么actin能作出来，而cox蛋白做不出来，请您为我指点迷津！谢谢！静候佳音！

作者: BUK 时间: 2013-9-14 18:30

你好！我做的是4KD左右大小的多肽，请问最好的转移电压及时间是多少，因为蛋白分子量太小，怕转移时间太长就会穿透，还有上次做的时候，转印仪上的网孔也被转到了膜上，是因为滤纸放的层数太少还是因为加完抗体后没有进行封闭，因为我用的是PVDF膜，所以就没用封闭。

作者: linlinstar 时间: 2013-9-14 18:31

各位好！我也在做Western，但一、二抗一直结合不好，我考虑抗体是以前购买的，且不是同一厂家的产品。请教大家，相比而言，哪家公司的抗体较好用？谢谢！

作者: 轰轰 时间: 2013-9-17 11:18

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原帖由 linlinstar 于 2013-9-14 18:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位好！我也在做Western，但一、二抗一直结合不好，我考虑抗体是以前购买的，且不是同一厂家的产品。请教大家，相比而言，哪家公司的抗体较好用？谢谢！ ...

一抗做了阳性对照是什么？

作者: 轰轰 时间: 2013-9-17 11:18

QUOTE:

原帖由轰轰于 2013-9-17 11:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗做了阳性对照是什么？

错了吧？
滤纸＞＝膜＞胶罢

作者: 轰轰 时间: 2013-9-17 11:19

DAB显色，ECL是什么都？

作者: one 时间: 2013-9-17 11:19

我准备作多抗，如何确定第一次注射蛋白用量？谢谢！

作者: whitesheep 时间: 2013-9-17 11:20

您好！我现在做western,有一个问题困扰了我很久，希望你能帮我解决这个烦恼。我的主要目的是观测用药物处理后细胞中特定蛋白的表达量的变化，但是我发现每次结果不好的根源在于上样量不相等，而这又是由于我蛋白浓度测的不准的原因。我用的裂解液配方是：1M Tris Hcl ph7.4 25ml;0.5M EDTA 10ml; 20% Triton-100 25ml; Urea 130g 加水至500ml. 我用过很多种方法测过蛋白浓度，利用染胶和不会受药物做用影响的蛋白做对比，每次的结果都显示各道的蛋白量是不相等的！

作者: tie8 时间: 2013-9-17 11:20

您好，我用噬菌体感染大肠杆菌，让大肠杆菌表达插入在噬菌体两臂间的基因，把表达出来的融合蛋白转印到安马西亚的ECL膜上（Amersham Biosciences公司），封闭，加一抗，二抗，加Santa Cruz公司的发光液，暗室曝光，洗片子，有时候效果还行，就是不稳定，信噪比太低，您能介绍一种适合做这个工作的膜吗？谢谢！

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-17 11:23

请问体内实验如何确定使用单克隆抗体?能经过呼吸道给药吗?

作者: kuohao17 时间: 2013-9-17 11:23

您好！我一直在做WB，四月份做的结果不错，可是现在做就不行了，我以前用的是国产的电泳仪，现在用的是Bio-rad 的，转膜不错，丽春红染色很好，可就是不出结果，后来加长染色时间，出现了类似丽春红染色的结果，只不过很淡很淡，请帮我分析一下，谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-9-17 11:24

我是新手，WB测PDE3A(磷酸二酯酶)蛋白表达
做了一个月了，也没得到较清晰的条带，郁闷中，特来求救。
我的实验全步骤如下：
细胞铲刮取贴壁细胞（约1000000 cells），低速离心收集，PBS离心洗涤一次,
冰浴下加Lysis Buffer 60 ul,涡旋30 min,12000 rpm离心10 min,取上清为蛋白样品液。
Bradford法测蛋白浓度，加5×Loading Buffer,煮沸5 min,
按50 ug蛋白/well上样,12％浓缩胶，mini-gel ，100 V,电泳2 h。
转膜条件：350MA,冰浴，2 h.
Blocking Buffer（PBS, 0.02%Tween-20 ，NaN3,0.02%BSA(SANTA CRUZ 公司推荐)）封闭1 h、
PBST洗膜10 min X 3，
一抗(Santa Cruz多抗，推荐稀释度1：500－1：5000，选1：1000)孵育2H
TBS洗膜10 min X 3，
二抗(推荐稀释度1：1000－1：5000，选1：2000)孵育2 h,
TBS洗膜10 min X 3，
ECL显色。
每次转膜后，预染Marker均可全部转到膜上，膜用氨基黑染可见清晰条带，
预染Marker，目的蛋白泳道都见条带
我共做了多次，都在暗室中看到膜上条带荧光，压片后，x片上的目的条带很淡，背景深，也有非特异条带。
我觉得可能原因：
1）一抗、二抗稀释度过高，
我打算今天把一抗降到1：200、1：500，二抗降到1：500、1：1000，再试试看。
2)洗脱不干净
3)一抗失效，
我不知怎么检测一抗是否失效（二抗在暗室中可使ECL发强荧光，应该未失效）

请给些建议，谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-17 11:24

我准备做Cathepsin L的免疫组化及Western,请问该订什么样的抗体？有哪个网站吗？谢谢提供几个。

作者: bring 时间: 2013-9-17 11:25

您好，请教一下：
1、我把样本加入孔内后，刚加压跑较不到3分钟，发现样本进入浓缩胶的部分扩散的十分厉害，大约有加样孔宽度的3倍，而仍留在加样孔的样本还是那样宽。请问这是什么原因？对试验结果有影响吗？
2、我买了santa cruz公司的一抗，说明书上建议起始稀释浓度为1：200，请问这样的是否太浓了？您的建议是就用1：200，还是1：500或1：100？
多谢了！！！

作者: jkobn 时间: 2013-9-17 11:25

膜>= 滤纸> 胶?
可是为什么我看到的是胶>膜呢？

作者: 轰轰 时间: 2013-9-17 15:58

应该是胶＞膜
之前是我搞错了

作者: u234 时间: 2013-9-17 15:58

求助：做磷酸化的western用什么蛋白磷酸酶抑制剂，在那些环节中用

作者: yonger 时间: 2013-9-17 15:59

你真的能肉眼看见ECL荧光吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-9-17 15:59

做Western blotting时抗原量大当然能看见, 做原核表达时就看不见拉,不过胶片能感光.

作者: wmp1234 时间: 2013-9-17 16:00

你真的能肉眼看见ECL荧光吗？

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做Western blotting时抗原量大当然能看见, 做原核表达时就看不见拉,不过胶片能感光. 安马西亚新出膜能在暗室里用相机拍或通过CCD导入电脑看的.

作者: bring 时间: 2013-9-17 16:00

请问：电泳槽和转膜槽用时间长后，里面的金属丝上沉积了缓冲液中的电解质，导致电泳和转移的效率下降。应该怎么清洗？听说NaOH可以是吗？浓度是多少？
扩展的问题：槽应该怎么保养？
这个贴太长，不知道我问的问题前面有没有。

作者: newway 时间: 2013-9-17 16:05

我最近做westernblot显出的带子总是有两个样本跟其它样本不跑在一条线上，但是宽窄是一样的。（分离胶是很平整的）。请问这是什么原因呀？谢谢了！

作者: 66+77 时间: 2013-9-18 11:13

不知有没有人用过Triton x-114作为裂解液成份，李永明的实用分子生物学技术手册上曾经专门讲到用Triton x-114来提取膜蛋白的方法，其中曾经说到原则上在4度的时候，一切蛋白质都溶于Triton x-114，由此我想将我们常用的裂解液配方中的Triton x-100或NP-40换成Triton x-114，不就可以成为全细胞裂解液了。只是我搞不懂x-100、x-114、
NP-40它们作用上的区别，不知替换后是否真的可以成为全细胞裂解液，正在实验中，还请各位发表高见。

作者: 68943512yao 时间: 2013-9-18 11:14

请教前辈：
我准备做大鼠脑的WB，是谷氨酸受体一种膜受体，表达量很低，我应该如何提取组织膜蛋白，WB中还有什么需要注意的吗

作者: loli 时间: 2013-9-18 11:14

不知道大侠做没做过磷酸化的免疫印迹，如果有的话，能否把经验拿来分享，有什么要注意的事项？我做过一般的免疫印迹，出过一些问题。但是结果还好，现在要做磷酸化蛋白的免疫，心底有点帕帕的，能预先告诉我一般会出现什么问题，如何避免等问题吗？我的蛋白是CHK2 的磷酸化蛋白，44KD，打算用10％的分离胶，半干转（我们实验室都用这个方法，效果很稳定）。刚刚看到上面的帖子说制样很重要，不知道需要注意什么问题。还有一个小问题想请教，PI的三种蛋白酶抑制剂用什么溶剂溶解。（这个以前没自己配过，老板在美国带回来的，用的快没了，又不好意思问老板这么简单的问题）
希望大家一起参与讨论，互通有无。

作者: hyuu 时间: 2013-9-18 11:15

我想做一个western 肝组织的样品应该怎么处理？
用普通的裂解的方法裂解离心之后的上清总是有很多悬浮的絮状的东西导致无法取得清亮的蛋白溶液做的western 的膜就特别脏显色之后有很多点状的东西

还有一个问题就是配封闭液时加tween 和不加有什么区别呢

刚刚学会做很多不明白的地方谢谢帮忙啦
多谢

作者: fei1226com 时间: 2013-9-18 11:15

我做细胞表达人血清白蛋白的Western ，现在发现做出的结果是：不管是标准品的阳性对照还是细胞表达上清的泳道都出现了很多杂交条带，我的一抗是用1：1000，二抗是用1：2000，得出这样的结果令人不可思议。开始我认为是蛋白降解，但与蛋白标准Marker对照却发现有些杂交条带比人血清白蛋白（65kD）还大，在65kD的地方是一条最深的带，在这条带的上下都有不明原因的带。是因为标准品不纯同时杂质还与抗体发生交叉反应吗，或者还是由其它的原因造成的呢？我的一抗及标准品都是从Sigma买的啊。请各位高手分析分析，谢谢！

作者: bongte 时间: 2013-9-18 11:16

不知道你们电泳和电转是用的什么设备。我的时间好像比你们的短多了吗？175kd的目标蛋白，电泳最多也就1.5hr,电转不能超过32min的。我还是觉得恒压比较好压。

作者: 分子式 时间: 2013-9-18 11:17

各位大虾：我最近做一个小分子蛋白50KD（人血中）的western blot，我是用重组蛋白免疫动物获得多抗后再检测血天然蛋白，但是问题是可以检测到重组蛋白达到20ng，检测天然蛋白时开始可以看到微弱的带色很浅，不能扫描，重复几次效果更差，因为天然蛋白血中含量很低（1ug/ml），我每次加样20ul，还有就是我将血清加load buffer一煮就成凝胶状，只好每次稀释样本，所以含量更低了，我用的是DAB显色，哪位大虾能指点我问题在哪里，还有有什么办法更灵敏，或者如何提高样品的浓度，非常紧急，先谢了

作者: ero11 时间: 2013-9-18 13:19

请问一下，电转以后封闭，是用5％的TBS的脱脂奶粉，还是5％的TBST脱脂奶粉好呢。

作者: qianqin1977 时间: 2013-9-18 13:20

请教大虾:我想测定25KD的BCL-2蛋白，用的是NC膜，半干式转膜1小时（1mA/cM2），5%脱脂奶粉封闭，一抗工作液稀释浓度是1：20，二抗三抗均为1：20，DAB显色，但膜上总没有条带，而电泳结束后直接将凝胶染色则可见条带，请高手指点！

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-9-18 13:20

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原帖由 qianqin1977 于 2013-9-18 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教大虾:我想测定25KD的BCL-2蛋白，用的是NC膜，半干式转膜1小时（1mA/cM2），5%脱脂奶粉封闭，一抗工作液稀释浓度是1：20，二抗三抗均为1：20，DAB显色，但膜上总没有条带，而电泳结束后直接将凝胶染色则可见条带，请高手指点！ ...

偶做了几次bcl-2，条带是有，但是不太清楚，不知侬的抗体是那边的，另bcl-2定位在细胞内膜系统，所用裂解液应该能够提取膜蛋白才行。

作者: 圆圆圈圈 时间: 2013-9-18 13:20

您好，想请教个菜鸟问题。
做小鼠的样本，选择小鼠来源的一抗行吗？二抗抗小鼠会不会产生极高的背景？？

作者: qianqin1977 时间: 2013-9-18 13:21

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原帖由 +小生怕怕+ 于 2013-9-18 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

偶做了几次bcl-2，条带是有，但是不太清楚，不知侬的抗体是那边的，另bcl-2定位在细胞内膜系统，所用裂解液应该能够提取膜蛋白才行。

天又试了一次，条带出来了，但过宽，我的裂解液是RIPA+PMSF, 一抗是北京中山金桥公司的，二抗三抗也是它的PV9000试剂盒。

作者: one 时间: 2013-9-18 13:22

请问大虾：为什么我转膜染色（用的super signal），背景也清楚，条代也不错，但是总是缺带，边上条代不清，或者中间条代明显不清楚。我用考马四亮篮染胶，胶没问题。
我转膜，180mv，1。5h。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-18 13:24

我现在作小分子量蛋白的western blot,分别是hsp27（分子量27 ）和histone h4(分子量18),用了15%的sds-page胶，湿式转膜，90mA,30V过夜，条带不明显，高手指点

作者: okhaha 时间: 2013-9-18 13:24

我是做细胞因子刺激后胞浆内磷酸化PI3K表达量变化的，需要actin做内参。我实验室的老师说要同时跑两份样品，可我想请问在同一张膜上可以同时或先后加一抗和anti-actin吗？即只做一份样品。请各位高手赐教！

作者: wood533 时间: 2013-9-18 13:25

我用了单克隆抗体，跑了几次都是两条带，相隔还比较远，为什么呢？

作者: lxh031 时间: 2013-9-18 13:25

请问您有没有做过环氧合酶COX的western！我现在actin每次都能做出来，但是按照同样的方法，COX的一直作不出来，不知道哪个环节出问题了，请帮忙解答一下，万分感谢！
我做过COX的WB,而且很好做,你看看是否是提蛋白上和一抗方面出了问题?

我是在怀疑这两方面的问题，但是请教了很多老师都说用RIPA细胞裂解液提取蛋白应该没问题，还在怀疑一抗的问题（SANTA CRUZ），如果可以的话，您能否提供您当时做的实验方案？谢谢！我曾经给您发过一封邮件，写了我大致的实验步骤！谢谢！

作者: glass 时间: 2013-9-18 13:26

各位好：我真诚的请教问题
我用1*sds凝胶加样缓冲液直接裂解细胞，请问怎么测蛋白浓度，本人万分着急，如能回答本人将万分感激！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:27

你们好
看到你们贴子，我想我可能有救了，我是新手，刚做了两个western,可是结果简直是让我想从8楼上跳下来，可是我可能不会的。我还是说说我的实验吧。
我作了一个融合表达，EGFP和目的基因，选用的是PEGFP-C1，在ecorI和bamhI处插入。我转然后在荧光显微镜下可见比较好的转染效率，用的是分子克隆的三去污剂裂解缓冲液裂解细胞，上样前煮了10分钟，结果是在对照（未转染）组和实验组同时同地出现了一条带，我认为是单抗的问题，因为该抗体未用于作过western, 我接着买了EGFP的多抗，发现结果与第一次几乎一样的，也就是说对照组和实验组在同一位置出现了条带，好象就是EGFP的位置，但是为何对照组也有呢，麻烦你给我一些建议，帮我分析一下。

图片附件: 78914526.jpg (2013-9-18 13:27, 22.14 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18519

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:27

从第三孔开始，依次是对照，MARKER,实验组1，实验组2，一共4孔。对照组的带稍浅一些。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:28

补一张黑白的

图片附件: 26701776.snap.jpg (2013-9-18 13:28, 20.23 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18520

作者: vcve 时间: 2013-9-18 13:29

请问你有没有做过鼠脑脑内蛋白的提取，240kDa左右，裂解液有什么特殊的要求吗？用什么样的抣浆器抣浆？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-18 13:29

请问大虾, 我现在在检测HeLa细胞中Bcl-2的表达,细胞用量约10*7,检测方法是用DAB:
1,一开始没有检测到目的条带,在55KD处有一隐隐约约的非特异条带,因而怀疑是一抗(SantaCruz,中山代理)的问题.
2,换成博士德的一抗后,第一次测到了较明显的27KD左右条带,但后几次Western Blot的结果不太稳定.条带感觉越来越淡.
3,因为想了解RNAi抑制细胞中Bcl-2的表达的效果,所以想找一个更敏感的检测方法以确定本底表达,再测定干扰效果,不知ECL或ECF是否会更灵敏一些?由于ECL或ECF都没整过, 需要哪些东东,用哪个公司的产品较好实在困惑?另外能否E一份protocol给在下,感激不尽.

作者: nn255 时间: 2013-9-18 13:30

您好！
请问：显影时胶片一片空白，可能的原因有哪些？我的目的蛋白是膜蛋白。谢谢！

作者: pengke1983 时间: 2013-9-18 13:31

我想请问一下是不是膜上出现预染Marker的条带就说明转膜应该是没问题的?
想用DAB显色,能否告知具体步骤?
多谢!

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-18 13:31

相关疾病：
浆细胞白血病
俺每次做，都会出特异性条带，可就是重复性很差，结果也跟俺想象的差很远，忽高忽低的。能给点建议吗，问题是出在制样上吧？俺用的是白血病细胞株。你能有空把你的实验心得和俺们分享一下吗？

作者: star#room 时间: 2013-9-18 13:32

我要用Wstern-blotting的方法研究细胞膜上的一种受体蛋白亚基（分子量：55KD）的表达情况，请问各位大侠，用什么方法获得此种受体蛋白的粗提物？？？
就目前我查到的资料显示需要40000rmp的离心机，但是我手上只有12000~15000rmp的离心机，我该怎么办？？？
有没有什么其他的方法？？

作者: abc816 时间: 2013-9-18 13:32

小弟最近在做wb，遇到几个问题，急盼老兄给予解决
1，半干转膜时的电流与电压如何计算，用恒流与用恒压有何区别，我们的胶的厚度是0.75CM,要用多大电流或电压
2. 我们在摸索试验的时候老出现这样的问题,就是转膜后丽春红染色能发现膜上有蛋白,但经过封闭,一抗及二抗之后,用化学发光法去拍片子,片子上什么都没有,估计是什么原因?我们用的是KPL公司的化学发光法,爆光底片的选择有要求嘛?

作者: vcve 时间: 2013-9-18 13:33

（求助）我做western blot两个星期了，每次都是同一个结果：丽春红染色条带很清晰，可胶片洗出来却是什么也没有。我的操作过程是这样的：丽春红染色后封闭1小时，一抗4度过夜或摇床1小时，分次洗膜25分钟，2抗摇床1小时，分次洗膜25分钟，显色液显色1-2分钟，之后暴光洗片。所用试剂是进口试剂合，应该没问题的。不知道问题出在什么地方，希望高手能帮帮我，谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:33

我的SDS-PAGE电泳图，各加样孔间总是有点弥散，所以做western 的时候有的条带就连在一起，图不很漂亮。请问是怎么回事啊？换新的电泳缓冲液也不行。

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:34

再问：哪家公司的bcl-2抗体比较好用，我试过博士得公司和中山公司分装的都不行.

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:34

我最近也在做BCL-2，两个公司的抗体都用了，确实不好用，看来是抗体的问题吧，要不要换公司试一试。

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请问大虾, 我现在在检测HeLa细胞中Bcl-2的表达,细胞用量约10*7,检测方法是用DAB:
1,一开始没有检测到目的条带,在55KD处有一隐隐约约的非特异条带,因而怀疑是一抗(SantaCruz,中山代理)的问题.
2,换成博士德的一抗后,第一次测到了较明显的27KD左右条带,但后几次Western Blot的结果不太稳定.条带感觉越来越淡.
3,因为想了解RNAi抑制细胞中Bcl-2的表达的效果,所以想找一个更敏感的检测方法以确定本底表达,再测定干扰效果,不知ECL或ECF是否会更灵敏一

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:34

我也在做BCL-2，一直做不出条带，请问裂解液的详细配方是什么？我用的是普通提取细胞总蛋白的裂解配方（150mmolNacl，50mmolTriscl,0.1%SDS,100Ug/ml PMSF,1%NP-40)，这样的裂解液不行吗？
北京中山金桥公司和北京中山生物有限公司是一样的吗？是不是也是分装的santa cruz的产品？
非常感谢！

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今天又试了一次，条带出来了，但过宽，我的裂解液是RIPA+PMSF, 一抗是北京中山金桥公司的，二抗三抗也是它的PV9000试剂盒。

作者: babybabe 时间: 2013-9-18 13:35

如果要你用同位素标记抗体做实验，你作不作？该怎么办？

作者: sunnyB 时间: 2013-9-18 13:36

我是用湿转，40v 1小时40分钟检测肝细胞LDL受体，作乐一抗和二抗的预实验，确定了比例；结果暴光出来胶片很花，在胶片上看的出marker，，但看不到该有的检测带，照理，这个肯定有基础表达的，请问是怎么回事呢？

作者: caihong 时间: 2013-9-18 13:36

各位高手好！我也在做小分子（12~24KD）蛋白的western，可是一直没有结果，大分子没有问题。现在不知如何啊？不知道是样品里根本就没有小分子蛋白还是没有作出来啊？请高手指教！

作者: memory 时间: 2013-9-18 13:37

我想请问一下，酶标记的抗体置于4度保存，一般可以保存多长时间？我们买的抗体现在放了快到一年了，不知道抗体的活性会怎样。我们买的是invitrogen公司的。谢谢！

作者: daod 时间: 2013-9-18 13:37

你好！我准备做westernblotting。刚接触不是很清楚。我的目的蛋白是带6HIS的融合蛋白。我想直接用histag来检测，要买哪些药品？一抗，二抗，膜等都没有，大概要多少钱？你能否给我一些资料，预算之类的，我要给我导师。

作者: BUK 时间: 2013-9-18 13:38

我检测了蛋白磷酸化水平之后，想把膜上结合的一抗strip 掉，再换不只针对磷酸化蛋白的一抗，来检测同一蛋白的总量以做内标。但是我做的总是不好，好像每次strip都太厉害，膜上除了一抗外，原有的蛋白也会丢，请问你有好用的strip buffer的配方吗？具体该怎么做？谢谢！

作者: jude 时间: 2013-9-18 13:38

有什么好的光密度扫描分析软件?

作者: zsxan1990 时间: 2013-9-18 13:38

我现做western，但我的条带用NBT/BCIP显色很弱，有时还有两条，三条非特异条带，但也都很弱，且显色的背景不干净，我上样量70ug/孔，我应该如何调整一抗，二抗的浓度，还有那些需要注意的，谢谢

作者: moonlight45 时间: 2013-9-18 13:39

我最近在做WESTERN,但结果总是不太好，我是杂全细胞裂解液中的蛋白磷酸化的，我转膜后用丽春红可以看到蛋白条带，用磷酸化的抗体却杂不到清晰的条带，我认为有可能是一抗有问题（是SANTA CRUZ的抗体）你认为还有可能是什么原因呢？在次感谢！

作者: abc816 时间: 2013-9-18 13:39

你好
图一是我三个月前做的WB结果,清晰,干净
图二是近期的WB 结果,90~60kD总有一片阴影,操作程序不变,缓冲液现用现配,但总是无法去掉,请帮忙分析一下,谢谢.
图一

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18521

作者: abc816 时间: 2013-9-18 13:40

图二请帮忙分析一下,谢谢

图片附件: 62931672.snap.jpg (2013-9-18 13:40, 38.63 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18522

作者: xue258 时间: 2013-9-18 13:40

我要做定量Western，是不是一定要内参，我看到有人说定量一定要有内参，是吗？常用的两种内参哪个更好些呢？在加抗体的时候目的抗体和内参抗体哪个先加有说法吗？谢谢！

作者: eric930 时间: 2013-9-18 13:41

我需要定量做，不知有什么方法？

作者: ffaa 时间: 2013-9-18 13:41

请教应用Western鉴定重组蛋白如何选择一抗
我表达了一种重组蛋白，N-端为某种天然多肽，35个aa；C端为某一天然多肽的一部分，7个aa。对于这两种天然多肽都有商品化的单抗，我可以选择其中一种吗？若可以的话，能不能出现一抗不结合目的蛋白的情况？若不能，我还可以选择什么其他的方法鉴定我的目的蛋白（最好是特异又经济的）？特急！！！

非常感谢！

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:42

我的Western目的蛋白做不出，但用了Actin和GAPDH两种内参曝光后都有条带，我怀疑是蛋白提纯问题或转膜问题，准备再做一次；我的蛋白是膜蛋白，分子量28KD，用三去污剂裂解组织样本，4度12000转离心30min后取上清。湿转，350mA，2h，请问问题出在蛋白提纯上吗？请教提取膜蛋白方法，谢谢大虾！！

作者: kswl870 时间: 2013-9-18 13:45

这个问题我刚问了老师，如果两种一二抗都是同种抗体（如一抗都是鼠抗人），加一抗时候目的抗体和内参抗体可以一起加，二抗加一次就行。

作者: gogo 时间: 2013-9-18 13:45

请问（1）：PVDF膜为什们要用甲醇泡？（2）：一抗和二抗的比例有何讲究？（3）：有人说如果抗体非常珍贵，可以使用后回，想问一下如何回收？是将稀释抗体的封闭液一起回收吗？一抗不都结合到膜上去了吗？这种回收的抗体能反复用几次？

作者: DONT 时间: 2013-9-18 13:45

我要作定量的Western，是不是一定要内对照呢？怎么定量呢？

谢谢！

作者: nvdabing 时间: 2013-9-18 13:46

请问：我用血清做Western，如何处理血清标本（－80 C），使它能做Western，要lysis buffer吗。

作者: 2541 时间: 2013-9-18 13:46

2.5 kd的多肽有办法做WB吗，打抗体的时候是否需要一个载体呢。

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-18 13:46

我做Western时，最后采用DAB显色时为何NC膜会全变色，而只有预计的条带为白色呢？
请给点建议。

作者: fox_79 时间: 2013-9-18 13:47

我用非变性梯度胶分离大分子量地蛋白（复合体），想用半干转膜，应该用多大电流（每平方厘米），转多长时间，这样对中等分子量（70kd）地蛋白有没有影响

作者: fox_79 时间: 2013-9-18 13:47

补充说明一下，蛋白（复合体）可能有几百KD

作者: INK 时间: 2013-9-18 13:48

蛋白样品经过四次冻容western效果将会比较差吗？

作者: tuuu2 时间: 2013-9-18 13:48

9KD用湿式能转出吗

作者: hustwb 时间: 2013-9-18 13:49

哪位知道哪个公司有9KD蛋白用的预染marker？

作者: xue258 时间: 2013-9-18 13:49

能提供一些离子通道膜蛋白的提取方法吗？（转染在HEK－293上）谢谢

作者: summerxx 时间: 2013-9-18 13:50

我是新手,上周按照实验室别人的protocol做了三次western,结果都不好,大家帮帮我吧,谢谢!
脊髓组织,目的蛋白是17k和90-110k的两种
1.分离胶都用的12%,定电流20mA,电泳2hrs左右
2.转膜100mA,1hr,硝酸纤维膜,孔径0.45微米,5%脱脂奶粉封闭1hr
3.一抗分别是1:1000和1:1500,用1%脱脂奶粉/T-PBS稀释,封在塑料袋内,4度过夜
4.二抗是按照试剂盒的说明做的,DAB发色.
结果都是出现好多杂带,而目的蛋白却没有,哪里有问题,请大家指教!

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-18 13:50

你好，我现在做的课题是先用免疫组化SABC法检测到了某中抗体可以和神经元的胞浆和胞核上的蛋白结合，我想用WESTERN BLOT进一步检测以下这种抗体和分子量多少的蛋白结合，我想请教一下：我的试剂盒是不是用免疫组化的就行了，还要再买吗？
谢谢！！

作者: jkobn 时间: 2013-9-18 13:50

我现在正准备作实验，查资料时发现检测葡萄糖转运蛋白的方法，文献上最常用两种：免疫荧光法和western blot法，请问这两种方法，何种更经济一些？毕竟，我们经费有限啊！希望大侠不吝赐教。另外，免疫荧光法能做定量么？要是不行，还要做什么实验？

作者: 兔纸 时间: 2013-9-18 13:51

我准备做小鼠组织中的Bcl-2,Bax, caspase-3、8、9 的western blot ，但听说很难，不知你那有没有较好的protocol ，我好依葫芦画瓢。

另外这些蛋白的测定对细胞裂解液的要求是否一样？什么裂解液比较好

作者: youyou99 时间: 2013-9-18 13:52

我是新手,上周按照实验室别人的protocol做了三次western,结果都不好,大家帮帮我吧,谢谢!
脊髓组织,目的蛋白是17k和90-110k的两种
1.分离胶都用的12%,定电流20mA,电泳2hrs左右
2.转膜100mA,1hr,硝酸纤维膜,孔径0.45微米,5%脱脂奶粉封闭1hr
3.一抗分别是1:1000和1:1500,用1%脱脂奶粉/T-PBS稀释,封在塑料袋内,4度过夜
4.二抗是按照试剂盒的说明做的,DAB发色.
结果都是出现好多杂带,而目的蛋白却没有,哪里有问题,请大家指教!

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一抗浓度还是太高！调整一下。一抗结合的时间也太长！
还有block 多长时间？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:52

我是新手,上周按照实验室别人的protocol做了三次western,结果都不好,大家帮帮我吧,谢谢!
脊髓组织,目的蛋白是17k和90-110k的两种
1.分离胶都用的12%,定电流20mA,电泳2hrs左右
2.转膜100mA,1hr,硝酸纤维膜,孔径0.45微米,5%脱脂奶粉封闭1hr
3.一抗分别是1:1000和1:1500,用1%脱脂奶粉/T-PBS稀释,封在塑料袋内,4度过夜
4.二抗是按照试剂盒的说明做的,DAB发色.
结果都是出现好多杂带,而目的蛋白却没有,哪里有问题,请大家指教!

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从你的描述来看只有非特异条带而无目的条带
，是抗体有问题，好好检察一下抗体是否好用吧

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:52

哪位知道哪个公司有9KD蛋白用的预染marker？

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NEB（BioLab）有，你查查目录，我具体记不清货号了~

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:53

我检测了蛋白磷酸化水平之后，想把膜上结合的一抗strip 掉，再换不只针对磷酸化蛋白的一抗，来检测同一蛋白的总量以做内标。但是我做的总是不好，好像每次strip都太厉害，膜上除了一抗外，原有的蛋白也会丢，请问你有好用的strip buffer的配方吗？具体该怎么做？谢谢！

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我们一般剥离条件是50度 30分钟（摇床50~100rpm或轻摇)，效果很好啊。剥离缓冲液配方见
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=2132338&sty=1')

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:53

图二请帮忙分析一下,谢谢

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降低一抗浓度

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:53

我现做western，但我的条带用NBT/BCIP显色很弱，有时还有两条，三条非特异条带，但也都很弱，且显色的背景不干净，我上样量70ug/孔，我应该如何调整一抗，二抗的浓度，还有那些需要注意的，谢谢

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你这个呢问题有两个，1.显色的背景不干净是一抗二抗孵育完后没洗干净，2.二抗浓度高了会产生非特异。显色弱你可以试着压片时间长一些，但这样肯定背景会增高。还有你的样品是否本身不纯或是有降解？可能会有多条带~

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:54

2.5 kd的多肽有办法做WB吗，打抗体的时候是否需要一个载体呢。

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可以阿，跑20%的胶，做抗体的话，可以用胶联剂将你的蛋白胶联后免疫，比加标签好一些

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 13:54

请问（1）：PVDF膜为什们要用甲醇泡？（2）：一抗和二抗的比例有何讲究？（3）：有人说如果抗体非常珍贵，可以使用后回，想问一下如何回收？是将稀释抗体的封闭液一起回收吗？一抗不都结合到膜上去了吗？这种回收的抗体能反复用几次？

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答1.PVDF膜用甲醇泡是让膜的孔径张开，这样才能更好的吸附蛋白。2.一般按照说明说就好。3.直接将稀释抗体的封闭液放到4度或-20就行，-20保存时将更长一些，一抗是有一部分结合到膜上了，但是不可能全部都结合的，protein interaction 是一个动态平衡的过程，到达一定程度就饱和了，虽然抗原抗体的反应要比一般的蛋白相互作用强~这种回收的抗体我们做过反复用三次是没什么问题的。

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-9-18 13:54

我的样品分子量为：35KD，请问内参选多少合适？有20KD大小的内参吗？

作者: bs4665 时间: 2013-9-18 13:55

太好了,有问的地方了,先谢谢你
我用BSA做封闭液时,背景太高,没有办法进行分析,换成TTBS配制的5%脱脂奶粉后,就没有结果了,我使用的是DAB进行显色的

作者: @花开花落@ 时间: 2013-9-18 13:55

您好：
我现在想做Western，遇到了一个问题：就是我的蛋白是分泌性蛋白，我要收集上清液标本，我不知道收集上清液后怎样把我要的蛋白提出来？与收集细胞标本有何不同？
再请教：分泌性蛋白可不可以收集细胞测到蛋白表达？（我做的是逆转录病毒转染，目的基因应该已经整合入宿主细胞的染色体的）

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-9-18 13:56

我要做蛋白半定量，请问各位高手，那里可以找到结果分析软件？

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-18 13:56

我的蛋白不到10KD。我每次转膜小的蛋白都转不上去，而大一些的蛋白都转上去了，请问有什么好的方法？包括PAGE胶的浓度是不是15%？转膜的电压？时间？

先谢谢你啦！

作者: TAT 时间: 2013-9-18 13:56

我用的也是这个剥离缓冲液，只是我以前的温度用56度的，剥离后总是会把与原先一抗结合的PVDF膜上的蛋白也剥离掉，再加新的一抗杂交后那儿就会出现空白，我下次把温度降低到50度试试。

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-18 13:57

我做的指标有三个都是120KD－－130KD之间，我用7.5％的分离胶跑2h－2.5h，但是转膜效果不好，请教各位大侠，有什麽好的办法帮帮我！多谢！（顺便说一句，我用的是北京六一厂的半干电转仪）

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-18 13:57

我是新手，以前都是搞的临床，现在要做实验，简直是没地方下手，想请教些关于western的问题：
1、欲从脊髓组织中提取一种250KD的蛋白，想知道跑电泳时的条件，比如胶的厚度、比例、试剂的量、电压。
2、转膜时的条件
多谢！

作者: www.1 时间: 2013-9-18 13:58

请教高人，我做western的蛋白表达条带很弱，上样量每孔已25微克了，一抗1：1200，还有其它办法吗？

作者: wood533 时间: 2013-9-18 13:58

想要采集western blot图中各个蛋白条带的光密度值，以作比较。不知哪位版主有相关的软件，能否传送一下。非常感谢

作者: uuooii 时间: 2013-9-18 13:59

您好！向您请教关于电泳和抗体方面的问题！
IgM 的五聚体结构中,,据说不是二硫键连接J链和两条重链,那么跑电泳是不是就有三条带了呢?这是我困惑已久的问题.谢谢您在丁香园上的付出，如果还有问题，可以直接给您发Email吗？我是新手，好多问题都不明白，还请您多多指教！谢谢！

作者: xingyi08 时间: 2013-9-18 14:00

请问你这么大分子量的蛋白做western ，胶的浓度用6%行不行，转膜什么条件比较好，我这里用的是半干转膜，谢谢！

作者: newway 时间: 2013-9-18 14:00

哪里可以查到MMP蛋白的结构和半衰期？因为我的标本在液氮冻过后存在-80度已经1年了，现在上样量200UG一抗1：100，条带仍不清楚，（ACTIN 和另一个受体蛋白很好），而且我借来的瘤细胞的蛋白样品想当阳性对照的，存在-80度2个月后条带也不清楚了，您做过这个蛋白吗？盼回复。另外，RIPA裂解液是否有很多方案，哪个裂解效果最好？不能加EDTA吧，它会抑制MMP的吧？

作者: newway 时间: 2013-9-18 14:01

哪里可以查到MMP蛋白的结构和半衰期？因为我的标本在液氮冻过后存在-80度已经1年了，现在上样量200UG一抗1：100，条带仍不清楚，（ACTIN 和另一个受体蛋白很好），而且我借来的瘤细胞的蛋白样品想当阳性对照的，存在-80度2个月后条带也不清楚了，您做过这个蛋白吗？盼回复。另外，RIPA裂解液是否有很多方案，哪个裂解效果最好？不能加EDTA吧，它会抑制MMP的吧？

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-18 14:01

请教大家，如果细胞培养上清某因子含量太低，以致不能出现明显条带，如何进行浓缩？浓缩到多大浓度合适？

作者: cwcwcww 时间: 2013-9-18 14:02

你好！我准备做western blot，用DAB显色。请问二抗一定要用辣根过氧化物酶标记的吗？过氧化物酶标记的二抗行吗？如果不用辣根过氧化物酶标记的二抗，发文章有说服力吗？我刚从事实验工作，太多的不懂，请不吝赐教。

作者: linlinstar 时间: 2013-9-18 14:02

我是一个WB的新手，现在遇到一个问题：转膜后，用丽春红染色总是看不到条带，膜上一片空白。我蛋白上样量为30-40ug，转膜条件为150mA，2小时（湿转）。但是随后的ECL曝光又有条带。因为有杂带，需要MARKER参照，结果丽春红染色又染不出MARK，急。
请牛人帮帮我。

作者: kuohao17 时间: 2013-9-18 14:03

请问IKs通道的α亚单位的分子量和β3肾上腺素受体的分子量各是多少？如果要做SDS-PAGE分离，凝胶浓度应配多大合适？

作者: kuohao17 时间: 2013-9-18 14:03

求助：请问Iks通道的α亚单位和β3肾上腺素受体的分子量各是多少？如果做sDS-PAGE分离，凝胶浓度应配多大的？

作者: sunnyB 时间: 2013-9-18 14:03

我也提一个有关转膜的问题。
我选用的是PVDF膜进行转膜，但几次转膜后用丽春红染色发现没有蛋白转上。
PVDF膜转前用甲醇泡过，电转条件为湿转100v 1hr。Transfer buffer用过25mM Tris,192mM glycine,20% methanol;也用过不含甲醇的Transfer buffer（BIO-RAD的 protocol上建议说用PVDF膜的话buffer不加甲醇）几次实验都转不上，而选用加甲醇的buffer转NC膜是成功的。
另外两种buffer里都有0.1% SDS.。

作者: yychen 时间: 2013-9-18 14:04

我也提一个有关转膜的问题。
我选用的是PVDF膜进行转膜，但几次转膜后用丽春红染色发现没有蛋白转上。
PVDF膜转前用甲醇泡过，电转条件为湿转100v 1hr。Transfer buffer用过25mM Tris,192mM glycine,20% methanol;也用过不含甲醇的Transfer buffer（BIO-RAD的 protocol上建议说用PVDF膜的话buffer不加甲醇）几次实验都转不上，而选用加甲醇的buffer转NC膜是成功的。
另外两种buffer里都有0.1% SDS.。

你湿转的时候最好用低电压，长时间，比如：60v，4小时。另外转膜后如果丽春红染不上，可以换用氨基黑或者考马斯亮蓝（这种方法只能用于PVDF膜，且染完后还可以做后续的ECL显影，我做过的）。立春红染色的范围：5ug，氨基黑染色：1ug，考马斯亮蓝：500ng.

作者: yjf1026 时间: 2013-9-18 15:10

考马斯亮蓝染膜方法与染胶方法一样吗？

作者: orangecake 时间: 2013-9-18 15:11

最近我们室做WB出现了这种怪现象：其他抗体的WB都很正常，惟独有一种多抗总是背景很高，但特异的条带却与说明书上的不相符。调整了抗体稀释度1：5000-1：10000也没有明显改善，实在不知道该怎么办？附图如下：

图片附件: 63685017.jpg (2013-9-18 15:11, 41.21 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18524

作者: 7437654 时间: 2013-9-18 15:23

首先感谢好人!
目的:我做的蛋白是膜表面蛋白,460KD,糖蛋白,是白蛋白,IF-B12的受体.我想从组织中分离纯化它.其中,用wb鉴别之.
已做工作:现在基本上有实验流程,但是,针对该蛋白的具体之处不是很明白.
问题:
1.在制备样品(从组织中分离)时,使用那种匀浆器?
2.能否给我一份和我的蛋白相似的流程和试剂清单,lixl7708@yahoo.com.cn,
3.如何确定SDS-PAGE膜的厚度和浓度?4-16%可行否?效果如何?这么大的marker能买到吗?不知您有没有,能否惠赠,或向您购买?
4.打算用硝化纤维膜,用0.22的还是0.45的?如用PVDF,效果是否比前者好,操作上有什么不同?
提了很多弱弱的问题,在此感谢!!

作者: 轰轰 时间: 2013-9-18 15:23

请问做western blot的标本一定要新鲜的吗,可以是用福尔马林浸泡过的吗?我已经很辛苦的收集了二个月标本了.现在怕是要前功尽弃了.请楼主告诉我是不是这样啊?

作者: pengke1983 时间: 2013-9-18 15:24

DAB和 ECL 有什么区别？哪个好用？谢谢！！！

作者: is2011 时间: 2013-9-18 15:25

你好，我以前做的蛋白，如今同样的条件却怎麽也做不出条带，请问我从哪里找原因？膜我染过了，见蛋白条带，显影液没问题，别人也在用，好的。抗体是santa cruz 的，刚买了2月多，一直放在冰箱里。

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-18 15:26

您好！刚进实验室， WB做的很不顺利，已经一个月了。除了第一次出了有很多杂带的结果外，现在一无所获。
请教：可能的原因。
1转膜应该没有问题。maker较清楚，未转的膜条带清楚。转过的膜条带非常淡（尽管未完全转过去）。
2封闭使用TBST(TWEEN0.1%）＋5％脱脂奶粉，过夜。
3一抗新购买，中山（santa cruze）：小鼠抗人及山羊抗人IgG， 37度2小时振摇。
4二抗新购买，中山（santa cruze）：山羊抗鼠及兔抗人IgG－HRP，37度，1小时振摇。
5ecl 1分钟。
6曝光2，5分钟。
7显影定影
做了近一个月，不出条带。
很郁闷。查找各种原因。无结果。
请您帮助找找原因。
曾经考虑ECL（snata cruze）效果较差，换用pierce的一次。无结果。
胶片用过2盒，无结果。
抗体新买的，不敢怀疑是抗体的原因。
有同事告诉我：二抗使用时（因二抗里有甘油：抗体＝1:1），应该较深插入取用抗体，不然取出的可能是上面的甘油。请教您一下。此说法是否成立。
另外有无其他原因。非常感谢，郁闷之人。

作者: nn255 时间: 2013-9-18 15:27

可能的原因：
1。建议看一下各种western的手册。
2。丽春红染结果如何，目的条带怎么样？
3。二抗应为抗羊和抗小鼠的，而非抗人的。
4。无条带是指片子上什么都没有，还是膜全为黑的。
5。如是片子上什么都没有，可以继续延长曝光时间（15～40分钟）或提高一抗和二抗的浓度。封闭无须加TBST,tween是用于降低背景的。
6。如是膜全为黑的，可降低抗体浓度，缩短曝光时间（1～30秒）

作者: xue258 时间: 2013-9-18 15:31

我有一些问题想向各位大侠请教：
我采用DAB-H2O2显色系统，用DAB干粉配制时总感觉溶解不完全，有沉淀，不知什么原因，正确的配制方法应该是怎么样的呢？
采用ECL显色时用酸性坚膜显定影粉可以吗，常规应该用什么型号的显定影粉？
做噬菌体筛选时X光底片上的显色斑应该是实心的还是虚的？

作者: INK 时间: 2013-9-18 15:31

请教一个问题：科室里面有人Western时经常要预电泳，我不知道这个有什么作用，具体怎么做法，谢谢。

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-18 15:34

请问高人：我准备做T型钙通道蛋白，它分子量比较大是262.4Kda，这个做western blot要用什么样的胶，要怎样跑电泳，转膜呢，marker怎么跑能？
请给我一个详细的protocol，先谢谢了！抗体已经买回来了，标本也已经取好了，就等着怎么取做了，所以有些急，因为同学做的都是150KDa以下的蛋白！
谢谢你提供的帮助！

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-18 15:40

我准备做T型钙通道蛋白的western blot，但是它的分子量是262Kda，我同学跑的都是150Kda以下的蛋白，我想请问一下我要用什么胶跑，marker怎么跑，高分子量的蛋白做western blot要注意那些，能给我一些详细的建议吗？我抗体也买回来了，标本也差不多取好了
就等着做western ，
另外做western 的一抗可以用来做免疫组化吗？（说明书上只说可以做western没说免疫组化）

作者: zzzz 时间: 2013-9-18 15:45

我做westernblot，转膜之后，用DAKO公司的试剂显色碱性磷酸酶标记的二抗，但该试剂盒仅提供了免疫组化原位杂交法的染色指导，没有染色westernblot的指导，我的膜是8×10cm,请问应稀释多少倍来染色？
附图：DAKO试剂的说明书，谢谢！

作者: zzzz 时间: 2013-9-18 15:45

DAKO说明书1

图片附件: 81314396.snap.jpg (2013-9-18 15:45, 83.88 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18525

作者: zzzz 时间: 2013-9-18 15:46

DAKO说明书2，不胜感激!

图片附件: 25469189.snap.jpg (2013-9-18 15:46, 61.85 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18526

作者: zzzz 时间: 2013-9-18 15:47

我做westernblot，转膜之后，用DAKO公司的试剂显色碱性磷酸酶标记的二抗，但该试剂盒仅提供了免疫组化原位杂交法的染色指导，没有染色westernblot的指导，我的膜是8×10cm,请问应稀释多少倍来染色？
附图：DAKO试剂的说明书，谢谢！

图片附件: 39003439.snap.jpg (2013-9-18 15:47, 83.88 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18527

作者: orangecake 时间: 2013-9-18 15:47

各位能给我解释一下什么是marker，作用是什么？

作者: wsll 时间: 2013-9-18 15:48

QUOTE:

原帖由 orangecake 于 2013-9-18 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位能给我解释一下什么是marker，作用是什么？

marker 就是一个标识，指示蛋白分子量的位置

作者: wsll 时间: 2013-9-18 15:48

请教高手：
我用SDS裂解液裂解细胞提蛋白，按照分子克隆上的步骤操作，先裂解，后收集煮沸，再离心收集上清，负70度保存。以前还好。但最近有两次发现上面漂了一层膜样的东西，再离心也没有用。下面的沉淀也漂漂的，感觉很“脏”。怎么回事？蛋白还能用吗？
谢谢

作者: plaa 时间: 2013-9-18 15:49

我是WB的新手，有个问题向大家请教。我做心肌 caspase3 (分子量 31kd) 的WB制样，电泳，转移都没什么问题。转移后染色的膜可见清晰目的蛋白条带。
我用5% Milk 的TBST 封闭1小时，清洗，加一抗(单抗) 用5%Milk TBST 稀释，4度隔夜。洗后加二抗只用TBST 稀释没加奶粉。结果ECL 胶片发现除目标蛋白还有很多其他条带。
第二次为了避免这些特异性条带，在加二抗的时候我用了5% Milk TBST 稀释，结果胶片上除了看到Maker 外再无任何蛋白条带。第二次同时做的GAPDH
的WB ，步骤和caspase3 的一模一样，二抗也加5%Milk ，结果相当好，无任何杂带，目标带清晰可见。
问网上的朋友，说可能是二抗应该提高浓度，可caspase3 二抗1：1000，GAPDH 的二抗才用1：5000 就出来了。
大家能给我些建议吗？

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 15:53

请问斑竹:
一般跑变性胶是要煮的，非变性胶不用煮。
变性的目的是使蛋白变成多肽链(煮可以实现这个目的)，那么用非变性的胶和变性的胶做同样的样品得出一样的结果，是否可以说明蛋白已变性呢？
我有第一次做westen时就发生了这样的情况？能否给点提示？

作者: u234 时间: 2013-9-18 15:54

请教高手：
我用SDS裂解液裂解细胞提蛋白，按照分子克隆上的步骤操作，先裂解，后收集煮沸，再离心收集上清，负70度保存。以前还好。但最近有两次发现上面漂了一层膜样的东西，再离心也没有用。下面的沉淀也漂漂的，感觉很“脏”。怎么回事？蛋白还能用吗？
谢谢

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我做的时候也发生过同样的情况，我做的是心肌的标本，有时也会遇到这种情况。我想应该是脂肪层，因为重量轻，离心也没有用。我个人认为，可以试着重新采样，采样注意减少脂肪污染样品。还有即使有脂肪也不影响WB,你可以先试一下，至少我是这样认为。

作者: orangecake 时间: 2013-9-18 15:55

请教一个问题，10８个细胞中大概能提出多少蛋白质。
或者说如果要想做WesternBlot，应该从多少细胞中提取蛋白质

作者: yjf1026 时间: 2013-9-18 15:56

过多的蛋白酶抑制剂可导致蛋白修饰，是否可影响磷酸化的蛋白WB结果呢？

还有，蛋白酶抑制剂的量是按浓度加，还是按蛋白的量呢？如：直径6cm皿的细胞，我加lysis buffer 200ul,按浓度时,抑制剂加2ul;　当lysis buffer 体积缩至50ul,同样的细胞量，抑制剂加2ul还是0.5ul呢？
我一直很困惑。盼您解疑，多谢！

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做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）
对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性（这是有根据的，不是偶自己编的：１，２００２年proteomics上一篇文献曾经报道过２，偶自己做过加或不加cocktail的对比，发现没邢灾?圆钜欤?２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法，偶以前发过帖子的，您在版子里搜索一下就可以。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。
此外，您的配方里少了一件必不可少的东西，想一想是什么？希望是键盘误！
ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）
加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。
希望超版或icesugar75主任看到后给此贴加分，累死了！

作者: 8s5g 时间: 2013-9-18 15:57

请问WB是否只能定性，很难定量！
我想做STAT3活化测定，能否采用同位素法进行？我查得资料显示，国内STAT3磷酸化水平的测定可能还没有用同位素法测定的，现在我从何处能获得相关资料呢？谢谢！

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你好，数月后的今天我才看到你的帖子，不知道你的STAT磷酸化可做成？用什么方法？我也要做有关的课题，但是我还茫然，能帮帮我吗，谢谢

作者: 7437654 时间: 2013-9-18 15:59

我的胶不小心断成两半了请问还能否转膜否?会不会有气泡产生

作者: u76mp 时间: 2013-9-18 16:04

各位大侠，请教一个问题，怎样检测去磷酸化的蛋白，用western检测去磷酸化和磷酸化的蛋白的方法有什么不同？谢谢赐教！

作者: PINK 时间: 2013-9-18 16:05

新手问：
听说做western配制液体要几千块，是吗？
可以购买现成的么？效果如何？
拟做免疫共沉淀，然后western，能介绍一下免疫共沉淀的实验步骤么？
冰冻的肿瘤标本组织要做western需要如何解冻呢？
有做免疫共沉淀和western的试剂盒么？

都是很弱的问题，谢了！

作者: 2541 时间: 2013-9-18 16:05

membrane transferring

volts is not good

A is better dianliu zuo biaozhun jiaohao

I can not input chinese sorry

作者: 831226 时间: 2013-9-18 16:06

我想问一下做WESTERN所用的内参GAPDA和b-actin之间有什么区别？谢谢！

作者: 987789 时间: 2013-9-18 16:07

Western 有那么贵么？嗬嗬，吓小孩子吧
现在这年头啥都有，俺们老板还买了全自动的blotting machine，封闭，洗膜一条龙全自动，俺成了废人了。。。：（
分析一下western的成本，最贵的还是抗体，什么TBS-T,奶粉，这些东西贵？还有跑page的那一套也不贵，ECL系统，KODAK Xray film...
估计也就十几刀。。。

作者: tieshazhang 时间: 2013-9-18 16:07

请问做低分子量蛋白的western blot应该注意些什么？
我的目标蛋白在13-17kd之间，用的是硝酸纤维素膜，半干法转膜。有没有可能在转膜时蛋白会穿膜？一般转膜时间要多长？
另外，还想请教：全长蛋白做的多克隆抗体能否与该蛋白的片段杂交？
谢谢！

作者: yonger 时间: 2013-9-18 16:09

我刚准备做WB，问一下，目的蛋白是13KD的，又15%的丙烯酰胺凝胶合适吗？我用12%的胶跑过一次，可是效果不好；另外还想问一下，上样缓冲液的事，我用的上样缓冲液跑胶的时候，可以看到MARKER中20KD大小的片段位置正好在染料颜色的部位，这个问题怎么解决呀？要等染料全走光的话，我要的蛋白也会走掉啦。是要换上样缓冲液吗？还是换胶的浓度？望指教，谢谢！

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-18 16:10

请教了!图中是我做的western blotting , 用DAB染色的.左边那个是加了一抗的,右边那个是没加一抗的,其它步骤都一样.但做出来的结果两者没什么差别,这是怎么一回事?
我的上样量是60ug,样品来自小鼠海马区匀浆.所测的蛋白是190KD和170KD两条蛋白,一抗是兔抗大鼠,二抗是羊抗兔.
western blot的步骤如下:
Western blot
Western blot的操作步骤按照Iyer等所描述的进行（Iyer et al., 1998）。
1) 蛋白提取
取肝脏组织，加入 200-300μl 匀浆缓冲液，在匀浆器中充分匀浆后转移至离心管中。95℃水浴10分钟。10000g离心30分钟，取上清。
2) 蛋白定量
比色法测定每个样品的蛋白浓度，以每个上样孔的蛋白量是60μg为标准，计算每份样品的的上样量，分装。
3) 蛋白提取液加入等量上样缓冲液，7.5％ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80V，1小时半，分离胶140V，3小时。
4) 转膜
取6张与凝胶大小相同的滤纸和1张硝酸纤维素滤膜，把硝酸纤维素滤膜置于转膜缓冲液中，润湿后浸泡去气泡。把滤纸浸泡到转膜缓冲液中。
将电泳后的凝胶放置于硝酸纤维素滤膜上，然后夹在滤纸中，滤纸上下各三层。将夹层物放置于电极之中，接通电源，25mA，4小时。
5) 将转膜后的硝酸纤维素滤膜放入加入5%BSA的TBS-T中，37℃封闭1小时。
6) 弃去封闭液，加入一抗，37℃温浴1小时。
7) 将硝酸纤维素滤膜用TBS-T 15分钟洗1次，5分钟洗3次。
8) 加入生物素化的山羊抗兔（用TBS-T 1:400稀释），37℃温浴1小时。
9) 将硝酸纤维素滤膜用TBS-T 15分钟洗1次，5分钟洗4次。
10) 加入辣根物酶标记的链酶亲合素（用TBS-T 1:400稀释），37℃温浴1小时。
11) 将硝酸纤维素滤膜用TBS-T 15分钟洗1次，5分钟洗3次。
12) DAB显色。
13) 采用Optimas6.5 图像分析处理系统对条带密度进行扫描、分析。

试剂配方：
1．匀浆缓冲液（PH7.5）:20mM HEPES(pH 7.5), 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.2mM DTT(临用时加入), 0.5mM 矾酸钠，0.4mM PMSF（临用时加入）。
2． 30% Acr－Bis：30g Acr，0.8g Bis，补足H2O至100ml并混匀，过滤后存于棕瓶，于4oC保存。
3． 4×分离胶缓冲液（pH8.8）：18.17g Tris碱，4ml 10%SDS储液，用12M HCl调pH至8.8，定容到100ml。
4． 4×浓缩胶缓冲液（pH6.8）：6.06g Tris碱，4ml 10%SDS储液，用12M HCl调pH至6.8，定容到100ml。
5． 10%APS ：0.1g APS 溶于1mlH2O中。
6． 15%SDS PAGE电泳：
分离胶：1.8ml H2O, 3.7ml 30% Acr－Bis, 1.9ml 4×分离胶缓冲液（pH8.8）, 0.112ml 10%APS, 0.005ml TEMED。
5%浓缩胶：2ml H2O ,0.6ml 30% Acr－Bis,0.888ml 4×浓缩胶缓冲液（pH6.8）, 0.056ml 10%APS, 0.010ml TEMED。
5×电极缓冲液：15.1g Tris碱，72.0g Gly，5.0g SDS,补足ddH2O至1000ml并混匀,用前稀释至1×。
7． 2×上样缓冲液：25ml 4×浓缩胶缓冲液（pH6.8），20ml甘油（20%，w/v），4g SDS（4%，w/v）,2ml 2－ME, 1ml 溴酚蓝（0.001%，w/v）,补足ddH2O至100ml并混匀，等量分装成1ml于－70oC储存。
8．转膜缓冲液：6.055g Tris碱，28.33g Gly，400ml甲醇，共溶于2L去离子水（不用调pH）。
9． 10×TBS（pH7.5）：48.44g Tris碱，160.3g Nacl，76ml 1M的Hcl，补足双蒸水至2L,调节pH到7.5，4oC保存。
10．TBS-T： Tween-20加入1×TBS（使Tween达0.1%（v/v））。

请教了!

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18529

作者: uaubc 时间: 2013-9-18 16:10

请教: 最近我做了不下十次Western blotting, 每次在ECL试剂发光后背景均很高,几乎看不到目的条带,敬请指教分析原因及改进措施, 谢谢.

作者: changlhsyo 时间: 2013-9-18 16:11

我是新手,上周按照实验室别人的protocol做了三次western,结果都不好,大家帮帮我吧,谢谢!
脊髓组织,目的蛋白是17k和90-110k的两种
1.分离胶都用的12%,定电流20mA,电泳2hrs左右
2.转膜100mA,1hr,硝酸纤维膜,孔径0.45微米,5%脱脂奶粉封闭1hr
3.一抗分别是1:1000和1:1500,用1%脱脂奶粉/T-PBS稀释,封在塑料袋内,4度过夜
4.二抗是按照试剂盒的说明做的,DAB发色.
结果都是出现好多杂带,而目的蛋白却没有,哪里有问题,请大家指教!

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我觉得是不是胶用的不对呢
一般 7。5%的胶用来跑50-200kDa
10% 30-70kDa
15% 12-45kDa
我们实验室一抗也一直是4度过夜所以可能不是时间太长的缘故吧
出现好多目的条带可能因为1抗用的是多抗把
另外你用marker了吗根据marker的指示确实是没有目的蛋白吗？

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:12

兔和鼠的同源性较强.
你所用抗体尽量避免用到兔抗体.

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:13

多抗做WB的效果比单抗的效果好.

作者: jkobn 时间: 2013-9-18 16:13

高手，你好，我的目的蛋白是300KD，内参照是50KD左右，该如何跑电泳呀？用多少浓度的胶好？能否两个条带都跑在同一块胶上？是否要用不连续的梯度胶呀？急！！！

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:16

8%的胶。
电转移转移时间长一些。内参上样量多一点。

作者: am10 时间: 2013-9-18 16:18

很高兴能见到你回来。
我现在做wb,膜上可以见到我所需要的band,但是色很浅，怎样才能有所改进，能够做出大虾们那样漂亮的BAND尼？
我上的蛋白量时40ug/well,一抗体是1：1000，二抗1：2000。
请ptglab多多指点？
另外，一二抗得比列，控制在多少为好？是不是增加上样量有作用？

作者: tuuu2 时间: 2013-9-18 16:21

200KD的蛋白转膜条件如何?多大的电流?多厂时间?多谢

作者: u234 时间: 2013-9-18 16:21

我想请问一下,如果转移完加入一抗后实验没做完,可否冷藏起来,第二天再做?
还有,一抗加入后的清洗是不是很重要?因为如果清洗不净,有可能造成假阳性?

作者: PINK 时间: 2013-9-18 16:22

请问大侠:Western bolt 结果背景较深，且深浅不一，该如何解决?我现在是脱脂奶封闭过夜，应该非特异的结合少很多吧！但ECL后仍背景较脏，黑一块白一块的。即将毕业，却拿不到好片子，真急啊！！

作者: 831226 时间: 2013-9-18 16:23

你好，我做的WB结果很奇怪，请指教。膜显色后正面出现许多蛋白条带，目的条带与其他条带比不明显，但是膜的背面也出现了条带，而且目的条带最明显，还有一些其他的带，但都不很清楚。请帮我分析一下原因。转移是湿式转移，40mA恒流3小时，转移时间是否长了？谢谢

作者: 49888 时间: 2013-9-18 16:24

我想知道制备抗体所要蛋白的量？我的蛋白是一种神经毒素

作者: 8princess8 时间: 2013-9-18 16:24

免疫沉淀(IP)后作免疫印迹(I，如何证明每个lane的蛋白质是相等的
I have a problem. Could you please help me?
免疫沉淀(IP)后作免疫印迹(I，如何证明每个lane的蛋白质是相等的？
譬如说做IR的tyrosine phosphorylation,我们先用anti-IR作免疫沉淀，再用PY99（抗tyrosine磷酸化抗体）作免疫印迹，可得到
结果。这时需要做strip,我想肯定不能用β-actin(可以吗？)。那么可以将膜清洗，用anti-IR重新沉淀，对吗？
可这又能说明什么问题？如果reprobe后，every lane的印迹相同，可以认为上样量一致。但如果不同，能说明上样量不一致吗？有可能是上样量一致，但处理因素将IR的蛋白量改变。那么？如何是好

作者: mamamiya 时间: 2013-9-18 16:24

请问楼主，WESTERN转膜时，用湿法转，应如何控制转移电压和时间，与哪些因素有关呀

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:32

200kd的蛋白用半干转，恒流150mA，2h
湿法转移30伏，6h

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:37

转移完后，用TBST-脱脂牛奶封闭。
加1抗可以与4度孵育过夜，在进行后面的实验。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:37

提高1抗稀释度（降低1抗的上样量），wash时间长一些。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:40

提高1抗稀释度（降低1抗的上样量），wash时间长一些。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:42

你的转移时间过长。
这种情况，你可以再膜的背面显色或曝光。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:43

如果免疫小鼠制备单抗，准备1mg（包括检测）左右。如果多肽的话，量需要4-5mg。

免疫兔子进行多抗制备，最低准备2mg蛋白（包括检测）。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:43

这个根据你的蛋白分子量决定，10%的胶30伏转移3h一般可以转移完全。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:48

我的实验只是定性，无需定量。一旦定性阳性，我再做免疫荧光，但现在是阴性。可是抗体说明书上写能够与Hela WCL细胞反应，再请问Hela WCL 与Hela有何区别？

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我想问一下，什么是WCL

作者: remenb 时间: 2013-9-18 16:48

我研究室购得的抗体已经1年了(Storage buffer
PBS with 0.05% sodium azide) ,未稀释过,不知能否用.产品未说明期限.
又如何能得知该抗体尚未变性.

作者: hold住 时间: 2013-9-18 16:49

请问如何把一抗洗下来，重新再标记新的一抗，洗脱液配方和洗脱条件是什么，HRP需要过氧化氢灭活吗，浓度是多少，谢谢！

作者: uuooii 时间: 2013-9-18 16:49

請問10kd的蛋白用半干转的條件如何??
我用15V 30分很像太多了
而且我的目標蛋白不是很多??
洗出來的結果都很乾淨是不是轉的時間太多了

請問大大有何解決方法??

感謝感謝...

作者: rxcc33 时间: 2013-9-18 16:52

楼主：
我急切的想问你一些问题，因为关系到毕业，请一定回答一下。我用一重组蛋白免疫4只兔子，3只兔子的血清可以用免疫双扩散法测出，效价为1：32，只是免疫沉淀线是两条线，我认为我的免疫已经成功，所以做western blot来验证，但是非常奇怪的是，膜在最后用ECL发光剂显影时，整个膜一片荧光，而且结合不牢固，用滤纸一沾就没有了，请教是否是我的一抗有问题

作者: yhz1973 时间: 2013-9-18 16:53

那些因素可能影响转膜的成功？

作者: yhz1973 时间: 2013-9-18 16:53

我做的western，目的蛋白是100KD，电泳恒压浓缩胶70V，10％分离胶140V，转膜恒压100V，1hr，但作不出目的条带，最有可能是转膜出问题，可能是什么原因呢？

作者: lixi559 时间: 2013-9-18 16:53

我用卵母细胞作western,由于样品来源有限，每泳道只能用100个卵母细胞，至今没有作出结果，请问是不是上样量太少的原因。
一抗，二抗验证过没有问题。nc膜和PVDF膜都用过。ecl显色。
有时在同一张膜上，我加两种一抗，一种是我要标记的，另一种是实验室作的非常成功的蛋白。显色后，我要的蛋白没有条带，另一种蛋白却有条带，还很清晰。这是否能证明western系统本身无问题，只是我要作的蛋白难标记。

另外，能否推荐一种好的蛋白裂解液。

作者: popo520 时间: 2013-9-18 16:56

我用卵母细胞作western,由于样品来源有限，每泳道只能用100个卵母细胞，至今没有作出结果，请问是不是上样量太少的原因。
一抗，二抗验证过没有问题。nc膜和PVDF膜都用过。ecl显色。
有时在同一张膜上，我加两种一抗，一种是我要标记的，另一种是实验室作的非常成功的蛋白。显色后，我要的蛋白没有条带，另一种蛋白却有条带，还很清晰。这是否能证明western系统本身无问题，只是我要作的蛋白难标记。

另外，能否推荐一种好的蛋白裂解液。

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-18 16:56

楼主你好：
我做悬浮细胞的WB。分子量22KD是膜蛋白，现在采用11%分离胶，4%浓缩胶，bio-rad公司的跑胶、转膜仪器和溶液。跑胶先用100v，待mark分开后改用200v跑胶。转膜用的是nc膜，4度，100v，转2小时。然后丽春红染色，封闭用的是2%milk+1%bsa。一抗是单抗，我目前采用1：250，二抗1：2000。做出来条带很浅，有时索兴没有。
存在问题：1）如何裂解细胞比较好，我想上50ug的量但浓度不够高体积太大，是否需要浓缩蛋白，不浓缩能办到吗？2）跑胶，转膜有需要改进的地方吗？3）一、二抗比例得当吗？一抗是否太高了（这是我自己摸的条件）？
望不吝赐教，万分感谢！

作者: 3648755 时间: 2013-9-18 16:57

我是浙江大学昨天给您打电话询问的人，不知道您还有没有印象，我今天打电话询问santa cruz 的技术支持，他们说我用他们公司的第一抗体测出来的条带分子量如果只有70kd以下，应该不会是目的蛋白（我的目的蛋白文献上都报告为200kd左右，但是通过查NCBI上的蛋白序列从而进一步用软件换算蛋白质分子量只有150kd，这里不知道是什么原因）
我就很想不通，难道我这么明显的条带会是非特异的么
会不会可能是我提蛋白过程中没有加蛋白酶抑制剂，把我的目的蛋白都降解成小片段的多肽，于是在低分子量的部位显色出来？有没有这个可能呢，期待您的指点。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 16:58

对于20kd以内的分子量的蛋白，最好用PSQ膜转移。
pvdf膜由于孔径较大，不适合转移小分子的。
你可以用两张pvdf膜一起转移，用双层的膜这样会有蛋白在膜上的。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:01

你的实验可能在WB实验中：蛋白没有转移到膜上；一抗稀释度偏低等等。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:01

1 膜预处理不好
2 转移液ph值，甲醇浓度
3 电流电压过高或过低
4 page胶不均匀

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:03

如果你用的是pvdf膜，我怀疑你实验时没有将膜用100%的甲醇浸泡。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:05

你的试验中，你肯定了1抗2抗底物都没有问题。

那么问题应该在蛋白样中。
1 你所用的卵母细胞没有目的蛋白
2 目的蛋白量浓度很低：提高上样量，或减小胶孔
在暗室处理时，提高曝光时间

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:05

文献报道的分子量一般都是在wb实验中检测过的。
他们所检测的蛋白一般都是修饰过的如磷酸化，甲基化，糖基化。

而通过软件换算的蛋白分子量一般就是：氨基酸的个数X111就是该蛋白的分子量。

你所测出来的70kd的蛋白，我建议你进行一下Blast。看看有没有和你目的蛋白同源的或序列比较接近的50-70kd蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:06

22kd的蛋白最好用15%的分离胶分离。

你可以选用ECL底物进行一下WB实验。

作者: lxh031 时间: 2013-9-18 17:07

我想请问一下,如果转移完加入一抗后实验没做完,可否冷藏起来,第二天再做?
还有,一抗加入后的清洗是不是很重要?因为如果清洗不净,有可能造成假阳性?

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加入一抗后可放在4度冰箱里过夜，效果很好，我前两天刚做过。
清洗这个步骤很重要，要想得到好结果就不能偷懒。

作者: lxh031 时间: 2013-9-18 17:07

我研究室购得的抗体已经1年了(Storage buffer
PBS with 0.05% sodium azide) ,未稀释过,不知能否用.产品未说明期限.
又如何能得知该抗体尚未变性.

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我不知你指的是一抗还是二抗，前几天我做的WB也是用一年前买的一抗，我也担心此问题所以加大抗体的量，结果很好。你也可以试试看。
当然能出这么好的结果，ptglab帮了很大的忙，十分感谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-9-18 17:08

>对于20kd以内的分子量的蛋白，最好用PSQ膜转移。
>pvdf膜由于孔径较大，不适合转移小分子的。
>你可以用两张pvdf膜一起转移，用双层的膜这样会有蛋白在膜上的。

請問如果是用兩張還是看正面的PVDF嗎??
第二張是不是也要去洗一洗呢??

感謝回覆

作者: NBA 时间: 2013-9-18 17:08

两张都可以。
第二张洗的时间短一些。

作者: gmjghh 时间: 2013-9-18 17:09

楼主：谢谢你的答复。我用的是nc膜呀。但结果就是不好呀？做的是THP-1细胞，

我想上50ug的量但浓度不够高体积太大，是否需要浓缩蛋白，不浓缩能办到吗？

作者: DDD 时间: 2013-9-18 17:10

请问楼主做过脂肪的western吗？怎样提取蛋白，去处脂肪？跟其它的组织比较有什么特别需要注意的地方？谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-18 17:11

你好，有个问题想请教一下，因为我们用的是人脑标本，资源较少，我现在有一标本已经多聚甲醛固定、蔗糖处理，准备做冰冻片子的，但我同时想做一下western以验证抗体的特异性（我们做的大都是人脑的石蜡切片），不知能不能做，应怎样处理，望赐教，谢谢。

作者: mamamiya 时间: 2013-9-18 17:11

请问您是用的碱性磷酸酶显色液吗？有配制方法吗？显色液的影响大吗？我做了两次都是有好多条带！您有很具体的方法合溶液配制方法吗？

作者: 969 时间: 2013-9-18 17:12

我现在要定购一c－myc抗体，是针对质粒上myc标签的抗体，不知定多少规格的合适，请问10ug够不够？如果产品不带阳性对照怎么办？非常感谢！

作者: kuaizige 时间: 2013-9-18 17:13

现请教一问题：我准备定量测一蛋白，但分子量较小，仅1.7kd，请问做western blot是否合适？

作者: 831226 时间: 2013-9-18 17:13

你好，我问一下，如果您用六一的半干转，分子量200kd的分子，您会用什么样的条件。比如恒流？恒压？时间？

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-18 17:14

我做神经烯醇化酶的电泳试验，因为是第一次接触试验，所以碰到很多问题。
老师让我先做一个梯度，以确定加样量，请问如何确定梯度？具体的公式是什么？有一个对照组和两个剂量组。用16孔的。

作者: xyw5 时间: 2013-9-18 17:15

我也有simple_person同样的问题，200KDa的蛋白，膜40m2，半干转移要什么条件啊，希望各位帮忙。多谢！

作者: bohe221 时间: 2013-9-18 17:15

我现在要定购一c－myc抗体，是针对质粒上myc标签的抗体，不知定多少规格的合适，请问10ug够不够？如果产品不带阳性对照怎么办？非常感谢！

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我用的santz 的c-myc 9E10。

作者: sunnyB 时间: 2013-9-18 17:16

我打算作western dot blot ，开始时要把我的表达上清点样于PVDF膜上，为了能看清楚，是否尽量多加样品呢？样品量多少有无规定？点样后的液滴大小有无限制？操作手法有无技巧？谢谢。

作者: greenbee 时间: 2013-9-18 17:17

你好！我转完膜之后用丽春红染色可以看见清楚的蛋白条带，但是当孵完一抗与二抗之后，再用丽春红染色就什么都没有了，包括marker！！我用的是PVDF膜，用甲醇泡过，并在transfer buffer中平衡了15~20分钟。转完膜之后的胶染色后显示转的比较干净。电压是100V，60min！这个问题困扰了我很久，所以我的结果还没出来，等着毕业！谢谢

作者: 831226 时间: 2013-9-18 17:33

我打算将培养细胞的胞浆/胞核分离，分别对胞浆/胞核/培养液进行Western-blot，能就分离的方法步骤及所用buffer或试剂盒给予指导帮助吗？还请多指导！越详细越好！
> 在这先谢过了！

作者: INK 时间: 2013-9-18 17:37

我从大组织里提取的蛋白质，纯度还可以，我在作SDS-PAGE电泳时，制样后总是会有很多的沉淀，上样时都有困难，是我的蛋白浓度太高了，还是有别的原因，我用的BIORAD的电泳装置。0.75的梳子，我的蛋白质浓度1mg/ml，3*的loading buffer我加入20ul体系。谢谢

作者: INK 时间: 2013-9-18 17:40

还有两个问题请教：sds的作用只是让蛋白质带上电荷，还是同时有变性的作用。恒压和恒流哪个好，为什么你用恒流，我所在的试验室用恒压，我现在在做一个500kd的蛋白，你做过这么大的吗，能不能传授点经验。

作者: INK 时间: 2013-9-18 17:42

还有两个问题请教：sds的作用只是让蛋白质带上电荷，还是同时有变性的作用。恒压和恒流哪个好，为什么你用恒流，我所在的试验室用恒压，我现在在做一个500kd的蛋白，你做过这么大的吗，能不能传授点经验。

作者: 04906 时间: 2013-9-18 17:45

你提取的是否是组织里的总蛋白，我现在正在找提取胃癌组织里的总蛋白的配方，还有具体操作步骤，我也是用来做western的，能否提供一下你的配方。还有哪位战友知道的能否告知。

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-18 17:49

在做WB时，用的是BIO－RAD的转移装置，100V,1.5h.用的是晶美公司的预染Marker，电泳时很清楚，但就是转不到膜上，请教高手。条件：
膜转移缓冲液是Glycine 2.93g,Tris 5.82g,SDS 0.37g,甲醇200ml.加双蒸水至1000ml.

作者: wmp1234 时间: 2013-9-18 17:49

我做的是从大组织里提取某一种蛋白质，我用的全是生化的方法，包括超速离心，盐析等，你从胃组织里提取总蛋白，大体的方法就是先将组织剪碎，然后加入裂解液，匀浆，最后离心，取上清就行了，但这只是总体上说，具体用什么裂解液，多少转速离心，还要具体分析。

作者: wmp1234 时间: 2013-9-18 17:50

我有一个肾脏组织总蛋白提取的方法：取冻存肾组织在冰盐水中冲洗3次，剪碎，按每15mg组织加入200ul提取液（100mmol/L的Tris－HCL 、1mmol/L的Cacl2、PH7.4，0.01％的TritonX-100）用超声细胞粉碎仪粉碎后，在4℃震荡30min后在4℃低温离心机12000g/min离心20分钟，取上清，用BCA法测蛋白浓度。不知道对你是不是有用

作者: 04906 时间: 2013-9-18 17:52

谢谢你,我正为找不到配方苦恼呢!!!是100mmol/L的Tris－HCL 的没错吧?还有我没有超声细胞粉碎仪怎么办?在4℃震荡30min要用什么仪器.最近我跑电泳,胶上的条带不清楚,我上样缓冲液都用到6×,还没有以前他们用2×的清楚.不过配胶用的液体都是去年师姐配的,不知道有没影响,今天去测了个PH值相差很远,是否跟这个也有关系呢????

作者: ritou1985 时间: 2013-9-18 17:56

我准备开始做westernblot,一抗用单抗要比用二抗好得多吗？谢谢

作者: toy 时间: 2013-9-18 17:57

首先，条带不清晰肯定有配胶溶液的问题，分离胶和浓缩胶缓冲液的PH值变了很多，肯定会影响结果的，10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。再就是蛋白的问题了，你上样之前有没测蛋白质浓度，BCA法或者Bradford法都可以。

作者: niangao1980 时间: 2013-9-18 17:59

我现在要订购santa cruz的一抗，它的两个产品sc－17732和sc－17733从产品信息上看没有什么差别，只是肽段不同，请问对实验有无影响，我怎样选择一个合适的呢？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-9-18 17:59

膜上的小条带（我们的目的蛋白所在）消失了，是否代表以及转移了呢？

作者: DDD 时间: 2013-9-18 18:00

请问有哪位朋友用过武汉博士德的Annexin-1和Annexin-5的一抗？或者博士德的其他蛋白一抗也可以。效果怎么样？做出来了吗？望告知，感激不尽。楼主您用过这个公司的一抗吗？

作者: pengke1983 时间: 2013-9-18 18:01

我也要开始做western了，我的蛋白是220kda的，是一种核蛋白。我们实验室有人作20kda左右的western，我的蛋白分子量与之相差很大，请问：我做western的条件包括胶的浓度，电泳的电压，时间；转膜的时间，电流；染色液（丽春红，考马斯亮蓝的浓度），染色时间；封闭液浓度封闭时间，抗体孵育浓度，时间等是不是都与二十几kda的不同？该怎样设置呢？谢谢指点！！

作者: birdfish 时间: 2013-9-18 18:01

有这样一个蛋白大约90kd左右，N端融合了HA tag。现在做western用自己的抗体能检测出来，但用HA tag的抗体却检测不到条带。这是怎么回事呢？？？困惑啊！请高手指点啊！！！

作者: yonger 时间: 2013-9-18 18:02

太好了，终于有高人可问了。我做了好几次的western了，总是没有条带。我实验的目的是定性检测MHC I 类分子单体的存在，跑的是非变性胶，用的是NC膜，转完之后用立春红染色，可以看到很明显的目的蛋白条带（目的蛋白已经纯化过的），3％的BSA4度封闭过夜，再按我们师姐他们的方法加一抗二抗后，用 DAB显色，却看不到条带，而用相同的一抗做ELISA却可以做出结果，请问问题有可能出在哪里？怎么检测我的二抗是否有问题？怎么确定一抗的浓度？因为我们用的一抗是买的杂交瘤细胞自己取的上清，有没有可能是一抗浓度太小？师姐建议用化学发光法，我们还没有试。多谢了！

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:08

条带多，不是显色液的问题。
应该是你的抗原抗体结合的问题。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:08

10ug足够。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:09

1.7kd的蛋白无法在sds胶的分布，15aa的多肽不适合WB检测。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:10

200kd的蛋白，一般用7%左右的sds-page胶。

150mA转移1.5h。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:11

如果蛋白量较大的话，建议10ug，1ug，0.1ug，0.01ug点样。

蛋白量小的话则做2-5倍的梯度上样。

作者: NBA 时间: 2013-9-18 18:14

恒流，150mA，1.5h。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:19

你的TBST溶液的PH值最好调整一下。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:19

换用1.0mm的胶。

或者将样品低速离心一下。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:20

恒压。

5%的胶。电泳时间加长。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:20

分子克隆试验指南

上提供好几个配方可以参考。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:20

如果是PVDF转移前将膜用100%的甲醇浸泡30秒。

转移时间加长。一般100mA，1.5h对50kd的蛋白可以转移完全。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:21

这看你的试验需要以及手头试剂。

就检测来说多抗比单抗效果好一些。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:25

如果转移小分子20kd以内，用psq膜，效果较好。

我不知道你说的小条带消失了是什么其情况。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:25

胶浓度8%
跑胶时间加长0.5h。
150mA，转移1.5h。

作者: NBA 时间: 2013-9-21 11:26

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作者: mimili_901 时间: 2013-9-21 11:26

我想请教你，我先在作C-JUN和PHOSP-C-JUN,发现显带很弱，我的上样量是25ug，抗体使cellsignal的1：2000座的，轻微如何改进，谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-9-21 11:27

我准备做Western Blot，一开始是不是需要摸条件，如蛋白上样量，抗体滴度之类的，还有其它的吗？望赐教！此外，在过程中需注意什么？

作者: avi317 时间: 2013-9-21 11:27

我想作的是用western blot 定量测定CAR(钙调蛋白)在内皮细胞的表达量,由于对这些没有什么概念,所以很迷茫,请大家赐教,应该如何进行实验,最好是具体一些,谢谢.乞盼回音.

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-21 11:28

做蛋白磷酸化的WB有没有什么需要特殊注意的事项？

作者: kuohao17 时间: 2013-9-21 11:28

3k左右的蛋白在15％胶上，转膜大概需要什么条件？如：恒流100ma，大概需要多少时间？谢谢!

作者: ha111 时间: 2013-9-21 11:29

我想买以色列的Insight公司的肝素酶（HPA）单克隆抗体，用来做WB，国内有代理吗？或者还有别的公司有吗？谢谢！

作者: ha111 时间: 2013-9-21 11:29

我查找文献，找到几个公司有单克隆的肝素酶抗体，但是不知道中国有没有代理：以色列的 Insight ，日本的Tsukuba！
还有别的公司出售肝素酶（HPA）单克隆抗体吗？我用来做western blot，santa cruz有多克隆抗体，用来做western blot好吗？谢谢！

作者: INK 时间: 2013-9-21 11:32

哎，可惜的是，我的Bio-Rad 膜已经用完啦，要不然就会省去很多麻烦，现在看来只能用普通滤纸代替看看效果怎样啦，ptglab,是不是普通滤纸按照你说的膜>=滤纸>胶就会烧膜呢？

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什么样算是烧膜阿？

楼主有样本吗？

作者: flower-201 时间: 2013-9-21 11:34

请教仁兄：我的目的蛋白质约70kd左右，可结果却在55KD左右的位置出现阳性条带。有时在55KD偏上的位置，有时又偏下。为何会出现这么大的变化呢。抗体是博士德的，Mark是晶美的预染Mark。

作者: loli 时间: 2013-9-21 13:12

请问我的目的蛋白分别是7.5kd, 14kd, 110kd, 和actin43kd。分别用多少浓度的gel? 多长时间？转膜，我用半干法，用多大的电压？多长时间？谢谢大侠的指点，看了你的帖子，有很多收获。

作者: jkobn 时间: 2013-9-21 13:13

我查找文献，找到几个公司有单克隆的肝素酶抗体，但是不知道中国有没有代理：以色列的 Insight ，日本的Tsukuba！
还有别的公司出售肝素酶（HPA）单克隆抗体吗？我用来做western blot，santa cruz有多克隆抗体，用来做western blot好吗？谢谢！急啊!!!

作者: 3648755 时间: 2013-9-21 13:14

我想请教各位大虾一个问题。
我做WESTERN BLOT来检测血清中与抗原特异性结合的IgM抗体，但是因为血清中能与抗原结合的IgG抗体的浓度比IgM的浓度高很多，而IgM又因浓度太低无法纯化。前段时间做的结果都不理想，条带很弱，而且有非特异性结合的条带。因此，我想请教一下，有什么方法可以使血清中的IgM抗体全部与抗原结合。我试验用的封闭液是5%的BSA，有没有更好的封闭液来降低非特异性吸附？谢谢了。

作者: gogo 时间: 2013-9-21 13:14

请问WB怎么定量啊？

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-21 13:17

我想向您咨询一下：在做免疫沉淀(immuoprecipitation)时,对照组用的IgG是什么?在国内可以买到吗?我急需。我也查了一些但是还是不太懂。怎么判断这种IgG与我要分离的目的蛋白的结合能力很小？以便不干扰目的蛋白的结合。而且也不知道贵不贵。

作者: ending 时间: 2013-9-21 13:20

我现在在做磷酸化AKT的western,但是做了一次都没有做出结果来,不知道问题出在哪里,下面简单的说说的的超作,1:我细胞的处理:我的细胞是养在平皿里,数量约2*106个,我用的是买的国产的裂解液,我在平皿中加的是200ul裂解液,然后置冰上约一小时,感觉到细胞没有那么强的拉丝了,就收集4度,14000g,离心了30min.
2:电泳和转膜都觉得没有什么问题,因为我用的预染mark,可以很清楚的看到mark全部转到pvdf膜上了.
3:敷一抗,我用的是cell signaling公司的抗体,选择的浓度参照说明书,1:1000,4度,过夜.
4:敷二抗,室温2h.
5:TBST洗干净后,用荧光显影后,曝光.
问题:1:细胞裂解有没有特别的要求?
2:我用的是脱脂牛奶,打算这次换BSA再做一次,不知道这个是不是我做不出来的关键问题.
3:我怎样才能够知道我的抗体是有活力的,因为我感觉到我不知道该怎样去找一个阳性的参照,应该不可能是买个AKT的蛋白吧?
现在时间很紧张,而真的不知道问题出在哪里,所以很着急,看了这么多您发的帮助人的贴,所以也请教您这些问题,现在是放假期间,但是真的是很抱歉的打搅您的休息了,希望能够得到您的帮助.再次的感谢!

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-21 13:23

请问大侠，我做的蛋白是20-90kD的，电转移后用丽春红S染不出来，但是二抗染色表明蛋白转移成功，这是怎么回事？有没有替代或解决的办法？谢谢 !
顺便问一下丽春红染色原理是什么??

作者: DONT 时间: 2013-9-21 13:39

我的蛋白分子量为70-74KD，请问制分离胶的浓度应该是多少？
还有您说的胶可事先制好，避光放于4度冰箱，临用前室温平衡是什么意思？
不胜感激！

作者: mamamiya 时间: 2013-9-21 13:39

200kd的蛋白，一般用7%左右的sds-page胶。

150mA转移1.5h。

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请问是半干式转膜么？电流那么大，电压会到多少阿？我一般电压到25V就不敢继续转下去了。我要做300KD的，谁有经验阿？先谢谢了！

作者: mamamiya 时间: 2013-9-21 13:40

我的蛋白分子量为70-74KD，请问制分离胶的浓度应该是多少？
还有您说的胶可事先制好，避光放于4度冰箱，临用前室温平衡是什么意思？
不胜感激！

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10%的胶就可以，关于把胶前一天现配好放入四度冰箱，第二天室温放置半小时后再加浓缩胶，我也那样干过，目的是为了节省第二天的时间，加入第二天时间充裕的话可以先用现配。

作者: mamamiya 时间: 2013-9-21 13:40

我的GFAP是进口的，二抗是国产的，三个样品分别是诱导前MSC，诱导后MSC，大鼠脑组织提取蛋白，目的条带应该是51KD，结果只有脑组织提取蛋白相应位置有条带，其他两个样品没有也属正常，但在大于51KD的位置出现了两条带，这是什么东西啊，如果是抗体不纯的话，为什么脑组织那个样品没有呢？
我电泳时有Marker，转膜后先丽春红染色，根据Marker分子量载下包含51KD的区域然后脱色后再泡一抗，我用的胶是12%的，样品制备:用Triton破膜提取胞浆蛋白，无论是培养细胞还是脑组织都是那样提的，抗体的稀释度就是按说明书的推荐来做的。有可能是我一抗加多了么？

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作者: mamamiya 时间: 2013-9-21 13:41

还有一次也是这样的结果，超奇怪阿！

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作者: 68943512yao 时间: 2013-9-21 13:41

请问加样时, 盐浓度太高会造成什么影响? 我得样品提取出来后,经过蛋白测定,总是觉得浓度太低,所以往往是真空浓缩后再上样. 好像总是跑不好,这是一张转完的膜, marker为什么是这样的?

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作者: 68943512yao 时间: 2013-9-21 13:42

这张gel的图, 没转,跑完后直接commssin blue染色, 为什么蛋白条有宽有窄?

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作者: ha111 时间: 2013-9-21 13:42

我最近准备做western。因为我检测的兔蛋白，没有相应的抗兔的抗体。老板决定去定做抗体，厂家推荐我们用化学合成多肽免疫动物获得抗体，我是菜鸟，不知道这样行不行，能不能用这种抗体来做western或免疫组化？而且价格较高5800元，不同的厂家又不一样，希望能明示国内有哪些公司可以，价格如何？

作者: cocacola 时间: 2013-9-21 13:42

各位大侠，我最近做western。转膜后丽春红染色显示转膜效果良好，条带都已经转上了。但是随后的免疫显色效果不好，没有条带。抗体的稀释度按说明书推荐1：100，但是我已经用到1：50了。二抗说明书上说做ELSA1：12000，但是没有做印迹的建议，我用了1：2500，但是最后什么条带也没有。我用的是DAB显色法。问题出在哪里呢？

作者: cocacola 时间: 2013-9-21 13:43

摸索了很久，终于转膜成功了，但是还是得不到结果，万分着急，望各位大侠指点迷津。万分感谢!

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-9-21 13:43

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摸索了很久，终于转膜成功了，但是还是得不到结果，万分着急，望各位大侠指点迷津。万分感谢!

没有结果，首先确定你要的蛋白被你剪下来泡抗体了，再就是抗体的问题。

作者: cocacola 时间: 2013-9-21 13:44

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原帖由 hot_hot_hot 于 2013-9-21 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

没有结果，首先确定你要的蛋白被你剪下来泡抗体了，再就是抗体的问题。

我把整个印迹条方到抗体里泡了，也许是抗体的问题，今天再孵育一次。

作者: PCR 时间: 2013-9-21 13:44

我做pkc、plc磷酸化的western，做了好几次，什么结果都没有。连背景都干干净净！不知道问题出在哪里，现将我的实验全过程简述如下，请有经验的战友指点一二：

1，  制备蛋白样品：刮刀从平皿上刮下细胞，低温800rpm离心5min，去上清。8×106 cell加入200ul单去污剂裂解液，冰浴裂解20min。加入5×loading buffer，沸水煮10min。常温12000rpm离心10min，取上清电泳。
2，  电泳：每孔上样40ul，120v 30min浓缩，160v100min分离。
3，  转膜：130mA（2.5mA/cm2膜），半干转移150min。丽春红染色，蛋白已经转移上（是否完全转移就不一定，有时将转过的胶染色，还有小部分未转出。）
4，  免疫检测：
封闭：5％脱脂奶，室温2h（或者4度过夜）
一抗：cell signaling的一抗，1：1000和1：200都做过，室温1h、2h、3h或者过夜都做过。TBST洗10min＋5min×2
二抗：1：1000和1：200都做过，室温1h、2h都做过。TBST洗10min＋5min×2
发光：将膜用滤纸吸干水，用ECL发光反应，曝光。
5，  结果：基本上连背景都没有，胶片上干干净净！

6，查原因：做过ECL和二抗的发光反应，正常。现在还换了一支新的二抗。

疑是一抗的问题，检测PKC磷酸化情况，用的抗体是抗所有PKC磷酸化的其他蛋白的磷酸化位点，所以很多蛋白都该有显示条带，但什么都没有。但一抗是直接从美国买的，cell signaling的产品，在我们实验室－20度冰箱放了大半年，应该不是买了太久没用的缘故吧。看资料抗体可以在此情况下保存很久活性降低不多啊。
做了这么多次都这样，真是绝望。盼高手指点啊。

作者: vera+ 时间: 2013-9-21 13:45

救命！
本人做了不下5次的western，每次都在膜上能看见丽春红染色倩影，蛋白一应俱全。可就是到发光时背景都干干净净，更别说是蛋白了。一抗及二抗都比推荐浓度稍大。我该如何是好

作者: summerxx 时间: 2013-9-21 13:45

最近我在做WESTERN的时候，发现背景很糟糕，并不是非特异性结合的条带多，而是一大块一大块的高背景。我用的是5％BSA ，TBST封闭液。洗涤液是TBST。这些试剂我最近都没有换过，如果不计算抗体的因素。我想知道是什么原因导致这样的问题。
还有，我在转膜之后，用立春红染色的时候，发现小分子的地方（分子量大于溴酚兰）会有一条很强的带，这可能是一些小分子聚集在这个地方了。以前液没有碰到过这样的情况。我用的分离胶是10％，基层胶5％。溴酚兰跑到最底端，快要跑出胶的时候才停止电泳的。请问，是什么原因可能导致的。我需要那方面作些调整呢。还望不吝赐教。

作者: PCR 时间: 2013-9-21 13:46

你确定你的抗体没有问题么。抗体浓度并不是越大越好，我觉得有必要从推荐的最大稀释比例慢慢试起。

作者: vera+ 时间: 2013-9-21 13:46

一抗、二抗都是新买的。

作者: vera+ 时间: 2013-9-21 13:47

假如一抗有问题，那应该至少有背景呀，非特异性的条带也应该出现意思一下。结果什么都没有

作者: xue258 时间: 2013-9-21 13:47

最近导师告知要用western检测的II型胶原分子量大约在300kd左右请问各位老师这么大的蛋白能跑出来吗别的实验室跑的最大的蛋白也就<200kd阿 western的条件包括胶的浓度，电泳的电压，时间；转膜的时间，电流怎样设置？
还有查到Marker有种Molecular Weight Markers Proteins kit

高分子量标准蛋白

分子量范围：67,000-670,000

五条带 Thyroglobulin 669,000 Ferritin 440,000

Catalase 23,2000 Lactate dehydrogenase 140,000

Albumin 67,000
不知道能不能用于SDSPAGE电泳？
谢谢

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 13:48

那就按照推荐浓度作，我以前也有这样的经历。浓度大了反而作不出来

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 13:48

还有可能就是你的膜放置的时间问题，把膜泡在BSA里面几天了，后来再来作，结果也是象你说的什么都没有。

作者: greenbee 时间: 2013-9-21 13:48

请教高人：我的SDS_PAGE做出来在40kd处的蛋白，转膜时我用23v100min，半干转移，但是丽春红染色时只发现了隐隐的Marker带，不过电泳跑出的四条Marker全都有，没有蛋白带，转过之后的胶银染还有蛋白和Marker，不知道我是应该再增加时间呢，还是应该加大电压呢，还是应该增加样品量呢？

作者: xingyi08 时间: 2013-9-21 13:49

请问你转膜的条件是什么。我也做20到90kd的蛋白，可做了一次胶片一片空白，我怀疑是转膜的问题，急切盼望你的答复

作者: greenbee 时间: 2013-9-21 13:49

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原帖由 xingyi08 于 2013-9-21 13:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问你转膜的条件是什么。我也做20到90kd的蛋白，可做了一次胶片一片空白，我怀疑是转膜的问题，急切盼望你的答复

转膜（湿转）60V 3－5小时，20到90kd的蛋白一般都能转上，而且立春红染色就可以知道是不是转膜的问题的呀

作者: flower-201 时间: 2013-9-21 13:50

我现在要做凋亡通路中caspase3和caspase9（荧光分光光度计）的检测，Western blot 检测NF-kB和IkBa、cytochrome c、PARP，由于经验匮乏，现有几个问题请教，请各位方家不吝赐教。
1、caspase3和caspase9检测中lysis buffer、reaction buffer的配方，比色皿中至少加多少体积，加抑制剂（浓度一般是多少）后多长时间加荧光底物，而后多长时间检测；
2、NF-kB和IkBa、cytochrome c、PARP的定位，不同定位的蛋白质如何提取，lysis buffer配方是否相同及配方。

作者: S6044 时间: 2013-9-21 13:50

请问各位大侠，我采用全湿式电转装置，想将非变性PAGE上的蛋白转移到PVDF膜上，我的电转液怎么配置？电转条件怎么设置？

作者: 大海啊故乡 时间: 2013-9-21 13:50

我不是高手但是也遇到过类似的问题,我的原因一抗或者是二抗孵育后,用TBST没有洗干净,建议多洗几次,不知道对你有没有帮助.

作者: vera+ 时间: 2013-9-21 13:51

延长洗涤的时间我作过效果不是很好，我想有必要试试看多洗几次了。

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 13:51

想请教大家一个问题,作为诱导剂的IPTG反复冻融后能不能失活?怕光吗?多谢!

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 13:52

想请教大家一个问题,作为诱导剂的IPTG反复冻融后能不能失活?怕光吗?多谢!

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 13:52

还想问一下各位高手,有人知道哪里能买到HBV前S2抗体吗,急需!

作者: 6327555 时间: 2013-9-21 13:53

您好,我想向你请教关于Western的问题.
情况是这样的,我作的EGFR若氨酸位点的自身磷酸化的Western Blot,提的是总蛋白,这是我的细胞裂解液的成分:每106个细胞加100-200μl细胞裂解液
20 mmol/L Tris-HCI pH 8.0
150 mmol/L NaCl、
1% Triton X-100
5 mmol/L EDTA、
0.2% BSA、
0.2% SDS 和 0.2% 脱氧胆酸钠 (Na-DOC)，
1 mmol/L NaF
1mmol/L Na3VO4
protease inhibitor cocktail (Sigma).

蛋白定量用Bradford Assay(这种方法是否合适,所测的蛋白浓度可信吗?我的裂解液中含有去污剂,而去污剂对Bradford Assay很敏感,对吗?)
Conc约5-6mg/ml

EGFR分子量170kD,所以我用6％的分离胶.1hr聚合, 5％的浓缩胶,30min聚合.
蛋白上样10-15μl,跑电泳:恒压100V,至溴酚蓝到底部为止,大概2-3小时,
转膜 : 恒流至少3mA/cm2,1hr,丽春红染色5min ,条带似乎有,但不是很清楚,拍照拍不下来,颜色太浅.
一抗,二抗根据产品说明书的稀释比例,作用1小时

用EGFR作内参,所以我用stripping buffer（62.5 mM Tris–HCl, pH 6.8, 100 mM ß-巯基乙醇，1% SDS）,50℃,5min. 再洗30min

ECL(A液B液1:1)4-5min,
曝光3 min和10min,,显影3-5分钟,

上面是我的实验陈述,一开始作了两次,发现没有任何条带,连非特异性条带都没有.很奇怪,是怎么回事???

为了检查我的实验操作是否有问题,我今天用β-actin 作了一次Western,
10%的分离胶,跑电泳100V,离溴酚蓝底部还有2 cm,停止电泳,
转膜, 3mA/cm2 30-40min, 丽春红染色5min,没有明显的条带,
一抗,二抗稀释比例都是1:1000

结果也是没有条带,是不是转膜没转上,?我已检测过二抗,二抗是没问题的

能不能帮我分析分析,谢谢!!

作者: junhun 时间: 2013-9-21 13:53

我也一直都在做磷酸化的WB，想检测的是磷酸化RB的表达情况，可是做了六七次了可一次都没成功过，实在是太郁闷了！！！每次显影出来都是很多背景，可又没有看到我的目的条带，我的实验步骤如下：
1，我是用三去污裂解液裂解的细胞，里面加了PMSF和亮抑酶肽两种蛋白酶抑制剂，也加了2.5MMOL/LNAF。我没有做蛋白定量，每个孔点了约四十UL样品，分离胶浓度为10%，电压：积层胶100V，分离胶145V。
2，转膜我是按分子克隆上的采用0.65MA/CM2，是用的干转，转了约二个小时，采用丽春红染色后可以看到比较清晰的蛋白条带。
3，我是用5%BSA封闭和抗体孵育，一抗浓度1：500，1：800，1：1000，1：1500，1：2000都用过（公司推荐的浓度为1：1000），一抗4度过夜，二抗是兔抗，浓度为1：800，也用过1：1000，37度孵育一个小时，孵一抗和二抗后每次的洗膜时间都是15分钟/次，共洗四次。
4，压片，显影，发光液其他人都用来做过没有问题，可每次加了发光液上去就可以看到满张膜都是亮亮的。
请高手们指点一下吧，我都快急死了～

作者: am10 时间: 2013-9-21 13:53

请教二抗的量与NC膜的关系？谢谢！

作者: lagua123 时间: 2013-9-21 13:54

各位高人请教一下样品裂解处理后变性后样品都凝固了而有的组织一同处理的没有凝固高不明白了，为什么？

作者: PCR 时间: 2013-9-21 13:54

我做蛋白电泳，转膜后Marker部分转上，但是蛋白条带没有，用Western检测也测不出来，是不是因为我上样的蛋白量太少？我的蛋白是70kd左右，是不是要做转膜、WB蛋白一定要上到15 微克以上才行？

作者: tuuu2 时间: 2013-9-21 13:55

各位好！我是新手，打算提取大鼠胰腺组织中的胰岛素做WB，请问有没有这方面的经验？第一步就难倒我了---用什么提组织中的蛋白？另外，胰岛素的分子量是5700，但在胰腺中以六聚体形式存在，我不知道跑出来的条带应该是在5.7KD还是在35KD？

作者: DNA 时间: 2013-9-21 13:55

有哪位老师表达和提纯了PPAR蛋白

作者: 7437654 时间: 2013-9-21 13:55

我前几天也遇到了同样的问题,我现在知道了大概是什么原因,可能是你封闭不够,建议多加点5%的BSA在平皿中摇,适当的延长你的时间,希望对你有帮助.

作者: #问号# 时间: 2013-9-21 13:56

最近做的胶都很差，跑得不直，堆积得也不好。想请教各位高手，配堆积胶的哪个液体最关键？该注意什么？以前发现配好的胶在电泳缓冲液泡一段时间后，跑出来的胶更漂亮，条带一点都不扩散，可现在泡了胶后，蛋白在堆积胶就开始分离了，想不明白为什么？

作者: 831226 时间: 2013-9-21 13:56

请教高手：
我们做VEGF的western，本应该在23kd出现条带，结果只有在65-70出现了，重复好几次均如此。抗体用的是santa原装的，不知道该如何解释。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-9-21 13:56

请问关于细胞膜通道蛋白的提取，以及Western 的转膜条件！！

文献上报道200kDa左右，我用RIPA提的总蛋白，上样量20微克/lane，电泳时采用8%分离胶，溴芬兰进入电泳液后，继续电泳半小时，
转膜条件：1.移缓冲液是Glycine 2.93g,Tris 5.82g,SDS 0.37g,甲醇200ml.加去离子水至1000ml
2.恒流150mA, 3H 。但用立春红染色没有条带出现。

请大家帮忙分析：是蛋白量不够，要专门提取膜蛋白才可以吗？？

还是转膜条件不行？？

作者: 49888 时间: 2013-9-21 13:57

请问关于细胞膜通道蛋白的提取，以及Western 的转膜条件！！

文献上报道200kDa左右，我用RIPA提的总蛋白，上样量20微克/lane，电泳时采用8%分离胶，溴芬兰进入电泳液后，继续电泳半小时，
转膜条件：1.移缓冲液是Glycine 2.93g,Tris 5.82g,SDS 0.37g,甲醇200ml.加去离子水至1000ml
2.恒流150mA, 3H 。但用立春红染色没有条带出现。

请大家帮忙分析：是蛋白量不够，要专门提取膜蛋白才可以吗？？

还是转膜条件不行？？

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Glycine 2.93g?

作者: ladyhuahua 时间: 2013-9-21 13:57

我用的转移缓冲液Glycine 是2.93g,Tris 5.82g,SDS 0.37g,甲醇200ml.加去离子水至1000ml，没有调pH值！！

作者: 49888 时间: 2013-9-21 13:58

我用的转移缓冲液Glycine 是29.3g/1000mL，转膜时电流再大一些，时间也长一些，不过我的胶浓度比你的要高，但是我的胶转膜效率还可以。我也是最近才接触印迹，也不知我的是不是正确。

作者: nn255 时间: 2013-9-21 13:58

我查找文献，找到几个公司有单克隆的肝素酶抗体，但是不知道中国有没有代理：以色列的 Insight ，日本的Tsukuba！
还有别的公司出售肝素酶（HPA）单克隆抗体吗？我用来做western blot，santa cruz有多克隆抗体，用来做western blot好吗？谢谢！

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你的抗体买到了马?
作的western blot 结果怎么样? 在作肝素酶western blot 时是否要加热?是否要加β-mercaptoethanol?

作者: flower@@ 时间: 2013-9-21 13:59

我的GFAP是进口的，二抗是国产的，三个样品分别是诱导前MSC，诱导后MSC，大鼠脑组织提取蛋白，目的条带应该是51KD，结果只有脑组织提取蛋白相应位置有条带，其他两个样品没有也属正常，但在大于51KD的位置出现了两条带，这是什么东西啊，如果是抗体不纯的话，为什么脑组织那个样品没有呢？
我电泳时有Marker，转膜后先丽春红染色，根据Marker分子量载下包含51KD的区域然后脱色后再泡一抗，我用的胶是12%的，样品制备:用Triton破膜提取胞浆蛋白，无论是培养细胞还是脑组织都是那样提的，抗体的稀释度就是按说明书的推荐来做的。有可能是我一抗加多了么？

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你买的是哪里的一抗啊,我做了没出现你这样的问题啊,可就是结果不稳定,不知能否交流交流??

作者: wawa 时间: 2013-9-21 13:59

一抗是否失效怎么检测呀？有人说先一抗点膜，然后洗膜，再点二抗，再洗膜，然后曝光，这样可以吗，会不会一开始就把一抗洗掉吗？一抗和二抗的比例问题，有人说可以做Dot-ELISA，具体怎么做，多谢！

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-9-21 14:00

电泳完我用考马斯亮蓝染色后有脱色，发现什么东西都没有，连跑的道都没有(在其他人的实验室做了一下，蛋白条带也很微弱），用的是三去污裂解液，样品是鼠大脑组织，但没有用蛋白酶椅子剂，真是很烦恼，请ptglab指点，感谢！

作者: greenbee 时间: 2013-9-21 14:00

你好，我在实验中遇到一个问题，就是显影后，会显出很多的条带，而且都很浓，我都分不出哪条是我所要的，但是所作的内参特别漂亮，不知是什么原因导致了抗体的非特异性结合，谢谢你的指教！

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-21 14:00

我做的是NF-kB P65(nuclea part) and p-IkB-alpha( cytozol part). 一抗是santacruze 的产品，但是做了几次都不能得到想要得band。　并且有几个杂bands,更难理解的是做P65时，在size６５处有一个很强的band出现，　但是根据实验情况，　control 应该没有band , 经刺激后的组才有band,而我的结果是都出现了band 而且都很强。所以我认为那不是我要的。听说做磷酸化的蛋白比较难，请问您做过类似的蛋白么。关于核蛋白提取，western　情况能给我一些建议么？急！！！
谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-21 14:01

请问您做过p-IkB 和NF-kB p65 的western么，有没有protocol可以发给我一份呢？因为我正在做这两个并且我用的第一抗体是santa cruze的，　可是就是没有目标band出现。　倒是有几个杂band。　有人说做磷酸化的就是很难做，　请问您有什么建议呢？急！！！

谢谢！

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-9-21 14:01

我是新手,请高手指点:
请问作WESTERN时,出来的非特异带多如PAGE胶,抗原细胞裂解液,抗体多科隆血清,这种情况能说明什么问题?

作者: changlhsyo 时间: 2013-9-21 14:02

请问各位高手：
我的蛋白分子量分别为50KD和10KD(前者为caspase前体,后者为其自身活化的亚基) ,我必须在同一张膜上来检测它们的有无,那我该如何确定转膜的时间啊?有那种转膜时间过长导致小分子量蛋白转过的情况吗? 另外，我的二抗是HRP标记的，我想检测它的效能，需要从哪几方面着手呢？因为是新手，很多问题不懂，希望得到各位的指点！

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-9-21 14:02

我的目的蛋白为7kD，最近转膜后用立春红老是染不出来。我的电转仪是biorad的，衡压，电流和时间如何确定？我用1mA/cm2，一小时，不知可以吗？着急。。。。

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-21 14:02

请教一个问题：我用原核系统表达的蛋白，并做了多克隆抗体，用该蛋白和抗体做western blot，泳道里黑一片，不知道是什么原因，但是用该抗体与组织提取的蛋白blot时候没有这种现象。
谢谢！

作者: www.1 时间: 2013-9-21 14:03

最近做了几次WB,我的目标蛋白约55KD,10%分离胶,显色的时候什么条带也没有!

考染能看见目标条带,转膜后的凝胶考染未见蛋白条带.转膜后的膜丽春红染色也没有看见蛋白条带.

最开始怀疑抗体浓度太低,后把一抗(单抗 )调整到1:500,二抗1:1000,仍然没有看到任何条带.

请问可能是什么原因?

作者: zhenxin 时间: 2013-9-21 14:03

请教一个菜鸟问题:
中山公司一抗(工作液,石蜡切片,未说明是否可作WEATERN)是否可作WEATERN?作WEATERN还需什么抗体呢?

作者: nn255 时间: 2013-9-21 14:04

您好，我做western 一年了，最近遇到很不解的事情。我做的是胞浆蛋白，以往抗体的条件也很稳定，比例一直用的是同一个，结果也可以，条代特异。但最近一个月来，用相同的抗体，相同的比例却没有出结果，而拿别人已经作出结果来的样品跑胶转膜后仍无任何条代。而我一抗二抗孵育用的方法也没做任何改变，还是和以前一样的。会是什么原因呢，请教。

作者: u234 时间: 2013-9-21 14:04

楼主真的是好热心啊。佩服。
我近来在做一胞浆蛋白的表达，分子量40K。用的抗体是ABCAM的多克隆抗体。步骤如下：
蛋白95度处理五分钟，上样，积层胶100V，分离胶120V。采用半干转（1.2MA/CM2）一小时。
封闭一小时，一抗孵育4度过夜，二抗室温一小时。可是显影时发现整张膜都有荧光，胶片可见膜的轮廓。
降低一抗浓度也是如此。今天尝试将二抗降低为1：2000（以前为1：1000）可是却没有条带了。
不知该怎样调整条件。

作者: KGZ564 时间: 2013-9-21 14:04

我现在特别郁闷，请您帮我想想原因。我做一种离子通道蛋白的Western.预试验时特别顺利，没改什么条件就出来了，而且条带清楚，没有背景。但旧抗体用完了，又买新抗体，加之中间还有其他事情，耽误了3周。等再一做（用新抗体），满视野荧光。但我用新抗体砸我原来的膜，背景就淡得多，虽然不如我用旧抗体好。所以我就认为是我提蛋白、转膜的事。我就重做，可几次之后，竟然成白板了。于是我就一个原因一个原因的排查，一点点的调。到现在快两个月了，什么原因都找了，还是不行，全是百板。
但我的膜湿转后用丽春红染条带很清楚，内参GAPDH也清楚，很强。我又砸了别人一个抗体，也出来了。所以我现在又认为是抗体的原因，是否这批抗体不太好，时间一常效价降低，失效了。但这两个（两个亚型）抗体要6000元，现请公司订还要等至少3周，我想尽快找到原因，又不敢轻易再订抗体。所以想请您帮我确证一下，是否现在可以基本定是抗体的原因？万分感谢！！！

作者: 831226 时间: 2013-9-21 14:05

皮肤蛋白提取最近实验不理想！！非常不理想，蛋白转膜时只在70kd位置有一条非特异带，，整个膜不干净，电泳时似乎也分不大开。谢谢有什么好的建议吗？

作者: 831226 时间: 2013-9-21 14:05

请问你提取过人体皮肤组织蛋白吗？皮肤蛋白提取最近实验不理想！！非常不理想，蛋白转膜时只在70kd位置有一条非特异带，，整个膜不干净，电泳时似乎也分不大开。谢谢有什么好的建议吗？

作者: eric930 时间: 2013-9-21 14:05

请问跑SDS——PAGE胶用的玻璃板北京六一厂有划么？怎么计费？12*8.5cm的那种！谢谢

作者: yes4 时间: 2013-9-21 14:06

｛我按以下方法提取膜蛋白的，请问是否正确？

离心获取细胞后，溶于有蛋白酶抑制剂A液中，冰浴超声10s×3；5000转4度离心10分钟，去除核及未裂解的细胞；取上清，12000转4度离心，取上清即可。
A液：1mM kcl, 3mM Nacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, 0.05%二巯基乙醇，0.5ug/ml Leupeptin, 20uM pmsf, 1% Triton x-100.
｝
reply：可以，没有问题。另外，还可以用改良的Ripa提，你这样提的是膜蛋白加胞浆蛋白。

现在，我改过方法，用Ripa提细胞质膜，15000g离心后，取沉淀。（我认为上清中是胞浆蛋白和细胞内膜蛋白）
请问，这个方法对吗？去年那方法我没检测到受体蛋白。

作者: qhyu 时间: 2013-9-21 14:07

可以回答我吗：
今年前四个月我的目的条代都很漂亮，杂带背景都没有，120KD。五月份没做实验。可六月份开始，就什么都做不出了，连背景也没有，胶片一片空白，可同时做内参GAPDH，30+KD就很好。偶尔一次用了别人的蛋白却出来了，怀疑一抗，重新买了RnD的一抗，还没。所有的操作一点没变，就是一点没结果。难道我的细胞变了，不表达了？郁闷了快两个月了，快没时间了。昨天同学同时做我两的蛋白，她的表达，我的没有。怀疑是蛋白？可裂解是同样的手法呀？
企盼高人的帮组，天天west，天天空白。我已经快要崩溃了

作者: greenbee 时间: 2013-9-21 14:07

我用PQE30表达了一个融合了泛素的蛋白，过NI-柱也能过出来，但是做western检测时6个His抗体杂不出来，泛素的抗体也杂不出来，排除抗体的问题，请问ptglab这是怎么回事？？？？谢谢！！

作者: xyw5 时间: 2013-9-21 14:07

您好,我需要做的是先提取系膜细胞的总蛋白,然后再做WESTERN 使其中的ERK显出条带.想请问:
1.因为我的实验分组有很多,有10组.我不清楚要做出结果需要多少蛋白量呢?资料上写的是需要20ug总蛋白.书上写10ug总蛋白.可是要提取这么多蛋白所需要的细胞应该大约是多少呢?不知道用孔板培养细胞里面提取的蛋白够不够
2.you shouldn't loading more than 0.3ug/mm2 for one well.
您的意思是:每个孔不能超过0.3微克每平方毫米?也就是依据孔的面积计算?
3.请问您MARKER的意义只是提供一个标准分子量的参照,对于我的实验只是比较各个组之间ERK的表达多少,有什么意义呢?
谢谢!!!

作者: mamamiya 时间: 2013-9-21 14:08

1、请问组织蛋白Western中有什么技巧么，条带总是跑得不如细胞蛋白漂亮：（
2、另外想问脂肪组织和肌肉组织中用什么内参比较好！多谢多谢！！

作者: wiwi 时间: 2013-9-21 14:08

我最近表达了一个融合和泛素的蛋白（用PQE30载体表达），电泳检测时候能明显看出诱导前后蛋白带的差别，但是这两天连续做了两次western都分别用6个His抗体和泛素抗体杂交都没有杂出带来，请问能有什么办法检测出来吗？

作者: gemei0115 时间: 2013-9-21 14:08

你好，我想请教一下：
我做一个蛋白激酶，跑出来的结果好难看。蛋白为46KD，上样量40ul，10％胶，湿转恒压100v、100分钟。一抗过夜、二抗4小时，ECL显色，荧光几乎看不见，曝光20分钟。
图中上面一部分都是歪歪扭扭的，而且都连在一起。下面一部分是又做的一个，虽然直一些，但还是连在一起，无法区分样品。我一块胶有10个孔。右下角两条红线表示MARKER的位置。
为什么我跑的总是连在一起呢，为什么有时条带是歪的呢？怎样解决这个问题？
谢谢

图片附件: 60414393.jpg (2013-9-21 14:08, 6.8 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18628

作者: bring 时间: 2013-9-21 14:09

我正在做磷酸化akt的western blot，作了一次，没看见条带。实验室的带教也没有做出来。实验室别的人在收集细胞之前加了微量的胰岛素来刺激其分泌，还加了特殊的磷酸化酶抑制剂，并且将一抗孵育3天得到了结果。我也是一抗3天，但是没成功。膜上十分干净，什么带都没有出现。

我用的是cell signa 的抗体*ser 473*　1：５００　,封闭液用的是10%BSA ,2小时；其分子量是60左右，跑胶和转膜上应该没有什么问题。

在园子里面搜索，很多战友说得到了结果，也说不难，请问大家中间的经验及教训。多谢指点！！

我打算把封闭液浓度降低，并且延长一抗时间试一试。

不好意思，重复发了贴。单独发的贴没有人响应，只好在这里向大家请教了！！

作者: youyou99 时间: 2013-9-21 14:10

各位请留步：

最近做的western有点问题，我想加一个内参。不知道用什么比较好。
好像有人说是actin，但是我不知道在哪里可以买到．sigma好像有但
种类比较多。不知该如何选择？还有特异性的二抗在哪里买呢？

作者: IAM007 时间: 2013-9-21 14:10

上样量为40ul？0.75mm可以上样40ul？如果蛋白上样量多的化可以连成一片de

作者: gemei0115 时间: 2013-9-21 14:11

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2013-9-21 14:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
上样量为40ul？0.75mm可以上样40ul？如果蛋白上样量多的化可以连成一片de

楼上的，我的胶是1.5mm

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-21 14:12

内参我们用的是康城的GAPDH，1：5000，很好用。抗小鼠二抗即可

作者: rxcc33 时间: 2013-9-21 14:12

请教：
丽春红染色后可见条带，但胶片一片空白，问题可能出在哪里，谢谢赐教！

作者: yjf1026 时间: 2013-9-21 14:12

请教:
得到的样品，做了ELISA时，阴性对照无反应，但做转膜（硝酸纤维素膜）时就出现了较强的非特异条带。而且我用的一抗、二抗、显色液均相同。不知是何原因？

作者: 了了 时间: 2013-9-21 14:13

我现在用的是博彩公司的蛋白提取液,但提出的蛋白浓度较低,而且将说明书上的组织最大量加倍( 操作说明最大量是毫克/ 毫升), 可蛋白浓度还是达不到要求,
请问怎样才能提到符合要求的蛋白浓度,谢谢了!

作者: leifengta 时间: 2013-9-21 14:13

我想向您请教一下：
我前天做了一次western,昨天转的膜，但今天早上一看根本看不到marker,而且在跑胶时marker比其他蛋白带子跑得快。我现在很郁闷，我觉得是我的marker配的有问题。我要做的蛋白是高分子量的，所以买了高分子量的marker（分子量是从53KDa-220KDa),，但按说明书上的配方配完后很稠，是深蓝色的，而且说明书上并没有明确说明必须加上样缓冲液。预跑的样品必须用上样缓冲液溶后热变性，marker在配制时也比用上样缓冲液溶解呀？我现在很苦恼不知道该怎么办，希望能得到您的指导和帮助。谢谢，谢谢！！！

作者: 831226 时间: 2013-9-21 14:13

请教：我已经做过很多次Western　Blot，转膜后，用丽春红染色，有明显的Marker和蛋白质的条带，可是接着做，就不出结果。

作者: xue258 时间: 2013-9-21 14:14

你好！
今天上来看你的帖子，我想我可能能够给你一些帮助，不知道你的抗体是不是今年买的，如果是今年买的，我想该和我的是大约一样的问题了，我也是和你做同样的一个抗体，之前做了两个做月，一直都没有出阳性的结果，每次都是什么都没有，或者是背景很脏，感觉就是洗不干净，我觉得按我的课题而言，是一定可以做出来的，但是一直做不出来，于是整整的摸索了两个月，我广州中山医做实验的，后来我我找到了我们学校也做这个蛋白做的很好的一个师兄，他告诉我他们以前买的cell signal 的都很好用的，但是今年买的这一批很不容易做出阳性结果来，并且需要的浓度比较大，就如你说的去用胰岛素这样的去刺激，磷酸化AKT的表达是最丰富的，都还需要抗体孵预几天的时间，那么如果你用其他的刺激你那个细胞的表达，一般来说是没有胰岛素刺激那么明显的，所以你做不出来是应该的，我当时一直做不出来，后来我弄到了点santa cruz 公司的同样的抗体，以1：1000的浓度很容易就做出来，而且每一次重复都可以做出来。
所以我想你的问题一定是抗体的问题占多数了，建议你换抗体试一试，不要再浪费你宝贵的时间了。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-21 14:14

你好！
看了你的结果，我觉得最有可能是你的胶没有跑好，不知道你有没有同时做对照把你的胶也染色看看，看你要的目的分子量的地方，带是不是也时这样不直的，我以前也遇到过类似的问题，胶跑好就不会这样了。
希望对你有帮助，祝你实验顺利！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-21 14:14

你好！
不知道你的抗体有没有问题，或者时本身你做的那个蛋白存在与否，这两个问题最关键。

作者: memory 时间: 2013-9-21 14:15

请问各路大侠：
我前天做了一次western,昨天转的膜，但今天早上一看根本看不到marker,而且在跑胶时marker比其他蛋白带子跑得快。我现在很郁闷，我觉得是我的marker配的有问题。我要做的蛋白是高分子量的，所以买了高分子量的marker（分子量是从53KDa-220KDa),，但按说明书上的配方配完后很稠，是深蓝色的，而且说明书上并没有明确说明必须加上样缓冲液。预跑的样品必须用上样缓冲液溶后热变性，marker在配制时也比用上样缓冲液溶解呀？我现在很苦恼不知道该怎么办，希望能得到您们的指导和帮助。谢谢，谢谢！！！

作者: 079777chao 时间: 2013-9-21 14:15

谢谢你，那抗体有问题应该是什么样的问题呢？

我的一抗是高免血清（1：1000稀释）二抗是买的SIGMA的（1：5000稀释）

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-21 14:15

抗体没有活性或者是活性很差，不能够有效的识别你的蛋白，不能够说你的抗体买的公司好就一定没有问题，一般二抗有问题的可能会小点，建议做个阳性参照就可以知道你的一抗有没有问题了，还有做个例如actin的内参，就可以知道是不是你的二抗，以及整个系统的问题了。
祝实验顺利！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-21 14:16

我是新手想请教一下我做的是130kd和70kd的蛋白，用什么浓度的浓缩胶和分离胶比较好。

作者: standbyme 时间: 2013-9-21 14:16

我提的是组织膜蛋白，看到有很多裂解蛋白的方法，最简单的是用上样缓冲液，不只膜蛋白是否可以这样提取，另外，在不知目的蛋白表达浓度的情况下，上样的总蛋白浓度应该至少达到多少？谢谢

作者: yes4 时间: 2013-9-21 14:17

一般要用到组织裂解液，并且要组织的来源不同裂解液的成分也不同，如胃组织由于其纤维组织丰富所以要用到triton ，还要用到一些酶抑制剂如抑肽酶和PMSF保护蛋白免受降解，至于上样的浓度要根据目的蛋白的含量来看，一般组织的要比细胞的上量要多，大概100多ug每孔，然后根据western结果来看，调整上样的蛋白含量。我们做的组织上样一般到150到200ug

作者: yes4 时间: 2013-9-21 14:17

我是新手想请教一下我做的是130kd和70kd的蛋白，用什么浓度的浓缩胶和分离胶比较好。

浓缩胶的浓度一般是5％，分离胶的浓度根据以下标准：12－43KD用15%的分离胶，16-68KD用10％，36－94KD用7。5％，57－212KD用5。0％，你自己选择吧

作者: yes4 时间: 2013-9-21 14:17

浓缩胶的浓度一般是5％，分离胶的浓度根据以下标准：12－43KD用15%的分离胶，16-68KD用10％，36－94KD用7。5％，57－212KD用5。0％，你自己选择吧

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 14:18

非常感谢！我向成品的细胞裂解液中加入25mMB-磷酸甘油、1mM矾酸钠会不会影响它本身的裂解效果呢？这两种试剂常见吗，需要花很长时间定购吗？麻烦你告诉我专门的磷酸化蛋白提取的buffer的名称和厂家。谢谢

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 14:18

在裂解液中加入25mMB-磷酸甘油、1mM矾酸钠就可以了。另外有专门的磷酸化蛋白提取的buffer卖

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 14:19

我做磷酸化蛋白的检测，要么全部检测不出来，要么个别检测不出来，但总蛋白每次都能检测出来，我用的细胞裂解液是bio－rad的laemmli buffer成品，是不是我的裂解液有问题，是否应加磷酸酶抑制剂，应该加什么，有没有磷酸化蛋白提取的buffer成品卖，能告诉我名字和厂家吗

作者: BOSS2011 时间: 2013-9-21 14:19

谢谢,谢谢你
我还有一个问题,我想知道DBA溶液的配制方法是什么?
我按照分子克隆书上和我师姐的配制都做了一遍,我师姐说,正常配制时候,应该有变色,可是我做的怎么没有呢?
我的DBA买的时间挺长的,但是一直没有人使用,能不能过期呢?
谢谢你.

作者: summerxx 时间: 2013-9-21 14:19

请问：我预检测的蛋白在40-60kd之间，内参选actin还是GAPDH好？
你介绍了康城的GAPDH，可是我没有搜到。

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-9-21 14:20

请教大虾：
分子量110kd的，如果用半干转，需要的时间是多少呢？那时间和分子量间的换算关系如何，也请指教一下啊！不胜感激！

作者: jujuba 时间: 2013-9-21 14:21

即将做wsetern blot请问脑组织总蛋白提取时匀浆后离心速度多少合适。谢谢！

作者: ququer787 时间: 2013-9-21 14:21

请教您，如果是目的蛋白很小9KD，应该用什么样的实验条件呢？

我用20%的分离胶，结果没有出来。

作者: bongte 时间: 2013-9-21 14:21

请问一下Western 结果用什么软件分析，在哪个里面有下载啊，感谢各位高手赐教

作者: rxcc33 时间: 2013-9-21 14:22

请问各位大侠用RIPA怎么裂解细胞，下面两种方法哪种好？

1.PBS洗细胞，用刮子刮下细胞，1000转离心5分钟，倒掉PBS，将细胞转移到EP管中，加RIPA裂解液，吹打均匀，4度冰箱20分钟。1000g（3000多转）离心20分钟，收集上清

2.EP管加裂解液后液氮反复冻融3次，1000g离心20分钟，收集上清

我要的蛋白是肌浆网上的膜蛋白，做WB，收集的上清里面包含了胞浆蛋白和膜蛋白是吗？这对做WB有影响吗？

谢谢

作者: gogo 时间: 2013-9-21 14:22

我想请问各位战友
我今天做WESTERN
用了预染的MARKER，用0.1A 30分钟转膜，可见MARKER的22KD的条带在膜上，我的目标片段是32KD，但是胶上只有98KD的条带，其他条带都没有了。
用1：500的一抗 1：2000二抗
用ECL后没见荧光，暴光30分钟未见条带
我上次用相同的条件，但用的是PIERCE的ECL，可见很强的荧光，也做出了条带
这次用的是国产的ECL，是师兄剩下的。

这次封闭完后，我发现MARKER的条带居然偏移了位置，向右边偏移了一些，不知道为什么，以前没出现这种事。

青高手分析原因，条件一样，是ECL的问题吗？这次的一抗是上次用过的，加了叠氮钠。还有转膜时我用的滤纸比胶要小一些，这样可以吗？是试剂公司的人说的，我上次也是这样作出了
显影液和定影液可以回收使用吗？？
请帮帮忙

作者: u76mp 时间: 2013-9-21 14:22

强烈求助：
1．采用5%脱脂奶粉4度封闭过夜，次日再加一抗室温2.5小时，清洗（TBST,TBST,TBS分别洗10min）,再加二抗室温1小时，清洗同上。请帮我看看步骤是否存在问题，另外，
方法上可否改为室温封闭2小时，一抗4度过夜。这样我觉得省点时间。
2．配方问题
TBST中tween的终浓度应为0.5%，还是1%。
还有的是这样的：TBS700ml+20%tween(事先用双蒸水配的)1.65ml
我算过，终浓度为0.05%
到底应该是多少啊？
3．采用的脱脂奶粉可有什么讲究，什么比较好呢？
4.有专门的封闭液么?会比脱脂奶粉好么?
5.一抗,二抗浓度需要多少,按照说明书么?有听说二抗稀释度要是一抗的10-20倍,是这样么?
6．今天做了次实验，转膜很漂亮，但是经过上诉实验方法封闭，一抗，二抗后，显影发现本底非常高，根本看不到东西。我一抗1：500，二抗1：200。帮我分析一下。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-21 14:23

我们用0.05％

脱脂奶粉应该也可以吧可以试试BSA

作者: applebook=213 时间: 2013-9-21 14:23

请问转膜的电压有没有一个可以参考的范围

比如我要转200kd的nestin 用3.0mA/cm2？是不是有点大

作者: loli 时间: 2013-9-21 14:23

各位大侠好,我做Westen blot ,可是做了很多次也没有出来,我的一抗是用葡萄球菌免疫兔的高免血清,二抗是兔抗牛的IgG,抗体的组合是对的么?

作者: tuuu2 时间: 2013-9-21 14:24

不知道你的二抗为啥这样高？

作者: lxh031 时间: 2013-9-21 14:24

你好!
我的靶蛋白为21KD,用0.45um 还是0.22um的NC膜? 0.85mA/cm2 ,半干电转移2小时可以吗?谢谢

作者: ffaa 时间: 2013-9-21 14:24

我要测的蛋白分子量只有15KD，做Western blot 容易出结果吗？

作者: plaa 时间: 2013-9-21 14:25

我也不是很清楚,因为我的说明书丢了,上网查后推荐做WB用1:200-1:400
问过别人时有的说太高了,本底会很高,有的又说可以,我晕了,可以给我点建议么》在浓度选择上.
我今天正在做准备用1:2000的试试.

作者: pencil菲 时间: 2013-9-21 14:25

western blot 做p38MAPK,方法和做别的一样只是一抗不同对吗？用单抗好还是多抗好

作者: 8princess8 时间: 2013-9-21 14:25

强烈求助：
1．采用5%脱脂奶粉4度封闭过夜，次日再加一抗室温2.5小时，清洗（TBST,TBST,TBS分别洗10min）,再加二抗室温1小时，清洗同上。请帮我看看步骤是否存在问题，另外，
方法上可否改为室温封闭2小时，一抗4度过夜。这样我觉得省点时间。
2．配方问题
TBST中tween的终浓度应为0.5%，还是1%。
还有的是这样的：TBS700ml+20%tween(事先用双蒸水配的)1.65ml
我算过，终浓度为0.05%
到底应该是多少啊？
3．采用的脱脂奶粉可有什么讲究，什么比较好呢？
4.有专门的封闭液么?会比脱脂奶粉好么?
5.一抗,二抗浓度需要多少,按照说明书么?有听说二抗稀释度要是一抗的10-20倍,是这样么?
6．今天做了次实验，转膜很漂亮，但是经过上诉实验方法封闭，一抗，二抗后，显影发现本底非常高，根本看不到东西。我一抗1：500，二抗1：200。帮我分析一下。

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1.步骤没有问题，封闭过夜或者一抗过夜都没有问题
2.tween不加也没事的，加0.05％是可以的
3.奶粉也没什么讲究，我用了过期两年的奶粉效果都很好
4.显影本底高的话可以试试减少压片及显影时间，我通常只压3-5s。
5.稀释度的话看说明，不过一抗的稀释度好像一般都是1：1000以上的。
还有就是抗体用封闭液稀释效果更好

作者: plaa 时间: 2013-9-21 14:26

一抗二抗都用封闭液稀释么？

作者: woshiduiyan 时间: 2013-9-21 14:26

我需提取的蛋白中一个是膜蛋白一个是胞浆蛋白。INVITRON公司的trizol试剂说明书上提到在RNA提取后可接着用于总蛋白提取。我想问一下楼主，按说明书所说是否我就可以一次性提取这两种蛋白呢？（我作WESTERN BLOTT) 另外，TRIZOL试剂说明书要求最后真空干燥蛋白沉淀，由于没有真空干燥仪器，我可否用空气中自然凉干那？急盼楼主的答复，先谢过了。

作者: zzzz 时间: 2013-9-21 14:27

我做的蛋白是从小鼠组织中提取的总蛋白，我做的定量总是不准！想请高手指点一下，组织蛋白的提取方法及定量方法！不胜感激！

作者: 30moonriver 时间: 2013-9-21 14:27

请问：我预检测的蛋白在40-60kd之间，内参选actin还是GAPDH好？
你介绍了康城的GAPDH，可是我没有搜到。

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GAPDH分子量30＋KD,应该可以分开。你在上海吗?我们去年买的是900＋元，一千不到，现货，四个人用到现在还有。明天给你他们公司的电话吧。

作者: duoduo 时间: 2013-9-21 14:28

自己很是相信cell signa的质量，所以压根就没有朝这方面想，总怀疑自己的技术不行。

多谢多谢！！

作者: tianmei001 时间: 2013-9-21 14:28

相关疾病：
病毒感染流行性感冒肝炎
研究发现一个新的在免疫应答中起关键作用的蛋白

一个新近发现的蛋白不仅在抵抗病毒感染的免疫系统中起着关键作用，而且被发现位于细胞中一个出人意料的位置，迫使研究者重新思考先前的有关人类免疫应答的理论。 UT Southwestern Medical Center的研究者称，基于这项发现，人们可开发出一种治疗和预防病毒感染（如流感，肝炎，西尼罗河病毒和 SARS）的新方法。研究成果已经公布在网上并且将发表在9月9日的Cell杂志上。
---更多详情 Bio.com
量子点（quantum dot， QD）又可称为半导体纳米微晶体（semiconductor nanocrystal），是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在2~20nm之间的纳米晶粒。目前研究较多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年来，半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视，其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科，已成为一门新兴的交叉学科。

作为一种最新型的荧光材料，与传统的有机染料分子相比量子点确实具有多种优势。其中最大的优点在于有丰富的颜色。单一种类的纳米半导体材料就能够按尺寸变化产生一个发光波长不同的、颜色分明的标记物家族，这是染料分子根本无法实现的。此外，它激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱单色性好，且颜色可调，并够承受多次的激发和光发射，有持久的稳定性。因此，这些优异的光学性质使得量子点在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极广的应用前景。
量子点技术的优点：

* 多种颜色：颜色取决于量子点的大小，在同一激发波长下，可发出多种激发光，达到同时检测多种指标的要求

* 荧光时间长：荧光时间较普通荧光分子延长数千倍，便于长期追踪和保存结果

* 检测方便：最简单的荧光显微镜即可进行检测

* 安全：细胞毒性低、可用于活细胞或者体内研究

* 应用范围广：可用于多领域和多仪器

量子点技术的用途：

1、观测活细胞里多个蛋白质的活动：量子点 (quantum dots) 现已可取代传统染色法，成为细胞内的荧光标记物，可进行长时间、多分子同时检测。

参考文献：Jaiswal JK et al. Nature Biotechnology 2002 Dec 2

2、荧光标记：这种新型荧光材料的出现为众多生物问题的研究带来的曙光。

量子点可与多种分子进行偶联，如Protein A、抗体、链霉亲和素等，作为荧光探针，检测特定靶分子的分布和功能。

参考文献

Wu, X. et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnol. 21, 41-46 (2003)

Jaiswal, J. K. et al. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotechnol. 21, 47-51 (2003)

量子点技术的应用领域：

* 生物体系中作为荧光探针

* 筛选药物的有利工具

* 医学成像

* 生物芯片研究

* 液相芯片(solution array，luminex技术)

作者: dog002 时间: 2013-9-21 14:28

相关疾病：
继发性青光眼
我是一个新手，我想做WB，但听说很难做出结果，我想知道你是否做过
SPARC/BM-40，也叫富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或骨连接蛋白，我要做的是牛眼小梁细胞，不知需要注意什么？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-21 14:29

我是Wwstern 新手，今天第一次做，显色结果目的条带好象出来了，但是是一条很细的，其中背景确是很花，有很多颜色。请问大侠是什么原因，下一步该怎么办？我是用AP显色，一抗购自SANTA CRUZ，为rabbit来源多抗，稀释度按说明书1：1000。二抗购自sigma，AP标记，按1：20000稀释。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-21 14:48

请问我看到文献关于westernblot半定量大多是采用HRP+ECL显色，我这边实验室是都采用AP显色的，不知道做蛋白半定量要可以吗？

作者: glass 时间: 2013-9-21 14:49

我第一次作WB,是接着师姐的做的，她已经跑完电泳，转完膜。这两步都没有问题，丽春红染色可见蛋白条带。我就是封闭加一抗二抗，结果曝光后什么都没有。加一抗二抗时都加了脱脂奶粉配的2％的封闭液，会不会是这个的原因啊？师姐说她做时也是用封闭液就没有结果，不用就有结果，考虑封闭液偏酸，我们将TBS-T的PH值调到了8.0，脱脂奶粉配封闭液从5％降到了2％，可封闭液的pH值还是偏向7.0，这样偏酸的封闭液是不是影响了抗体的结合？
一抗，二抗是santa cruz公司的。ECL
请各位帮我分析一下是什么原因没有出结果。

作者: 831226 时间: 2013-9-21 15:21

我正在做32KD分子大小的Western Blot，几次转膜都不成功，今向ptglab请教转膜条件，我用的是湿法转移，仪器是北京六一的，望不吝赐教，不胜感激！！

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 15:22

我正在做32KD分子大小的Western Blot，几次转膜都不成功，今向ptglab请教转膜条件，我用的是湿法转移，仪器是北京六一的，望不吝赐教，不胜感激！！！

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我用的也是湿法转移,但是我用的是进口的,好象是bio什么公司的,我不是很清楚.我认为
第一,你的分离胶浓度应该正确,你是属于小分子量的,应该用15% 12.5% 10%都可以吧,不过,可能前两者更适合点,你试试.
第二,保证胶上确实有目的蛋白.否则,其他无从谈起.
第三,如果跑胶没有问题,考虑安装转膜设备的问题.是否在叠加NC膜滤纸时排除了气泡,接触是否紧密,是否存在电转液漏.
第四,电转时间是否足够.你所谓的"转膜都不成功"是否转后再染胶了呢?是否胶上还有蛋白,如果还有较多蛋白,可能电转时间不够或者问题如第三.
至于,其他的就等你再恢复详细点再说吧.
共同进步,请指教.

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 15:23

我第一次作WB,是接着师姐的做的，她已经跑完电泳，转完膜。这两步都没有问题，丽春红染色可见蛋白条带。我就是封闭加一抗二抗，结果曝光后什么都没有。加一抗二抗时都加了脱脂奶粉配的2％的封闭液，会不会是这个的原因啊？师姐说她做时也是用封闭液就没有结果，不用就有结果，考虑封闭液偏酸，我们将TBS-T的PH值调到了8.0，脱脂奶粉配封闭液从5％降到了2％，可封闭液的pH值还是偏向7.0，这样偏酸的封闭液是不是影响了抗体的结合？
一抗，二抗是santa cruz公司的。ECL
请各位帮我分析一下是什么原因没有出结果。

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你所谓的"什么都没有"是什么意思啊,是指本底高,黑色一片,还是本底正常,却什么都没有呢?
"不用就有结果"是什么意思,难道可以不用封闭液封闭吗?请详细点.
一起参考

作者: jujuba 时间: 2013-9-21 15:23

1.胶的厚度和蛋白质的分子量大小有关吗，我的蛋白是130kd的，0.75mm的胶可以跑下来吗
2.我用的RIPA缓冲液提膜蛋白，取的是上清，剩下的沉淀还可以用于提RNA吗？如果我想用同一份标本既做western blot又做RT-PCR该按什么顺序提蛋白和RNA比较合理呢
很急啊，希望您在百忙中尽早抽时间帮我，不胜感激

作者: idoww 时间: 2013-9-21 15:24

“什么都没有”就使本底正常，却什么都没有。加二抗时不用封闭液稀释二抗，而只用TBS-T。加一抗前当然已经封闭过了。你说这是怎么回事呢？

作者: kuohao17 时间: 2013-9-21 15:25

“什么都没有”就使本底正常，却什么都没有。加二抗时不用封闭液稀释二抗，而只用TBS-T。加一抗前当然已经封闭过了。你说这是怎么回事呢？

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二抗不用封闭液稀释二抗，用TBS-T应该不会有问题.ECL很敏感.只要你的膜上有目的蛋白,应该都会有条带显示的
首先,确定你的一抗,二抗是否有问题,浓度如何?
其次,考虑ECL是否有问题.
另外,PH是很重要的,我的PH值给忘了,下次给你,我是用5%奶粉配的
先考虑这些吧

作者: ROSE李 时间: 2013-9-21 15:26

今天我们用TBS-T稀释抗体，一抗二抗1：500 、1：750，抗体应该没有问题，之前师姐有做出来，但不是每次都出。这次还是没有结果啊
TBS-T的PH值是8
我们用5％奶粉配时ph值就降到7了。这是怎么回事啊？
怕是ph值太低，就不用奶粉配抗体了。
可还是没有结果，DAB显色也是什么都没有。是不是说明抗体没有结合上啊
一抗4度过夜，二抗室温1小时。这样的时间可以吗？
会是在电泳时没有分开吗。我们的蛋白50KD左右，电泳时电压一直56V电流35V，这样会不会存在分不开蛋白的情况。如果分不开是不是也不能和抗体反应？？

作者: wu11998866 时间: 2013-9-21 15:26

我想做真菌细胞的MDR（多药耐药蛋白的）检测，查到的文献相关的很少。

也不知道如何做，能给我详细的指导吗？我可以给你发邮件请教吗？先谢谢了

作者: wu11998866 时间: 2013-9-21 15:27

相关疾病：
肿瘤
有没有高手做过真菌多药耐药蛋白的western blot, 与肿瘤细胞的多药耐药蛋白相似。
我是一个新手，需要大家的指导？先谢谢了。

作者: yes4 时间: 2013-9-21 15:27

用于石蜡切片的免疫组化抗体可否用于WB的一抗。有目录上有写某某抗体，Ab-1，-2的字样，这个ab-1是什么意思啊，比如caspase3 ab-1。与caspase3抗体有什么区别吗？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-21 15:33

我有个最菜的问题要问，细胞裂解液加的比例是1：10，是不是1g湿组织：10ml 液体，哪位好心人请回答我！阿

作者: windy+++ 时间: 2013-9-21 15:34

请教大侠，如目的基因和内参（分别为42、57KD）一抗为同一种属来源，三种方法
（1）两种一抗同时加，或者先
（2）目的基因一抗－－HRP二抗－－DAB，然后内参一抗－－HRP二抗－－DAB
（3）目的基因一抗－－内参一抗－－HRP二抗－－DAB
应采用哪一种，
如必须采用方法（2），是否必须strip
请大侠指点

作者: 49888 时间: 2013-9-21 15:35

总蛋白的提取都有些什么好方法？请不吝赐教！

作者: 101010 时间: 2013-9-21 15:37

请问一抗和酶标二抗的稀释度怎麽确定？对非特异性显色影响大吗？我同时跑了两块胶，一块染了色，另一块做免疫印迹，结果在第一块胶没看到小于14400的蛋白着色，可是做印迹的结果却是小于14400的区域出现了大片显色，这是怎麽回事啊？大师，我该怎麽做？

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-21 15:39

Hi,我目前在作一个线粒体内膜上蛋白的WB。该蛋白我加了一个V5 tag用于WB检测。但一直检测不到信号（阳性对照是细胞质表达的一个蛋白，可检测到信号，证明抗体有效）。所以我想可能是目标蛋白没有溶于loading buffer 中。可是loading buffer中的SDS是很强的去污剂，按理讲膜蛋白应该溶于其中吧（我直接将loading buffer加到HeLa细胞中）。不知有何高见指点迷津。

作者: 33号 时间: 2013-9-21 15:40

我刚开始做western,有很多地方都要请教一下哦:
1. 做预实验与现在做正式实验时的条件都一样,只是蛋白浓度不一样了,预实验时做得条带很清楚,但现在就是做不出来.想问一下,一般蛋白浓度以及上样量在什么范围时才能做出来?
2. 还有就是我要先做IP然后再用IP纯化了蛋白做western,请问这时蛋白怎样定量?

作者: duoduo 时间: 2013-9-21 15:40

我转膜的时候转了几次老师转不上去怎么办啊，我只有一次偶然的机会转上去，可是以后做的几个都转不上，现在找原因也找不到，我的蛋白的分子量是50000多，我用60v的电压转过2小时，100v的电压也转过1.5小时、2小时等，可是转膜完后，用丽春红染色发现膜上没有印记，而且转膜的胶染色后也没有蛋白在上面，这是什么原因啊？？？？？
还有您提到过要用marker在膜上，可是染色后，或者与抗体底物等反应后，marker的条待还能看清楚吗？？？应该怎么解决，用凝交图象分析系统是否可以对膜进行光密度分析呢？？！！！！
不好意思，异口气问您这么多问题，迫切期待您的回答！！谢谢

作者: ALALA 时间: 2013-9-21 15:41

两种一抗可以一起加,我做过的,没有问题.但前提是两种一抗的稀释度是都摸好的,显色时强度差不多才行.

作者: ALALA 时间: 2013-9-21 15:41

胶和膜上都没有蛋白?是不是你的电极搞反了?我也搞错过一次,蛋白无影无踪了.还有一种可能就是电压过高,时间过长,或者膜的孔径太大,也会转过,我一般用250mA即20V转2小时.不过就算转过了的话,膜外面的滤膜上也可以看到Marker条带呀.
染色或反应后依旧可以看到Marker条带.凝胶成象系统可以进行灰度分析.

作者: 987789 时间: 2013-9-21 15:43

强烈求助：
1．采用5%脱脂奶粉4度封闭过夜，次日再加一抗室温2.5小时，清洗（TBST,TBST,TBS分别洗10min）,再加二抗室温1小时，清洗同上。请帮我看看步骤是否存在问题，另外，
方法上可否改为室温封闭2小时，一抗4度过夜。这样我觉得省点时间。
2．配方问题
TBST中tween的终浓度应为0.5%，还是1%。
还有的是这样的：TBS700ml+20%tween(事先用双蒸水配的)1.65ml
我算过，终浓度为0.05%
到底应该是多少啊？
3．采用的脱脂奶粉可有什么讲究，什么比较好呢？
4.有专门的封闭液么?会比脱脂奶粉好么?
5.一抗,二抗浓度需要多少,按照说明书么?有听说二抗稀释度要是一抗的10-20倍,是这样么?
6．今天做了次实验，转膜很漂亮，但是经过上诉实验方法封闭，一抗，二抗后，显影发现本底非常高，根本看不到东西。我一抗1：500，二抗1：200。帮我分析一下。

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我用的是5%的古城牌脱脂奶粉,效果很好.bsa当然可以但是太贵.
我们用的tween浓度是0.3%
封闭1小时,一抗4度过夜,二抗2小时,ecl发光,一抗1:400(我用的是santa cruze),二抗1:2000发光效果很好

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-21 15:46

想请教一下:
1. 我养的是大鼠主动脉平滑肌细胞,贴壁的,所以每次裂解细胞总是很难把细胞完全刮下来,不知道可否再裂解前先用胰蛋白酶使之消化下来后再加裂解液进行裂解呢?还有就是加了胰酶后是不是的一定加血清进行中止?如果是的话,这些会不会对细胞裂解的蛋白产生影响?
2. 先做IP 然后再用ip 纯化的蛋白做westernblot,这样IP后的蛋白在做westernblot跑胶上样时怎样定量啊?我只知道直接用蛋白做westernblot时测蛋白浓度定量.

作者: tie8 时间: 2013-9-21 15:46

我做的蛋白只有只有10KD，12%的分离胶合适吗？电泳时多大电流比较合适？湿转的电流及时间多少比较合适啊？
谢谢了！！！

作者: 7437654 时间: 2013-9-21 15:56

我用抗GST mAb做一抗，请问哪家公司的产品好（价格不超过2000元的，请同时告诉我二抗是用什么抗体）。谢谢！

作者: damingxia0904 时间: 2013-9-21 15:56

我要表达的蛋白只有11kd，15%电泳显示有可疑的目的带，条带很弱。但是wb做不出来，请问湿转应该采用什么条件，实验室现在只有0.45um的nc膜。谢谢！

作者: standbyme 时间: 2013-9-21 15:56

我想问一下，如何提高灵敏度亚？谢谢！！

作者: linlinstar 时间: 2013-9-21 15:57

我转膜的时候，怎么老是转不上去啊，我试过很多条件，有100V，1.5小时；60v，2.5小时；15v,4小时；等，而且都是在冰浴里做的，但是经丽春红染色后就是不见条带，一直找不到原因，希望高手能够指点迷津，谢谢

作者: linlinstar 时间: 2013-9-21 15:59

我第一次转上一次，可是以后的十几次都没有转成功，我100v，1.5小时，60v,2.5小时；15v，4小时，都试过，但是经丽春红染色后就是不见条带，但是就是没有结果，电极是按照说明来的不可能搞错吧，你也出现过此类情况吗？你是怎么解决的啊

作者: flower-201 时间: 2013-9-21 15:59

请教各位高手：
我想提取胁迫条件下培养的细胞中去污剂不可溶蛋白，但不知如何提取，急！请各位大侠指点，谢谢！

作者: flower-201 时间: 2013-9-21 15:59

请问哪位朋友有抗人survivin抗体可以卖一点给我,急需!!!用量不大,请提供帮助 SOS !

作者: guagua 时间: 2013-9-21 16:00

我转膜的时候转了几次老师转不上去怎么办啊，我只有一次偶然的机会转上去，可是以后做的几个都转不上，现在找原因也找不到，我的蛋白的分子量是50000多，我用60v的电压转过2小时，100v的电压也转过1.5小时、2小时等，可是转膜完后，用丽春红染色发现膜上没有印记，而且转膜的胶染色后也没有蛋白在上面，这是什么原因啊？？？？？
还有您提到过要用marker在膜上，可是染色后，或者与抗体底物等反应后，marker的条待还能看清楚吗？？？应该怎么解决，用凝交图象分析系统是否可以对膜进行光密度分析呢？？！！！！
不好意思，异口气问您这么多问题，迫切期待您的回答！！谢谢

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可能转过了，15伏15min，bio－rad半干转移，基本没问题。marker染色后用铅笔将条带描上。凝交图象分析系统主要对胶进行光密度分析，不对膜进行分析。

作者: 079777chao 时间: 2013-9-21 16:01

做WB目的片断未看到,背景却比较强,还有非特异条带出现,这应该是抗体好用吧?可为什么看不到目的片断呢?不知各位有何高招?我一抗浓度是1:500,二抗浓度是1:3000

作者: kswl870 时间: 2013-9-21 16:02

我做的目标蛋白分子量在40KD ,胶跑出来了,但膜用立春红染色什么都没有,我用的是六一的石墨半干转印 ,转印条件是恒流60mA,45 min ,结果胶和膜上什么都没有,我的转印仪是新的.

作者: bring 时间: 2013-9-21 16:02

您好!我最近开始做WB有个疑问请教:
1.转膜时间:我的目的蛋白17kd, PVDF膜, 100ma转膜3h,压片有很多大于17kd的非特异性条带,目的条带没有,是否转膜时间出了问题,有什么好的建议?

2.我还有个蛋白只有8.3KD,该用百分之几的分离胶?

谢谢!

作者: fox_79 时间: 2013-9-21 16:03

请问楼主：
我的目的蛋白约11KD，用15%的胶合适吧，电泳及转膜时应该稳压还是稳流，多大合适呢？
谢谢楼主！

作者: ending 时间: 2013-9-21 16:03

你好！
我是新手，想做western，我的目的蛋白的分子量是88kDa，想请教您电泳及转膜的条件。非常感谢！

作者: junjie05 时间: 2013-9-21 16:04

你好，听说你做过包涵体沉淀免疫兔子，请问沉淀和佐剂如何混合，混合前沉淀要冻干吗？混合到什么程度才可以打兔子？不好意思，弱问题请赐教。

作者: idea2011 时间: 2013-9-21 16:04

1.一抗或二抗用封闭液稀释的好还是PBST(or TBST)稀释的好呢?
2.考染能看见目标条带,转膜后的凝胶考染未见蛋白条带.转膜后的膜丽春红染色也没有看见蛋白条带.是否一抗浓度太高？
请问可能是什么原因?
在线等，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:05

抗体稀释用封闭液和TBST都可以.用封闭液效果好一些.

二的原因是蛋白没有转移到膜上.你找一下转移过程有没有问题.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:06

包含体用4M的尿素溶解至600ug/ml,然后取500ul,1:1混合佐剂,进行主注射.具体的量看你的免疫流程和免疫量.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:09

建议你用20v转移4h.另外就是膜的预处理可能会有问题.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:12

8%的胶(1.5mm厚),100伏电泳至溴芬兰跑至胶下边缘.

转移,半干转移100mA转移2h-2.5h

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:12

分子量11kd的蛋白选用孔径小的膜如PSQ膜.
半干转移.恒流.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:13

分子量11kd的蛋白选用孔径小的膜如PSQ膜.
半干转移.恒流.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:13

1,转移过;17kd蛋白15%的胶,100mA转移40分钟足够.

2,8.7kd的蛋白用15的胶分离.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:14

可能膜没有预处理好.

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:15

可能膜没有预处理好

作者: NBA 时间: 2013-9-21 16:16

如果确定目的蛋白存在,那么你用的1抗质量不是太好.

背景脏,洗一抗,二抗时,洗涤次数不够;或者抗体稀释倍数偏低.

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-21 16:17

我想从石蜡包埋组织中提取蛋白,然后做WESTERN,请介绍一种提取的方法
谢谢

作者: pengke1983 时间: 2013-9-21 16:17

请问:用westernblot测组织匀浆液中的蛋白,如果未在匀浆时加入细胞裂解液,仅用了盐水,有无补救方法?

作者: xingyi08 时间: 2013-9-21 16:19

我做western目的是为了检测成纤维细胞分泌的一种蛋白a－SMA，42KDa，今天又做了一次，用的细胞量计数约为1×106，按照RIPA的使用说明，每10的6次方个细胞应加1mlRIPA和10uLPMSF，可作出来后用BCA法测蛋白，总蛋白浓度只有457ug/ml，如果按每孔加样15uL的话，除去7.5uL上样Buffer，只有7.5uL样品，即3.4ug总蛋白，量太少了。可要是增加细胞量的话，相应的裂解液也要增加，也无法提高总蛋白浓度，请问有谁能解释一下吗，是我在裂解细胞那一步出错了吗，请指教，谢谢！

作者: daod 时间: 2013-9-21 16:20

我的目的蛋白分子量分别为18和14KDa（由前者降解而来）,我用12%的胶做，背景挺干净的，但是在40KDa左右的位置出现了清晰的条带，而该有的位置却一片空白。请问是什么原因啊，有人曾提议是否形成了二聚体？而我查阅文章发现14KDa的那个蛋白与磷脂酰乙醇胺形成了共价结合，RIPA裂解液应该不会打断共价键吧？谢谢。而且国外的文献做出来的条带就是18和14KDa。

作者: milkdog 时间: 2013-9-21 16:21

我从今年暑假期间开始做western，从那时起开始关注这方面的帖子，也从那时知道了你，很欣赏你的渊博，更佩服你的热心和勤劳。我曾给你发过邮件，也打过你原来公司的电话，他们告诉我你现在不在国内了，不知道你在他乡还好吧？祝福你生活愉快！天天笑口常开！我到现在也做了三个多月的western了，大蛋白（100多kd），小蛋白（〈20kd）的也都做过了，半干转、湿转等也都摸过条件了。感动于你的热心，我也在有空时尽我力所能及得回答一些问题，而且以后一定更常光顾这块。发这个帖子主要就是想表达一下对你的敬意和祝福：祝福你永远开心！

作者: flower-201 时间: 2013-9-21 16:21

我正在做western，以前做过很多次了，碰到的问题并不多，
但是这次跑胶、转膜后上一抗，上二抗后曝光，先是条带很弱（以前做很强），
然后又上了一次更浓的二抗，加了更多的发光剂，结果什么也没有，
换了一次二抗，还是什么也没有，
染过膜，上面有很多蛋白，也直接加二抗到发光剂里，有很强的荧光，证明二抗和发光剂都没问题，请问高手们，能是什么地方出了问题？
还有，我是用机器洗片，一般没有什么问题。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-21 16:23

非常感谢我们这个帖子,我从这里学到很多东西。我要做三种蛋白的Western blot，前一段做出过p53,polβ(39kd,融合蛋白65kd)的条带，但现在却重复不出来了。还有一种是Rasp21蛋白，出现过一次条带，但也不能肯定是不是目的蛋白．麻烦ptglab和各位高手帮我分析分析制胶和转膜条件是否合适：　
p53 ,polβ相同条件：５％积层胶，８０伏，半小时；１０％分离胶，１６０伏，两个小时；半干转膜，２０毫安，４５分钟
Rasp21:5%积层胶，８０伏，半小时；１５％分离胶，１６０伏，两个小时；半干转膜，１０毫安，４０分钟

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-21 16:24

我觉得你的转膜电流小了，我常规是用100mA ，如果是大点的胶（BioRad的mini 3电泳槽完整的胶）就适当提高电流，你试试用100mA恒流，转2个半小时到3 个小时。一抗2h，二抗1h，洗膜时间为10min 3次。还有你一抗和二抗浓度还要注意是否合适。一般一抗稀释是1：200～1000，

作者: uaubc 时间: 2013-9-21 16:24

我近期在作Western Blotting 试验，我是测定鸡蛋中的蛋白因子（VEGF，BFGF，PDGF，EGF等），但是目前买不到鸡的一抗？
各位学友，哪里有卖鸡的一抗？二抗？
谢谢！
我想用兔抗人或鼠抗人的一抗，但又不知道兔，鼠和鸡的VEGF，BFGF，PDGF，EGF等因子同源性如何？
请帮忙！
谢谢！

作者: plaa 时间: 2013-9-21 16:26

大侠帮忙：请教个弱智问题
我师妹要做RT-PCR，我要做western ,由于组织很小，她们用TRIzol提了后的蛋白我能够来做Western 么？可以的话，TRIZOL提了后下面怎么做接者做？

作者: 911 时间: 2013-9-21 16:27

请教:
1我做western出现了一个奇怪的现象,DAB显色时,在DAB溶液中膜上始终看不到目的带,将膜从DAB溶液中取出用吸水纸弄到半干时,会看到目的带,但是随着膜逐渐干燥,目的带也会逐渐消失.请问这是怎么回事?
2我是用大肠杆菌表达的目的蛋白,现在做western在显色后能看到目的带时(即上面所说膜半干时)看到:纯化后的样品只显一条带,且位置正确;没纯化的包涵体则是上下都有条带,但随着膜逐渐干燥,非特异性带逐渐消失,显出包含体特意性条带,但特意性条带最终也随着膜的干燥而消失.最后NC膜上除了marker没有别的东西了
我做了4次,都这样!转印是没有问题的.一抗是采集的猪的血清,用ELISA试剂盒鉴定是阳性的,4次实验用了2种血清,结果都一样.二抗检测可以显色.DAB别人用是好用的.我是第一次做western,请多指教!谢谢先!

作者: 911 时间: 2013-9-21 16:27

另外,显色时DAB与双氧水的比例有严格要求吗?多少比较好呢?

作者: ROSE李 时间: 2013-9-21 16:28

为什么我有时候显影后条带有几条，我加的是单抗，应该只有一个目的条带的，可是有时会出现三到四条，距离很近，应该是同一个抗体检测出来的。

是不是蛋白质降解了？但是SDS胶是正常了。

作者: 小游abc 时间: 2013-9-21 16:28

我用20毫安,45分钟(胶面积4*5)昨天又做出了p53的条带,膜还算漂亮,只是在53kd的位置上有两条带,以前做的也是这样,用的是中山分装santacruze的兔多克隆抗体（１：５０）．蛋白是分别从正常细胞．转空质粒细胞．转野生型质粒细胞中提的，并加了药物，为什么都是两条带呢？哪位高手遇到过类似情况没？
另外rasp21我也是按照半干恒流，１０毫安，４０分钟转后，胶上考染后干净，但膜上也没有，滤纸上也没见，是条件不合适，还是０．４５um的膜孔径太大？多谢指导了！

作者: wmp1234 时间: 2013-9-21 16:29

你好
我做的是硝基化的BSA的western，但是每次结果背景都很高
我的二抗孵育了2h，是不是二抗孵育的时间过长了。

作者: bling 时间: 2013-9-21 16:30

WB一般每复孔加的一抗量是多少啊？我想有个参照，因为没有做过WB。

作者: ffaa 时间: 2013-9-21 16:30

你好！我正在准备做wb，请问我用这种方法提取膜蛋白可以吗？
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf(PH=7.4
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA（乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸）
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

作者: wu11998866 时间: 2013-9-21 16:32

我想问一下高手，我在做肝组织蛋白的提取（肝脏已经磨成细胞），最好使用什么样配方的裂解液？据说肝脏中蛋白酶比较多，在加蛋白酶抑制剂以及操作方面有什么要注意的？我第一次的结果不是很理想，beta-actin只有很弱的条带（细胞数足够）。谢谢！！

作者: any333 时间: 2013-9-21 16:32

您好，
我想问一下，我的样品蛋白含量很低（具体含量没有测），SDS-PAGE胶只有银染才能染上，考染染不上。而Nativ-page 两种染色法都不能染上。所以，我想请问，我的样品能够进行转膜马？如果使用SDS-PAGE 胶进行western ，那么是否需要在转膜前对胶进行复性？如何复性？谢谢！

作者: dog002 时间: 2013-9-21 16:34

我做的是鼠尾1型胶原三明治培养肝细胞，以悬浮培养作为对照。
我想通过western测定试验组和对照组细胞胞浆中的蛋白，但鼠尾1型胶原本身就是蛋白，我不知道如何去除它。但如果不去除它，又无法进行测定前的蛋白配平。请指教，谢谢！

作者: bs4665 时间: 2013-9-21 16:34

我是western新手，昨天配制sds－page的时候，发现胶凝聚后缩小了很多，换过AP后，情况改善。不知道是什么原因。望大侠赐教啊！

作者: junjie05 时间: 2013-9-21 16:35

最近开始做Western Blot，目的条带是16kD、18kD大小，但一直没出。我的电泳基本条件如下：

1.Bio-Rad mini-gel电泳及电转系统；
2.浓缩胶5％，分离胶15％；
3.电泳电压：浓缩胶40V,进入分离胶后调为80V，marker最小条带为6.5kD,目的蛋白应该没跑出去;
4.电转：湿转200mA衡流 1.5h（PVDF膜，0.45um孔径）;
5.转完后发现marker带居然不在膜上（一抗孵育的时候才回忆起来）;
6.一抗4度孵育过夜;
7.TBST洗膜10min×2次:
8.二抗孵育室温1h;
9.TBST洗膜10min×2次;
10.ECL发光显影.

自己觉得最大的问题在转膜环节！一直搞不懂转膜是要恒压，还是恒流？分子克隆上是0.68mA/cm2,但通常根据marker指示裁下的条带很窄，膜面积会很小，比如3.2cm×1.2cm，那电流按分子克隆上只需2.6mA! 假设按恒压，比如60V 1h，但发现转膜电流跟电转槽内的电转液多少相关，可能是电转液深度影响电阻,那对转膜会有多大影响？

对像我这样分子量在20kD以下，转膜的电压、电流、时间、PVDF膜孔径（0.45，0.2um）怎么选择？

望赐教！

谢谢！谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-9-21 16:37

向楼主请教一个问题：
我在用NC膜作WB，现在基本能确定要检测的蛋白与膜的结合不强，只要洗两三次膜就会把蛋白洗掉。如果不洗，能做出条带，但是背景高。我也用过PVDF膜，也只是稍好一点。
分子克隆上讲过可以用紫外线处理，不知道楼主用过没有？能否指点一下。

作者: zhenxin 时间: 2013-9-21 16:37

我要做的血清样品，浓度是10ng/ml左右，问一下这个浓度可以用western检测么，应该用哪种western，谢谢

作者: PINK 时间: 2013-9-21 16:38

大家好,我是做western的新手，要从大鼠的海马组织里提取蛋白，一种是分子量为7-17kd,一种是磷酸化的蛋白。我想请教大家，给我提供个组织匀浆液的配方。谢谢了！

作者: XYZQ 时间: 2013-9-21 16:39

我有几个问题想问你：
1。我做western两次，用的是同一个蛋白样品，但是转出来的膜，第二次的marker条带看起来比第一次的淡，结果显影时，胶片上什么都没有。不知道是不是转膜出了问题？
第一次膜，只有第一张胶片显影出来了，其他的后面的胶片什么东西也没有，很奇怪，请问是什么原因？
2。蛋白样品在上样前是否还需要离心？

谢谢。

作者: u76mp 时间: 2013-9-21 16:40

高手,请问用你前面提到的stop buffer提取总蛋白的话,用何种方法测定蛋白含量?用biorad方法测定时裂解掖中的甘油对测定的影响是否会很大?用何种方法合适?谢谢!

作者: qumm1985 时间: 2013-9-21 16:40

我最近作WB,目的蛋白为300KD-700KD,浓缩胶3.6%,分离胶为6.6%.我的标本是人血清的脂蛋白,做了多次,胶考染都无条带，急．所以有几个问题想请教一下：
　１＼血清标本是否要除去白蛋白．
　２＼正常ＷＢ的上样量是多少，是不是指的是总蛋白的量，我的目标蛋白在血清中的量为１０mg/L左右，而血清还存在大量的其它蛋白，那么我的上样量应是多少？
3\对于大分子量的蛋白做ＷＢ，您看应该注意什么？为什么我每次跑都没有条带，只能看到泳道的印而且是从头到尾．

作者: qumm1985 时间: 2013-9-21 16:41

我做WB是大分子量的300KD-700KD(血清标本).做了很多

次都没有出来条带，考染后只看到泳道和印迹，而且是从上到下．不知您是否做过如此大的蛋白，有无相关经验，请赐教．急盼！谢谢

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-21 16:42

最近开始做Western Blot，目的条带是42kD、44kD大小，但结果条带均在Maker的43条带偏下，这种结果是否是正确的？理论上，应该是在43kd的上下两侧啊？谢谢了

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-21 16:43

我正在做western，目标分子量为60KD左右，目前的匀奖组织液提取后，SDS-PAGE电泳的浓度为10%，60V浓缩胶，100V的分离胶，跑完大概两个小时。

转膜我采用的是BIO-RAD的湿转膜仪，为了省膜，我一般每次转3-4道。
这几天我摸索的条件，恒压70V，3小时；恒流80mA，5.5小时等。但是效果非常不好，不管高分子量还是低分子量都不怎么清楚。我的电转buffer是0.037%的SDS，PH9.2的那种。

请问，不同大小的胶在湿转的时候可以用统一的恒压或者恒流条件吗？
能否给我一个推荐的转膜条件？
我在信箱也给你写信了。请您有时间给我回复

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-21 16:43

我的蛋白是28KD的酸性蛋白（等电点3.8)。用BIO-RAD半干转仪，12%SDS-PAGE,PVDF膜，10V电压转移8分钟，转膜缓冲液也按说明书试用了加SDS和不加SDS两种，却经常将蛋白转过。实际上，我按4mA/cm2转移15分钟，结果也并不理想。
不知道转膜条件除与蛋白分子量有关外，是否与等电点等其他性质有关。
另外，我用的预染MARKER是国产的，其好坏是否会影响其他蛋白的转移？

作者: kuaizige 时间: 2013-9-21 16:43

以前都是用11％的胶，为了把低分子蛋白跑开点，就用了15％的胶。
但电泳后发现很多问题。

50V 32min进入分离胶，改为90V，再120min后，溴酚兰快接近底部，停止电泳。100V转膜100min。丽春红染膜后，发现，14KD的marker才到膜的2/3处，而以往11％胶时，它已经到膜底部了。膜下部1/3全部空白。

为了把蛋白跑开，我是不是要增加电泳的时间，但增加的话，溴酚兰跑出去了，我都不知道该什么时候结束电泳。

ps 需要的蛋白为23 KD,积沉胶为5％,暂时不打算买预染的marker

作者: toy 时间: 2013-9-21 16:44

我是用M15表达我的目的蛋白的。由于我做的是膜蛋白，我去掉了前面的信号肽段。我将目的基因连于PQE31载体，我测序过，没有移码。我用IPTG诱导表达可见明显的蛋白表达加强（见图m15-pqe1靠近MARKER道，右边的MARKER从上到下依次是97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD），本来很高兴的，可问题就来了。
我用软件预测的蛋白的分子量加上前面的6个组氨酸和酶切为点的翻译就是24.1KD，可感觉我的加强带位置优点靠上就用了另外的一个MARKER一起定分子量。见图109pqedif-iptg++.看见这张图了吗？两边分别有2种MARKER。左边的从上到下依次是97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD，右边的从上到下依次是118KD、85KD、47KD、36KD、26KD、20KD。中间有6条道，第6条是个阴性对照。看见明显的蛋白表达加强了吗？这就是我诱导后表达的蛋白，我用软件预测后分子量是24KD。可通过2侧的MARKER定位是在26-29KD之间呀。怎么解释这个现象呢？而且2侧的MARKER20KD不在一条线上而且还相差好远，这是什么回事呢？
究竟这个蛋白表达加强是不是我要表达的蛋白呢？为什么跑电泳会出现这个现象呢？（我都是用的12%的分离胶）你可以帮我解答一下吗？很困惑，在这个地方不知道何去何从！

作者: bamboo16 时间: 2013-9-21 17:02

小弟现在准备做western检测FN蛋白的单聚体和多聚体,查到国外文献做过多聚体的western,但是有很多的地方不明白,把文献贴上,
文章中说用200μL的2×上样缓冲液裂解细胞,是不是每一孔用200μL?
浓度是不是就按照文献上写的????
为什么煮沸后多聚体结构不破坏??
提取蛋白后是否可以放在冰箱中保存,是否会破坏我需要检测蛋白的多聚体结构??

作者: xingyi08 时间: 2013-9-21 17:02

相关疾病：
肿瘤
我想做p53\bcl-2\PCNA的western blot，用小鼠的肿瘤组织做。实验室以前也没人做过，我想问问你具体的操作过程，能否给出详细步骤。
谢谢了

作者: avi317 时间: 2013-9-21 17:02

我的实验条件如下,检测组织睾丸(液氮保存)中的scf, c-kit, fas, caspase3,caspase8,采用半干电转.
问题如下:
1.使用提取总蛋白的裂解液能否提出上述蛋白?
2.半干电转时是否要考虑降温的问题,比如加冰块等等.
3.NC膜在实验中容易弄破吗?因为PVDF太贵了,所以考虑NC膜.

作者: dog002 时间: 2013-9-21 17:03

我从鸡胚里提出的MLCK用K36抗体检测，可是蛋白跑出来条带很模糊扭曲，我用的是6%的分离胶。请问有什么能改进的地方吗？

作者: H2O 时间: 2013-9-21 17:04

你给我留言里的网址上面我找了，没有我需要的，只有一个类似的试剂盒，但是上面也没有说明具体的东西，是不是我需要买哪个试剂盒。

作者: kulee 时间: 2013-9-21 17:04

我订了一个抗体，是RAT ANTI-ZO-1 MONOCLONAL ANTIBODY，可是我得动物模型就是大鼠，也就是现在我得问题是大鼠抗大鼠，当时定的时候没注意，有人说这样理论上是可以的，但是实际上基本没人这么用，我想请教一下这样可以么？如果可以我的二抗要定什么样的合适啊？我需要用这个抗体做WB和荧光!谢谢指教，而且很急，麻烦了

作者: ero11 时间: 2013-9-21 17:04

我是新手，问个很低级的问题，请问1.0M的Tris是用tris-HCl配还是tris-base配的，谢谢！

作者: PINK 时间: 2013-9-21 17:05

请问,我用的BIO-RAD的装置,湿转对滤纸\膜\胶的大小有何注意点,转膜时恒流好还是恒压好啊?另外电泳时跑浓缩胶与分离胶的电压一定要不同吗?谢谢!

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-21 17:06

您好,想请教您,我在做WB,用的是Bio-Rad 的仪器,总是转不上.
我用的是8%的分离胶,PVDF膜,恒流350mA,目的蛋白68和130KD,从15分钟到2小时我都试过了.电泳后的胶染了有清楚的蛋白条带.请赐教,不胜感激.

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-21 17:06

我用的是0.75mmr的梳了,没有大的了,350mA的电流对68和130KD的蛋白会不会空透PVDF膜

作者: tudou85 时间: 2013-9-21 17:07

相关疾病：
肿瘤
请问谁知道如果从小鼠肿瘤组织中提取蛋白作western, 测定p53等肿瘤凋亡相关蛋白，是提取总蛋白还是胞浆或胞膜的蛋白

作者: 了了 时间: 2013-9-21 17:07

我用Bio－Rad湿法转膜，目的蛋白大小分别为6和130kD，应该用恒压还是恒流啊？恒压多高多长时间？恒流呢？急呀,先谢了!

作者: 了了 时间: 2013-9-21 17:08

我用Bio－Rad湿法转膜，目的蛋白大小分别为68和130kD，应该用恒压还是恒流啊？恒压多高多长时间？恒流呢？急呀,先谢了!

对不起,刚发的有点问题,分子量是68和130KDa.

作者: gmjghh 时间: 2013-9-21 17:08

western-blot 测裸鼠肿瘤组织内的caspase-3，可全蛋白如何提取呢？是不是有相应的试剂，麻烦推荐几种吧
要是哥哥有时间，能不能把组织中测western blot 的详细实验步骤帖一下
谢谢了

作者: 6327555 时间: 2013-9-21 17:09

呵呵，gyl-1025也做caspase-3呵。全蛋白提取不熟，不过western-blot 的话，直接收细胞后制样就可以了吧。关键是一抗。

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-21 17:09

请问哪个公司的抗His一抗效价好，比较稳定？还有你觉得His的Western放大效应明显吗？

作者: INK 时间: 2013-9-21 17:09

你好，我做western 时，第一次DAB显色有很弱的带，第二次增大二抗浓度后不见目的带，做Dot-blot，点样品的膜上也显色微弱，二抗以及显色系统应该没问题，显色明显。我应该从哪方面来做调整？增加一抗浓度可行吗？谢谢先！

作者: xingyi08 时间: 2013-9-21 17:10

我用pvdf膜，结果发现丽春红染不上，但是考马斯亮蓝可以染出条带。请问是不是pvdf膜对丽春红配方有特殊要求？谢谢

作者: 2541 时间: 2013-9-21 17:11

你好，我做western 时，第一次DAB显色有很弱的带，第二次增大二抗浓度后不见目的带，做Dot-blot，点样品的膜上也显色微弱，二抗以及显色系统应该没问题，显色明显。我应该从哪方面来做调整？增加一抗浓度可行吗？谢谢先！

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1，可以增加一抗浓度

2，还可以延长一抗和二抗的温育时间

3，也有可能第一次和第二次用的蛋白样品不一样，或者说第二次用的样品已经分解了，那么当然没有条带了

以上3个方案应该可以解决你的问题

作者: 2541 时间: 2013-9-21 17:11

我用pvdf膜，结果发现丽春红染不上，但是考马斯亮蓝可以染出条带。请问是不是pvdf膜对丽春红配方有特殊要求？谢谢

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这种原因主要在于丽春红染色和考马斯亮蓝染色灵敏度不同造成的，考马斯亮蓝染色的灵敏度要比丽春红染色的高，所以你发现考马斯亮蓝可以染出条带，而丽春红染不上。

丽春红染色一般染色时间为5—10min，pvdf膜对丽春红配方无特殊要求，下面是《分子克隆》上的配方，希望对你有帮助

丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g 加水至100ml，此为贮存液。
用1份贮存液加9份去离子水即成丽春红S使用液

作者: okhaha 时间: 2013-9-21 17:11

我现在刚开始作ＷＢ，看见您的这些帖子和及时的回答很是佩服。
我想问一下，我的目的蛋白是50ｋＤａ，用ＰＶＤＦ膜，转膜30　ｍＡ，　100ｖ，2ｈ，一抗1：2000（多抗，起始浓度1：200，范围1：100-1：1000）室温过夜，二抗1：10000（辣根　1：5000-1：10　000）室温　2ｈ。
转膜是转上了，但显色很淡，阴性对照只见杂带，样品是经纯化的，纯度>90％，但没有任何显色。膜上还有背景色，同时电泳染色的有ｍａｒｋｅｒ，结果也未见纯化样品的目的条带。

自己分析原因：可能是样品浓度太低，不能显示。
　　　　　　　封闭的时候加入2％ＢＳＡ可减少背景色。是吗？
　　　　　　　但特异性差，就不知如何改变一抗和二抗的浓度了。
请指点。这里先谢谢了。

作者: 2541 时间: 2013-9-21 17:12

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2013-9-21 17:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在刚开始作ＷＢ，看见您的这些帖子和及时的回答很是佩服。
我想问一下，我的目的蛋白是50ｋＤａ，用ＰＶＤＦ膜，转膜30　ｍＡ，　100ｖ，2ｈ，一抗1：2000（多抗，起始浓度1：200，范围1：100-1：1000）室温过夜，二抗1：10000（辣根　1：5000-1：10　000）室温　2ｈ。
转膜是转上了，但显 ...

应该说50ｋＤａ的蛋白电泳以及转膜是不会有什么问题的，所以你自己觉得“可能是样品浓度太低，不能显示。”，这点是最值得考虑的，建议你提取蛋白的时候还是先对蛋白浓度进行测量，可以选用考马斯法，BCA法都可以。

封闭一般在磷酸化的情况下才选择ＢＳＡ，一般的WB只用脱脂奶粉就行。降低背景颜色可以采取减短温育时间等方法。

作者: IAM007 时间: 2013-9-21 17:12

前几天第一次准备做western,好多液体配的我头都晕了啊今天结果出来了,marker转的还算清楚(我用15%的分离胶,5%的积层胶)大概转了6道左右的MARKER ,(我用的是预染的MARKER),我没用丽春红染色,用BSA封闭3小时(室温)直接加的一抗4度过夜,然后加的二抗3小时,然后显色,条带出现的好象有点靠上啊,(而且出现好多模糊的蛋白的条带,是没封闭好吧?) 跟MARKER比我也不知道到底在哪,caspase3是32KD,活化成17,12KD 两个亚体,是不是应该出现很近的两条带才是??是不是应该比较靠下才对呢?那会不会出现没活化的32KD的呢?还有预染的MARKER 在15%的胶里大概会跑出多少KD 到多少KD 的几条带呢??我的TTBS忘记调PH了,今天我用试纸测了一下'ph8.0以上,会对最后显色有什么影响吗?
谢谢前辈指点

还有件事想问下,我门细胞周期蛋白的一抗是兔抗人,二抗却是抗鼠的,给公司打电话问,他们说一抗是多克窿的,可以结合,可是这次我门在一个蛋白显色后,用TTBS洗后,又加了这个,后来出来一点点,也不能确定是不是,或者是杂带,比较郁闷,不知道是不是抗体的问题?

作者: IAM007 时间: 2013-9-21 17:13

最近开始做Western Blot，目的条带是16kD、18kD大小，但一直没出。我的电泳基本条件如下：

1.Bio-Rad mini-gel电泳及电转系统；
2.浓缩胶5％，分离胶15％；
3.电泳电压：浓缩胶40V,进入分离胶后调为80V，marker最小条带为6.5kD,目的蛋白应该没跑出去;
4.电转：湿转200mA衡流 1.5h（PVDF膜，0.45um孔径）;
5.转完后发现marker带居然不在膜上（一抗孵育的时候才回忆起来）;
6.一抗4度孵育过夜;
7.TBST洗膜10min×2次:
8.二抗孵育室温1h;
9.TBST洗膜10min×2次;
10.ECL发光显影.

自己觉得最大的问题在转膜环节！一直搞不懂转膜是要恒压，还是恒流？分子克隆上是0.68mA/cm2,但通常根据marker指示裁下的条带很窄，膜面积会很小，比如3.2cm×1.2cm，那电流按分子克隆上只需2.6mA! 假设按恒压，比如60V 1h，但发现转膜电流跟电转槽内的电转液多少相关，可能是电转液深度影响电阻,那对转膜会有多大影响？

对像我这样分子量在20kD以下，转膜的电压、电流、时间、PVDF膜孔径（0.45，0.2um）怎么选择？

望赐教！

谢谢！谢谢！

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我们也做的小的蛋白,以前也经常转不上,这次我门用35mA,4度冰箱里转了一晚上,大概是10个小时,我门用的是预染的MARKER,这次都清楚的转上去了,你下次也试试看吧!实验顺利!!

作者: ROSE李 时间: 2013-9-21 17:13

我想问一个灵敏度的问题，wb最低能测多大浓度的蛋白，我的蛋白是10微克每升，用wb能检测多来么谢谢

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-21 17:13

你好我每空上样的细胞数可达 4000000 做western blot 条带浅细请问有好的方法裂解细胞吗用试剂盒也行有好的公司的试剂盒请推荐一下我提取细胞的蛋白浓度不高谢谢

作者: eric930 时间: 2013-9-21 17:14

请问提取核蛋白的裂解液有没有不含矾酸钠Na3VO4的配方?谢谢！

作者: TNT 时间: 2013-9-21 17:14

这些日子我一直在做WESTERN，但是一直没什么进展，我大致说一下我的具体过程：（我用CHO细胞表达46KD的蛋白），先收集上清---超滤管浓缩蛋白，浓缩后的蛋白跑PAGE胶，浓缩胶是5%（90V），分离胶是10%（120V），跑完后发现蛋白那条泳道一条带都没有！！！即使这样我还继续往下做，转膜（12V，1.5h）,牛奶4度封闭过夜，第二天洗膜，加一抗（1：1000）室温2h,二抗（1：500）室温2h，洗膜后发光，也是什么也没有，但是阳性对照可以看见。
以上就是我做的具体过程，也不知是哪里出了问题，希望得到您的帮助！！！谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-9-21 17:15

请教高手：在进行细胞信号通路研究时，比如PI3K通路研究时，是提取细胞总蛋白？胞浆总蛋白？还是胞核总蛋白？
非常感谢！

作者: guagua 时间: 2013-9-21 17:16

您好！
　　我想问下有没有在胶片上能显示出来的蛋白Ｍarker．在哪里可以买到．
要不然如果多抗的话，目的条带很难辨认出来．

作者: yjf1026 时间: 2013-9-21 17:16

请问直接用标记的一抗做WESTERN可以吗？

有什么利弊吗？

作者: ha111 时间: 2013-9-21 17:16

我马上想做E.coli中的一个蛋白在不同环境下的表达量的变化，考虑用western-blot技术。现在准备工作出现几个疑问，盼赐教：
1.我的这个蛋白是RNA聚合酶的一个因子即转录因子sigma 32，这个蛋白是很不稳定，常规温度30，37度表达量都很小，42度增加，但半衰期也很短，那么我可否用western-blot检测？
2.这几天查过很多国内国外的抗体公司，结果只找到一个出售sigma 32抗体的美国公司，该公司在国内没有代理，请问您还知道哪个公司有出售吗？

作者: zhihui小新 时间: 2013-9-21 17:17

我做一个小蛋白的wb,只有12kd，可是尝试了很多种抗体包括单抗多抗，以及抗体稀释度可几乎做出来得都是所有蛋白带都显。很疑惑，即使没有表达出来蛋白也不应该是这种情况吧！请大家指点。

作者: JK.jon 时间: 2013-9-21 17:17

我想做局部组织细胞在药物干预后胶原蛋白量的对比，不知是否可用Western blot

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-21 17:17

我有一个问题：别人帮我做了一个westernblot的实验，结果也挺好，但是我想对这个结果作定量检测，不知道用什么软件，我看了一些资料，但是我手头没有他们说的软件，您能给我提供点建议吗？非常感谢！
我将这个问题发到您的邮箱了，您如果有时间的话，可以回信，非常感谢。

作者: gogo 时间: 2013-9-21 17:18

老大，有问题请教
做IP时，我的目的蛋白的分子量是44KD，而IgG重链在50KD,重链那条带染色很深很宽，因此不能确定我的目的蛋白是否被IP下来，请问如何去掉IgG重链。
请高手不吝赐教，

作者: yychen 时间: 2013-9-21 17:20

膜蛋白erbb2可以用总蛋白抽提试剂盒提取吗？因为我还要同时提取胞浆蛋Bcl-Xl,Akt。上海康成的总蛋白提取试剂盒怎么样？

作者: fei1226com 时间: 2013-9-21 17:20

做western blot时,可不做"转膜"这一步？因为蛋白在膜上容易扩散。
我听说有种方法，可以直接把跑完PAGE后的凝胶泡在乙醇中进行蛋白的固定，然后直接做免疫检测。
此法省去了需要转膜的繁琐步骤，就是不知道具体是怎么做的？
望ptglab赐教，谢谢

作者: jkobn 时间: 2013-9-21 17:21

WB遇到问题，急切盼望解答！
最近在做从OCT包埋的小鼠肠道组织中提取蛋白，WB检测p21蛋白的表达情况。
做了两个月了，bata-actin的条带很强，丽春红染色正常，但无论如何也检测不到p21蛋白的表达。在同一块胶上加了一个细胞总蛋白作对照，结果p21蛋白的表达很强，但是组织蛋白仍检测不到任何信号。重复了n次，一抗浓度上到1：100，换了3个公司的抗体，结果全都一样。
这一批组织是4，5年前取材的，为了防止提取过程中蛋白降解，低温、蛋白抑制剂都注意到了，组织裂解液用的是cell signaling的，10倍稀释，具体过程：1.在干冰上把组织切碎，2.加入lysis buffer，4度静置30分钟，3. sonication 10秒，3次，组织完全打碎，4. 13,000 RPM 30分钟，5. 取上清液测浓度，电泳。
老板天天催，我认为p21蛋白降解了，他说以前都能做出来，我必须拿出结果来。

作者: yonger 时间: 2013-9-21 17:21

你好:
我最近开始做Western blot ，看到你这么热心的给我们解疑很感激！这里我也有问题想象你请教：因为我用的是预染的Ｍarker，所以能清楚的看到所有的条带都转到ＰＶＤＦ膜上了，５％脱脂奶封闭一小时，一抗根据说明书上的推荐剂量１：１０００稀释４度过夜后ＴＢＳＴ洗３次，１０＇／次，二抗及内参１：５０００稀释，３７度孵育一小时后ＴＢＳＴ洗３次，１０＇／次，ＥＣＬ发光，发现膜上１／２的地方都可见荧光，底片洗出来是白片一张！连内参都没出来，很郁闷！同时也很好奇，这是什么原因呢？还有就是我是用１×ＳＤＳ　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐｈ６.８　０.５Ｍ　Ｔｒｉｓ　，ＤＴＴ，　Ｇｌｙｃｏｈｏｌ，２０％ＳＤＳ　嗅芬兰）加ＰＭＳＦ裂解细胞的，ＤＴＴ应该是会使蛋白变性的吧？这样蛋白四度保存还会降解吗？谢谢！在线等待你的答复！

作者: ROSE李 时间: 2013-9-21 17:22

我要做WB的组织蛋白含量很高，大于40ug/ul，我在《蛋白质技术手册］上看到的每孔最大上样量是40ug，那折算下来我的上样量才不到1ul，是否需要稀释样品，用什么来稀释呢，是裂解液吗？(我用的是BioRad的电泳系统，0.75mm的那种)。谢谢先啦!

作者: gogo 时间: 2013-9-21 17:22

你好！我有一个很弱的问题想请教你一下．我要做Western Blot，购买了北京天为时代的Anti-His Antibody作为一抗，到货后才发现价钱超贵（３７０）而量很少．
它的规格是２０ul(1mg/ml)；工作浓度是按１：２００－５０００稀释．
因为是第一次做W-B，而且这个抗体的量又很少，所以不敢轻易做．还望ptglab高手和各位路过的高手帮我具体说明一下该如何稀释！
小弱在此非常感谢大家的鼎力相助！急！！

作者: nvdabing 时间: 2013-9-21 17:23

我实验室最近想做western blot，一是想问要买哪些设备，二是组织中蛋白怎么提取。十万火急！先谢谢了。

作者: okhaha 时间: 2013-9-21 17:23

你好，我想做1-3kd的多肽，这个配方行吗，好像精编分子生物学实验指南上介绍类似配方只能分离到5kd，再小就有困难了，而20%的胶也很难分离小分子量的物质，能否解疑一下，还有这么小的分子量marker哪里能买到？谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-21 17:23

请教：
本来一抗说明书说要将一抗放在4度冰箱里，可是我今天突然把它放到－20度里还凝固了，大概就一小时左右，我现在把它拿出来放在4度冰箱里。
请问这对试验结果影响大吗？很急啊，谢谢！！

作者: avi317 时间: 2013-9-21 17:24

我近期要做western blot，也在园子里搜索了一下，可是对于内参和目的蛋白是否一起孕育的问题很是困惑不解，
我看有的战友是在一张膜上跑，然后用剪刀把它们分开。比如说目的蛋白是66KD，就可以根据MAKER的位子把目的蛋白66KD为中心上下各留一些，然后分别染；有的是目的蛋白和内参各自跑胶、转膜，然后各自染色；也有的是一张膜上跑，然后先检测、拍照目的蛋白，目的蛋白检测完后，再洗掉，重新检测、拍照内参。
可是这样染的话，目的蛋白和内参不在一张膜上，如何进行计算同一个样品的灰度比值呢？恳切等待您的回复

作者: cwcwcww 时间: 2013-9-21 17:24

各位，请教几个问题，
我做了三次结果都不好。我第一次做Western-blot，用DAB显色，结果出来很多条带，就像胶的考马斯亮蓝染色一样.又做了两次，结果什么条带也没有。我第一次做的一抗浓度是1：300，二抗1：400。后两次一抗1：400，二抗1：500。用的是博士德公司的抗体及DAB显色试剂盒。一抗是兔抗人的（推荐稀释1：100—1：400），二抗是羊抗兔的（推荐稀释1：200—1：400）。还有一个问题，我的蛋白大小是127KD,大分子的蛋白还是小分子的蛋白容易做Western-blot?样品的处理有什么注意事项？为什么我每次跑得蛋白条带都是大分子的蛋白条带很淡，小分子的聚在一起？是细胞中小分子蛋白含量高的原因吗？多谢指教。蛋白上样前一定要测蛋白浓度吗？如果跑胶用考马斯亮蓝染色后的条带亮度来判断上样量？应该多亮才可以呀？
我用1×SDS上样缓冲液（分子克隆的配方）来裂解细胞，25平方厘米的一满瓶细胞加了200ul的1×SDS上样缓冲液，然后超声几次，100度沸水加热10min,12000g，4度离心10min.(但没有沉淀，不知为什么？），然后样品放负20度保存。
电泳时每孔加样20ul，浓缩胶80V,分离胶120V,大约跑2.5h。考马斯亮蓝染色后蛋白条带都是大分子的蛋白条带很淡，最下面小分子的聚在一起（不知是什么原因）。而且最近两次跑电泳在浓缩胶里不能压成一条线，而第一次跑压得很细。
转膜用的是PVDF膜，湿式转移100V,1h(六一厂的仪器）。转移后marker部分用丽春红染色，有条带。而且转移后的胶用考马斯亮蓝染色没有条带后直，应该转过去了。
转移后把膜放到含5％脱脂奶粉的PBS中，4度摇床封闭过夜。
用TBST洗一下膜，加入一抗(用TBST稀释）4度孵育过夜(前两次都是室温4h)，用TBST洗膜三次，每次15min,放在摇床上摇。加入二抗(用TBST稀释），室温孵育1h,用TBST洗膜三次，每次15min,放在摇床上摇。
用DAB显色（1ml水中加入A、B、C液各一滴），加到膜上，第一次1min后就出现条带，第二次有一些背景，没有条带，第三次什么都没有。
请您帮我分析一下原因，我的操作哪一步有问题，请指教。非常感谢。
还想请教一下一抗与二抗的稀释浓度怎样确定？有人说用点杂交摸条件，点杂交怎样做呀？

作者: junjie05 时间: 2013-9-21 17:25

我是一个刚开始做试验的研究生，我现在在做Western blotting 。但是总是做不出结果来。请教您们几个比较急的问题.。

1、我做的蛋白是从小鼠脑组织抽取的，分子量是15－17Kb。

2、但是曝光显影总是没有看到目的蛋白，不知道做的过程中哪个地方出了问题。

3、下面是我做的试验方法步骤。

非常感谢您们

盼回

第一天：

脑组织蛋白的抽取：

⑴ 取小鼠脑组织～200mg加2ml全细胞裂解液（1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：1％蛋白酶抑制剂）手动冰上快速匀浆。
⑵ 14000rpm离心40min
⑶ 上清即为抽取的蛋白，吸出分装，进行定量。（-20℃保存）

电泳

制备聚丙烯酰胺凝胶：

1、 SDS-PAGE 15%胶的配制

30％丙烯酰胺 (ml) 4.0

4 X resolving (ml) 2

ddH2O (ml) 2

10%AP (μl) 40~~~~~~~~~~~~~~80

2、混匀后小心将分离胶注入准备好的玻璃板中，到达第一条横线。

3、封胶

4、待胶凝后将封胶液倒掉。

5、配制5％浓缩胶：插入梳子，室温下放置1小时左右。

5％浓缩胶

30％丙烯酰胺 (ml) 0.35

4 X stacking (ml) 0.75

ddH2O (ml) 1.97

10%AP (μl) 20~~~~~30

6、灌好浓缩胶后1h拔除梳子。

7、加样

1）、小心移去梳子，将凝胶电泳板放入电泳槽，用夹子夹紧，然后在上下电泳槽中分别加入电泳缓冲液（running buffer）并使上槽缓冲液浸没胶面。

2）、上样前将胶板下的气泡赶走。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。每孔分别用微量加样器加20μl事先制备好的样品，（对于0.15cm厚的胶最哆加15 μl样品）样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane)。。

3）、电泳：预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。接通电源，电压120－130V，当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源

转膜
1、电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：剪一块与胶大小一致的Hybond－P 膜，在甲醇中泡10 秒钟，再在转移buffer(transfer buffer)中浸泡10分钟，同时切下的胶也在转移buffer(transfer buffer)中浸泡一会儿然后按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(transfer buffer)。转膜时在冰块中进行。

2、100V恒压转膜2小时左右。

3、膜用塑料盒装好，加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）封好盒子。室温摇床孵育30min。

4、倒掉封闭液，加入一抗4℃过夜。

第二天

1、将膜用Washing buffer洗20分钟X 3。

2、将膜放入塑料盒中，加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗（1：1000）,封好盒子。室温摇床孵育1小时。

3、Washing buffer洗20分钟X 3。

4、PBS洗几次

5、在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上包好显影（避光进行）。

作者: ffaa 时间: 2013-9-21 17:25

我刚接触wb，做的是滑膜细胞的EP受体的提取，加样了30微升，电泳了大概3个小时，转移了4个小时（由于现在气温比较低，所以延长了时间），染色可见条带，但比较细和淡，封闭过夜，一抗3个小时，洗三次，二抗3个小时，曝光，可是什么都没有：（
在操作的过程中有以下疑问：
1：5％的牛奶是用含吐温的PBS配吗？
2：分装抗体时用的不是消毒的小管，有影响吗，是不是要用消毒的？
3：我的抗体的说明书上是－20度保存，我分装的且是经常用的可以放在4度吗？
4：封闭、一抗、二抗的孵育的最好时间是多少？
5：什么情况下说明一抗和二抗的浓度是最好的？
谢谢！

作者: vivian4123 时间: 2013-9-21 17:25

我也打算做west blot,样品是分离的洗涤血小板，我想问一下，裂解洗涤血小板膜的裂解液用普通的裂解液适用么？
谢谢

作者: yonger 时间: 2013-9-21 17:30

我有问题想请教
1.可不可能用丽春红染色后看不见目的带，而杂交后能看见，也就是说其2个的灵敏度问题。
2.细胞破碎后，混合液很黏，16000rpm，30min都离不下碎片，我的细胞很多，是不是裂解液加少了？
3，我的蛋白是150kd，请教半干转恒压条件
麻烦你了

作者: jujuba 时间: 2013-9-21 17:32

有个问题不明白。半干转膜和湿式转膜有什么区别？各自的优缺点是什么？什么情况下使用半干转膜？什么情况下使用湿式转膜？

作者: fox_79 时间: 2013-9-21 17:32

请教高手：我最近也在做Western-blot，但是遇到一种情况，在暗室ECL显色时看见了一点亮光，但是很快就消失了，不知道是不是我的抗体浓度问题，导致簇灭过快呢，其他同学做的也没问题的。请问有没有遇到过这样的问题，是什么原因呢？多谢指教。

作者: fox_79 时间: 2013-9-21 17:33

1：5％的牛奶是用含吐温的PBS配吗？
2：分装抗体时用的不是消毒的小管，有影响吗，是不是要用消毒的？
3：我的抗体的说明书上是－20度保存，我分装的且是经常用的可以放在4度吗？
4：封闭、一抗、二抗的孵育的最好时间是多少？
5：什么情况下说明一抗和二抗的浓度是最好的？
谢谢！

根据我们实验室的经验
1.牛奶是用PBST配的，吐温是千分之一
2.分装抗体用的管只要高压过就行
3.我们使用一抗都是4度保存的
4.封闭1-2个小时，1个小时基本够用的，一抗室温2个小时，要是过夜就4度，二抗室温1个小时
5.抗体的浓度根据你出的带决定的

作者: daod 时间: 2013-9-21 17:33

有什么好的分析结果的方法吗？比如灰度值的处理，采用何种统计学分析方法？

作者: wmp1234 时间: 2013-9-21 17:36

前辈好，我做得的目的蛋白是32 用biorad电泳设备，细胞用ripa裂解4度过夜，用
前加loading100 度3分钟，12000 4独离心。电泳基层胶65V30分，压缩胶120V1。30h 转膜70V2小时，marker转过去了，染胶很干净，然膜却染不上。还有显色是开始发光后
要将多余的显色液吸去吗。相同的条件，在别人那里做就行，我回来自己做就不行。而
且显色的时候，膜的边特别亮

作者: finger 时间: 2013-9-21 17:36

真是活雷锋啊！我以后有问题不懂就请教你。我在做受体蛋白酪氨酸激酶磷酸化的western-blot定性检测，以前学食品的都没接触过。

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:38

打算测小鼠心肌组织中p38、ERK，因标本较少，请问用western-blot 至少需要多少心肌组织。

作者: dotaaa 时间: 2013-9-21 17:39

我以前在做WESTERN BLOT的时候,一抗后洗膜用TBST(PH8.0)三次*5分钟,今天延长到三次*15分钟,当洗完之后发现PVDF膜有点跟以往不一样,它中间部分比较透明,看上去是油状的,有点象用甲醛浸湿后透明现象的时候,但透明的部分又不规则,我做过很多次了,却是第一次遇到这种情况,请大家指点!
我用的PVDF膜是MILLIPORE公司的

作者: pengke1983 时间: 2013-9-21 17:39

我想问一下，我的蛋白是51kd,请问湿转什么条件合适？

作者: Ao7 时间: 2013-9-21 17:40

请问一下:从角膜中取某种蛋白做western,应该怎么提啊?要命的是我的角膜的量比较少啊!
谢谢了

作者: langlang 时间: 2013-9-21 17:41

您好，
向您请教WB中间的问题。
我现在做WB，以不加一抗作为阴性对照。组织来源大鼠的脑。
步骤如下：
Tissue was harvested from rat brain and lysed in lysis buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 10%NP40).100ug of protein from total cell lysates, determined by using the Braford assay were boiled in 2*SDS sample buffer for 5 min, electrophoresed on a 10% polyacrylamide . and then transferred onto a PVDF membrane. After blocking with 5% free flat milk in TBST, the membrane was incubated with primary antibodies CHL (1:250) for 2 h at room temperature and 4℃ overnight. The membrane was washed with TBS and probed with HRP-conjugated anti-mouse IgG (1:3000) for 1 h at room temperature. After the membrane was washed with TBST, protein bands were developed with ECL reagents.

但是现在做不加一抗的阴性对照中，发现应该再目的条带的位置上，加一抗和不加一抗都一样。请问是怎么回事？

感激不尽

作者: utt0989 时间: 2013-9-21 17:42

您好，我想请教一下，我的实验是作单抗，因为蛋白（包含体）总是不能弄的很纯，所以我就用2M尿素溶解的含70-80%目的蛋白+佐剂，免疫小鼠。
融合后筛选的时候，包被ELISA板子的抗原不是要非常纯么？我就想用SDS胶回收的蛋白来包被，你说这样行么？SDS变性了的蛋白还能筛选针对于融合蛋白的抗体么？如果不行，那怎么办呀，用非变性胶可以么？

作者: 菠萝喵 时间: 2013-9-21 17:42

您好！
我的Western转膜也是效率低：分离胶10%，半干法先是用的100V转1小时；转膜后丽春红染色无条带，转过膜的凝胶考马斯亮蓝染色也无条带；另又用150mA的恒流转1小时试了一次，依然没有看见膜上有条带。
这是什么原因呢？郁闷ing
请帮我分析下，谢谢。

作者: DDD 时间: 2013-9-21 17:43

您好！我有几个问题请教一下：
1.封闭液是否要加tween20，浓度也是很不确定，是千分之一还是0.01%-0.02%呢？抑或是0.05%？（别人告诉我的）
2.一抗和二抗是用稀释液是否要加tween20？
3.我们用的是湿转，他们的条件一般是350mA，1-1.5小时。这个条件不知是否精确？

作者: @花开花落@ 时间: 2013-9-21 17:46

请教western blot封闭的问题，一抗是多克隆抗体，选用那种封闭液背景会低一点呢？除了脱脂奶粉，我看到有人用二抗来源的血清（例如3％山羊血清

）或者BSA封闭，合适吗？谢谢！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-21 17:46

您好！
我的Western转膜也是效率低：分离胶10%，半干法先是用的100V转1小时；转膜后丽春红染色无条带，转过膜的凝胶考马斯亮蓝染色也无条带；另又用150mA的恒流转1小时试了一次，依然没有看见膜上有条带。
这是什么原因呢？郁闷ing
请帮我分析下，谢谢。

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半干法转膜一般推荐用恒流，由自己决定。转移时电流或电压的大小及转膜时间都要看你的目的蛋白分子量大小来确定。
你转膜后立春红染色和考染都无条带，如果你电极方向、膜和胶的顺序都没有错的话，我觉得很可能是转过头了，蛋白已经转出膜了。
试一下低电压或转的时间短点！自己摸索一下最好的转膜条件！
摸索时你可以隔一段时间取出一点膜染色看一下。祝你好运！

作者: wmp1234 时间: 2013-9-21 17:47

我想请教一下，我的蛋白分子量超大的，450KD~13000KD，能做WESTERN吗？急！

作者: ii077345 时间: 2013-9-21 17:47

相关疾病：
白内障
您好：
　　我在做关于晶体蛋白表达差异的硕士课题。晶体蛋白主要有三个成分，分子量分别为８００kd，１６０kd，２０kd。我想做的是看不同类型白内障中晶体蛋白和正常晶体蛋白表达的差异。我想咨询一下，Western　Blotting是不是一定做不了８００kd的蛋白？　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

作者: youreyes 时间: 2013-9-21 17:48

转膜还是转不上。现在用的湿法转，60V转一个半小时，每次铺两块胶，一块电泳后立即考马斯亮蓝染，条带很清晰；一块转膜后胶和膜都染，竟然膜和胶上都无条带！已排除电极，胶膜的放置错误及转膜液PH值的问题，想不出什么原因，烦恼啊。。。
今天同学转膜时将我的样品上了两泳道，结果是转膜后我的样品膜上胶上都无条带，她的蛋白条带很清楚，真不知什么原因了，难道是蛋白本身有问题？若是蛋白问题为何跑过电泳未转膜的胶上有很好的条带呢？
请同道指教！期待ing

作者: c86v 时间: 2013-9-21 17:49

各位好：
1.蛋白38KD,胶8*9Cm2,bio-rad湿转
2.膜》胶》滤纸
3.转移V60，2h，加冰袋冷却
4.膜呈现兰色，只是溴芬兰的颜色，也有兰色的蛋白条带，经过立春红染色未件其他的蛋白条带
今天打算将转移的时间延长至4小时，电压60，加了两层膜，，转移正在进行中，午夜会有结果！
各位强人，给些建议吧！

作者: gogo 时间: 2013-9-21 17:49

关于组织WESTERN-BLOT,我的GST融合蛋白只与天然蛋白中的GST酶作用,出现很清楚的特异带,我预期的蛋白没有.而且我的蛋白(不含GST时)只有8.4KD,18%SDS-PAGE很可能已将此蛋白跑丢了 ,您看有什么办法解决吗? 谢谢!

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-21 17:49

您好！
我现在在做westrn，实验中出现几个问题，想请教一下：
1.我在杂完一抗、二抗显色后发现很多蛋白带，就像刚跑完电泳用考马染色后的结果差不多
2.对于PVDF膜有没有正反，用甲醇处理多长时间？我一般1-2s不知可否？
3.我要做蛋白大小40KD、200KD，实验室转印仪是bio的湿转，请问一下转印条件？
4.我看很多转移缓冲液配方不一样，我这种条件用什么配方较好？
5.我要做定量western，用的内参是tublin，我的总蛋白上样量是不是应该一样？我可以用BCA法测定总蛋白浓度吗？做出western结果用什么软件分析？我门目前实验室有一台凝胶成像系统，不知能不能用？
6.我的二抗是用碱性磷酸酶标记，不知能用定量的方法吗？
请帮帮忙！谢谢！
期待您的答复！

作者: wu11998866 时间: 2013-9-21 17:50

我的目的条带是36kd，跑完胶后做Western，余胶染色显示蛋白已经转移了。我的缓冲液，膜放置位置应该都没问题。我用的是湿转，恒流30mA转了9个小时。接着就是0.25％BSA封闭三个小时，PBST洗三遍，一抗二抗我们都是自己制作的，二抗是辣根过氧化物酶标记的，前面做ELISA证明其效果尚可。我用1：100一抗孕育1小时，PBST洗三遍，1：100二抗孕育1小时，PBST洗三遍，后加DAB显色，但膜却没一点颜色变化。希望ptglab大哥帮我分析一下原因，谢谢！

作者: biabiade 时间: 2013-9-21 17:50

我做AGO蛋白(100kd左右)的WB
条件是：hela（L293）细胞用上样buffer裂解，150ul上大样转膜（只留一孔预染mark），100v上层胶，120v下层胶，至mark的最小一条带跑出停止，用pvdf膜转膜，全湿法，300mA,1hr，在TBST里过夜，第二日，5％牛奶封闭30—60min，37度，1L的TBST洗，5％牛奶稀释一抗1000倍，37度，60min，1L的TBST洗，5％牛奶稀释二抗2000倍，37度，40－60min。ECL显影，几秒至几分钟不等，有时条带较清晰，但条带太多，应该很多都是非特异的，整张膜经常有左右贯穿的条带，深浅和目的条带相当，阴性对照也有，有时背景很高，黑乎乎的，怎样改善条件来使图片更清晰？（在一张膜上做了关于AGO蛋白的不同肽段的相对抗体，也就是做了不同的抗体）（一抗是多抗）
是否可能一抗不纯？
加大TBST中盐浓度有用吗？
是否须牛奶改为BSA？
使用ecl试剂盒后是否需要将残留的试剂吸的一干二净？
是否细胞有问题？

作者: qumm1985 时间: 2013-9-21 17:51

请问一下，我要表达的蛋白是带有flag标签的，蛋白质总大小有11KDa，现在出现的问题是western检测不到表达。做的胶是15％的。我western实验有正对照，是37KDa的蛋白质，可以检测到，没有问题。所以我不知道问题出在什么地方了？是因为转染效率不行，还是就没有表达呢？好几个蛋白都是这么大，不会都没有表达吧？到底哪出了问题呢？请帮助我吧。

作者: abc816 时间: 2013-9-21 17:52

请问，78KD和55KD大小的蛋白分别用多大浓度的胶？谢谢。

作者: kswl870 时间: 2013-9-21 17:52

western blot用单克隆抗体与多克隆抗体，有区别吗？谢谢

作者: kswl870 时间: 2013-9-21 17:53

内参与marker有什么区别？谢谢老师

作者: tie8 时间: 2013-9-21 17:54

western blot用单克隆抗体与多克隆抗体，有区别吗？谢谢

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多克隆抗体和单克隆抗体相比基本上有以下几方面不同：
信号强度：多克隆抗体较好；单克隆抗体视不同抗体而异
特异性：多克隆抗体良好，但有一定背景；单克隆抗体特异性最佳，但有交叉反应
优点：多克隆抗体多数能识别变形抗原；单克隆抗体特异性好，抗体来源不受限制
缺点：多克隆抗体不易重复，有时背景较深，抗体要滴定；单克隆抗体多数不能识别变形抗原

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-21 17:54

转膜问题:
请问我用的是bio-rad的电泳仪,转膜一定要对齐吗?是不是不对齐就转不过去?

作者: 韩梅梅 时间: 2013-9-21 17:55

您好！
我的Western转膜也是效率低：分离胶10%，半干法先是用的100V转1小时；转膜后丽春红染色无条带，转过膜的凝胶考马斯亮蓝染色也无条带；另又用150mA的恒流转1小时试了一次，依然没有看见膜上有条带。
这是什么原因呢？郁闷ing
请帮我分析下，谢谢。

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我个人意见是：不一定是转染的问题，会不会是跑胶的问题蛋白没跑下来

作者: www.1 时间: 2013-9-21 17:56

各位好：我的蛋白表达浓度比较低，做蛋白浓缩时候会不会对目的蛋白的免疫原性有影响，有的话，会有多大！如，sds上样处理，三氯乙酸沉淀浓缩，对做western blot 的影响有多大？急！

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:56

各位好：
1.蛋白38KD,胶8*9Cm2,bio-rad湿转
2.膜》胶》滤纸
3.转移V60，2h，加冰袋冷却
4.膜呈现兰色，只是溴芬兰的颜色，也有兰色的蛋白条带，经过立春红染色未件其他的蛋白条带
今天打算将转移的时间延长至4小时，电压60，加了两层膜，，转移正在进行中，午夜会有结果！
各位强人，给些建议吧！！！！！！！

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蛋白38KD，不大，我们做52KD的蛋白，转膜100V/55-60min正好。考虑你的蛋白及Bio-red系统和我们差不多，建议你这样：

1、采用预染Marker。可以清晰得看到能否转到膜上！从而判断自己的蛋白能否转上
2、既然是Bio-red系统的小型垂直电泳及转膜系统，没必要拘泥于膜》胶》滤纸。Bio-red的那个三明治夹子很大，膜和胶一样大就行，而且两者肯定要比Whitman3M滤纸小！！！
3、你要缩短时间，试试100V/50min。因为我们做53KD的同时还要在同一块膜上做GAPDH内参，37KD，转膜一点问题没有。
4、什么膜？如果是PVDF膜，甲醇活化1min。还有，pvdf做不出来换NC膜试试，往往有惊喜，这是我有切身体会的。
5、最后一点，检查你的转模缓冲液的配方，最好重配

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:57

您好！
我现在在做westrn，实验中出现几个问题，想请教一下：
1.我在杂完一抗、二抗显色后发现很多蛋白带，就像刚跑完电泳用考马染色后的结果差不多
2.对于PVDF膜有没有正反，用甲醇处理多长时间？我一般1-2s不知可否？
3.我要做蛋白大小40KD、200KD，实验室转印仪是bio的湿转，请问一下转印条件？
4.我看很多转移缓冲液配方不一样，我这种条件用什么配方较好？
5.我要做定量western，用的内参是tublin，我的总蛋白上样量是不是应该一样？我可以用BCA法测定总蛋白浓度吗？做出western结果用什么软件分析？我门目前实验室有一台凝胶成像系统，不知能不能用？
6.我的二抗是用碱性磷酸酶标记，不知能用定量的方法吗？
请帮帮忙！谢谢！
期待您的答复！

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1、增加封闭时间，减少抗体孵育时间，降低二抗浓度，缩短曝光时间
2、进口无，国产的有。10s--1min比较好，透明为止
3、40KD 100V/50-60MIN 200KD 120--50V/90--120MIN 不同的蛋白要自己摸的
4、自己实验室常用的最好，可以用别人配的呀：）
5、总蛋白要一样。BCA法可以，Brodford更简单。软件很多，在本版搜索一下。
6、WB是半定量而已，方法性质决定了

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:57

请问，78KD和55KD大小的蛋白分别用多大浓度的胶？谢谢。

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想在同一块胶上跑出来用 8% 比较合适

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:58

你好。我的目的条带是36kd，跑完胶后做Western，余胶染色显示蛋白已经转移了。我的缓冲液，膜放置位置应该都没问题。我用的是湿转，恒流30mA转了9个小时。接着就是0.25％BSA封闭三个小时，PBST洗三遍，一抗二抗我们都是自己制作的，二抗是辣根过氧化物酶标记的，前面做ELISA证明其效果尚可。我用1：100一抗孕育1小时，PBST洗三遍，1：100二抗孕育1小时，PBST洗三遍，后加DAB显色，但膜却没一点颜色变化。希望ptglab大哥帮我分析一下原因，谢谢！

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1、根据Bio-red的说明书，建议你100v/50min，肯定没问题。
2、封闭液浓度不够 10%牛奶或1%BSA
3、一般什么都没有是一抗问题比较大，而一抗又是你们自己做得，这个可靠性。。。

作者: fsdd817 时间: 2013-9-21 17:58

我做AGO蛋白(100kd左右)的WB
条件是：hela（L293）细胞用上样buffer裂解，150ul上大样转膜（只留一孔预染mark），100v上层胶，120v下层胶，至mark的最小一条带跑出停止，用pvdf膜转膜，全湿法，300mA,1hr，在TBST里过夜，第二日，5％牛奶封闭30—60min，37度，1L的TBST洗，5％牛奶稀释一抗1000倍，37度，60min，1L的TBST洗，5％牛奶稀释二抗2000倍，37度，40－60min。ECL显影，几秒至几分钟不等，有时条带较清晰，但条带太多，应该很多都是非特异的，整张膜经常有左右贯穿的条带，深浅和目的条带相当，阴性对照也有，有时背景很高，黑乎乎的，怎样改善条件来使图片更清晰？（在一张膜上做了关于AGO蛋白的不同肽段的相对抗体，也就是做了不同的抗体）（一抗是多抗）
是否可能一抗不纯？
加大TBST中盐浓度有用吗？
是否须牛奶改为BSA？
使用ecl试剂盒后是否需要将残留的试剂吸的一干二净？
是否细胞有问题？

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1、很有可能，多抗的缺点就是非特异性带多，我们要做得就是如何减少再减少之。
2、可以加大TWEEN-20到2%，盐浓度恐怕没什么用。
3、加大牛奶浓度10--15% ，换BSA也可，但是一般来说没什么立竿见影的效果。
4、不需要，镊子拎起来，稍稍去掉就行。
5、不能回答。。：）

作者: Ao7 时间: 2013-9-21 17:59

我做的是actin 和tubulin，是否需要应用内参，如果应用，该用什么，还是actin和tubulin吗？
另外，最后一步在杂交后的显影，我订的试剂是博士德的DAB，我想问一下，这个试剂是否是在杂交后的膜上直接应用，不需要暗室即可出现我所需要的蛋白条带啊？把它直接放在凝胶成像系统上分析就可以了吧？多谢！

作者: DONT 时间: 2013-9-21 17:59

TBS的PH对western影响主要有哪些影响，有多大！

作者: DONT 时间: 2013-9-21 17:59

我要将表达上清用TCA浓缩，SDS_PAGE电泳，TCA对蛋白的免疫原性有多大的影响，如果做Wb的一抗要自己制备，那么抗原是否也要做TCA处理后进行动物免疫！？

作者: ha111 时间: 2013-9-21 18:00

我做220kd的蛋白质,但转膜老转不上去,请问一下可能有哪些原因呢

作者: glass 时间: 2013-9-21 18:14

请教各位，我作120KD的大分子蛋白，最近都不顺利，有几个问题请教一下
1 marker为29-205KD高分子量，应该有六条条带，我电泳后染色，只看到三条条带，位于胶的下半部分，上半部分都没有条带，连样本的孔在上半部分也没有条带。电泳电压为开始80v，后来120v，溴酚兰指示线跑到距离底部一厘米左右终止电泳，按理说应该不会是蛋白跑出去了阿。各位能否帮我分析一下原因！！
2 我是作组织匀浆提胞膜蛋白后WB，有无战友做过这方面的？？具体的匀浆液是什么？？有没有专门的胞膜蛋白提取试剂盒？？有无战友用过？？请教提组织胞膜蛋白的方法！！谢谢各位了！！

作者: yysr238 时间: 2013-9-21 18:14

我目前在做一个糖蛋白的WESTERN, 它有两个subunit,经去糖基酶处理后,一个分子量为102KDa,另一个分子量为95KDa.我用了7.5%Tris glycine gel, but they run to the very close postion. I am wondering how I can separate them in one gle clearly. Any special gel available? Thanks in advance.

作者: XYZQ 时间: 2013-9-21 18:14

我要提取微管蛋白TUBULIN，vEGF及其受体FLT-1和磷酸化FLK-1，做WESTERN用，看了一些资料，感觉头很大，不知有高手提过这几个蛋白吗？分别用什么方法？有现成厂家的试剂吗？请各位帮忙，
谢谢！

作者: PPT 时间: 2013-9-21 18:15

我做磷酸化的P38MAPK，结果一直不出。用的DAB显色，因为做ECL比较麻烦。请问我的显色方法怎么才能出结果。

作者: mogu 时间: 2013-9-21 18:15

各位高手，我跑一个17kd的蛋白，sda－page的结果挺好，总是转膜转不上，我用的是六一的湿转，60mA ，2h。我转完了，用考马斯亮蓝染胶以后，都可以看到我的条带没有了。难道我的时间太长，转过了。我用的是0.45uM的PVDF膜，是不是得换0.2uM的膜

作者: junhun 时间: 2013-9-21 18:15

我最近跑了两个组织的电泳。其中一个组织条带扭曲，且有杂带，另外一个组织条带很细。这些组织都在-70摄氏度冰箱里放了三个月，会不会是给放坏了啊？得不出预期结果，毕不了业啊，急！

作者: ero11 时间: 2013-9-21 18:16

全是杂带，特异带出来了有点杂带也无所谓，但没有特异的带出来，没见到比其他带浓的特异带，这咋办？要说一抗二抗浓度大了，可用的超敏试剂盒荧光还很弱，不象是抗体浓度大呀？封闭是室温下2小时，也不短了！帮我想想吧！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-21 18:16

我有好多问题想请问高手：
1、一抗二抗什么比例比较合适？我的一抗是稀释300倍二抗1500倍可以吗？
2、我曾用200和1000倍的一抗二抗稀释度做出来过，可是后来用300倍 15 00倍时却几次都背景太高，这是怎么回事啊？
3、前面两次我又用300倍15 00倍结果什么也没暴光出来。样本和洗片都没有问题。我做过底物和辣根过氧化物酶的实验，两者也都没问题。转膜也没问题。想问高手：二抗本身有无可能坏了？不然一抗坏了就损失比较大了

作者: feima+ 时间: 2013-9-21 18:17

我的融合蛋白是包涵体。我想将超声裂解后的沉淀用上样缓冲液煮沸后作wbs，不知可行？一抗能结合吗？请教一下，谢谢！

作者: ritou1985 时间: 2013-9-22 09:42

请问一个问题，protein loading control是指的什么，我问了好几个人，怎么答案都不一样呢。
请教各位，指点迷津！

作者: daod 时间: 2013-9-22 09:42

请各位大虾给我分析分析我今天western失败的原因：biorad的转膜仪，湿转，50V，2.5h ，丽春红染色没有任何条带。

作者: qiangren789 时间: 2013-9-22 09:43

求救！我把一个新基因（1113bp）构建到pCDNA3.1-myc/his 载体，转染hepG2细胞，转染后做western blotting. 转染后24小时左右，用碧云天的western blotting裂解液裂解细胞，通常大小的培养瓶用300ul裂解液，冰上操作，让后加上样缓冲液和b-巯基乙醇沸水煮10钟。每次以40ul上样，湿转膜，4瓦4到5小时，没有结果，好几次了。一抗二抗应没问题，因为我们实验室的其他人用作原核表达都出结果了。我的表达蛋白带标签的，myc/his 。考虑可能是转染的效率不是很高，后来又用G418筛选，还是没有结果。我转膜的时间4，5个小时都试过，最近又用2小时。都不行。请问真核表达的量是不是很低呢，用不用G418筛选，再有瞬时表达得转染后几小时内裂解细胞？谢谢您这么热心帮忙，太高兴了。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 09:43

请各位大虾给我分析分析我今天western失败的原因：biorad的转膜仪，湿转，50V，2.5h ，丽春红染色没有任何条带。

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什么膜？ PVDF？
看看这个
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=6213198&sty=3')

作者: bs4665 时间: 2013-9-22 09:44

请问您做过组织IKK的Westernblot?吗我准备用Westernblot测大鼠组织的IKK含量，不知所需的蛋白浓度大概是多少？灵敏度如何？还想请教一下组织IKK的Westernblot过程中有哪些注意事项？不胜感激！

作者: fsdd817 时间: 2013-9-22 09:44

求救！我把一个新基因（1113bp）构建到pCDNA3.1-myc/his 载体，转染hepG2细胞，转染后做western blotting. 转染后24小时左右，用碧云天的western blotting裂解液裂解细胞，通常大小的培养瓶用300ul裂解液，冰上操作，让后加上样缓冲液和b-巯基乙醇沸水煮10钟。每次以40ul上样，湿转膜，4瓦4到5小时，没有结果，好几次了。一抗二抗应没问题，因为我们实验室的其他人用作原核表达都出结果了。我的表达蛋白带标签的，myc/his 。考虑可能是转染的效率不是很高，后来又用G418筛选，还是没有结果。我转膜的时间4，5个小时都试过，最近又用2小时。都不行。请问真核表达的量是不是很低呢，用不用G418筛选，再有瞬时表达得转染后几小时内裂解细胞？谢谢您这么热心帮忙，太高兴了。请您一定帮帮忙啊。

作者: woshituzhu 时间: 2013-9-22 09:45

请问您做过硝基酪氨酸（3－NT）的WB吗？有裂解液的配方吗？

作者: DNA 时间: 2013-9-22 09:45

大虾果然高人，我前天就给你回了一次消息，但是没有发上去。
大虾能不能给我推荐一个实验条件呢？
我的蛋白大概是50到70的，还有一个是二十几的，biorad的湿转仪，我用了大虾推荐的一个方法，用甲醇漂洗一下，再用立春红染色，已经能够看到了能够转上了，但是效果不好。
我后面那次用的条件是100V 2h。

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 09:46

QUOTE:

原帖由 DNA 于 2013-9-22 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大虾果然高人，我前天就给你回了一次消息，但是没有发上去。
大虾能不能给我推荐一个实验条件呢？
我的蛋白大概是50到70的，还有一个是二十几的，biorad的湿转仪，我用了大虾推荐的一个方法，用甲醇漂洗一下，再用立春红染色，已经能够 ...

我也是菜鸟，咋能称高手啊~~

biorad的湿转仪？Mini湿转仪是不？用100V 转1小时记得置于冰盆中这是biorad自己的推荐标准湿转方案但是这对于50到70的比较好 20KD那个可能会有损失，可以试试100V 50分钟两个蛋白估计能同时转上有不穿膜太多

作者: DNA 时间: 2013-9-22 09:47 标题: 回复 #2106 8princess8 的帖子

我上次做的100V 2h转膜基本成功，但是用立春红染色的时候只能看到第二个泳道的蛋白，甚至marker都没有看到，我的marker 是国产的，是不是不容易转上去，就算是转上去了也不能看到啊，我现在就不能象他们那样直接可以看到marker 转上去的兰色条带，我的上样量是5 微升，

作者: DNA 时间: 2013-9-22 09:48

QUOTE:

原帖由 DNA 于 2013-9-22 09:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我上次做的100V 2h转膜基本成功，但是用立春红染色的时候只能看到第二个泳道的蛋白，甚至marker都没有看到，我的marker 是国产的，是不是不容易转上去，就算是转上去了也不能看到啊，我现在就不能象他们那样直接可以看到marker ...

Marker不在胶上？也不在膜上？那就是转过了嘛

5ul有点少，告诉你一个比较好的预染Marker，碧云天公司的，100v 1h 5ul可以很清楚地转在膜上

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 09:48

我的现象与你的现象一样，用的载体和裂解液都是一模一样的，我也是瞬时表达和稳定表达都做了，WB检验没结果，RT-PCR倒是有，现在超级郁闷，都不知道怎么做了，下面还要做动物试验，要做到什么时间啊

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 09:49

各位前辈,小妹有疑问:我要的目的蛋白是56和66KD的膜蛋白,心脏组织采用RIPA裂解30min,我用的60V浓缩胶和120V的分离胶电泳,90V湿转2小时.5%BSA封闭1小时,一抗1:1000,1小时,洗三次后加二抗1:2000,1小时后洗三次,然后显影,却没有结果.请问是哪里出问题了?还有,组织和裂解液的比例为多少比较合适呢?实在急!

作者: DNA 时间: 2013-9-22 09:49

我现在改用半干法转了,现在marker 是没有问题了,但是现在新的问题又出来了,我的marker 全部转上去了(还有部分在胶上,但是可以在PVDF摸上看到全部的清晰的条带),我用的条件是8V, 50min ,但是蛋白转上去的却很少.我用考马撕染的时候,转过的胶与我同样条件下跑的胶的蛋白浓度差不多.

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 09:50

现在marker 是没有问题了,但是现在新的问题又出来了,我的marker 全部转上去了(还有部分在胶上,但是可以在PVDF摸上看到全部的清晰的条带),我用的条件是8V, 50min ,但是蛋白转上去的却很少.

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你说的这种情况我没见过，蛋白转不过去/?

说不定是Marker或是转膜缓冲液的问题，请别的有经验的战友指导指导

作者: TAT 时间: 2013-9-22 09:54

做了几次WB，但是我要问一下我有一个个体是有时出带，有时不出，而且不同组织还不一样，我坐的是内参，按道理应该是都出的。请教，谢谢！111

作者: biabiade 时间: 2013-9-22 09:54

请问楼主和各位前辈，我在作免疫沉淀后作免疫印迹检测蛋白，由于被检测蛋白的分子量接近50kd左右，和一抗的重链基本重合，所以条带不是很清楚，请问能否想办法，加入酶标二抗时不让一抗的重链和轻链反应，也就是屏蔽掉胶上的一抗的重链和轻链，最后只有我要检测的抗原显色呀，急用，谢谢

作者: cocacola 时间: 2013-9-22 09:55

请教：
我每次做western,就是显不出影来，不知道原因在哪里，我用的是预染的marker，转膜后marker全部的转移到膜上，用丽春红染色后也发现有蛋白条带，经封闭，一抗二抗覆育后，用ECL显色就是发现胶片上啥也没有啊，实在不知道原因出在什么地方，能不能帮我分析一下，我分析的是一种磷酸化蛋白。

作者: DNA 时间: 2013-9-22 09:55

请教各位大虾：
我现在转膜已经没有问题了，我用立春红染色已经很好了，条带清楚而且分离较好。
但是我现在显色没有结果，都把我急死了。
我转膜后是5%的脱脂奶粉（PBST 稀释），常温，两小时，
1：200，300，500的一抗，37度，摇床，1.5h，
PBST 10min/次 X 4 二抗 1：1000，1500，2000，5000 常温摇床，1h
PBST 10min/次 X 4,
用pierce的显色试剂，但是现在都没有条带，
为什么呢？

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-22 09:56

最近想做western blot，
跑胶前的样品就按照平常处理行吗？
我平常跑胶是用甲醇氯仿抽提的，
感觉效果还可以的，
不知这样处理完的样品跑胶可以做western吗？
做western时应该注意些什么问题？
望高手们指点一下！
新手先谢过了！

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-22 09:57

请问我要转14K、27K和41K的蛋白如何设定条件？

我第一次做，如何摸索条件？谢谢！

作者: ha111 时间: 2013-9-22 09:57

我想请问一下我做的是酵母蛋白的WB，分子量41KD， 12%的PAGE胶，转膜时间2小时，电压45伏。5%的脱脂奶粉封闭。结果是白纸一张。不知道是哪里出了问题。一，二抗稀释比例及其它实验条件，我们实验室其它人都作出了比较好的条带。
请高手分析一下，要怎么改进呢？

作者: toy 时间: 2013-9-22 09:58

请教一下，心脏组织的WESTERN 用什么内参比较好？
另外，前段时间做了一次心脏组织的WESTERN，做的是actin，结果出来两个条带，周围的人都说从没见过actin有两个条带的。这是怎么回事啊？

作者: newway 时间: 2013-9-22 09:58

求助各位前辈：
14KD 蛋白做 Western 跑普通的SDS-PAGE能行吗？另外，半干转膜需要什么条件？15V 30min 可以吗？

作者: idoww 时间: 2013-9-22 09:59

想请教一个问题，我做WB时，电泳半个小时没见样品移动，是什么地方的原因？

作者: lixi559 时间: 2013-9-22 09:59

前辈,你好:
最近我走分子量17.5KD蛋白,15%的分离胶,用40伏4小时及90伏2.5小时军转不上,转膜后胶染色也没有条带,我估计转过了,请教一下我应用的电压及时间.
谢谢!!!

作者: lixi559 时间: 2013-9-22 10:03

大家好！
我做的是一个植物细胞壁蛋白，大小约为25KD。
方法是：12％的凝胶分离；半干转移法，0.8mA/cm2，2h。
转膜后发现：预染marker和菌带（大肠杆菌中提取的重组蛋白质）转上去了，但是在植物样品中提取的蛋白质（转移后胶染色）却没有转移上去，也就是说转移不完全。
试问：
转移时电流是否太小？

万分感谢！

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-9-22 10:05

我的问题主要是加发光剂后膜上显示均匀弥漫荧光，这是什么原因呢，荧光的作用时间多久呢？具体是这样的：我用同一张膜进行了三次曝光，将发光剂用枪均匀的加在膜的正面，大概约5分钟。此时在按时肉眼观察膜上看不到任何荧光，进行曝光约10分钟，显影后可见较淡的蛋白条带，为了加强效果，进行第二次曝光，距离第一次大约20分钟，在暗室可以看见弥漫荧光，曝光后显影整个胶片是黑色的，看不见条带；第三次曝光，距离第二次大约20分钟，此时暗室观察不到膜上任何的荧光，曝光15分钟后显影胶片白茫茫一片，什么都没有，是不是在这个时间内荧光淬灭的原因呢？
我的一抗是santa的多克隆抗体，1：100稀释，二抗1：2000稀释，封闭液是％脱脂奶粉，过夜。
希望得到您的解答。
谢谢！

作者: 9900 时间: 2013-9-22 10:05

请问LZ，我做WESTERN BLOTTING，跑出来的beta-actin竟然在marker50kD的位置，而说明书上写应该是42，几次都是这样，我的beta-actin放在最靠边的道上，跟我一起做的，条件和用的marker、beta-actin的一抗都跟我是一样的，可做出来就是42的。
是什么问题？
感谢感谢！万分头大！

作者: junjie05 时间: 2013-9-22 10:07

本人为实验室新手，现在有个问题，有没有抽提中性粒细胞的总蛋白的方法？谢谢了

作者: lixi559 时间: 2013-9-22 10:08

请教各位战友一个问题，
做western blotting的时候可以用硝酸纤维素膜，但是也可以用PVDF膜
这两个膜有什么差别吗？
为什么做southern的时候用的是尼龙膜，
是由于尼龙膜对核酸的吸附较强的缘故吗?
恳求高人们指点一下！
谢谢！

作者: utt0989 时间: 2013-9-22 10:08

我做了几次western blotting,结果都不是很理想。用的是PVDF膜，转膜没有问题，用立春红染色看见很多蛋白带。因为蛋白是his-tag标记的，就用了一个抗体penta his HRP conjugate, 1:4000稀释，显影曝光发现只要膜上面有的蛋白带都能和抗体结合！完全不能用来筛选表达的转化子啊。要怎么做才能解决这个问题啊？能说说么？谢谢啦：）

作者: wood533 时间: 2013-9-22 10:09

我马上去试试，这段时间一直用250ma,2.5-3.0消失，总是没有目的条带，郁闷的我快跳楼了，谢谢了，有消息我马上传过来，希望前辈有时间再帮我一下，再次感谢

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:10

我最近作了两个月的western-blot。考马斯亮兰和立春红染色均能看到显示目标蛋白分子量的maker范围内有蛋白条带显色。用国产扬子江脱脂奶粉封闭，ECL发光显色可见多条蛋白条带显示，背景也很强。而用其他国产奶粉则显示为白片。β-actin则在任何条件下均强阳性表达。且无任何杂带。请哪位高手为我指点迷津，我都快崩溃了。

作者: 98776langtao 时间: 2013-9-22 10:11

我刚用20伏2小时转过，国产六一dyc型转膜槽，电流约25毫安，丽春红染色无条带，请问用这种条件转膜丽春红染色后是否只能转上小分子蛋白，大分子蛋白能看到吗？有没有可能转上了但丽春红看不到，以前用250毫安时能看到大分子小分子看不清，我估计转过了。对了，我用百分制15的胶，是不是应该为12%的呀，
能不能把你的邮箱告诉我呀，不好意思，有些冒昧，westen快把我逼疯了，谢谢
希望你能早些看到我的帖子。
谢谢！！

作者: u234 时间: 2013-9-22 10:16

我有个问题想请教一下。行Western blot实验时，蛋白的上样量跟抗体的亲和力有很大的关系。我在检测某个蛋白的表达谱时，虽然该蛋白跟内参beta-actin大小相差较大，理论上可以利用同一块胶检测目的蛋白和内参的表达，然而，针对目的蛋白的抗体的亲和力很高，而且目的蛋白在细胞中的丰度也很高，因此上样量达到2ug时，即使暴光时间很短，杂交条带也很强。检测beta-actin的表达时，上样量至少要超过20ug。为了能够进行定量或半定量研究，只能分开跑，分别检测目的蛋白和内参的表达。不知楼主有没有更好的方法。

作者: langlang 时间: 2013-9-22 10:17

你好，我最近作250kd的蛋白，但转膜转不上，请高手指点。

作者: kuohao17 时间: 2013-9-22 10:18

我测的是磷酸化的蛋白，楼主能否提供适合于提取磷酸化蛋白的组织细胞裂解液啊！
万分感谢！

作者: one 时间: 2013-9-22 10:19

大家好
western转膜后考液染胶,发现胶的中部区域的条带转到膜上了.
胶的两边却没有转移成功.

我的转移条件是:
蛋白大小30KD,12%分离胶
半干法转移 ,电流:0.8x膜面积(mA),电压显示4-6v(师姐说她用的时候是50v左右).2h

寻求大家的帮助

作者: one 时间: 2013-9-22 10:20

想请教一个问题，我做WB时，电泳半个小时没见样品移动，是什么地方的原因？

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电泳液出错了

作者: avi317 时间: 2013-9-22 10:20

我有个捆饶我很久的问题想请教:我用的是5%脱脂奶粉和TBST,最近我在封闭和一抗过夜时候,奶粉总是析出,我实在没有办法了.PH我测过了,奶粉也换过了,TBST也重配了,连摇的条件我都试了n次,还是析出.而且膜也没有问题.请问为什么会析出呢?我要疯了

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:22

你说的这种情况我没见过，蛋白转不过去/?

说不定是Marker或是转膜缓冲液的问题，请别的有经验的战友指导指导

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一般认为marker转上去则相应的蛋白也转上去了，因二者在胶上的迁移速度相同，则在转膜时迁移出胶到膜上的速度也应该一致。如果是考染胶后发现蛋白残留，则可能是蛋白条带含量高于marker而成的残留。如果是丽春红染膜发现条带很浅或者无有而marker清晰，则与丽春红的敏感度较低有关。虽然丽春红是转膜成功的可靠依据，但受到敏感性的限制。
不过如果膜上可以看到预染marker，而胶上也可以看到残留的预染marker，则是转膜不充分的体现，大分子量的蛋白往往会出现。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:23

请问楼主和各位前辈，我在作免疫沉淀后作免疫印迹检测蛋白，由于被检测蛋白的分子量接近50kd左右，和一抗的重链基本重合，所以条带不是很清楚，请问能否想办法，加入酶标二抗时不让一抗的重链和轻链反应，也就是屏蔽掉胶上的一抗的重链和轻链，最后只有我要检测的抗原显色呀，急用，谢谢

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如果条件允许的话，提高一抗浓度，大幅降低二抗浓度以尝试

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:24

请教一下，心脏组织的WESTERN 用什么内参比较好？
另外，前段时间做了一次心脏组织的WESTERN，做的是actin，结果出来两个条带，周围的人都说从没见过actin有两个条带的。这是怎么回事啊？

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一般认为是二抗引起的交叉。曾有人告诉我是IgG重链引起的，但我后来想的一下从道理上似乎是推导不出来。可能是其他蛋白质。用marker确定分子量，排除杂带或不加一抗直接加二抗以确认杂带的位置而排除。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:24

想请教一个问题，我做WB时，电泳半个小时没见样品移动，是什么地方的原因？

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可能是低级错误，整个系统存在断路造成的

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:25

我的问题主要是加发光剂后膜上显示均匀弥漫荧光，这是什么原因呢，荧光的作用时间多久呢？具体是这样的：我用同一张膜进行了三次曝光，将发光剂用枪均匀的加在膜的正面，大概约5分钟。此时在按时肉眼观察膜上看不到任何荧光，进行曝光约10分钟，显影后可见较淡的蛋白条带，为了加强效果，进行第二次曝光，距离第一次大约20分钟，在暗室可以看见弥漫荧光，曝光后显影整个胶片是黑色的，看不见条带；第三次曝光，距离第二次大约20分钟，此时暗室观察不到膜上任何的荧光，曝光15分钟后显影胶片白茫茫一片，什么都没有，是不是在这个时间内荧光淬灭的原因呢？
我的一抗是santa的多克隆抗体，1：100稀释，二抗1：2000稀释，封闭液是％脱脂奶粉，过夜。
希望得到您的解答。
谢谢！

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抗体浓度过高造成的可能性最大，数倍稀释一抗和二抗，可以一抗1：400，二抗1：4000

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:25

请问LZ，我做WESTERN BLOTTING，跑出来的beta-actin竟然在marker50kD的位置，而说明书上写应该是42，几次都是这样，我的beta-actin放在最靠边的道上，跟我一起做的，条件和用的marker、beta-actin的一抗都跟我是一样的，可做出来就是42的。
是什么问题？
感谢感谢！万分头大！

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首先要排除二抗引起的干扰。方法前文已述。有多个人做内参时在50kd的地方产生杂带，其出现的强弱和有无与组织和细胞有关。所以要重点排除。但一般都是内参高于此条带，所以除了排除杂带，考虑细胞源和蛋白提取方法差异外，你要分析信号过强或过弱两个可能。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:26

请教各位战友一个问题，
做western blotting的时候可以用硝酸纤维素膜，但是也可以用PVDF膜
这两个膜有什么差别吗？
为什么做southern的时候用的是尼龙膜，
是由于尼龙膜对核酸的吸附较强的缘故吗?
恳求高人们指点一下！
谢谢！

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NC膜和PVDF膜对蛋白结合力较高
尼龙膜对DNA和RNA结合力较高
如果没有尼龙膜，NC膜也可以代替，但效果不好

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:27

我最近作了两个月的western-blot。考马斯亮兰和立春红染色均能看到显示目标蛋白分子量的maker范围内有蛋白条带显色。用国产扬子江脱脂奶粉封闭，ECL发光显色可见多条蛋白条带显示，背景也很强。而用其他国产奶粉则显示为白片。β-actin则在任何条件下均强阳性表达。且无任何杂带。请哪位高手为我指点迷津，我都快崩溃了。

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考马斯亮兰和丽春红染色均有其敏感性，目标蛋白分子量的maker范围内有蛋白条带显色不代表目的蛋白一定是所见中的一条，与其表达量有关。
牛奶的质量影响结果，这个是已经明确的了
可以还用用国产扬子江脱脂奶粉，通过降低二抗(和/或一抗）试一试，在原基础上至少再5倍稀释二抗尝试

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:27

我有个问题想请教一下。行Western blot实验时，蛋白的上样量跟抗体的亲和力有很大的关系。我在检测某个蛋白的表达谱时，虽然该蛋白跟内参beta-actin大小相差较大，理论上可以利用同一块胶检测目的蛋白和内参的表达，然而，针对目的蛋白的抗体的亲和力很高，而且目的蛋白在细胞中的丰度也很高，因此上样量达到2ug时，即使暴光时间很短，杂交条带也很强。检测beta-actin的表达时，上样量至少要超过20ug。为了能够进行定量或半定量研究，只能分开跑，分别检测目的蛋白和内参的表达。不知楼主有没有更好的方法。

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同一张膜，先做内参，常规封闭后再做目的蛋白，你的符合同一张蛋白非洗脱抗体后二次检测的适应证

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:27

大家好
western转膜后考液染胶,发现胶的中部区域的条带转到膜上了.
胶的两边却没有转移成功.

我的转移条件是:
蛋白大小30KD,12%分离胶
半干法转移 ,电流:0.8x膜面积(mA),电压显示4-6v(师姐说她用的时候是50v左右).2h

寻求大家的帮助

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注意精细操作，可使用上下各6层滤纸以保持转膜液的半干环境以稳定体系。0.8x膜面积电流2h很强了，而且可能引起干胶，30kd的12％胶使用不含SDS的转膜液一般1h就可以基本转上去，但也可能与你转膜仪效率有关，使用自己实验室的经验方法吧。也可以自己摸索一下。
电压与膜面积（总电流）有关，同时随时间会逐渐升高，不是实验监测的主要依据。

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 10:28

我有个捆饶我很久的问题想请教:我用的是5%脱脂奶粉和TBST,最近我在封闭和一抗过夜时候,奶粉总是析出,我实在没有办法了.PH我测过了,奶粉也换过了,TBST也重配了,连摇的条件我都试了n次,还是析出.而且膜也没有问题.请问为什么会析出呢?我要疯了

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一般奶粉受潮后会形成不悬颗粒。
奶粉析出是指产生沉淀吗？如果不影响试验则可忽略，否则可静置使析出后使用上层悬浊液而不要使用底层颗粒沉淀。

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-22 10:30

我做的组织蛋白，分子量约60KD，分离胶12％，浓缩胶5％。
1 每孔上样20ul,电泳80V30min，100V2：30h，考染MARKER条带杂乱不清；
2 300MA转膜2：30h；
3 一抗1：200,内参1：200共同于37度孵育2h；（一抗购于博士德公司，免疫组化已做出来了）
4 PBST洗后二抗1：5000（推荐1：5000-10000）室温1h；
5 DAB显色无条带

有以下疑问请教高手：
一、蛋白一定要定量后上样吗，每孔上样量？
二、内参的使用方法，只在一抗中加吗？
三、二抗浓度是否过低？

作者: zzzz 时间: 2013-9-22 10:31

战友，你好：我现在在做大鼠肠系膜上动脉血管组织的缺氧诱导因子-1（HIF-1）在失血性休克后的半定量检测，遇到了一些问题。
1.由于所提取的蛋白样本的浓度较低，故上样时不能将所需体积完全上入，论坛的帖子里讨论了很多浓缩蛋白的方法，我打算用三氯醋酸法试一下，这样会不会对试验结果有影响？特别对于蛋白的表达量？
2.我所做的几次都是以反色结果告终（目标条带是白的，背景是黑色），是什么原因？而且有较多的非特异条带，怎样消除？我的具体步骤是：电泳 70V 6h，转膜（NC膜）20V 4度过夜，经立春红染色发现大部分蛋白已转上，封闭用血清＋脱脂奶粉 4度，过夜，一抗（小鼠抗大鼠，单抗，NOVUS公司，说明书建议稀释度1：1000，不过我现在用的是1：3000），室温孵育1-2h，二抗是进口分装的（稀释度1：5000-1：8000）室温孵育1-2h，。我的靶蛋白分子量93KD.显色采用化学发光法（KPL试剂盒），A、B液各1-1.5ml孵育5-10分钟。
3.请传授一些曝片的技巧，我现在怀疑自己这方面还有问题，我是按显影液－定影液－水的步骤进行的，不过每次的底片都是花的，而且总是背景很深。
4.我们试验室有BIO-RAD的半干转，可没人用，能说说怎么用吗？只需将打湿的三文治放入就行了吗？电压和电流控制？时间？效果？

谢谢。恭候回答！！！

作者: IAM007 时间: 2013-9-22 10:31

请问转膜液里加了NaF，250mA电流的电压从没加时97V变为40V，是什么原因呢？对结果有影响吗？

作者: yjf1026 时间: 2013-9-22 10:31

我昨天做的WESTERN，丽春红染色后条带很清晰，但最后显影后却什么都没有。样品是肯定没有问题的

另外，我还想问一下，转膜时如忘记开磁力搅拌大概半个小时，之后开了，再转半小时，这对实验结果有何影响？

作者: tuuu2 时间: 2013-9-22 10:32

请教各位高手：
我最近准备做western,但是关于内参的设置问题有些不明白，有哪位高手指点一下，我是想看一下同一种蛋白在不同的生长条件下的表达状况，这样的话对于内参的设置是否有什么要求？
谢谢!

作者: qiangren789 时间: 2013-9-22 10:32

我灌的SDS聚丙烯酰胺凝胶怎么不凝了？我以前一直做的好好的，中间间隔了半个月，我现在再做时，胶竟然不凝了，我又重新配了过硫酸胺，SDS，丙烯酰胺，TRIS碱，还是不凝了，怎么会这样？？？？请大侠指点一下，我都晕死了，是不是就我这么倒霉哦，连胶都不凝！！！！

作者: cwcwcww 时间: 2013-9-22 10:33

是的，是按“胶”的面积要求的电流，那是我公司的电话，星期一打好吧。

是切下的胶还是整个胶？
要是两块胶同时转怎么算？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-9-22 10:33

一般不凝只有兩個可能可以借別人的temed 跟APS（powder）
試試就知道了

不然TEMED跟APS加倍也可以
拿一點在試管混混就馬上知道了

作者: youreyes 时间: 2013-9-22 10:33

我是个做ＷＢ的新手，有２个问题想向大家请教：
１.我做的ＷＢ的蛋白是一个疏水的小分子蛋白（２１ＫＤ），我是从动物组织中提取，做的Ｎ次的ＷＢ，都没有结果，一片空白，刚开始怀疑是抗体不好用，后来觉得可能是在提蛋白时就没把这中疏水蛋白提出来，所以现在麻烦哪个高手给一个详细的提疏水小蛋白的实验流程，先谢谢了！
２.好多人提到验证抗体是否好用做点杂交，但是本人做过一次，什么也没出，想问一下　，点杂交具体的实验流程是怎样的，谢谢！
　　万分感谢！希望大虾不吝赐教，不胜感激！

作者: pengke1983 时间: 2013-9-22 10:34

可以先跟大家說你提取疏水性蛋白的方式嗎？

如果是就只要把你抽出的蛋白小心的（依據不同的濃度）依序點在膜上
剩下跟著一起洗就好了

記得要等點稍微乾一點再去洗喔！

作者: kuaizige 时间: 2013-9-22 10:39

"我想再问一下，点完之后的蛋白用37度烘干么？ "

我的習慣是放在室溫(25 C)的Laminar Flows 5-10mins
看到膜上面沒有水珠就可以了...37度烤乾也可以...
再高我就沒有試過了...
dot blotting很快一個下午左右就可以看結果

作者: kswl870 时间: 2013-9-22 10:40

你好
我现在要做一个大约10kd左右蛋白的wb
在组织中提取,一直怀疑在蛋白的提取中出现了问题
你能把你的提取小蛋白的步骤和试剂发给我吗?

作者: ii077345 时间: 2013-9-22 10:42

前辈，我想问一个菜鸟的问题
就是我要作羊水和血清的western，是测肺泡表面活性蛋白A，分子量是
700 000不清楚标本取了之后应该怎么保存，需要什么步骤，是不是先离心，转数和时间是多少呢？然后冻存，如果冻存，是在什么条件下呢，负80℃，液氮么？
万分感谢，还请不吝赐教！

作者: applebook=213 时间: 2013-9-22 10:42

膜放了一年，还可以用吗？

作者: 33号 时间: 2013-9-22 10:43

>>膜放了一年，还可以用吗？

如果是放在盒子裡面塑膠袋都有封好的情形下
襯紙也都完好的
一般是不會有任何問題的

如果是已經轉過蛋白以後的膜要弄WESTERN
兩個禮拜我都不敢保證可以拿去洗WESTERN

作者: wsll 时间: 2013-9-22 10:43

前辈，我想问一个菜鸟的问题
就是我要作羊水和血清的western，是测肺泡表面活性蛋白A，分子量是
700 000不清楚标本取了之后应该怎么保存，需要什么步骤，是不是先离心，转数和时间是多少呢？然后冻存，如果冻存，是在什么条件下呢，负80℃，液氮么？
万分感谢，还请不吝赐教！

没有人搭理我么？

作者: mysmdbl 时间: 2013-9-22 10:44

请问我的WESTERN为什么会有这样的图？
这是beta-actin
跟以前的条件完全一样，以前从来没出现过

[ 本帖最后由 mysmdbl 于 2013-9-22 12:24 编辑 ]

图片附件: 84330146.jpg (2013-9-22 12:24, 49.82 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18650

作者: gogo 时间: 2013-9-22 12:24

我最近作了一次western ,丽春红染色什么都没有。不知什么原因。我的蛋白浓度较低，上样量才10ug，上了20UL

作者: ero11 时间: 2013-9-22 12:26

楼主说提核蛋白要用stop buffer，配方他的帖子里有，可是我找了好久都没有发现那个有配方的帖子。大家可不可以告诉我在哪里，谢谢啦

作者: yes4 时间: 2013-9-22 12:27

我最近跑的是大概200Kd的蛋白，结果总是不理想，大概的问题我自己分析了一下：
1。样品是细胞裂解液，跑过电泳，条带还是很好的（估计样品不会有问题吧）
2。电泳用的8％的胶是160V，大概3个小时（是不是高了，对蛋白有影响，如何修正？）
3。转移是200ma恒流3个小时，室温（mark是转上去了，但是别人还是推荐时间延长，但是不知道具体多少电流和时间，请告知）
4。一抗做过Elisa验证应该没有问题，二抗1：1万，是不是稀了点？
注：同样的细胞和单抗别人跑出来过的。

作者: leifengta 时间: 2013-9-22 12:27

>2. 电泳用的8％的胶是160V，大概3个小时
> （是不是高了，对蛋白有影响，如何修正？）
既然你前面說條帶沒有問題...可以推論你的電泳是可以接收的...
>3。转移是200ma恒流3个小时....
如果是bio rad的機器應該是還好
要確認一下你的marker是小分子（下面）比較好
還是大分子（上面）比較好
>4。一抗做过Elisa验证应该没有问题，二抗1：1万，是不是稀了点？
一開始還是用廠商建議的3000-5000倍去做比較適合
如果背景太大稀釋一下就好了

作者: birdfish 时间: 2013-9-22 12:29

请问楼主：
在电转的时候，如果减少glycine的量有什么作用，是不是有利于大分子蛋白的转膜呢？如果在大分子蛋白所带的电荷很少且没有SDS的情况下是不是更是如此呢？

作者: bling 时间: 2013-9-22 12:29

我现在在做western blot，我的表达蛋白的分子量为45KD左右，分离胶是10％，用25v，过夜，最后好像没有结果，想请教我最好用多少电压和时间电转呢？谢谢!

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-22 12:29

楼主你好：
我近阶段刚开始做western blot遇见了一些问题：
分子量：30，000kD 恒压电转 100V45min刚开始时效果还可以。
后来做的几次都出现同样的问题：
电转后NC膜面老是变画，再显色时膜上有好多花纹。刚开始我以为是滤纸
用得不合适，可是，改变滤纸用量后仍然是很多花纹。请问：改变什么条件
才能得到好的结果。是由什么原因造成的？怎样的条件才能得到好的结果。

作者: uuooii 时间: 2013-9-22 12:30

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问，但是我的时间有限，问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

sean

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遇到高人，太好了！我也做了一段时间的western blot，结果一直不尽人意。想请教高人，我的蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，为一120KDa的同型二聚体，铺的是5%浓缩胶，12%分离较，40mI恒流电泳40min，半干电转2小时，我本专业是临床医学，所以一直没注意电压方面的讲究，汗颜中。想问一下转膜方面的相关技巧，我转膜后胶上还有不少条带剩余，最后结果也做出来几次，条带都很浅。我欲得到的结果是看健康组和患病组这种蛋白含量的差别，请高人多多指教，我想快点做完这个实验，因为时间有限。多谢！

作者: bling 时间: 2013-9-22 12:31

楼主：我的表达蛋白的分子量为45KD左右，分离胶是10％，用25v，过夜，最后好像没有结果，想请教我最好用多少电压和时间电转呢？我是用湿法做的电转。谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-22 12:31

请问做stat3磷酸化的western有什么与其他蛋白不同的地方吗?需要注意什么?谢谢~~

作者: bs4665 时间: 2013-9-22 12:32

你好,上次给你发了一次邮件,可能是你太忙了,没能收到你的回复.现在将我的问题留于此,望不吝指导:
蛋白60ug,上样,胶10%,电泳后一半考染,蛋白条带清晰,加一半湿法200mA转2层膜(PVDF),2h,Marker转膜完全,转膜后蛋白考染,蛋白转膜完全,但丽春红染色时,只能见到10KD左右蛋白条带清晰,余为片状,不成条带,加发光剂后,蛋白泳道处不见荧光,膜周围却肉眼可见荧光,成像后显影结果与肉眼相似.
明年就要毕业了,老师要我做6个蛋白,急死了.

作者: 66+77 时间: 2013-9-22 12:33

我做的蛋白有好几种,有的是膜蛋白和胞浆蛋白和核蛋白,请问用什么样的蛋白提取试剂盒最好,谢谢!

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 12:34

你好，我测得蛋白分子量100KD左右，分离胶用多少浓度比较好啊？还有我转膜电流200MA，转膜时间100min，这样够不够啊？我测组织蛋白，封闭时间1.5h是否够？显影出现杂带是什么原因？谢谢！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 12:34

呵呵，硝酸纤维膜要重复利用时，用什么清洗比较好啊？是不是一定要用产家的抗体清除液啊？一般膜需怎么保存，重复利用时封闭、一抗、二抗的时间是否和前一次一样啊？谢谢

作者: 66+77 时间: 2013-9-22 12:35

关于土温20浓度的问题：
1. 园子里有人说WB的TBST洗液的土温20浓度在0.05-0.1%之间；浓度大于0.2% 会将特异性结合也给洗掉。可我看有些人用的洗液土温20浓度可到1%，这是为什么？
2. 还有人说用TBST配 5%脱脂奶稀释多克隆一抗，其中的土温20可到2-5%，是这样吗？
3.我做斑点杂交时，背景高，条带浅，如何改进？

作者: daod 时间: 2013-9-22 12:35

不好意思，我想做半定量分析，请具体说一下该怎样分析结果，需要什么软件，这个软件在哪里获得，是不是每个样本至少要做三次，取其平均值才能做。还有如果遇到问题，能不能发邮件给你，打扰了

作者: orangecake 时间: 2013-9-22 12:36

最近在做wnt 及beta-catenin两个蛋白的western，wnt不管怎么做都会有条带出现，但beta-catenin怎么做就是没条带。我换过一抗和二抗了，每次跑两张胶，转两张膜，条件都是一样的。 beta-catenin是连接蛋白我检测的是组织中的beta-catenin总蛋白。提的组织蛋白中应该会有这总蛋白的不会连条带都没有。每次只有一排marker的条带。可以帮帮忙分析一下原因吗？

作者: KGZ564 时间: 2013-9-22 12:36

呵呵，硝酸纤维膜要重复利用时，用什么清洗比较好啊？是不是一定要用产家的抗体清除液啊？一般膜需怎么保存，重复利用时封闭、一抗、二抗的时间是否和前一次一样啊？谢谢

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很多人也會用NaOH稍微洗一下
就可以把上面的抗體洗掉

重复利用时一抗的時間還是稍微增加一下比較好

作者: KGZ564 时间: 2013-9-22 12:37

你好,上次给你发了一次邮件,可能是你太忙了,没能收到你的回复.现在将我的问题留于此,望不吝指导:
蛋白60ug,上样,胶10%,电泳后一半考染,蛋白条带清晰,加一半湿法200mA转2层膜(PVDF),2h,Marker转膜完全,转膜后蛋白考染,蛋白转膜完全,但丽春红染色时,只能见到10KD左右蛋白条带清晰,余为片状,不成条带,加发光剂后,蛋白泳道处不见荧光,膜周围却肉眼可见荧光,成像后显影结果与肉眼相似.

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多嘴插個話

一般10KD的轉膜很少轉到兩個小時
Marker下面(<10kd)一定都是糊糊的
你要的目標蛋白應該也會有同樣的情形

附帶一問
你的膜有換0.22um的孔徑嗎？

作者: douding66 时间: 2013-9-22 12:37

请问:有没有做western做的很好,但点杂交做不出来的?请问原因何在?

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-22 12:39

最近在做wnt 及beta-catenin两个蛋白的western，wnt不管怎么做都会有条带出现，但beta-catenin怎么做就是没条带。我换过一抗和二抗了，每次跑两张胶，转两张膜，条件都是一样的。 beta-catenin是连接蛋白我检测的是组织中的beta-catenin总蛋白。提的组织蛋白中应该会有这总蛋白的不会连条带都没有。每次只有一排marker的条带。可以帮帮忙分析一下原因吗？

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给些建议，希望能帮上忙
1、“只有一排marker”应该是在转膜后吧，你可以用丽春红预染一下看看转膜效果怎样，没有蛋白条带很可能就是你的转膜条件不适应，应适当调整。
2、是单独做beta-catenin，还是和wnt 在同一张膜上，若是同一张膜，你要考虑一抗有没有问题了。
3、你应注意到两个蛋白的丰度不一样，所以应该调整抗体的浓度，及压膜曝光时间。
若不能解决问题，请把你的试验条件详细列出，以便大家一同解决

作者: 小糖块 时间: 2013-9-22 12:39

什么问题啊？marker跑得很清晰，就是跑不开。洗片洗出好多带哦，大小小的蛋白都被我染出来了!不知谁是目的蛋白，呵呵。

我的蛋白是21KD，用12%的胶。浓缩胶跑30分钟，分离胶1：30，marker从第一条到最后一条(100分子量到10)之间不超过1cm。我又加跑1小时，即分离胶2：30，溴芬兰已跑到底了，marker第一条到最后一条距离才不到2cm。奇怪的是marker是整体下移，都在胶的中间位置，上面的胶空空的。几次都这样。

作者: wu11998866 时间: 2013-9-22 12:40

我的目的蛋白是２１ＫＤ和２８ＫＤ，请问以下用ＢＩＯＲＡＤ湿转时是恒压好呢？还是恒流好呢？
恒压时是多少电压？　时间？
恒流时是多少？　时间？
　哦，对了，　我提取的２１ＫＤ是ＢＡＸ和２８ＫＤ是ＢＣＬ－ＸＬ，提取时我只加了ＰＭＳＦ一个蛋白酶抑制剂，不止行不？
谢谢了

作者: 3N4G 时间: 2013-9-22 12:40

请教：我想做一个分子量4.2KD的蛋白，看了很多贴子，好像应该用15％的tricine-SDS PAGE分离胶，好像电转液的配方也不同，PVDF膜用0.1um的，求助分离胶，浓缩胶与电转液具体配方，另外还有什么与普通分子量的蛋白电泳有何不同，比如电压与时间，请指教，万分感谢！

作者: vera+ 时间: 2013-9-22 12:41

各位学友，有没做过兔的Western Blotting的？我近期要做Western Blotting 试验，是测定兔的凋亡因子（Bcl－2 和Bax）及eNOS，但是目前买不到兔的单抗？
谢谢！我查了一些相关文献有用鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体，但多克隆抗体缺乏特异性，
我想用鼠抗人的一抗，但又不知道兔，鼠，人等因子同源性如何？
请帮忙！
万分谢谢！

作者: wiwi 时间: 2013-9-22 12:42

请教：我的是120和40KD的蛋白，之前第一次做都很好，结果现在曝光都没有，之前的条件是12％的分离胶，电泳大概200分钟，转膜湿转恒流400mA,90min.我用的是BIO-RAD的电泳和转膜系统，PVDF膜用的是MILLIPORE的0.45uＭ的膜，是不是转膜时间太短了？我染过胶和膜，胶的下面没有条带，上面是有的，膜也差不多呢！多谢了！

作者: one 时间: 2013-9-22 12:42

请教一个问题，跑8％的胶，考马司亮蓝染色发现120kd以上胶上几乎没有东西，下面条带比较清楚，做过几次转膜也是如此，不知道什么原因。　

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-22 12:43

我刚开始做western，看到很多电转液的配方，不知道哪个对，1L配方：甘氨酸14.4g,Tris碱3.03g,甲醇150ml(PVDF膜）；还有一个甘氨酸2.9g,Tris碱5.8g,甲醇150ml(PVDF膜）。还有TBS的配方也有很多版本，Tris碱的含量到底是100mM(分子克隆第四版），还是20mM，还看文献上有25mM，50mM，究竟哪个才是对的？有什么不同？请各位高手帮忙！！谢谢

作者: xue258 时间: 2013-9-22 12:44

楼主您好！
我最近在做WB，因为是做磷酸化的，用了康成的第二代超敏ECL，显影时经常是看到有荧光，但是一下子就没有了，根本来不及压片。降低了抗原量，降低了一抗浓度，都没有什么改善。一开始是上100微克的量，后来减低到约50微克，二抗也调低到2000:1，但问题还是没有解决。改用CST的ECL又检测不出来。请问是什么原因引起的，有什么解决办法？谢谢！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 12:44

我的目的蛋白是120KD，凝胶电泳可以跑出来，只是条带比较淡。
电泳：8％分离胶，5％积层胶，100v20min，120v1h40min。
转移恒压55v3h。
转移后胶考染，仍可见条带，膜未染色，直接孵育一抗，DAB显色无条带，以后需要改变那些条件？望大家赐教！谢谢！

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:45

什么问题啊？marker跑得很清晰，就是跑不开。洗片洗出好多带哦，大小小的蛋白都被我染出来了!不知谁是目的蛋白，呵呵。

我的蛋白是21KD，用12%的胶。浓缩胶跑30分钟，分离胶1：30，marker从第一条到最后一条(100分子量到10)之间不超过1cm。我又加跑1小时，即分离胶2：30，溴芬兰已跑到底了，marker第一条到最后一条距离才不到2cm。奇怪的是marker是整体下移，都在胶的中间位置，上面的胶空空的。几次都这样。

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12%最佳分离效果在30～80kd，分子量太大太小都不是很理想，所以会出现你所述现象。建议：
1 更换为15%分离胶
2 闲暇时可以尝试利用考染图比较8％ 10％ 12％ 13.5% 15％等几种胶的电泳图谱

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:46

我的目的蛋白是２１ＫＤ和２８ＫＤ，请问以下用ＢＩＯＲＡＤ湿转时是恒压好呢？还是恒流好呢？
恒压时是多少电压？　时间？
恒流时是多少？　时间？
　哦，对了，　我提取的２１ＫＤ是ＢＡＸ和２８ＫＤ是ＢＣＬ－ＸＬ，提取时我只加了ＰＭＳＦ一个蛋白酶抑制剂，不止行不？
谢谢了

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1 不同转膜仪效率会有差别，恒压恒流都可以，条件根据本实验室的经验确定
2 保持低温操作，只加了ＰＭＳＦ一个蛋白酶抑制剂不会引起蛋白的明显降解，可跑胶考然以确定

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:46

各位学友，有没做过兔的Western Blotting的？我近期要做Western Blotting 试验，是测定兔的凋亡因子（Bcl－2 和Bax）及eNOS，但是目前买不到兔的单抗？
谢谢！我查了一些相关文献有用鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体，但多克隆抗体缺乏特异性，
我想用鼠抗人的一抗，但又不知道兔，鼠，人等因子同源性如何？
请帮忙！　

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Bcl－2 和Bax 及eNOS都是比较保守的基因，关于兔，鼠，人等因子同源性很少有人知道，我建议你咨询试剂公司。你最好选择多抗，既然你有抗人的抗体，可以试着作个预试验。

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:47

请教一个问题，跑8％的胶，考马司亮蓝染色发现120kd以上胶上几乎没有东西，下面条带比较清楚，做过几次转膜也是如此，不知道什么原因。　

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1 你蛋白表达谱里120kd以上的分子含量本来就不高，所以即使有条带考染的敏感性也不够，看不出来。这个可能是主要原因，同时跑个其他组织的蛋白对比一下就能确认了
2 8％胶分离大分子效果尚可，所以如果换成12％胶，大分子分的不是很明显都聚集在一起时也可以加强染色效果。你也可以试一下。只是验证而已，但不能用来做大分子的western。
3 蛋白降解可导致大分子缺失。但蛋白降解的可能性太小了。

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:47

我刚开始做western，看到很多电转液的配方，不知道哪个对，1L配方：甘氨酸14.4g,Tris碱3.03g,甲醇150ml(PVDF膜）；还有一个甘氨酸2.9g,Tris碱5.8g,甲醇150ml(PVDF膜）。还有TBS的配方也有很多版本，Tris碱的含量到底是100mM(分子克隆第四版），还是20mM，还看文献上有25mM，50mM，究竟哪个才是对的？有什么不同？请各位高手帮忙！！谢谢

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分子克隆4？我只有分子克隆2和分子克隆3，我还不知道已经出到第四版了？这是谬传吧。
1 一定要注意转膜是湿转还是半干转，配方会有差异的，但大家都能做出来，只要是公开出版的都可以用，没必要厚此薄彼。
2 我是用“分子克隆2”及“抗体技术实验指南”的配方，很稳定，半干转：甘氨酸2.9g,Tris碱5.8g,SDS 0.37g 甲醇200ml 定容至1000ml。
3 分子克隆2”提供的TBST的配方Tris碱的含量是20mM，配方如下
10×TBST（1L）
Tris-base  24.2g
Nacl  80g
Tween-20  10ml
去离子水  800ml
HCl调节PH至7.6 定容至1L，用前稀释10倍为1×工作液

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:48

楼主您好！
我最近在做WB，因为是做磷酸化的，用了康成的第二代超敏ECL，显影时经常是看到有荧光，但是一下子就没有了，根本来不及压片。降低了抗原量，降低了一抗浓度，都没有什么改善。一开始是上100微克的量，后来减低到约50微克，二抗也调低到2000:1，但问题还是没有解决。改用CST的ECL又检测不出来。请问是什么原因引起的，有什么解决办法？谢谢！

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你的问题就出在信号太高，超敏ECL敏感性极高，当然荧光耗竭来不及检测了
为什么不尝试在已稀释浓度的基础上再稀释抗体10倍～50倍？或者同时减少抗体封闭时间？降低上样量的确能力有限。做western不怕信号强，就怕信号弱。原有基础上再稀释20倍我干过的，可行。

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 12:48

我的目的蛋白是120KD，凝胶电泳可以跑出来，只是条带比较淡。
电泳：8％分离胶，5％积层胶，100v20min，120v1h40min。
转移恒压55v3h。
转移后胶考染，仍可见条带，膜未染色，直接孵育一抗，DAB显色无条带，以后需要改变那些条件？望大家赐教！谢谢！

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如果你成功做过其他蛋白的话就是说问题不出在操作上，那么是很头疼的事情。如果是预实验，建议做个成功的蛋白或者内参已确保你操作是正确的。然后尝试从优化转膜条件，再一个就是提高信号强度的角度着手。120KD转膜不充分还是很常见的。

作者: pengke1983 时间: 2013-9-22 12:49

请问高人，我最近做WESTERN BLOT ,转膜后用立春红染色,我的配方是:
立春红 50毫克,乙酸100微升,加单蒸水至10毫升,然后把膜直接放里面染色,5分钟后冲去染液,就是刚冲的一秒钟有红色的带出现,然后就一片白,怎么办?配方有问题吗?拜托啊,我都快郁闷死了,做了好几次都这样!

作者: abc816 时间: 2013-9-22 12:49

请问高人，我最近做WESTERN BLOT ,转膜后用立春红染色,我的配方是:
立春红 50毫克,乙酸100微升,加单蒸水至10毫升,然后把膜直接放里面染色,5分钟后冲去染液,就是刚冲的一秒钟有红色的带出现,然后就一片白,怎么办?配方有问题吗?拜托啊,我都快郁闷死了,做了好几次都这样!

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我用的是抗体技术实验指南的配方：
丽春红一般配成10＊母液：
三氯乙酸 -----30%
磺基水杨酸---30%
丽春红S--------2%
注：室温保存>1年。用去离子水稀释至10倍体积即为1＊工作液，工作液可反复利用多次而不影响后续。

如果非要配成1＊工作液，那为3%三氯乙酸，3%磺基水杨酸，0.2%丽春红S。
而你的配方是：1%乙酸，0.5%丽春红S。

另丽春红染色的方法是：
取足够浸润膜的1＊工作液（一般是20－40ml），膜置平皿于摇床摇动10min,取出后置膜于一新平皿中，一手持平皿倾斜与水平成30－60度角以利于冲洗时水流流下，另一手用洗瓶按一定顺序冲洗膜，注意仔细观察在没有蛋白的地方红色会逐渐褪去，而留下与蛋白条带结合处的丽春红。丽春红与蛋白是氢键的非共价结合，如果冲洗时间过长也可导致与蛋白条带结合处的丽春红被冲掉。
染色后置TBST中漂洗5－10min＊1－2次至无色即可。

作者: idea2011 时间: 2013-9-22 12:50

因为我要检测的是EGFR的磷酸化蛋白，本来量就不多，如果一抗再稀释10倍即稀释到1000：1的话会不会太低了？

这几天我把上次做得不好但保存在PBST4度里的PVDF膜（原来孵过CST的二抗后又显过影的）又拿出来，换了一个国产的二抗，4度过夜，这回的话CST的ECL（不是超敏的）显影显得很好，梯度也很明显。

于是考虑二抗的问题，这一次从上样开始重新试了一回，只换了该国产二抗（原来用的是CST的二抗），结果是要好一些：用康成的超敏ECL还能压出片子来，但我要做的是一个药物梯度，用超敏发现抑制最轻的即目的蛋白含量最高的那一个总是耗尽最快，结果出来的条带总是与实际相反。改用CST的ECL，却又很淡很淡的条带（压片5分钟）。

综合这几天的结果，考虑如果能用CST的ECL显影的话则符合我的要求，超敏可能太难控制了。

但现在是现在用的条件好像不太合适，请问yaplewang大侠，这应该考虑调整什么问题？混合两个二抗一起孵育是否可行？

非常感谢！

（目前用的条件：上样量50微克，检测EGFR磷酸化蛋白，一抗1：1500，二抗国产羊抗小鼠1：5000，一抗4度揺床过夜，二抗室温30分钟后4度过夜）

作者: tianmei001 时间: 2013-9-22 12:50

请问楼主，我准备做培养细胞的磷酸化EGFR的western，按照一般提取蛋白的操作，连续做了两次，一点表达都做不出来（不是表达强弱的问题），是不是磷酸化的蛋白在提取的时候要加一些特殊的磷酸化保护剂？还是其他的什么问题？谢谢！

作者: 49888 时间: 2013-9-22 12:51

请问楼主，能否告诉我几个卖一抗的公司，我是新兵，急着要做western，但还买到一抗。

作者: yjf1026 时间: 2013-9-22 12:52

Marker不在胶上？也不在膜上？那就是转过了嘛

5ul有点少，告诉你一个比较好的预染Marker，碧云天公司的，100v 1h 5ul可以很清楚地转在膜上????????

碧云天公司的???我刚刚买的，要20微升上样，电泳就好淡的。转膜后干脆就没有影子了！！！超级郁闷，感觉被骗了一样，我还照付钱了。再也不会买它们的东西了

作者: 04906 时间: 2013-9-22 12:53

1　如果一抗再稀释10倍即稀释到1000：1的话会不会太低了？

2　用超敏发现抑制最轻的即目的蛋白含量最高的那一个总是耗尽最快，结果出来的条带总是与实际相反。改用CST的ECL，却又很淡很淡的条带（压片5分钟）。
但现在是现在用的条件好像不太合适，这应该考虑调整什么问题？混合两个二抗一起孵育是否可行？
3　这几天我把上次做得不好但保存在PBST4度里的PVDF膜（原来孵过CST的二抗后又显过影的）又拿出来，换了一个国产的二抗，4度过夜，这回的话CST的ECL（不是超敏的）显影显得很好，梯度也很明显。

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1　我用超级底物，一抗用过1：5000，二抗用1：10000，完全可以
2　你的就上信号太高的问题，叫你大胆稀释一抗＋超敏是为你节约一抗用量。如果你不放心我建议你：
你两个二抗的效率不一样，不过不用混合两个二抗，你自己随便选一个都可以，用CST的ECL，5min太短了，延长压片时间至30min乃至1h乃至3h乃至过夜，一定能够提高信号
具体操作参见我帖：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5936631&sty=1&tpg=1&age=0')
1楼第4行至第13行
3　是可行的，在我上链接帖的后面某一帖我已论述

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-22 12:53

我用一种蛋白调出另一种蛋白来了(western-blot),还需要做对照吗?怎样做合适呢?表明是特异性的作用啊？

作者: babybabe 时间: 2013-9-22 12:54

大家好，我准备做16KD的蛋白western，可是没有任何经验，想请教一下电泳、转膜条件以及其它的注意事项，我看好多贴子转膜都是恒压，我们实验室有其他同学做25KD以上的蛋白，都是恒流半干转，（电流=膜面积*系数[小分子0.6-0.65大分子0.8-0.85]），时间大约2小时，我不知道16KD蛋白要怎么转，时间多长？谢谢你们的帮助

作者: u76mp 时间: 2013-9-22 12:54

有谁做过tubulin和VEGF吗？我最近做实验内参tubulin出现的带总是不均匀，带中间有空，甚至有些竖条纹，而vegf却没有类似情况，已经两个周了，自己找不到原因，请各位帮忙！还有我做的VEGF好像有四条带，哪位高手做过，请指教！谢谢！

作者: kuohao17 时间: 2013-9-22 12:55

请教高手，
1。放4度的抗体可以保存多久，前天还有漂亮的结果，今天会不会失效
2。你说转膜很关键对吗，那么我用90v，恒压，湿转2h可以吗，分子量是110kD。

作者: 831226 时间: 2013-9-22 12:55

最近在做western，转膜一直不好，转过好多次，只有一次转后，经丽春红染色有条带，之后怎么染都未见条带

昨天买了预染marker，转了两次，一次转后，胶上marker的蓝色条带已经完全消失，但是膜上也未见marker条带
第二次，胶上的marker基本转完，只有点儿大蛋白剩余，膜上隐约可见marker,但并不清晰，而丽春红染后什么条带也没有？

Ps：我用的是半干转

实在不明白，所以请教一下，非常感谢！！！
总是重复也没结果，所以超级郁闷！请各位指点一下！！

作者: lixi559 时间: 2013-9-22 12:55

如何将蛋白Ｍarker和目的蛋白及内参同时在胶片上显示出来的．

作者: 阿凡提 时间: 2013-9-22 12:56

大家好。
第一次做western 条带的影子都没有各位帮看看会是哪些原因导致啊？
自己想想可能原因有：
1。组织处理组织处理未加蛋白酶抑制剂，直接用PBS。
2。各步需振摇的，对于振摇速度有无要求，别人说要轻轻振摇，我摇的时候可能稍比轻轻振摇速度快了点。
3。抗体一抗是绵羊抗大鼠的。二抗用的是兔抗山羊的。二抗本应是抗绵羊的，买错了。但因有人说也可用，所以就用了。
各位帮忙看看，这些原因会导致最终无条带吗？
还有其它原因否？

作者: BUK 时间: 2013-9-22 12:57

我最近想做一个脑内CD73蛋白的表达，目前的问题：
（1）：虽然CD73抗体公司有售，但是我在PUBMED里面很少看到有用抗体做western的文献，大多是做它mRNA表达，一般理解western做出来结果应该比RT－PCR更能说明蛋白表达的情况，所以我一直不清楚为什么没人做western，是不是脑内表达太低了？
（2）如果做RT-PCR是不是也可以间接反应该蛋白的表达情况？我们单位有RT-PCR的机器，如果做这个实验的话，成本大不大？

作者: zhezhe 时间: 2013-9-22 12:57

我做WB已经一年多了.期间遇到的最多的问题是,最后(NBT/BCIP)显色时发现,膜上就象时电泳条带一样.只要是有蛋白转上去的地方,都显色.我的背景很干净,应该不是封闭的问题.一抗和二抗都是按照说明书上给的浓度稀释的.请问这种现象是什么原因,怎么解决啊。

作者: langlang 时间: 2013-9-22 12:58

我想问一下，我现在用的二抗是天为时代的，不晓得大人有没用过，他建议的稀释倍数是200－500，我想问一下，稀释到1000可不可以

作者: tuuu2 时间: 2013-9-22 12:58

电转完后用丽春红染色，为什么就只有下端的溴酚兰有颜色？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-9-22 12:58

我检测AFP，分子量70kD左右，但是显影后有两个条带估计都100kD以上，有可能吗？
western的分子量会不会比蛋白的分子量大或者小？

楼主都好多天没来解答，快来啊！哈哈，谢谢先

作者: cocacola 时间: 2013-9-22 12:59

请问ECL的X胶片扫描用那家公司的扫描仪比较好？

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:00

请问ECL的X胶片扫描用那家公司的扫描仪比较好？

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用MICROTEK公司的ArtixScan1010就可以。

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:01

我检测AFP，分子量70kD左右，但是显影后有两个条带估计都100kD以上，有可能吗？
western的分子量会不会比蛋白的分子量大或者小？

楼主都好多天没来解答，快来啊！哈哈，谢谢先

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有没有可能是你的蛋白聚合了（聚合成二聚体了，我以前做过遇见过这种情况，出来的条带有两个，一个在正确的位置，另一个比那个大一倍左右）

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:01

我想问一下，我现在用的二抗是天为时代的，不晓得大人有没用过，他建议的稀释倍数是200－500，我想问一下，稀释到1000可不可以

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具体的实验浓度要根据自己的一抗来摸索，检测手段的灵敏度不同也会有差别，所以没有具体的数字，他提供的应该是比较常用的稀释倍数，你要根据自己的实验要求和条件来确定自己最适合的稀释倍数。

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:01

请教高手，
1。放4度的抗体可以保存多久，前天还有漂亮的结果，今天会不会失效
2。你说转膜很关键对吗，那么我用90v，恒压，湿转2h可以吗，分子量是110kD。

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4度一般不要超过一个月，不过不同的抗体稳定性差别也很大，有的抗体对温度很敏感，有的就比较稳定，根据抗体而定，你可以分装后放负20或者负70保存啊，用的时候单独取用。
90V湿转2小时110KD应该可以。

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:01

我用一种蛋白调出另一种蛋白来了(western-blot),还需要做对照吗?怎样做合适呢?表明是特异性的作用啊？

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如果是表达的蛋白你可以用表达前的裂解液同时做个WB作为阴性控制。

作者: is2011 时间: 2013-9-22 13:02

我想问一下，我的目的蛋白大概是23KDa ，同时用了内参Actin （42KDa）。

在湿法转膜时的电压及转膜时间上你有什么建议呢？

还有就是在一抗孵育的时候，可不可以把目的蛋白的抗体和Actin的抗体混合在一起同时在膜上孵育呢？两者对应的二抗是一样的。

谢谢

作者: dog002 时间: 2013-9-22 13:03

刚开始准备作western blot，请问：（1）western blot必须做内参吗？（2）有人知道IκBα的分子量啊？

非常感谢！

作者: mickeylin 时间: 2013-9-22 13:04

刚开始准备作western blot，请问：（1）western blot必须做内参吗？（2）有人知道IκBα的分子量啊？

非常感谢！

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我也准备做IκBα的测定，刚查过分子量为37KDa，不知你用的是什么组织啊？
可以交流一下^_^。

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:04

你好！
我的目的蛋白有130kd左右，是个膜蛋白。加药处理后收细胞，比较不同的处理对目的蛋白表达的影响，并且还要检测对某磷酸化位点的该蛋白表达的影响。电泳和转移所用相关试剂都是参考汪家政的《蛋白质技术手册》和《分子克隆》（第2版）配的。电泳仪和转膜仪都是北京六一的产品。5%的积层胶，8%的分离胶。分子量11~170kd的预染marker,在130kd处有条带。恒压电泳，积层胶100V,分离胶150V，电泳至溴酚兰跑到胶底（但是130kd处marker还只跑到分离胶的上1/3和中1/3交界处）。曾用考马斯亮蓝染色，但是没有看到目的条带，用银染才看到目的条带，但是很细。根据marker位置切胶，用半干法恒流转膜，0.45微米pvdf，28mA，转2个多小时，丽春红染色没看到目的条带，并且蛋白条带很少，几乎是干净的。觉得是蛋白量低（膜蛋白），接着往下做，含5%BSA的TBST室温封闭1小时，CST的一抗，碧云天的二抗，都是新买的，显影液和定影液都是新配的，X光片也是新的。但是发光的ECL是原来剩的，估计起码有1年多快2年了。。。。。。结果没做出来。
我想请问是不是样品量太低了？还是转膜条件有问题？湿转会好些么？另外，ECL4度可以放多久阿？我打算买新的。但是我觉得问题首先不在ECL,丽春红就没染出来了。是不是只要考染和丽春红染色能看得到就一般就量上说来是没有问题的了？
另外，我想请教，蛋白样品有些粘，超声的话会不会对我还要检测的磷酸化蛋白产生影响？

作者: woshituzhu 时间: 2013-9-22 13:04

我打算最近做western检测细胞中p53的表达情况，手头有actin的内参，有两个基本问题请教一下：
1 p53的分子量53KD，actin的分子量42KD，请问能不能用一张胶来跑，多大浓度的胶合适？
2 能不能用将2种一抗加到同一张膜同时作用并一起显色，或者能不能在同一张膜上先将一种抗体（一抗）孵育完成并冲洗后再接着用第二种抗体（一抗）孵育，最后再在同一张膜上显色？
谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 13:05

QUOTE:

原帖由 woshituzhu 于 2013-9-22 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我打算最近做western检测细胞中p53的表达情况，手头有actin的内参，有两个基本问题请教一下：
1 p53的分子量53KD，actin的分子量42KD，请问能不能用一张胶来跑，多大浓度的胶合适？
2 能不能用将2种一抗加到同一张膜同时作用并一起 ...

1、53KD 和42KD的蛋白可以用同一块胶来跑，用12%的就可以。
2、我觉得可以将不同蛋白条带的膜剪下来，分别加一抗孵育，然后再一起用二抗、显色。不过如果将两个一抗加到一起来孵育，应该也可以，特异结合嘛！至于你说的后种方法，太浪费时间了。

作者: jujuba 时间: 2013-9-22 13:05

请问各位高手：

我已经做了几个月的WESTERN。条件：NOVAGEN的全蛋白裂解液，上样量30～50，BIORAD电泳仪，100V 1h10min湿转，4度一抗过夜，室温二抗1h，压片时间20min.。全部抗体均是CST的。ECL也是CST的。但最近一个月突然间一直做白板，连tubulin也孵不出来。怀疑液体出问题，已经将所有液体重新配过，蛋白也重新提取过了。但仍然什么都做不出来。偶尔做出一两次条带也特别不清晰。目的蛋白42kd和56kd。膜用立春红染色大分子有条带，小分子没有条带。
用相同的条件以前一直做的很好。已经快把我逼疯了。请各位高手帮忙分析一下可能的原因。感激不尽。

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:06

请教western基本问题：
我打算最近做western检测细胞中p53的表达情况，手头有actin的内参，有两个基本问题请教一下：
1 p53的分子量53KD，actin的分子量42KD，请问能不能用一张胶来跑，多大浓度的胶合适？
2 能不能用将2种一抗加到同一张膜同时作用并一起显色，或者能不能在同一张膜上先将一种抗体（一抗）孵育完成并冲洗后再接着用第二种抗体（一抗）孵育，最后再在同一张膜上显色？
谢谢！

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1 可以在一张胶上跑，12％的就可以。
2 将两种抗体按一定比例加到一起同时做（我们同时用几种抗体的混合液做都可以），这样不但可以节省时间，而且比较性直观，如果用你说的第二种方法在用第二个抗体检测时候可能会对第一个抗体的结合有影响，而且劳神费时。

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:06

请问各位高手：

我已经做了几个月的WESTERN。条件：NOVAGEN的全蛋白裂解液，上样量30～50，BIORAD电泳仪，100V 1h10min湿转，4度一抗过夜，室温二抗1h，压片时间20min.。全部抗体均是CST的。ECL也是CST的。但最近一个月突然间一直做白板，连tubulin也孵不出来。怀疑液体出问题，已经将所有液体重新配过，蛋白也重新提取过了。但仍然什么都做不出来。偶尔做出一两次条带也特别不清晰。目的蛋白42kd和56kd。膜用立春红染色大分子有条带，小分子没有条带。
用相同的条件以前一直做的很好。已经快把我逼疯了。请各位高手帮忙分析一下可能的原因。感激不尽。

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1 检测一下膜有没有问题，我前段时间就是膜出了问题，差点把我逼疯了。
2 你染块胶看一下电泳的蛋白分布情况，这样可以确定是不是电泳的问题。
3 你转膜缓冲液用的甲醇是多少的，如果是10％的你可以试一下加到20％，我以前做过一次，有的时候两个百分比浓度的甲醇效果差不多，有的时候相差很大。
4 湿转100V，60———80分钟就可以，我们就转70分钟。

祝你好运气！

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:07

我想问一下，我的目的蛋白大概是23KDa ，同时用了内参Actin （42KDa）。

在湿法转膜时的电压及转膜时间上你有什么建议呢？

还有就是在一抗孵育的时候，可不可以把目的蛋白的抗体和Actin的抗体混合在一起同时在膜上孵育呢？两者对应的二抗是一样的。

谢谢

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12％的胶100V，70分钟应该可以转的不错。
可以同时孵育（前提是两个一抗的种属来源相同），二抗要根据一抗来定，用抗一抗种属的酶标抗体。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-9-22 13:07

请问各位高手:

我第一次做WESTERN,以前从来都没有过接触，我要做AQP1及AQP2的WESTERN, 文献介绍这两种蛋白在细胞膜及细胞浆都有表达，那么我在做的时候对于这种既在浆又在膜有表达的蛋白实际操作方法是不是一样的？还有做WESTERN是不是非要知道蛋白的分子量才可以做？

希望可以尽快得到各位的答复，真的很急!!

作者: #甜# 时间: 2013-9-22 13:07

各位大侠，现在我也在做，出现了一些很是郁闷的问题：
我做的是TNFa，分子量约为17kd，用的是12%得分离胶，80v约25min,120v溴酚蓝跑出即停止，用了预染marker（天为时代的），转膜，NC膜，70mA1.5h，（因为膜的孔径是0.45得，所以只能将时间缩短，以前是2h），可以看到膜上有marker，丽春红染色，目的条带不清晰，封闭过夜，一抗（1：400），2h,二抗（1：7000），2h，ECL显影，发现有很多非特异性条带而且大多都大于目的条带，而目的条带若隐若现，不能肯定，不知该怎么办，很是郁闷。
望各位不吝赐教，感激不尽！

作者: 大白菜 时间: 2013-9-22 13:08

蛋白的分子量可以决定胶的浓度，跑胶的时间，以及转膜后目的条带的位置，所以一定是要知道的

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:09

各位大侠，现在我也在做，出现了一些很是郁闷的问题：
我做的是TNFa，分子量约为17kd，用的是12%得分离胶，80v约25min,120v溴酚蓝跑出即停止，用了预染marker（天为时代的），转膜，NC膜，70mA1.5h，（因为膜的孔径是0.45得，所以只能将时间缩短，以前是2h），可以看到膜上有marker，丽春红染色，目的条带不清晰，封闭过夜，一抗（1：400），2h,二抗（1：7000），2h，ECL显影，发现有很多非特异性条带而且大多都大于目的条带，而目的条带若隐若现，不能肯定，不知该怎么办，很是郁闷。
望各位不吝赐教，感激不尽！！！

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给你发了纸条，收到了吗？
刚才回去想了下，你的背景是整个背景都很深还是整个背景很干净，只是出现几个很明显的非特异条带？如果整个背景都黑就一定是二抗和一抗的稀释不够，如果是只有非特异条带可能是抗体特异性不强或者你的裂解液有非目的蛋白被抗体特异结合了。

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-22 13:09

请教高手:

我做过很多的WESTERN,最近做内参tubulin ,NC膜上的带总是不均匀，中间有空隙，我是把两种抗体混合在一起杂交的，而目的蛋白的带却很规则，找不到原因，请各位高手帮忙！
还有我做的VEGF,用的是Santa的抗体,说明书上只有一条带,我的结果好像至少两条带，哪位高手做过，请指教！很急,很急,多谢多谢!

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-22 13:10

请问高手：我想用血清和尿液样品做Western，但不知这两种样品是否可以和蛋白样品一样，先测蛋白浓度，再根据浓度上样；或者直接按一定比例稀释上样？另外，内参该用什么呢？谢谢！

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 13:11

我是做心肌组织EGR－1蛋白（核蛋白）的wb的，有很多问题想和你请教一下！
心肌组织比较致密，在提取的过程中有没有什么诀窍啊？谢谢

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:11

请教高手:

我做过很多的WESTERN,最近做内参tubulin ,NC膜上的带总是不均匀，中间有空隙，我是把两种抗体混合在一起杂交的，而目的蛋白的带却很规则，找不到原因，请各位高手帮忙！
还有我做的VEGF,用的是Santa的抗体,说明书上只有一条带,我的结果好像至少两条带，哪位高手做过，请指教！很急,很急,多谢多谢!

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是转膜的时候有气泡或者SDS泡沫吗？目的蛋白条带很规则不是很好的事情吗？
Santa做抗体还是比较牛的，应该不是抗体的原因，是不是你上样的蛋白里有聚合的现象啊，我以前做GST抗体，就有两个条带，是聚合我原因，你的也可能是这个原因吧，查一下你目的蛋白的性质，看是不是很容易聚合。

作者: zranqi_1 时间: 2013-9-22 13:12

谢谢你，我查阅了文献，VEGF有多种形式，可能是抗体的特异性不强吧.关于内参tubulin的带中间有空隙的问题,我感觉不是气泡,气泡都是很圆的空白点,而我的内参带中间并不是气泡,而只是颜色稍淡.带形稍宽。想不明白??

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:12

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2013-9-22 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你，我查阅了文献，VEGF有多种形式，可能是抗体的特异性不强吧.关于内参tubulin的带中间有空隙的问题,我感觉不是气泡,气泡都是很圆的空白点,而我的内参带中间并不是气泡,而只是颜色稍淡.带形稍宽。想不明白?? ...

你把胶在转移缓冲液里平衡时多用点平衡液，转膜的时候将胶好好在缓冲液里弄一下或者在烧杯壁上凛一下，让胶表面比较光滑（将膜拿起时缓冲液会均匀的分散在胶上，和洗玻璃器皿的要求差不多），用的膜也在器壁上弄一下，让表面比较光滑，把膜铺在胶上时感觉好像膜完全粘在胶上的感觉，用滚子轻轻来回赶一下，应该可以的。我明白你说的那种“气泡”，不是完全没有条带，是不是很清晰，好像不光滑的感觉，蛋白不均匀，我转的时候也经常遇见这种情况，一般情况下不影响结果判断，只是不美观而已，多注意点就可以了。

作者: qumm1985 时间: 2013-9-22 13:13

请问我的蛋白大小是40kd，半干转，恒流100ma，大概转膜时间是多少啊？
同学用同样的机器 70kd的蛋白大概要40min

作者: loli 时间: 2013-9-22 13:13

我最近做了一个western，转膜没有问题，marker都转上去了，我的目的蛋白是100KD和130KD左右。一抗和二抗实验室的人都用过了，别人都能做的出来。二抗我用的是HRP，但是ECL显色的时候我的片子就是一片空白，什么也没有。第二天我又拿同一张膜重新封闭，然后再加内参acrin的一抗，然后再加二抗HRP，ECL显色后又是空白，连actin也没有blot出来。显影液和定影液都没有问题。我想问的是，除了操作失误原因外，还可能有什么问题造成什么都没有呢？连内参actin都没有？我用的是12孔板细胞转染的外源质粒，如果细胞量很少的话，造成蛋白少，会不会影响western结果呢？造成做不出带来？或者还有什么其他方面的原因？望指教！

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-22 13:14

我从来没有做过核蛋白，想问一下做核蛋白的内参如何选择呢，我做的目的蛋白是PPARgamma，大小在55-65KD，多谢！

作者: yychen 时间: 2013-9-22 13:14

请帮我看看，我是细胞提蛋白后，12％SDS-PAGE,先100v再120v跑电泳，待蓝色到胶底后停下。半干转120mA 1h（40cm2的pvdf膜0.2um孔径），预染marker（11——170kda）已在膜上。曝光后同时做的70kda的条带非常清晰，actin也很明显，但是27kda一点都没有，请高手帮我分析分析什么原因。

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 13:14

高手啊高手，我做western，有两次都是加一抗，再加二抗，发光什么都没有，然后我TBS洗了下，再重复一样的一抗，二抗，就有清晰条带了，于是我想是不是一抗浓度太低了。我就增大一倍的一抗浓度，还是没有条带。那是不是一定要按做出来那样，重复加一抗二抗才行啊？会不会是后来加的一抗结合到开始加的二抗上，放大了一次，然后又加二抗又放大了一次，所以出来了啊？

还有我刚看你回答psyche111的问题，说两个一抗一起加一起做是没问题的，我有点担心诶，是不是真的行的啊？那是不是只要两个一抗各自的稀释倍数跟单独做的时候一样就行了呢？然后还要加二抗，二抗也是加不一样的，一个抗鼠，一个抗兔，那是不是也是两个一起加，各自的稀释倍数跟单独做的时候一样那样加就没问题呢？各自不会影响啊？

作者: windy+++ 时间: 2013-9-22 13:15

请问，我准备做western，可是目的蛋白只有9KD左右，拟用15％的分离胶，可以吧？溴芬蓝的分子量是否约是10KD？那么转膜时要用多大电流,多长时间就可以了？我是用湿法转移。谢谢

作者: 101010 时间: 2013-9-22 13:15

请教转膜电流及时间!
如果用湿转的话,大于100KD的蛋白要转多久,小于20KD的又要多久呢?谢谢!!!

作者: 冰儿0109 时间: 2013-9-22 13:16

请教高手:
我做过很多的WESTERN,最近做内参tubulin ,NC膜上的带总是不均匀，中间有空隙，我是把两种抗体混合在一起杂交的，而目的蛋白的带却很规则，找不到原因，请各位高手帮忙！
还有我做的VEGF,用的是Santa的抗体,说明书上只有一条带,我的结果好像至少两条带，哪位高手做过，请指教！很急,很急,多谢多谢!

我和你做的是一样的目的蛋白和内参，也和你出现同样的问题，我的tubulin也是不均匀，中间有空隙，一直没有找到原因。不知你买VEGF的货号，我买的说明书上也是一条带，但我查资料VEGF是一个异构体，而且N末端同源，所以我杂出的VEGF有四条带的现象，我认为这是正常且就应是多条带。请问楼上你的VEGF解聚容易吗？我怎么总解不完全？

作者: 莓菓333 时间: 2013-9-22 13:19

请教
在一抗孵育的时候一定要振荡吗？振荡的原理是什么？我在一抗孵育时为了省抗体就将抗体加到封口膜上然后将膜反扣到上面，有这样做过的战友吗？能介绍一下经验吗？另有没有其它的方法可以节省抗体？

作者: 987789 时间: 2013-9-22 13:19

高手你好！！
我前几天做了wb，分子量43kd，我上样量50 ug，电泳时电压先80V，mark分层后电压110V，一直让它跑到胶的最底，转膜电流200mA，3小时10分钟，然后牛奶封闭2小时，洗4*15分钟，一抗（1：1000）封闭过夜，洗4*15分钟，二抗封闭2小时，洗4*15分钟，曝光时看不到荧光带，底片什么都没有，然后用伊春红染色，可以看见很多蛋白条带，。不知道这些条带是不是我要的目的蛋白，我得问题大致出在那里？
我还一起作了个分子量20kd的蛋白，只把转膜时间改为1小时，其它不变，结果跟上面一样，什么都没有，，伊春红染色，可以也看见很多蛋白条带，不知怎么回事，很急啊。

作者: 987789 时间: 2013-9-22 13:20

忘记说我得胶是12％的，两种蛋白都是，我一起做的

作者: junjie05 时间: 2013-9-22 13:20

我检测的是55KD的蛋白，已经用细胞爬片的免疫组织化学证明了阳性表达（一抗稀释200倍），提取细胞总蛋白，跑完电泳考马斯亮蓝染显示蛋白提取不成问题，转印用的是湿转6mA,15小时，70的MARKER转的很清晰，55KD的MARKER有些淡，用5%的脱脂奶粉封闭2小时（TBST配置），一抗1：1000稀释室温孵育2小时，TBST洗三次，二抗1：1000室温孵育1小时，后显色，没有条带出现，您觉得我该在哪方面改进的

作者: ritou1985 时间: 2013-9-22 13:23

我有个问题想请教一下,
我现在一般是过夜转膜（湿转）,有没有可以1-2个小时转膜的方法,
如有的话,请教一下
transfer buffer 和转膜电流和电压
谢谢

作者: 079777chao 时间: 2013-9-22 13:24

最近在做免疫沉淀的实验。
我用的是兔血清先和细胞裂解液孵育－》
加入Protein A 孵育－》
离心，漂洗Protein A，在上样buffer中煮样－》
SDS－PAGE －》
western 检测目的蛋白是否被沉淀下来。

western检测时发现72KD以上一长条染色很深的带，如图中红框标出的（当然不是我的目的条带）。我想去掉这种背景，但想不出这是什么东西，特向有经验的前辈们请教。谢谢。

注：应该不是抗体的带，因为跑胶时DTT浓度为100mM，抗体应被还原成55，25KD两种带。

我的问题是，那条显色很深的带是蛋白么？

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作者: bring 时间: 2013-9-22 13:25

我有个问题想请教一下,
我现在一般是过夜转膜（湿转）,有没有可以1-2个小时转膜的方法,
如有的话,请教一下
transfer buffer 和转膜电流和电压
谢谢

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100V,60----90分钟就可以,没必要过夜.
Buffer可以用192mM甘氨酸,25mM TRIS,20%甲醇就可以了

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:26

请教
在一抗孵育的时候一定要振荡吗？振荡的原理是什么？我在一抗孵育时为了省抗体就将抗体加到封口膜上然后将膜反扣到上面，有这样做过的战友吗？能介绍一下经验吗？另有没有其它的方法可以节省抗体？

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不一定,振荡就是为了使抗体更充分的接触膜,你可以过10多分钟动一下膜也可以;
另外你可以用自封袋做,这样也可以;
要想省抗体最好用杂交槽,但是一般公司会用,科研比较少,因为杂交槽比较贵,成本比较大;
无论用什么方法,只要你保证膜和抗体有良好的接触就可以.

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:26

请问，我准备做western，可是目的蛋白只有9KD左右，拟用15％的分离胶，可以吧？溴芬蓝的分子量是否约是10KD？那么转膜时要用多大电流,多长时间就可以了？我是用湿法转移。谢谢

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溴酚蓝的分子量差不多是10个KD左右,不过小于20KD的蛋白很难跑,最好用跑小肽的胶跑,而且要用0.2u的膜才能吸附,我用0.45u膜10KD的外标marker很差,几乎看不清楚.

作者: mamamiya 时间: 2013-9-22 13:27

高手，请教一下：
我的目的蛋白30，50 KD，细胞裂解液电泳后胶考染有条带，半干转120MA（40CM2）2H，胶上仅剩118和85KD的MARKER条带，所有MARKER条带均可见于膜上，但以抗体孵育2小时后TBST洗15MIN*4次后显影5，15分钟无条带，阳性对照也没有，B-actin也没条带。膜是蛋白面朝上暴光的，胶片是糙面对膜的，事后膜再考染有蛋白条带。问题会出在哪？我已重复过N次，实验室里有人也在做，B-actin 是阳性，条带也有，只是不稳定。我的都是白板，弄不明白什么地方出了问题，很是郁闷。是否可在暗盒里压过夜？公用的暗室，胶片在暗盒里压着，再放抽屉里可以吗？

作者: wsll 时间: 2013-9-22 13:27

我是新手刚开始做western blot
想问问到底做western blot 需要特别注意的地方有哪些啊?
我看很多人对三明治结构中膜\滤纸\胶的大小说法都不一
请问到底是怎么样的大小顺序?
我现在在做actin练手马上就要做膜水通道蛋白的抗体检测
有没有哪些高手做过给我一些技术指导啊
谢谢

作者: cwcwcww 时间: 2013-9-22 13:27

请教一下，想用western blot检测His tag融合蛋白，在国内找什么公司买价廉物美啊？

作者: moonlight45 时间: 2013-9-22 13:28

我和你做的是一样的目的蛋白和内参，也和你出现同样的问题，我的tubulin也是不均匀，中间有空隙，一直没有找到原因。不知你买VEGF的货号，我买的说明书上也是一条带，但我查资料VEGF是一个异构体，而且N末端同源，所以我杂出的VEGF有四条带的现象，我认为这是正常且就应是多条带。请问楼上你的VEGF解聚容易吗？我怎么总解不完全？

我的货号是VEGF(C-1)SC-7269,我做的目前是三条带，不过，还好我要的约20KD的带最强.我采用的是简单的煮沸5分钟,效果还好.

作者: moonlight45 时间: 2013-9-22 13:28

我是新手刚开始做western blot
想问问到底做western blot 需要特别注意的地方有哪些啊?
我看很多人对三明治结构中膜\滤纸\胶的大小说法都不一
请问到底是怎么样的大小顺序?
我现在在做actin练手马上就要做膜水通道蛋白的抗体检测
有没有哪些高手做过给我一些技术指导啊
谢谢

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滤纸>膜>胶

作者: moonlight45 时间: 2013-9-22 13:29

把胶在转移缓冲液里平衡时多用点平衡液，转膜的时候将胶好好在缓冲液里弄一下或者在烧杯壁上凛一下，让胶表面比较光滑（将膜拿起时缓冲液会均匀的分散在胶上，和洗玻璃器皿的要求差不多），用的膜也在器壁上弄一下，让表面比较光滑，把膜铺在胶上时感觉好像膜完全粘在胶上的感觉，用滚子轻轻来回赶一下，应该可以的。我明白你说的那种“气泡”，不是完全没有条带，是不是很清晰，好像不光滑的感觉，蛋白不均匀，我转的时候也经常遇见这种情况，一般情况下不影响结果判断，只是不美观而已，多注意点就可以了。

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楼主，请帮帮忙,我今天做了我几年来最难看的WB,目标蛋白是207KD的蛋白，蛋白样品是新提取的。我用的是6%分离胶，5%浓缩胶，70V1小时后100V2小时。50V湿转印2小时，电泳过程溴酚蓝带很正常，Marker条带也比较直，碱性磷酸酶标记的二抗显色成了这个样子！！！NC膜上杂乱的条带是紫色的，应该是特异带，位置大约是70-80KD请帮我分析是什么原因?

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18653

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:32

我是新手刚开始做western blot
想问问到底做western blot 需要特别注意的地方有哪些啊?
我看很多人对三明治结构中膜\滤纸\胶的大小说法都不一
请问到底是怎么样的大小顺序?
我现在在做actin练手马上就要做膜水通道蛋白的抗体检测
有没有哪些高手做过给我一些技术指导啊
谢谢

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如果是湿转的话没有什么大小顺序，我用的是滤纸超大，膜和胶差不多大，没问题，转出来效果不错。

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:33

楼主，请帮帮忙,我今天做了我几年来最难看的WB,目标蛋白是207KD的蛋白，蛋白样品是新提取的。我用的是6%分离胶，5%浓缩胶，70V1小时后100V2小时。50V湿转印2小时，电泳过程溴酚蓝带很正常，Marker条带也比较直，碱性磷酸酶标记的二抗显色成了这个样子！！！NC膜上杂乱的条带是紫色的，应该是特异带，位置大约是70-80KD请帮我分析是什么原因?

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你发的图片看的不是很清楚，我没有做过这么大的蛋白，不过觉得你的胶浓度好像太小了，所以凝固的不是很好的感觉，我看图上的也不成条带啊，我觉得是你的胶浓度可能太小；
另外，你说电泳过程溴酚蓝很正常是什么意思？你指作为指示的溴酚蓝吗？溴酚蓝正常也不能说明你的蛋白就一定正常啊，建议你把胶对称跑，这样跑完电泳后一半用来考染，一半用来转膜，这样才能说明问题。
你说的MARKER条带很直是什么意思，是转膜后染的膜还是跑完电泳后染的胶？

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-22 13:33

高手你好！
我前几天做了wb，分子量43kd和20kd，我上样量50 ug，两种蛋白一起做，一种蛋白一块胶，都是12％的胶，电泳时电压先80V，mark分层后电压110V，一直让它跑到胶的最底，转膜电流200mA，20kd的一个小时，43kd的3小时10分钟，然后牛奶封闭2小时，洗4*15分钟，一抗（1：1000）封闭过夜，洗4*15分钟，二抗（1：6000）封闭2小时，洗4*15分钟，加ECL时看不到荧光带，底片爆3分，5分，20分，什么都没有，然后用伊春红染色，可以看见很多蛋白条带，。不知道这些条带是不是我要的目的蛋白，我得问题大致出在那里？
请高手指点迷津，谢谢！

作者: abc816 时间: 2013-9-22 13:34

你发的图片看的不是很清楚，我没有做过这么大的蛋白，不过觉得你的胶浓度好像太小了，所以凝固的不是很好的感觉，我看图上的也不成条带啊，我觉得是你的胶浓度可能太小；
另外，你说电泳过程溴酚蓝很正常是什么意思？你指作为指示的溴酚蓝吗？溴酚蓝正常也不能说明你的蛋白就一定正常啊，建议你把胶对称跑，这样跑完电泳后一半用来考染，一半用来转膜，这样才能说明问题。
你说的MARKER条带很直是什么意思，是转膜后染的膜还是跑完电泳后染的胶？

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我的确是对称跑了两块胶,一样的浓度，一起灌的胶,另外一块做的是另一个指标约80KD，虽然80KD目的带比较淡,但还是很规则的条带.一起灌的胶,凝固上不应该有很大的差别啊?我说电泳过程溴酚蓝很正常是指溴酚蓝条带很平滑,感觉胶应该没有大问题。我在另一块胶上的跑的预染MARKER条带很清晰很平滑。所以我真的很迷惑，如果是大分子量蛋白降解了可能造成这种现象吗?

作者: gogo 时间: 2013-9-22 13:35

我在做western，现在遇到了一个怪问题，就是加一抗4度过夜，第二天洗过之后加1：10000（1：20000：1：8000;1:15000也试过了）的二抗室温1小时和半小时都试过了，之后在洗20分钟，ECL染曝光，总是雾蒙蒙一片，更本看不见任何条带，之后用锡纸包好放入4度冰箱，又过一夜，第二天从锡纸中取出膜TBST洗了后，再加一次二抗1：10000一个小时，再曝光，就会曝出清晰的条带，很奇怪的现象，已经重复三次都这样，不知道为什么。

作者: TAT 时间: 2013-9-22 13:36

我和你做的是一样的目的蛋白和内参，也和你出现同样的问题，我的tubulin也是不均匀，中间有空隙，一直没有找到原因。不知你买VEGF的货号，我买的说明书上也是一条带，但我查资料VEGF是一个异构体，而且N末端同源，所以我杂出的VEGF有四条带的现象，我认为这是正常且就应是多条带。请问楼上你的VEGF解聚容易吗？我怎么总解不完全？

我的货号是VEGF(C-1)SC-7269,我做的目前是三条带，不过，还好我要的约20KD的带最强.我采用的是简单的煮沸5分钟,效果还好.

请问l，你的上样缓冲液配方是什么？可否写一下？我买的一个厂家的还原型上样缓冲液，做出来VEGF解聚的特别少。

作者: gogo 时间: 2013-9-22 13:36

请教为什么我膜加完一抗后曝光为一边雾状，用锡纸包好放入4度有过了一夜，再加二抗，等于加了两次二抗，就能爆出清晰的条呆，连续一直都是这个样子，二抗浓度1：8000；1：10000；1：20000均试过都不行，而且就是鼠抗这样，兔抗就能正常爆出，十分不解希望高人指点

作者: abc816 时间: 2013-9-22 13:37

QUOTE:

原帖由 TAT 于 2013-9-22 13:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我和你做的是一样的目的蛋白和内参，也和你出现同样的问题，我的tubulin也是不均匀，中间有空隙，一直没有找到原因。不知你买VEGF的货号，我买的说明书上也是一条带，但我查资料VEGF是一个异构体，而且N末端同源，所以我杂出的VEGF有 ...

我用的是华特生公司的5Xbuffer,18元/ml,不过上样比例是1:3.即30ul加10ul.
另外我想问你有没有做过VEGF的受体KDR(Flk -1).效果如何?我做的效果一直不好。找不到原因。

作者: 米西11米西 时间: 2013-9-22 13:37

NC膜有没有正反面．
还有一抗，二抗的稀释度要摸条件吗，还是按照实验步骤稀释

作者: bamboo16 时间: 2013-9-22 13:38

昨天我做western blot又出现了一个让我疑惑的问题
原来我转膜一直都是 40V 6个小时转完之后虽然预染的Marker带会比在胶上暗点但是基本还是跟胶上的颜色一样
但是这两次我转同样的条件
第一次发现Marker 丢失膜上没有预染Marker 但是胶上同样也没有残留的Marker条带了滤纸上也没有
第二次就是胶上没有残留的Marker 膜上条带颜色很浅而滤纸上似乎有Marker
所以想知道
1.不同膜的大小转同样的蛋白时它转的时间是不一样的?
2.电流的大小对蛋白转移的速度有什么样的影响吗?
3.电转槽中电转液的多少对电流有影响吗?是否会影响电转速度?
谢谢各路高手指导小菜鸟哈

作者: changlhsyo 时间: 2013-9-22 13:38

高手你好！！你抽点空，来给我指点下嘛！！1
我昨天又做了western blot，分子量43kd，12％的胶，电泳时电压先80V，mark分层后电压110V，一直让它跑到胶的最底，转膜电流200mA 3小时，然后脱脂牛奶封闭2小时，TBS－T洗10min*3次，一抗（1：1000 和 1：500）封闭过夜，洗10min*3次，二抗（1：5000）封闭2小时，洗10min*3次。加ECL时看不到荧光带，底片爆3分，5分，20分，什么都没有，然后用伊春红染色，可以看见很多蛋白条带，用DAB染色无条带。
1.这是不是说我得目的蛋白根本就没转到膜上？
2.我提蛋白时，目的蛋白没有提出来的可能性大不？
3.电泳和转膜的电压及时间，你觉得怎么调整下，我来试一试。
4.我师姐以前做出过，一抗二抗可能没问题，她跑了，所以，只好麻烦你，

作者: flyxx05 时间: 2013-9-22 13:38

老师您好:
如果目标蛋白的分子量是30 KD,一抗的分子量是20KD,那么,做Western blot ,最后条带应该出在30还是20.
出条带的位置是和目标蛋白的位置一致还是和一抗的位置一致.谢谢!

作者: nn255 时间: 2013-9-22 13:39

western 过程中出现很棘手的问题，不知如何解决：
用阳性和阴性细胞株摸条件能做出很好的结果，但改用临床标本使用相同的条件却发现目的条带很浅，背景很强，上样量由于蛋白浓度的限制无法进一步增加。
想请教各位高手如何解决，去掉背景，使条带显色稍强？用pbst多洗几次？加大tween20浓度？减少二抗浓度？还是？
多谢

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-22 13:39

我和你做的是一样的目的蛋白和内参，也和你出现同样的问题，我的tubulin也是不均匀，中间有空隙，一直没有找到原因。不知你买VEGF的货号，我买的说明书上也是一条带，但我查资料VEGF是一个异构体，而且N末端同源，所以我杂出的VEGF有四条带的现象，我认为这是正常且就应是多条带。请问楼上你的VEGF解聚容易吗？我怎么总解不完全？

我的货号是VEGF(C-1)SC-7269,我做的目前是三条带，不过，还好我要的约20KD的带最强.我采用的是简单的煮沸5分钟,效果还好.

你的上样缓冲液配方是什么？可否写一下？我买的一个厂家的还原型上样缓冲液，做出来VEGF解聚的特别少。

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我用的是华特生公司的5Xbuffer,18元/ml,不过上样比例是1:3.即30ul加10ul.
另外我想问你有没有做过VEGF的受体KDR(Flk -1).效果如何?我做的效果一直不好。找不到原因。

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我还没开始做VEGF受体，先把VEGF和内参做好再做它的受体，我们可以一起讨论啊！

作者: summerxx 时间: 2013-9-22 13:41

我很想问你一个问题，用福尔马林固定的标本，然后从中抽提的蛋白可不可以做WB，因为我以前做WB时都用的是从新鲜组织或细胞中抽提的蛋白，所以我不知道能不能用从固定过的标本中抽提的蛋白来做WB？还请大虾不吝赐教。

作者: KGZ564 时间: 2013-9-22 13:43

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-9-22 13:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我很想问你一个问题，用福尔马林固定的标本，然后从中抽提的蛋白可不可以做WB，因为我以前做WB时都用的是从新鲜组织或细胞中抽提的蛋白，所以我不知道能不能用从固定过的标本中抽提的蛋白来做WB？还请大虾不吝赐教。 ...

好象做WB的标本是不能用任何液体浸泡的,不然对蛋白都有破坏作用的.个人看法,仅供参考.

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:44

老师您好:
如果目标蛋白的分子量是30 KD,一抗的分子量是20KD,那么,做Western blot ,最后条带应该出在30还是20.
出条带的位置是和目标蛋白的位置一致还是和一抗的位置一致.谢谢!

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肯定是目标蛋白的位置了。
你的抗体是什么东西，怎么是20KD?

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:44

昨天我做western blot又出现了一个让我疑惑的问题
原来我转膜一直都是 40V 6个小时转完之后虽然预染的Marker带会比在胶上暗点但是基本还是跟胶上的颜色一样
但是这两次我转同样的条件
第一次发现Marker 丢失膜上没有预染Marker 但是胶上同样也没有残留的Marker条带了滤纸上也没有
第二次就是胶上没有残留的Marker 膜上条带颜色很浅而滤纸上似乎有Marker
所以想知道
1.不同膜的大小转同样的蛋白时它转的时间是不一样的?
2.电流的大小对蛋白转移的速度有什么样的影响吗?
3.电转槽中电转液的多少对电流有影响吗?是否会影响电转速度?
谢谢各路高手指导小菜鸟哈

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很可能是膜的问题（你前后使用的膜的孔径大小一样吗？），你看一下膜的背面（和滤纸挨着的面）有没有微弱的条带，如果有就是膜的结合能力有问题，我前段时间出现过两次这样的情况，可被弄惨了！
不同孔径（0.2；0.45u）的膜结合蛋白的能力当然有不同了，能截留的蛋白量也不同；
电流大小对转膜速度应该有影响，但是影响不是很大，个人认为只要能保证转移系统不能过热就可行；
电转槽中的电转液要没过三明治夹心，电转液的多少不同整个体系的电容不同，所以对电流也有影响，不过影响都不是很大，只要能没过三明治夹心就应该没问题

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:44

NC膜有没有正反面．
还有一抗，二抗的稀释度要摸条件吗，还是按照实验步骤稀释

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一抗二抗稀释度当然要摸条件了，因为每个实验室的器材和试验用品及溶液不同，所以灵敏度可能有差异，如果是要确定长时间的使用稀释度当然要摸一下条件，找到最适合自己的稀释梯度。

作者: PINK 时间: 2013-9-22 13:45

目前做实验出现的问题是: 我干预后的目的蛋白文献报道为23.8KD, 可我的结果是那个蛋白出现的同时, 空白族和对照组也出现分子量比较大的条带,而且变化不大, 不知什么原因, 请各位帮忙分析一下. 我用的是R&D公司的单克隆抗体.

作者: 2541 时间: 2013-9-22 13:45

高人，请教我的半干转条件：２００ＫＤ蛋白，用多少浓度的分离胶跑？大概怎么样的条件才能充分转膜啊？谢谢拉！

作者: bs4665 时间: 2013-9-22 13:46

请教，
我表达的是哺乳动物的生长激素，想做WB。如果不想自己制做一抗的话，能不能用公司出售的人生长激素一抗呢？
先谢谢啦

作者: Ao7 时间: 2013-9-22 13:47

我用的垂直电泳槽跑7.5％分离胶，running buffer PH8.3，电压150V.

但将胶固定上电泳槽后，倒入电泳液，发现电泳液会渗漏到外腔中，一会儿腔内外的电泳液面就平齐了，跑电泳时电压150V，电流只有10mA，40分钟后溴吩蓝到底，但marker根本就没有分开，上下约3.5cm长，但糊糊的一个长条带，加样蛋白也没有跑分开，据加样孔1/2远的地方模糊的一小条。

请问估计是怎么一回事，电泳液老是渗漏该怎么办？

谢谢！

作者: rxcc33 时间: 2013-9-22 13:47

仁兄，你不想想内腔的电泳液流到外面很明显就是你的胶板与电泳槽之间有缝隙才使得里面的液体流到外面的，由于电泳液的外溢，没有形成一个完整的的回路，怎么会跑开呢。
你要是想解决问题要么就是重新安装一下电泳槽，要不就是从外面吸电泳液加入到内腔中，进行电泳，你要时刻的看并加，不要让内腔中的液面变得太低。

作者: rxcc33 时间: 2013-9-22 13:47

象这种大分子量的蛋白电泳一般用浓度低的胶进行，多用7.5%，对于半干法我没有尝试做过，但是有一个原则你记得，就是浓度低的胶的转膜要不比浓度高的胶的转膜时间要短一些，因为胶的孔径大，容易转过去，但是一般我们用的膜都对蛋白有一定截流作用，尤其是PVDF膜，所以就算时间长一点也不会有太大的问题。

作者: rxcc33 时间: 2013-9-22 13:48

高手，知道你对WB很是有经验，所以很想请教你一个问题，你知道如何从PVDF膜上把蛋白洗脱下来吗，洗脱后的蛋白可以直接进行质谱的鉴定吗？
很是需要你的建议，非常感谢！

作者: rxcc33 时间: 2013-9-22 13:48

还有一个问题想请教一下，你说把一抗与二抗混合在一起让其两者结合后再与膜上的目的抗原结合这样可以吗？因为对于膜上不同的目的条带的抗体都可以混在一起让其进行孵育并结合，那让一抗与二抗混合再与膜上的抗原结合这样可行吗？
还有你有试过对胶不进行转膜，直接在胶上对其进行抗原抗体反应并进行显色，可行吗？因为实验需要，所以必须这样做。望能给与建议。

作者: ququer787 时间: 2013-9-22 13:49

请问一下，半干转和湿转的转膜缓冲液是否一样？因为做实验配到点儿问题，想问一下，查了一些资料觉得应该是一样的，但还是想确定一下！！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-22 13:49

请教：目的蛋白是15KD，用15％分离胶，再湿转350mA 1h，没有看到明显的蛋白条带，是不是转移时间太长了？

作者: kulee 时间: 2013-9-22 13:50

一个笨问题streptavidin/HRP有没有种属特异性

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-22 13:50

我想用western方法检测细胞胞浆内的磷酸化及非磷酸化p38，目前，我已经成功的检测了非磷酸化p38，但是却不能检测出磷酸化的p38。先简单描述一下我的实验步骤吧：
1.  每瓶细胞中加入100 ul细胞裂解液（北京碧云天公司）。5分钟后用细胞刮刮出，12000 rpm离心6分钟，取上清。
2.  BCA法测定蛋白含量，按4：1的比例加入5×上样缓冲液，煮沸5分钟，置4度冰箱保存（注：原来听别人说，蛋白煮沸变性后，可放于4度冰箱长期保存，但是一个星期后，为了保险起见，我把蛋白冻到了-20度）。
3.  上样量：100 ug/孔。
4.  电泳：60 v×40 min，待样品到达分离胶与浓缩胶的边缘后，电压120 v×2 h。
5.  转印过夜：40 mA×14 h。
6.  封闭液（用TBST配制的5％脱脂奶粉）封闭37度摇床×2 h
7.  一抗（1：200，Santa Cruze公司产小鼠抗大鼠p-p38）37度摇床孵育3 h。
8.  洗膜：TBST 10 min×2次，TBS 10 min×1次。
9.  二抗（1：2000，北京中杉公司产HRP标记的羊抗小鼠Ig-G）37度摇床孵育2 h。
10.  洗膜：同前。
11.  DAB（北京中杉公司）避光显色10 min。

我想请教的是：
1.  我测其他蛋白也是用的以上步骤，结果还行。与一般蛋白相比，磷酸化蛋白的检测有什么不同及注意事项呢？
2.  如果没有结果出来，我应该怎样优化我的实验步骤呢？
3.  磷酸化蛋白的提取及保存有没有什么特殊及注意事项呢？

期待答复。谢谢！

作者: 3N4G 时间: 2013-9-22 13:51

象这种大分子量的蛋白电泳一般用浓度低的胶进行，多用7.5%，对于半干法我没有尝试做过，但是有一个原则你记得，就是浓度低的胶的转膜要不比浓度高的胶的转膜时间要短一些，因为胶的孔径大，容易转过去，但是一般我们用的膜都对蛋白有一定截流作用，尤其是PVDF膜，所以就算时间长一点也不会有太大的问题。

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非常感谢！
如你所说，大分子量用低浓度胶跑，转膜的时间比不需要延长对吗？但是一般认为大分子蛋白转膜都需要延长时间才对啊．两种观点好象是相反的意思．哪一种才是正确的啊？期待答复，再次感谢！

作者: 锤子 时间: 2013-9-22 13:51

象这种大分子量的蛋白电泳一般用浓度低的胶进行，多用7.5%，对于半干法我没有尝试做过，但是有一个原则你记得，就是浓度低的胶的转膜要不比浓度高的胶的转膜时间要短一些，因为胶的孔径大，容易转过去，但是一般我们用的膜都对蛋白有一定截流作用，尤其是PVDF膜，所以就算时间长一点也不会有太大的问题。

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原来是这样，很有收获。我这几天做了ICAm－1的表达，分子量85－110KD，6％的胶，转膜90分钟，电流0.02A/cm2，转膜之后丽春红染色没有明显条带，胶用考马斯亮兰染色也没有东西。所以我现在想是不是转过了？是不是转膜时间再短点就行了？
还有，我要做分子量15－20KD的蛋白，是不是胶用12％就行了？转膜应该转多久呢？

作者: purrr 时间: 2013-9-22 13:52

你好，我有问题想请教，我要做大鼠胶原蛋白I 的Western blot，请问用多少浓度的分离胶合适？转膜的时间是比较长还是应该偏短？

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:52

高手，知道你对WB很是有经验，所以很想请教你一个问题，你知道如何从PVDF膜上把蛋白洗脱下来吗，洗脱后的蛋白可以直接进行质谱的鉴定吗？
很是需要你的建议，非常感谢！

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我也不知道怎么把蛋白洗脱下来，也想过，不过试了几次没成功，不过看过些资料，好像说PVDF膜上的蛋白不用洗脱下来就可以进行质谱分析，具体忘记了，过两天我给你看看。

作者: bring 时间: 2013-9-22 13:53

还有一个问题想请教一下，你说把一抗与二抗混合在一起让其两者结合后再与膜上的目的抗原结合这样可以吗？因为对于膜上不同的目的条带的抗体都可以混在一起让其进行孵育并结合，那让一抗与二抗混合再与膜上的抗原结合这样可行吗？
还有你有试过对胶不进行转膜，直接在胶上对其进行抗原抗体反应并进行显色，可行吗？因为实验需要，所以必须这样做。望能给与建议。

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可以，先把一抗和二抗混合（同时加一抗和二抗）的试验我做过，可以出结果，不过背景比较深，而且一抗二抗的比例很重要，很浪费二抗，这样的策略对一些时间要求比较紧，结果只用来定性的重复性检测可以用（摸索出一个稀释度重复使用，整个实验节约时间），对于科研试验或者尝试性试验就不太好，对结果判断有影响。（个人观点）

直接在胶上的试验我们试验室的一个同事做过（他只做了一次），没出结果，不过我看过的资料里说也能出结果，但是要对胶进行封闭，因为我现在所在的是公司，而我负责的是生产，所以没机会尝试各种想法的试验，很是郁闷的事情，如果你能帮我介绍个可以尝试想法的地方可以一起研究一下。呵呵

作者: 831226 时间: 2013-9-22 13:53

请问WB转印时PVDF膜用甲醇活化多久啊？另外转完后将膜烘干，下次用的时候是否也需将膜用甲醇处理，处理多久？谢谢。

作者: 831226 时间: 2013-9-22 14:43

这两天做Western blot，蛋白分子量43kd，我用12％的分离较，5％的积成胶，上样量50ug，用5*loading buffer，恒压先80V,marker分层后110V，一直跑到底，转膜用恒流200mA，3h，脱脂牛奶封闭过夜，一抗（1：300；500；600；1000）都试过，室温摇床2h，二抗（HRP）（1：6000；7000；8000）都试过，室温摇床2h，洗都是TBS－T 15min*3，ECL时没有荧光，曝光什么都没，然后用DAB显色也是没有条带，但用丽春红染有明显条带。
请教各位： 1.我的试验过程及条件是否合适，那里需要改进？
2.我的胶跑的自认为还行，没有歪，marker的条带分的很清楚，不知到这样算不算跑胶没问题；
3.丽春红染有条带，DAB无条带，是不是我的目的蛋白没转上，或者转过了？我的首要问题是想知道我的膜上有没有我得目的蛋白，怎么可以知道啊？或者我提蛋白是没有把目的蛋白提出来？
4.会不会是一抗与目的蛋白结合的问题，或者是一抗跟二抗结合的问题，怎么排除？
5.我很菜，做了好几次都没结果，好难过，我一个人在黑暗中摸索，不知道问题出在那里，不知道该怎么尝试，郁闷，希望得到各位的帮助，给点意见，谢谢啊！

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-22 14:43

请问大侠:我每次做到ECL这一步老出问题，不是条带一团黑，就是不出条带，不知是什么原因。我用的是PIERCE公司的持久型低飞克级的化学发光底物，可每次发光都不能持续几分钟。急求赐教！

作者: 68943512yao 时间: 2013-9-22 14:43

你好：我最近作了两次western，碰到一个问题：5%的牛奶的pbs封闭后，用PBS（tween－20 0.05％）洗脱三次后，发现原来黏附在PVDF膜上的牛奶全部从膜上脱落下来，就好像粉刷的涂料从从墙体剥离一样。我问了几个人，他们都说没有碰到这样情况，请问高手，这是啥原因？另外PVDF膜用前处理，用纯甲醇需浸泡多长时间？（又说10s，又说10min的）

作者: eric930 时间: 2013-9-22 14:44

你好，我做western目的蛋白出来了，很清楚，但因为是要看表达变化，所以又洗膜孵管家基因的抗体，但是tubulin和GAPDH效果都不好，变化趋势和目的蛋白是一致的，所以我就说不清是蛋白定量上样的差异还是本身组织表达的差异。请教，我已经很注意定量和上样的过程了，混匀什么的每一步也都做了，可能问题出在哪里？会是蛋白裂解液的问题吗？会是研磨过程放在研钵里造成污染吗？如果我先做管家基因，再根据扫图的结果调整上样量，这样行吗？会不会反而造成人为的上样误差？可不可能管家基因也有变化呢？我用的是食管组织，蛋白裂解液配方：Tris-HCL,SDS,EDTA.

作者: qumm1985 时间: 2013-9-22 14:44

请教大侠：我的目的蛋白分子量为6.2KD和5.6KD，我先做Tricine-SDS-PAGE电泳，16％的分离胶（没有加尿素），我转膜后发现我的两个蛋白被Tricine上样缓冲液中的溴酚蓝遮盖了，DAB显色看不见，不知如何处理，请指教！！

作者: 吴才子 时间: 2013-9-22 14:50

谢谢各位的精彩回帖。小弟有了很大的受益！！！！
这两天做Western blot，蛋白分子量43kd，我用12％的分离较，5％的积成胶，上样量50ug，用5*loading buffer，恒压先80V,marker分层后110V，一直跑到底，转膜用恒流200mA，3h，脱脂牛奶封闭过夜，一抗（1：300；500；600；1000）都试过，室温摇床2h，二抗（HRP）（1：6000；7000；8000）都试过，室温摇床2h，洗都是TBS－T 15min*3，ECL时没有荧光，曝光什么都没，然后用DAB显色也是没有条带，但用丽春红染有明显条带。
请教各位： 1.我的试验过程及条件是否合适，那里需要改进？
2.我的胶跑的自认为还行，没有歪，marker的条带分的很清楚，不知到这样算不算跑胶没问题；
3.丽春红染有条带，DAB无条带，是不是我的目的蛋白没转上，或者转过了？我的首要问题是想知道我的膜上有没有我得目的蛋白，怎么可以知道啊？或者我提蛋白是没有把目的蛋白提出来？
4.会不会是一抗与目的蛋白结合的问题，或者是一抗跟二抗结合的问题，怎么排除？
5.我很菜，做了好几次都没结果，好难过，我一个人在黑暗中摸索，不知道问题出在那里，不知道该怎么尝试，郁闷，希望得到各位的帮助，给点意见，谢谢啊！！！！

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仅供参考：
1.转膜时放2张膜，看看是不是第一张膜过转了，转完后染胶，看是否转膜不完全
2.抗体孵育完洗膜时，TBST 10min*2，TBS 10min*1
3.二抗建议稀释浓度为：1：10000，1：20000，1：40000

作者: 莓菓333 时间: 2013-9-22 14:51

对于大分量的蛋白，转膜的时间是要对一些，我已经尝试过了没有问题，至于你说的问题，也是对的只是出发点不同，在十年以前，对于大分子量的蛋白不宜转到膜上，应为当时做印迹大多用的是NC膜，因由于这种膜对蛋白的吸附不好，所以通过增加时间或是其他的方法来完成。而现在PVDF末的广泛使用使得这一问题得到完全的解决，因为它对蛋白有特异性吸附，所以很容易到膜上，我们实验室以前有人试过用抽滤都可以把蛋白固定到膜上，所以时间不用很长也可以是蛋白转到膜上，但是你要是不放心可以多转一会，如果你不急的话。这是和膜的性质有关系，不要来问我为什么，其实我也不知道，一般我都是转恒流200mA，1.5h.

作者: 莓菓333 时间: 2013-9-22 14:53

你说用丽春红染色没有，转过的胶也没有染色，可能是转过了，因为我用7.5%的胶时，才和你的条件一样，如果是6%的胶我可能会选择1小时。不过你可以继续做一下看有没有，有时候丽春红染色后用水不断的漂洗太久也会看不到条带的，而且染的时间太短也会看不出来的。
你说要鉴定小分子量的蛋白，我觉得你做好用15%的胶，因为你的分子量太小了，用的浓度要高一些，否则会跑出去的。

作者: 莓菓333 时间: 2013-9-22 14:54

从膜上脱落下来的是牛奶中蛋白变性而聚合形成的，可能应为孵育的时温度太低或是时间太长了，不影响的，我以前封闭后洗膜也出现过这种情况，后来的结果作的很好，背景很低的。至于原因我是根据经验推断的，也不是很准确，可是有一点可以确定，你这种情况的出现对后续的工作是没有影响的。还有我建议你在封闭后不要再用PBS洗三次了，直接在PBS中漂洗就好了。这样可以减少封闭的馍上蛋白的损失，使得本地降低。

作者: 莓菓333 时间: 2013-9-22 14:55

到底是高手，连这么偏的问题都能让你回答出来，而且你都试过，看来你的经验的确是很丰富呀，既然大家的问题这么多，而你又都可以给与帮助，干吗不多会几次贴呀，让我们也对学习一下嘛

作者: bongte 时间: 2013-9-22 14:56

相关疾病：
浆细胞白血病
我也在做WB,遇到很多问题,我做的是白血病细胞系细胞.目的蛋白是IL-3,15KD.取3X106细胞,EP管中加入80ul细胞裂解液,加对应量PMSF.在裂解细胞时剧烈摇匀,浓缩胶5%,65V50min,分离胶100V2.5 h.转膜80V,2小时,预染marker能全部转过去.β-actin一抗是单抗,IGM的,IL-3也是单抗,IGG的.膜分开一抗孵育.DAB显色。预染蛋白MARKER分子量为75、58、38、20、13。结果β-actin条带在58和38之间(离58更近些)及平行于38偏低位置各有一条带，亮度也弱。一抗１：７５０（说明书上１：１０００）,二抗1:1000(1:1000-1:3000)而IL-3在20和13之间没有条带。我把一抗1:500,二抗1:500稀释,竟然出现四条带.在上两条带下分别出现,但是比上两条带细,其中一条似乎是我想要的.我的裂解液是否有问题？1XPBS 80ml
Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1XPBS缓冲液至 100ml。为什麽β-actin出了两条带，位置不对,亮度也不高,而1:500稀释后出现四条带,好象其中一条是我想要的.单抗怎麽会出现这种情况呢?IL-3为什麽不出结果？哪里需要改进？焦急等待指点。

作者: plaa 时间: 2013-9-22 14:57

转膜后剩余的胶为何用考马斯染色，是除去什么偏差？

作者: bring 时间: 2013-9-22 14:58

到底是高手，连这么偏的问题都能让你回答出来，而且你都试过，看来你的经验的确是很丰富呀，既然大家的问题这么多，而你又都可以给与帮助，干吗不多会几次贴呀，让我们也对学习一下嘛

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大家共同学习！
我不是不想和大家交流，是我现在没有条件，没办法上网，也没机会做更多想做的实验。

作者: 阿k 时间: 2013-9-22 14:58

超强帖！顶一下。感谢各位大虾的技术指导
我最近也在做western，出了点问题，请教两个问题：
1.我做了几次结果，目的条带出来了，但是比较弥散（条带太宽），采图不漂亮，什么原因？
自己分析：1.蛋白是从组织中提取的（一起做的师兄，从细胞提取的蛋白，条带很漂亮）2.电泳，或是转膜没控制好.
2.ECL老是没法显示，只能加用DAB显，为什么？
ECL加了以后肉眼直接能看出荧光吗，还是必须胶片曝光后才能显示。ECL不能显示与二抗浓度关系大吗？二抗1：5000和1：10000都用过了（ECL试剂没有失效，公司来检测过了）

请各位大虾分析一下，谢谢！

作者: ii077345 时间: 2013-9-22 14:59

我所纯化的蛋白为未知蛋白，目前仅知其具有甘露糖结合的活性和分子量，想用WB的方法鉴定纯化出的蛋白是否具有结合甘露糖的能力。在实验的过程中一直得不到理想的结果，有两个问题请各位高手指教：
1、不知在SDS-PAGE和WB的条件下，蛋白的糖结合活性是否可得以保存
2、因为蛋白是未知的，所以没有抗体可用，我们用一种带有甘露糖基的BSA来代替抗体，并用10nm胶体金与之耦联作为显色之用。10nm胶体金之前一直用于电镜观察，不知可否用于WB的显色。请各位给些建议。

作者: 麦丽素1986 时间: 2013-9-22 14:59

请问一下，分子量是36和66的蛋白转膜时间和转膜条件多少比较好啊！还有一抗和二抗的浓度太高是不是还难出结果啊？？？是没有显示结果还是杂带增多啊？？一般浓度梯度怎么摸啊？一抗和二抗之间的浓度关系怎么确定啊？？谢谢！！

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 15:00

以下实验我没有做过，只是从实验书上看到的，希望能对你有所帮助。（资料来源：《蛋白质印迹手册》，MILLIPORE）

Immobilon PVDF转印膜质谱

MS是鉴定印迹膜上蛋白质的相对较新的方法，它包括首先用MS兼容染料染PVDF膜（可以使用考马，酰胺黑或者Pypro燃料），然后从膜上切下目标区带，并进行膜上蛋白水解和肽抽提，随后进行MS分析（Gharahdaghietal.,1996;Bienvenut,etal.,1999;Bunaietal.,2003）。
另外一种可以考虑的方法是直接从印迹膜进行蛋白质质谱分析，这种方法通常用于2-D胶分离的蛋白质，通过平行操作，凝胶上所有蛋白质同时进行消化水解，并电转移到Immobilon PVDF转印膜上，然后进行质谱扫描分析消化产生的肽（Binzetal.,1999;Bienvenutetal.,1999;Bienvenutetal.,2003）。另外，在一种称为“化学打印”的方法种（Wallaceetal.,2001;Gooleyetal.,1998），二维分离的蛋白质首先被转移到膜上并显示，然后用分散的少量胰酶直接在点上消化（Sloanceetal.,2002）。两种方法中都要将基质喷到膜上并直接用MALDI-TOF质谱扫描，最后用肽指纹图谱来鉴定蛋白质。

蛋白质消化方法
用于质谱的膜上蛋白质消化方法
在用这种方法描述进行质谱分析前，准备用Immobilon PVDF转印膜固定的蛋白质。
仪器和溶液
Mili-Q水溶解的50％甲醇
30％乙月青/50mM碳酸氢铵
胰蛋白酶，以0.1mg/ml溶于水
溶于Mili-Q水的80％乙月青
真空离心机
微离心管
MALDI-TOF基质

操作
1.将蛋白质从凝胶转移到膜上。
2.用考马或酰胺黑染色印迹膜。
3.用水漂洗染色后的膜并干燥。
4.用清洁的镊子切下含有目标蛋白的膜片并分别放置到微离心管中。
5.用500ul50％甲醇室温脱色膜片2小时。
6.吸弃上清，干燥膜片。
7.加入10ul30％乙月青，50mM碳酸氢铵和4ul0.1mg/ml胰蛋白酶。
8.室温反应过夜。
9.转移上清到洁净微离心管中。
10.加入20ul80％乙月青超声处理15分钟以抽提消化的肽产物。
11.与前面的上清一起合并抽提液。
12.在真空离心机中干燥消化产物。
注：此外，可用Millipore Ziptip微量移液吸头纯化并浓缩肽消化产物，它可以代替干燥方法。用这种方法时候，加入0.5％三氟乙酸（确保PH小于3）酸化消化产物，然后按照ZipTip移液器头用户指南的说明进行操作（Millipore Lit.No.P36444）。
13.用少量30％乙月青/0.1%三氟乙酸重悬每种肽抽提产物.
14.加1--2ul消化液到挖的到一MALDI盘子之上,并且与1ul基质混合。

作者: 00无名指00 时间: 2013-9-22 15:02

遇到牛人，请问你蛋白样品煮与不煮有什么区别吗？我有个样品就是煮了监测不到信号，不煮反而有信号，这是怎么回事呢？

作者: hyuu 时间: 2013-9-22 15:05

我做的是室温封闭过夜，一抗一小时，二抗一小时，显色至出现条带为止终止ＯＫ

作者: vvmmoy 时间: 2013-9-22 15:05

我的预染蛋白Marker分子量：6.5; 16.5; 25; 32.5; 47.5; 62; 83; 175;
在胶上跑电泳时可以清楚的看见8条带，但转到PVDF膜上时就只有三条带了，它们分别是：16.5; 25; 62 .175（这个条带还没有转到膜上，可能是转膜时间太短）。中间条带不知去哪里了，真是奇怪！
1：我的仪器是：Bio-rad
2：湿转条件：45V；3小时
3：湿转电泳缓冲液：Tris :3.035g; 甘氨酸14.415g ;甲醇150ml然后加双蒸水至1000ml
4：PVDF膜处理：甲醇泡10秒；在双蒸水中泡5分钟然后在湿转电泳缓冲液泡10分钟。
5：凝胶用湿转电泳缓冲液浸润15分钟
不知是什么原因会这样，请牛人帮我分析一下，先谢过了！

作者: skytree 时间: 2013-9-22 15:07

请问:为什么我的蛋白带跑出来有的宽有的窄呢?就是几条泳道是宽的另外的又很窄?还有其中一条带出现"微笑"的表现了~~谢谢

作者: yysr238 时间: 2013-9-22 15:11

由于二抗浓度不够而导致ECL法失败。请问我能否把膜随便洗洗再接着用新配的二抗继续孵育？

作者: mamamiya 时间: 2013-9-22 15:12

谁知道哪里有21-羟化酶抗体吗？

作者: 966735obeng 时间: 2013-9-22 15:12

请教140KD的蛋白转膜时所需的电流及时间，用湿转，顺便请教一个弱弱的问题，干转和湿转转出来有什么区别呢？能否说下干转是否需要什么特殊的装置呢？先谢谢各位了！

作者: 8s5g 时间: 2013-9-22 15:14

我作91KD的蛋白，只出来过一次，以后就再也没出来过，之前别人用同样的系统也作出过这个蛋白，问题到底出在哪里呢？
1、三去污裂解液裂解细胞，超声6秒，12000g 10分钟离心取上清，获得蛋白
2、10%的分离胶，上样量30微克，biorad 系统，80V，25分钟；120V，1H，
3、350MA恒流湿转1H，预染MARKER很清晰的转到了膜上，不放心，又用立春红染膜，也有蛋白条带
4、5%脱脂牛奶封闭1H，1：500稀释一抗4度孵育过夜；
5、TBST洗膜15min/次*3次
6、1 ：3000稀释二抗，室温孵育1H，洗膜如上
7、显影：DAB和化学发光都用过，可是没有条带！
后来把抗体洗掉孵B-ACTIN ,条带清晰~~
到底为什么，急死了~~

作者: any333 时间: 2013-9-22 15:14

我做大鼠的肺的wb,但取出的肺组织有血,这对实验有影响吗?怎样才能减少肺组织中的血呢?

作者: yes4 时间: 2013-9-22 15:15

请问一下有谁用过PIERCE的unblot系列的试剂盒。
cuturl('http://www.piercenet.com/Objects/View.cfm?type=ProductFamily&ID=01041115')
他的方法可行吗，效果怎么样，欢迎大家交流不转膜的Weatern。谢谢。

作者: ROSE李 时间: 2013-9-22 15:16

我想请教一下关于制备抗体的问题
我用电洗脱的方法得到蛋白，准备去免疫兔子，蛋白大约130KDa。我想请教一下需不需要加免疫佐剂

作者: tangxin_80 时间: 2013-9-22 15:18

我是做western的新手，有很多问题要向大家请教。
我做的是个200kd 的蛋白，6%的胶，跑胶时间约1个半小时（溴酚兰跑出来就停了）80v/120v。转膜2个小时260mA。丽春红染色有条带。牛奶封闭1个小时（室温），TBST洗三遍（有人说不能洗？）一抗1：1000，4度过夜。2抗1：10000 1个半小时。
ECL显色，结果总是出现和立春红染出来的条带一样的片子，且没有目的条带！急死了！不知道问题出在哪里，盼指教！！！（一抗应该没有问题，别人试过的）

作者: guagua 时间: 2013-9-22 15:18

请问大侠
我准备做wb，所以要先制备抗体，我已基本敲定用pet32a载体，氨基酸272aa
接下来的问题是
1。我是用原核表达系统表达全长（272个并不是很长所以）呢，还是推测抗原决定簇
筛选一段，我已经预测过了，都是十几二十几个aa断断续续，如果那样我是不是还要想办法把
一二个连起来表达
2。我的基因有二个同工酶基因，但别人已经做过试验他们没有cross immuno reaction，所以应该不用避开保守结构峪去设计引物把
3。另外弱弱的问去免疫兔子之类的是用含有融合标签的目的蛋白吧，需要切掉标签马而且
pet32后面那个标签如果表达好像就没什么方法切掉了，前面那个倒是可以切
问题比较复杂，还忘不吝赐教，谢谢

作者: dragonkilly 时间: 2013-9-22 15:23

您好！我检测的是肿瘤细胞中的膜受体，使用的是RIPA裂解细胞，说明书说蛋白是55KD大小，但是我作了几次都是50KD左右大小，是在处理样品时把蛋白断裂了吗？要是这样该这么处理样品啊？我的上样液使用的是含beta－巯基乙醇的，是否要换成含DTT的上样液那？
图中的Marker 红色的是70KD，另外那个是55KD。
急盼指导！
谢谢！

[ 本帖最后由 dragonkilly 于 2013-9-22 15:25 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18654

作者: kuaizige 时间: 2013-9-22 15:25

有WB问题请教，我做iNOS 就是NO的合酶
像合酶这样的蛋白细胞裂解液是否有特殊要求？？
分子量130KD 湿转用什么条件好？？
盼望回复

作者: greenbee 时间: 2013-9-22 15:26

老师您好，我在实验开始时未注意用考马斯亮兰染色时有R250和G250两种，R250用冰乙酸配，而G250用磷酸配，结果我用磷酸配了R250，请问还可以用马？会不会造成不良后果？谢谢！

作者: 04906 时间: 2013-9-22 15:27

请问我做的是蛋白差异表达，但是现在做出来的结果是感觉不同组织的差异不是很大，可能是目的蛋白都显得深了，请问能有什么方法使目的蛋白显出来但又不是很深？
我自己想，一抗二抗的浓度和时间有没有关系？还是一抗的关系不大，而二抗的关系大？曝光的时间应该有关系，还有就是是不是加样量大一点差异会明显一点？
请问高手能否做较为系统的阐述？谢谢！

作者: u234 时间: 2013-9-22 15:28

我的蛋白具体在胞内的位置不知。我用的是强的RIPA，胞膜胞浆胞核蛋白都可以裂解到，我想如果是蛋白转位，会不会用这种的蛋白裂解液表达量是没有变化的？我的基因预计是癌基因或抑癌基因，有什么关系吗？

作者: 白白的 时间: 2013-9-22 15:28

我做WB已数月，连内参β－actin都没做清楚，郁闷至极！！
我做的是昆明小白鼠输卵管的WB，用RIPA抽提，4条输卵管加120ul裂解液。每次上样为15ul 浓度为6ug/ul ，5mm厚上样孔，电泳转膜没问题，含5％脱脂奶粉的TBST中封闭过夜。santa cruz一抗，碧云天二抗，还试过sigma、北京博奥森一抗，santa cruz二抗，结果都大同小异。显色剂是pierce的化学发光试剂盒，还试过santa cruz试剂盒，显影定影使用自动洗片机（其他人做结果都很好），一抗现在已经稀释到100万倍！二抗8000倍，均孵育1h，洗膜4次，1h，压片时间十秒以上就可见背景，每次只做内参都出现两到三条带，郁闷！！！，请教你有用过如此高的稀释倍数吗？
后来上样量改为5ul（同样浓度）sigma的一抗1：20万，二抗碧云天1：5000，终于只出现一条带，但是同一次转的膜第二天又没结果了（封闭液中4度保存），原来也经常这样，一次能出来一次出不来的，郁闷死了。
请问楼主有没用到如此高的稀释倍数，我该如何优化，还有为什么结果这么不稳定，一会有结果，一会没有。我在南方，室温约十到十五度，不知天气是否有影响。
不好意思，讲得有点乱，希望能够赐教，小妹在此谢谢了

作者: junhun 时间: 2013-9-22 15:30

原来的蛋白上样量太高了，20-30ug总蛋白足够了，至少对检测actin如此。

“同一次转的膜第二天又没结果了（封闭液中4度保存），”封闭液中有否加叠氮钠？没加的话抗原可能会被降解。

作者: 969 时间: 2013-9-22 15:31

原来的蛋白上样量太高了，20-30ug总蛋白足够了，至少对检测actin如此。
“同一次转的膜第二天又没结果了（封闭液中4度保存），”封闭液中有否加叠氮钠？没加的话抗原可能会被降解。

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谢谢，没有加的。那请问该如何保存转膜后的膜比较好？

作者: pencil菲 时间: 2013-9-22 15:33

根据Millipore的《蛋白质印迹手册》（建议大家找Millipore公司要这本手册，讲解很详细，中英文版的都有）上讲：将转印好的膜干燥后，用滤纸夹住，密封在塑料袋中，4度可保存2周，-20度可保存2月，-70度可保存更长时间。

我试过干燥的膜在4度保存3周没有问题。我用的是PVDF膜（没试过NC膜），再次使用时要用甲醇浸润。

作者: guagua 时间: 2013-9-22 15:34

我最近做ＷＢ，ＥＣＬ显完底片一片空白，连本底都没有，非常干净、，是一抗比例不对还是ＥＣＬ试剂有问题？蛋白提取应该没啥问题，因为考染有条带，请高手来分析一下，本人将不胜感激．

作者: 68943512yao 时间: 2013-9-22 15:35

楼主,,您好,,我最近做wB碰到了大问题了, 这几天我显影就是什么都没有,,但是我转膜后立春红染色条带比较好啊,,我的蛋白是膜蛋白名字是缝隙连接-43蛋白,我需要检测的是包括膜上有功能的和降解回到细胞浆和未成熟尚未到胞膜上的蛋白,所以我只能选择总蛋白提取试剂盒,,,情况就是我前面碰到的, 是不是膜蛋白用RIPA裂解液不好呀/?我的电泳是60/130伏特转膜0,4安培50分钟,然后封闭过夜,一抗室温度4小时. 2抗室温90分钟, 显影了就是膜上什么都看不到真白啊........
我做动物实验的时候做出来这个指标,怎么到细胞实验里就做不出来了呢? 我养的是血管平滑肌细胞,一个六孔板加60微升的裂解液, 用的是4*上样缓冲液,PVDF膜甲醇竟泡5分钟,转磨液内放10分钟. 请各位厉害的哥哥姐姐来看下啊请各位给我好的意见我马上就毕业的人了快救我啊

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-22 15:35

RIPA足以裂解细胞，溶解各个组分的蛋白。
膜蛋白往往会有些特别的性质，你可以检查一下蛋白的等电点，如果和所用的Transfer buffer的pH接近，就要换其他的buffer。还有，尝试上样前，不要在沸水浴中煮样品，而是直接上样，或者60-70度煮样品。

作者: yhz1973 时间: 2013-9-22 15:36

我是测处理前后细胞MMP-2蛋白表达变化，准备用WB来检测。但不知道是直接裂解细胞后获得蛋白来做呢，还是用无血清培养基培养细胞后取培养液来做？如果是后者，这个培养液上样前应该怎么处理呢？需不需要加热变性呢？请这方面的高手指点

作者: 987789 时间: 2013-9-22 15:36

除非是要检测分泌性蛋白，取培养液电泳，否则，都是取全细胞裂解物或细胞组分裂解物电泳。

样品处理，一般都要沸水浴变性，打开二硫键；但有的蛋白性质特殊，比如有些膜蛋白，加热后会破坏蛋白结构，就用60-70度变性，或不加热变性，直接上样电泳。

作者: bluelake 时间: 2013-9-22 15:37

楼主你好！本人有几个WESTERN的问题想得到您的帮助，请不吝赐教。

1、我的目的蛋白是250KD的在细胞浆中表达的蛋白质，由于蛋白的分子量比较大，不知道在裂解细胞的时候需要注意什么问题？请您推荐一种合适的裂解液，还有蛋白酶抑制剂用什么？裂解液和蛋白酶抑制剂用量多少？我用6孔板做转染。

2、在上样时候，我每个孔最多能上30UL的量，其实蛋白液的量也就是15UL了，我想知道怎样才能使上样的量加大一些？

3、看了帖子有人说这么大的蛋白质要用梯度胶跑，有必要么？我用的是4％－8％的胶。

4、最重要的问题：转膜的条件？半干转 OR 湿转？用多大的电压和电流？转多长时间？转膜BUFFER有特殊要求么？看了帖子说加大SDS量而减少甲醇的量（科室没有半干转膜系统，请问一套要多少钱？）。

5、由于我的蛋白没有特异性的抗体，只能用病人的血清作为一抗，那么此时一抗的稀释比例要多少呢？

以上是我的几个问题，希望您能够解答，谢谢！

作者: wu11998866 时间: 2013-9-22 15:38

请问用NaF做磷酸化的蛋白酶抑制剂，配制时浓度是多少？加多少量合适？我做的是脑，从来没用过这个，请给予指点！

作者: 04906 时间: 2013-9-22 15:39

NaF，工作浓度1mM，母液500mM，溶于水。
Na3VO4，工作浓度1mM，母液500mM。

作者: is2011 时间: 2013-9-22 15:40

请指教一下,
我做的心肌组织蛋白,共做了两张膜,除了一抗不一样外,其余条件完全一样(一个是actin,一个是troponin),结果很奇怪,actin那张膜上,背景清楚,但是条带很浅,有些孔看不见(我作了一个浓度梯度,6,3,1.5mg/ml).但是troponin那张膜上,背景比较重,非特异条带多得我都着不到目的条带了.我大致得条件是浓缩胶60V,分离胶100V,转膜350mA55分钟.ECL
我的一抗是SANTA CRUZ(两个都是1:1000)是不是不好?我的膜杂带多是不是也说明我的蛋白是有的,就是提蛋白,电泳,转移都没有大问题,但是为什么actin为什么会这么少?

作者: finger 时间: 2013-9-22 15:40

斑竹你好，我做WESTERN BLOT有几个月了，也只把β-actin做出来了，目的条带怎么也不出来，我的目的条带分子量是36，做之前没有测蛋白浓度，分离胶浓度用的12％，100V，1.5小时，封闭一小时，一抗四度过夜，二抗2小时，ECL显色没结果，请给我点建议好吗？？应该从哪几方面改进啊？？谢谢

作者: birdfish 时间: 2013-9-22 15:41

我要做核内蛋白的WB，分子量为60KD，看了园内的想用histone H1为内参，合适吗？有老鼠抗人H1吗？哪家公司有？
非常感谢

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-22 15:42

请问，我做hif,全湿式转膜的条件最好是多少？

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-22 15:43

请问一抗在-20度下能保存多久而不失效？

作者: 菠萝喵 时间: 2013-9-22 15:44

请问，我最近砸一个22kd的蛋白，一般强制表达的可以砸出来，但是高表达细胞体系怎么都砸不出来，可能是蛋白表达水平相对强制表达的比较低的原因，我想请问一下，如何能够通过调整技术来砸出来？或者您有什么更好的建议呢？谢谢！
我每次上样60ug，一抗1：100

作者: caihong 时间: 2013-9-22 15:44

我做的是肿瘤细胞凋亡基因BCL-2的westenblot，用的是中杉STANTACRUZ的一抗SC-783，第一次显影后有好多黑点甚至连成片，有人说是没洗干净，也有人说是一抗特异性不好。第二次做，我延长洗片子的时间，可是显影后什么都没有了，连胶都看不到，这两次作的预染marker还都转上了，请问是一抗质量问题吗

作者: caihong 时间: 2013-9-22 15:45

相关疾病：
肿瘤
我做的是肿瘤细胞凋亡基因BCL-2的westenblot,抗体选用什么的好,是兔抗还是鼠抗好呢?

作者: dog002 时间: 2013-9-22 15:46

我初次做WB 想问哪个公司的抗体比较好?

作者: hustwb 时间: 2013-9-22 15:46

我是WB的新手,我想请问几个问题!我的目的蛋白分子量是92和124KD,我用的是6%的分离胶,5%的浓缩胶,分离胶和浓缩胶都是用100V电泳,转膜湿转250mA,2h,结果92KD出结果了,但是124KD没有结果?
我想请问,下次我是用两块胶一起跑还是分开跑呢?124KD的蛋白为什么没有结果呢?该选择怎样的电泳和电转的条件呢?

作者: wanglaoshi 时间: 2013-9-22 15:47

楼主你好,
我刚做的实验是用PEI转染的方法将pEGFP-C2融合载体转染到鱼类巨噬细胞里面.然后我提取蛋白有GFP抗体作了Western 检测.奇怪的是,未转染细胞提取的蛋白也出现了阳性条带,而且大小也是GFP的27kDa.不知道原因是在哪里.我已经重复两遍了.怀疑是抗体的问题.不知道你还能想到是哪方面的问题.谢谢!

作者: rxcc33 时间: 2013-9-22 15:48

我是初学者，有几个问题想请教：
1 听说WESTERN可以定量、半定量，可是我看文献上的结果都显示条带有没有，统计阳性阴性例数，我很不明白，这里的定量和半定量确切的指什么。它和免疫组化，ELISA的方法比较有什么优缺点呢？
2 我采用的是病人的血液标本，要提取核内蛋白，请问有较好的细胞裂解液配方么？
3 我的蛋白分子量在14－50 之间，请问分离胶、积层胶浓度用多大更好呢？12％，3％，可以么
4 电泳和转膜时，用多大的电压和电流好呢?
5 听说一抗很重要，能推荐性质较稳定的比较适宜做western一抗的，国内国外几家公司么。

作者: superboy 时间: 2013-9-22 15:48

显影后有黑点，一般是封闭不完全造成的，用5%脱脂奶粉，一定要溶解充分；封闭液若是反复使用，要加叠氮钠防腐。也有可能是显影前，用湿手摸胶片，造成污渍。一抗效价不高的话，是有可能染过一次后就再也染不出来了。选择抗体，单纯做WB的话，兔源鼠源不重要，最好是查一下paper，选择已经证明好用的抗体，不要盲目迷信某一家公司。

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westenblot前辈高人，我做的是肿瘤细胞凋亡基因BCL-2的westenblot，用的是中杉STANTACRUZ的一抗SC-783，第一次显影后有好多黑点甚至连成片，有人说是没洗干净，也有人说是一抗特异性不好。第二次做，我延长洗片子的时间，可是显影后什么都没有了，连胶都看不到，这两次作的预染marker还都转上了，请问是一抗质量问题吗

作者: superboy 时间: 2013-9-22 15:49

124KD蛋白的抗体试一试不同稀释度；查查蛋白性质，是否疏水蛋白，等电点，等等，以便判断在蛋白提取、处理、转膜上有没有什么特别要注意的地方。

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我是WB的新手,我想请问几个问题!我的目的蛋白分子量是92和124KD,我用的是6%的分离胶,5%的浓缩胶,分离胶和浓缩胶都是用100V电泳,转膜湿转250mA,2h,结果92KD出结果了,但是124KD没有结果?
我想请问,下次我是用两块胶一起跑还是分开跑呢?124KD的蛋白为什么没有结果呢?该选择怎样的电泳和电转的条件呢?

作者: superboy 时间: 2013-9-22 15:50

抗体有非特异条带不奇怪，尤其是多抗，关键是比较未转染组，空载体control组和你的融合蛋白组，看是否有特异的目的条带。

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楼主你好,
我刚做的实验是用PEI转染的方法将pEGFP-C2融合载体转染到鱼类巨噬细胞里面.然后我提取蛋白有GFP抗体作了Western 检测.奇怪的是,未转染细胞提取的蛋白也出现了阳性条带,而且大小也是GFP的27kDa.不知道原因是在哪里.我已经重复两遍了.怀疑是抗体的问题.不知道你还能想到是哪方面的问题.谢谢!

作者: superboy 时间: 2013-9-22 15:50

WB半定量是指在没有曝光过度、蛋白上样没有过饱和的情况下，显影条带的强弱能大体反映蛋白量的多少。你把同样的样品按不同上样量做一次WB就明白了。
14-50KD蛋白，用15%好一些，至少小分子的条带会更好看。最好用0.22um的转印膜，否则小分子蛋白很容易透膜的。
一抗根据已发表的文章选择。
其他按常规的WB进行即可。
血液标本我没做过，有的公司有试剂盒卖。

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我是初学者，有几个问题想请教：
1 听说WESTERN可以定量、半定量，可是我看文献上的结果都显示条带有没有，统计阳性阴性例数，我很不明白，这里的定量和半定量确切的指什么。它和免疫组化，ELISA的方法比较有什么优缺点呢？
2 我采用的是病人的血液标本，要提取核内蛋白，请问有较好的细胞裂解液配方么？
3 我的蛋白分子量在14－50 之间，请问分离胶、积层胶浓度用多大更好呢？12％，3％，可以么
4 电泳和转膜时，用多大的电压和电流好呢?
5 听说一抗很重要，能推荐性质较稳定的比较适宜做western一抗的，国内国外几家公司么。

作者: xyw5 时间: 2013-9-22 15:51

请问你做过分子量200kd以上的western blot 吗都是什么条件帮我问问我做220kd 的做完后膜上没有目的条带

作者: xyw5 时间: 2013-9-22 15:51

积层胶３０mA 分离胶５０mA 跑至７３的红色marker 到胶底　　转膜恒压７０伏８小时，marker最大是１７０，跑分离胶电压为120伏

作者: xyw5 时间: 2013-9-22 15:52

积层胶３０mA 分离胶５０mA 跑至７３的红色marker 到胶底　　转膜恒压７０伏８小时，marker最大是１７０，跑分离胶电压为120伏

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这是以前的实验条件！请问应如何改进呀？

作者: zhenxin 时间: 2013-9-22 15:53

最近作一个分子量450KD左右的蛋白的WESTERN，目的条带总是歪歪扭扭，很难看，同一块胶上小于200kd的条带就很平整

我用6%的胶，biorad的电泳装置，试过不同电压，100V到60V，效果都不理想，好像电压越小越糟糕；转膜倒没什么问题

电泳图见附件，就是最上面的带

想问问做分子量那么大的蛋白电泳有什么好方法？

多谢！！

图片附件: 55596334.snap.jpg (2013-9-22 15:53, 15.07 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18655

作者: uaubc 时间: 2013-9-22 15:53

请问各位,我准备做western,要购买试剂了,但是检测方法是用辣根过氧化物酶好呢,还是用碱性磷酸酶好呢,我看好象大多数是用辣根过氧化物酶,但是书上写碱性磷酸酶显色更好些,辣根见光褪色,不知道该买哪种二抗,谢谢

作者: uaubc 时间: 2013-9-22 15:54

请教PTGLAB,我做的是膜蛋白，分子量大约150KDA,转膜2MA/CM2,半干转,但是一直做不出来,请问提取膜蛋白是否和提取胞浆蛋白一样啊,我用的是碧云天的裂解液,提取方法和提取胞浆蛋白的方法一样,但是一直没有做出来,
不知道是蛋白有问题还是抗体有问题,但是一样的蛋白,100KDA以下的都可以做出来,因为我们的标本比较少,所以我们的胶都是跟锯分子量来几个人分的,所以蛋白应该没有问题.
不过他们的都是胞浆蛋白.

非常感谢

作者: ffaa 时间: 2013-9-22 15:55

回楼上，膜蛋白在离心时需要10万g以上,另外,膜蛋白量也较少,相对比较难做

作者: c86v 时间: 2013-9-22 15:55

回楼上，膜蛋白在离心时需要10万g以上,另外,膜蛋白量也较少,相对比较难做

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 15:57

想问大虾们，Ｗestern 的液体适用于所有的蛋白测定吗?

作者: yysr238 时间: 2013-9-22 15:59

我要提的蛋白是分泌型蛋白，在培养基中的。请问这中蛋白怎么提取？谢谢！

作者: bs4665 时间: 2013-9-22 15:59

您好：

我要做western blot , 我的目的蛋白是265 kD和289kD，我想买合适的郁然marker ,请问您知道哪里有吗？
谢谢！

作者: hold住 时间: 2013-9-22 16:00

1、我马上要开始做膀胱壁的CGRP（降钙素基因相关肽）的定量检测，有人说用PCR，我觉得不行吧，蛋白定量应该用WESTERN BLOT ，你说对不？

2、因为我刚开始做实验，一窍不通，我是不是应该向某个公司定购抗体什么之类的，但有个公司说你要告诉我是什么厂家的具体什么试剂，他们才能帮我们订，其它的他们也不太了解。请问我如何知道我需要的试剂（抗体或其它什么东东。我真是一窍不通）
.
3、我想做CGRP的检测，那么我怎么才能知道CGRP是在胞浆内还是核内，还是膜上，或都说，管它在哪里，这对我并不重要，请问是这样吗？
4、如果做WESTERN BLOT是不是我只要买好一抗和二抗，其它的设备一般的实验室都会有的。
不好意思，问题在你看来可能非常幼稚！劳烦帮我解答！

作者: hold住 时间: 2013-9-22 16:02

5、接上，在开始做WESTEREN BLOT之前，我应该准备哪些重要的试剂（除了一般生化实验室常备的设备外）

作者: pengke1983 时间: 2013-9-22 16:02

想请教一下，我现在已经完成了植物叶片的２Ｄ分析，发现了一些差异表达蛋白。接下来想做ｗｅｓｔｅｒｎ鉴定，但对相关的抗体怎么获得，选什么做内标完全没概念。是不是植物蛋白的抗体都要自己制备？有商品化的购买吗？谢谢

作者: memory 时间: 2013-9-22 16:04

求助：我做好久的WB，老做不好。
内参GAPDH和β－actin的条带粗的时候是黑黑浓浓的一条，细的时候就变成距离很近的两条了，不知您是否出现过这种情况，那两条是否有一条是非特异的？
还有就是目的蛋白22kd，没有非特异条带，但是曝光结果肉眼都看不出粗细区别，但内参粗细相差很大，试过好几种内参都这样，（BCA法测蛋白后上样量基本一致），是否是目的蛋白的一抗浓度太高？我无法把内参的条带粗细调差不多，那拍照的话很难看。
恳请赐教！

作者: tuuu2 时间: 2013-9-22 16:05

请教关于WB最后出来的条带形状不好的问题。
我最近做WB得到的条带，形状有时会弯曲，有时干脆就是几个不相连的点，而且相邻泳道的条带之间没有间隔，会连在一起（即使只暴光很短时间）。请问大家有什么建议，多谢了

作者: junhun 时间: 2013-9-22 16:05

请问，提取大鼠甲状腺组织的蛋白，因腺体体积较小，有增大蛋白量的实验方法吗？
如果用trizol裂解细胞的话，可以同时提出核酸和蛋白质吗？请问有具体的方法吗
如果要同时做同一组织五种蛋白的WB,应该如何上样，切胶和转膜呢？
谢谢

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-22 16:07

请教如下：实验目的蛋白在凋亡后由线粒体移位于胞浆，WB法提取胞浆蛋白时不能破坏线粒体膜，查阅文献的提取液配方不同，很困惑，不知道哪种好？请执教……
方法一：
120mmol/L kcl
5mmol/L KH2PO4
10mmol/L HEPES
2mmol/L EGTA
0.15g/L digitonin
蛋白酶抑制剂
PH7.4
方法二：
50nmol/L Tris-Hcl ,PH8.0
150nmol/L Nacl
100ug/ml PMSF
1ug/ul Aprotinin
请教这两种都可以吗？有更好的方法吗？一般的实验室都能配吗？
不胜感激……

作者: one 时间: 2013-9-22 16:08

各位好，我刚用TE70做半干转移，请教一下，14kDa的蛋白用什么样的转移条件？转移液？谢谢！

作者: summerxx 时间: 2013-9-22 16:08

请问10乘电泳缓冲液的pH值要调到多少呀？

作者: 6327555 时间: 2013-9-22 16:09

你好，我今天刚做了第一次western，曝光显影后发现片子上什么都没有，就是张白片。转膜后膜上能清楚的看到Marker，显影液、定影液都是新鲜配制的；一抗是SANTA CRUZ的（1：200稀释（TBS-T））,4°孵育过夜；二抗1：5000孵育1h；SANTA CRUZ的ECL作用1min后进行曝光显影的。灯光下曝光已经确认胶片是好的，不过发现显影液洗过第一张胶片后就明显变黄。蛋白的上样量为60ug。请多多指教，谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-9-22 16:11

请问10乘电泳缓冲液的pH值要调到多少呀,(用试纸调)

作者: lxh031 时间: 2013-9-22 16:12

10*电泳缓冲液我们调的是PH8.3

作者: 911 时间: 2013-9-22 16:17

21kd.26kd分子量的蛋白用湿转和半干转转膜的时间,电流或电压条件?谢谢了!

作者: hulu呼噜 时间: 2013-9-22 16:20

请问免疫细胞化学差别明显,但Western Blotting 没有明显差别,怎么解释?

作者: qqq111 时间: 2013-9-22 16:21

请问浓缩胶与分离胶的浓度指的是什么呀?是指丙烯酰氨的质量分数吗?
还有,今天暴光时,第一次暴的挺浓的,为什么再加AB液就暴不出来了呢?

作者: popo520 时间: 2013-9-22 16:21

我用一样的样本分别跑了12%和8%的page电泳，跑完后考染出的条带为什么差别那么大呢？12%上条带很清晰可8%上很浅，几乎看不出，请教各位大虾有碰到过这种问题的吗？我的170kd的蛋白应该是跑8%的没错吧

作者: one 时间: 2013-9-22 16:22

请教各位高手提取大鼠甲状腺组织的蛋白，因腺体体积较小，有增大蛋白量的实验方法吗？
如果用trizol裂解细胞的话，可以同时提出核酸和蛋白质吗？请问有具体的方法吗
如果要同时做同一组织五种蛋白的WB,应该如何上样，切胶和转膜呢？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-22 16:22

小弟我有几个问题想问问哦：）
1. 当EP管中的蛋白做一次WB后，剩下的应该放于-80度还是-20度？
2. 电泳和转膜时，是应该设置恒压还是恒流？请问各自的设置标准和数据是什么？
3. 电泳结束后是否要先将胶放入转膜缓冲液中漂洗然后再铺？还是可以直接从电泳槽中取出铺胶？
4. 请问是否MARKER转到膜上是否就代表其对应分子量的蛋白全部转到膜上呢？
5. 曾经听说可以用膜的边角做杂交，请问杂交怎么做啊？
6. 转膜完了后，膜是否要用TBST洗，然后再封闭？还是可以直接封闭？
7. 一抗的稀释液是5％牛奶还是1％的牛奶？（牛奶溶于TBST）
8. 听说如果二抗是羊抗就要用TBST洗2个小时？不知是否如此？
9. 请问洗脱抗体液应该如何配置？

非常感谢楼主以及各位大虾给予帮助，小弟在此预先谢谢啦：）

作者: am10 时间: 2013-9-22 16:23

问题一：两种明显有交叉反应可能的二抗为什么可以一起孵育？
比如两种二抗是马抗羊，羊抗兔？以下是园子里一位战友的原话：

“请问,你的一抗是两种不同的抗体吗,其来源一样吗,如果不一样,就可以一块孵育,如果是这种情况:两种一抗是鼠抗什么和羊抗什么,二抗分别是羊抗鼠和鼠抗羊,加在一起孵育绝对没问题! ”

为什么这两个二抗不会交叉反应呢？

问题二：一抗采用同一物种来源，二抗采用同一个，能否做Western blot？
比如两个一抗是鼠抗因子A，鼠抗因子B，二抗用羊抗鼠。对结果有影响么？

作者: tie8 时间: 2013-9-22 16:24

回答问题二：一抗采用同一物种来源，二抗采用同一个，能否做Western blot？
比如两个一抗是鼠抗因子A，鼠抗因子B，二抗用羊抗鼠。对结果有影响么？

没有影响，我一直都是这么作的，甚至三个同一物种来源的一抗用一个二抗都作过，效果也很好。

作者: daod 时间: 2013-9-22 16:25

请问：
我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好。
怎样才能确定是不是磷酸化的蛋白？

作者: any333 时间: 2013-9-22 16:25

你好：
我想请问一下：在刚开始侧蛋白浓度的意义是什么？另外我还想请问一下：marker是不是预染的比较好？不预染的行吗？我用的是DAB显色，这好不好？
小弟多谢！

作者: 49888 时间: 2013-9-22 16:26

你好：
我想请教一下：我用的内参是43KD，而我的MARKER的最小值是44.3KD，请问这样可以吗？

作者: 49888 时间: 2013-9-22 16:27

高手，你好！
我想问一下神经组织和血液标本如何保存，不让其蛋白丢失，请帮忙告知。还有做这类的WB我需要注意什么，我检测的是NF－KB 。
谢谢！

作者: zhenxin 时间: 2013-9-22 16:27

现在从血清里富集到人的所有抗体，我现在有的是Protein A/G是结合到琼脂糖珠上的，请问哪位大哥大姐我该如何做呢？
我现在是用1*PBS 洗涤琼脂糖珠
1%BSA 4度封闭1 小时
然后血清用1%BSA稀释50倍，加入到琼脂糖珠的液体中
4度过夜
然后离心，1000转 2分钟用 PBS洗3次
是不是这样就能结合富集到抗体了？
如果想鉴定一下抗体是否结合了是不是只能通过蛋白电泳看分子量大小呢？
Protein 的是45-50KD 而抗体我差的是150KD- 900KD
如果结合了，电泳的目的条带分子量大小是不是二者相加呢？按我上面的方法，恳请高人指点

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 16:28

1，明确一抗是否可以做WB
2，按照说明书进行WB的合适稀释倍数进行稀释
3，WB的二抗合理稀释，避免背景过强妨碍目的条带显影

作者: niangao1980 时间: 2013-9-22 16:29

本人是western新手，现在做蛋白随药物作用时间而变化的半定量实验。Actin作为内参。裂解液用SDS。第一次上样后actin的表达不equal，经过调整后，actin比较equal，可是两个目标蛋白在后面两个时间点的control组都很不equal。这样怎么办啊？是不是和我提取的方法有关呢？

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作者: S6044 时间: 2013-9-22 16:29

请问高手，我用的一抗浓度是1：200，二抗是1：10000，封闭了2个半小时，二抗孵育前后用TBST各洗1个小时，每次15分钟洗4次，但背景总是很黑，这是什么原因？谢谢

作者: qianqin1977 时间: 2013-9-22 16:31

请问:电转时胶>膜=滤纸,行吗?

作者: 8s5g 时间: 2013-9-22 16:31

您好，我想提取小鼠肝组织的总胞浆蛋白然后做Western，但一点思路也没有.您能帮我推荐一些关于如何提取小鼠肝组织的总胞浆蛋白的书吗。
谢谢。

作者: pengke1983 时间: 2013-9-22 16:32

请问大家,我丽春红染色后,用TBS洗了二十分钟后,PVDF膜还是粉色的,然后我就封闭了,不知道对后面的有影响没,谢谢

作者: zsxan1990 时间: 2013-9-22 16:32

为什么我的跑的8%sds-page的溴酚蓝电泳速度相当于35kd左右，而且蛋白都靠下，70KD就在中下部了，期待高手赐教，感谢站友1！

作者: 3N4G 时间: 2013-9-22 16:33

请教一下，立春红染色可以见到条带，曝光的时候没有目标条带，另外marker也曝光显影不全，小分子量的看不到，预染marker小分子量的也不很清晰，我的蛋白是13kd左右，所以需要看到小分子量的marker，marker的上样量已经达到20ul。另外还有一个问题就是加了发光物的膜放在保鲜膜上后没有用保鲜膜盖住，直接压了片子，但是膜粘在片子上后取下还没再继续用于曝光吗，有没有挽救办法，我把膜取下放好后继续曝光，结果是白板，是不是与此有关。谢谢高手指点了。

作者: idoww 时间: 2013-9-22 16:33

怎样调整1 2 抗的比列去调整非目的条带啊
原理是什么啊
我做的Western 时1 抗的比列不同，结果杂的结果就不一样
为什么？

作者: PINK 时间: 2013-9-22 16:35

请问一下，我做的时候每孔上样量是10微克，做了两次都没有条带，已经证实了电泳和转膜都没有什么大问题，抗体是CST的，问题也不大，我做的是人胃癌组织中MMP-2的表达，应该表达水平还是比较高的。所以我想问题是不是出在上样量了？有没有什么方法能够将蛋白浓缩一下再来做？谢谢了！！我有点着急了。

作者: redbutterfly 时间: 2013-9-22 16:36

紧急求助！请问3KD多肽能做WESTERN BLOTTING吗？转膜时湿转能做吗？条件怎么控制？

作者: kuohao17 时间: 2013-9-22 16:37

相关疾病：
肿瘤
请问楼主，我做的是肿瘤细胞凋亡相关蛋白，有caspase-3,-9,Bal-2等，内参b-actin都能出来条带，可检测的蛋白就是没有条带，我用的DAB染色，Bio-Rad半干转,10V,60min

作者: zwsyrt 时间: 2013-9-22 16:38

请问HES buffer中加那些蛋白抑制剂,加多少?
另外,我的SANTA的一抗被我误冻了,对结果有无影响? 谢谢指教

作者: 3648755 时间: 2013-9-22 16:39

楼主，您好！我最近在做细胞浆、细胞核蛋白的western blot。开始我用santa cruz的beta-tubulin抗体作内参，细胞核中β-tubulin阴性，我的目标蛋白为阳性；细胞浆中β-tubulin为阳性。对这个结果我很满意，因为我的目的就是想证明细胞核中是否表达我的目标蛋白。可今天我又用Sigma公司的a-tubulin在此杂交，结果细胞核中为阳性。这是什么原因？着急！请指教！

作者: jujuba 时间: 2013-9-22 16:39

我做的是CDC42,和RAC1一起跑的,操作步骤都是一样(2个大小都是20KDA左右),转印一个半小时左右,RAC1的条带很漂亮,可CDC42的就没有!!
RAC是1:1000稀释,CDC42是1:250稀释(说明书上的浓度),2抗都是1:2000稀释,请高手赐教!!!!
还有,回收的抗体效果怎么样,可以出条带吗?
我们用的是DAB显色，后来CDC42抗体浓度提高到了1：125稀释，仍然没有结果！急！！！

作者: jujuba 时间: 2013-9-22 16:40

我做的是actin，3％BSA 37度封闭50分钟，一抗4度过夜，漂洗，二抗室温1h，然后用博士德的DAB试剂盒显色，单背景特别深，请问为什么？有什么办法能降低背景？谢谢！

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作者: 9900 时间: 2013-9-22 16:47

我做的蛋白分子量是80kd，转膜后丽春红染色，有蛋白，一抗二抗都是今年买的，博士德的，用碧云天的ECL再暗室里根本什么都看不见，不发光，但是胶片确实全部曝光，请教可能原因，谢谢！

作者: is2011 时间: 2013-9-22 16:47

有几个问题请教
1。我的条带倒是挺明显的，可是整张胶片颜色还是偏黑，可能是什么原因导致的呢？
2。我先作了一个GAPDH，用的博奥森的一抗，pierce的二抗，出来了4条带，天哪。不知道为什么。
3。我用TRIZOL提蛋白（提RNA的副产品），可是很难溶，不知ptglab有没有什么建议？溶了以后浓度很低，所以上样量很大，怎么办哪？也不知道TRIZOL提蛋白会不会损失一些种类的蛋白？
苦恼ing

作者: mimili_901 时间: 2013-9-22 16:48

请教，血清样品的半定量western，样品制备需要注意什么？上样量如何控制？如何选内参呢？谢谢！

作者: niangao1980 时间: 2013-9-22 16:48

不好意思，弱弱问一下，内参如何定量，是不是也需要相应抗体啊

作者: 7437654 时间: 2013-9-22 16:49

我刚开始做western
蛋白分子量36kd，大脑只有部分细胞表达，丰度超低的膜蛋白
而且一抗是单克隆抗体
做了几次没有结果
请问：12％的胶可用什么样的转膜条件？（bio-red,pvdf膜，湿转）
一抗有没有必要换成单克隆抗体？
是否必须换成三抗？

作者: www.1 时间: 2013-9-22 16:49

我做western两三个月了
竟没出一次结果
最近郁闷的快不行了只能求救了
我做的是细胞膜蛋白的western,目的蛋白130kd
用的是现代免疫技术中专用的膜蛋白的配方提取膜蛋白，这种情况下提取蛋白中B-actin的表达和量会受影响吗？可以用它来做内参吗？
跑胶用5%，8%的凝胶，电压80v,100v跑，跑完的胶复染有蛋白条带
问题就处在转膜上，我用的是PVDF膜
而且我的转膜装置每次都是默认恒流转膜，湿转，我用300MA的电流转膜
电压刚开始显示140V，后来就是100V左右
每次转过的膜用李春红染色都是乱七八糟的，有的地方还有小范围的透明的区域，不知道是什么原因，特别是带有溴芬兰的区域膜就是透明的，WHY?
但就是没有蛋白的条带
可是八转过膜的胶再染色也没有条带
可能是转过了
但是再减小的话我用250MA转3个小时也没有蛋白在膜上
就不知道原因在那里了？
130KD的蛋白在湿转情况下恒流到底多少的电流及时间合适呢？
感谢ptglab，问了这么多的问题，希望能收到你最专业的知道

作者: qhyu 时间: 2013-9-22 16:50

先谢谢了！
上个星期我作了两次wb，两次都有条带出来的。很高兴！
这个星期，我作了三次，一次条带也没有出来。郁闷极了。
条件是这样的：条件是一样的，后面条带没有出来的膜，我用丽春红染色，蛋白条带是有的，目的蛋白应该是没有问题的。后面跟以前的一抗的浓度，二抗的浓度，抚育的时条件是一样的。
一抗是santa cruz公司的，二抗是博奥森公司的，一抗比例1：200，二抗是1：1000。我加发光剂的时候，暗室是看不到有荧光的。不太可能是一抗跟二抗的问题吧？前几天还做呢！条件相同，为什么就做不出来呢？？
谢谢！！

作者: youyou99 时间: 2013-9-22 16:50

请教一个比较奇怪的问题。

两个月前，突然发现WB做不出结果了，胶片上没有带。我是用HRP-linked 抗体然后再胶片上显影。开始找原因。换了目的蛋白含量很高的菌液、换了新抗体，显色的时候在膜上肉眼可以看到非常清楚的荧光，但是就是胶片上显示不出条带。按照逻辑，我怀疑是胶片或者显色液的问题，但是恰好有同学也显色，同样的胶片和显色液，他的正常！没招了，仔细看每一个用过的液体，发现封闭液不知怎么搞的有好多牛奶的沉淀。之后换了新的封闭液，WB一切正常。

问题虽然解决了，但是到现在我还是不理解原因。按照我的逻辑，如果封闭液不行了，影响的是之后的抗体等等；既然有肉眼可以看到的荧光，说明封闭液的影响没有太大，还是有抗体结合上来了，但是为什么胶片上没有条带呢（也不是我显影的操作有问题，因为我用有荧光的膜让同学帮着显色也是不行）？
谢谢！

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-22 16:50

我做Western也做了有好几次了,最好的结果也就只能做到现在这个样子(如图所示),一直觉得有点问题,但又不知从哪些方面去调整。我的用原核表达的蛋白来做Western的。
有几个问题一直没弄明白的：
1. 蛋白必须是用纯化后的来做吗？我上样时既有全菌蛋白、也有上清和包涵体，转膜后立春红染色的结果与考染的差不多，基本都转上去了，但在显色时的条带也差不多，基本上都有带，老板说我的特异性太差了，应该所有的都只有目的带，我觉得这不太可能。
2、一抗用血清必须要吸附吗？我没有做吸附这一步，影响大不大？
3、一抗和二抗作用的浓度和时间都要优化吗？我只是按一般的操作一抗1：100稀释，作用2h，二抗1：2500稀释，作用1h，没有进行优化。
4、我有一个蛋白最后显色的结果和考染的条带的强度差不多，初步的ELISA结果也还可以，但另一个蛋白考染时的上清和包含体的条带都较浓，立春红染色时也很浓，但最后显色时的条带却很黯淡，但还是有带的，而且用其做ELISA的结果一直都不行，是否说明这个蛋白没有活性或是容易降解？
5、我的最终目的是建ELISA，Western只是中间的一个检测步骤，花时间进行各种条件的优化似乎不值得。
还请高手们不吝赐教！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18658

作者: 红茶可乐 时间: 2013-9-22 16:57

请问搂主，我在转膜时用１２０V恒压９０分钟，一般没问题，但有时电源会突然自动跳至电流转，此时没法再设回电压，请问是电源问题还是短路或其他原因？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-9-22 16:58

前辈高人大家好

看到了在丁香园上的帖子，被你们的乐于助人感动。我第一次作实验，用到western blot技术，有些问题想向您请教，还望前辈不吝赐教，感激不尽。

目的：测PSD-95的表达

1 需用8%的分离胶，请问这个配方可以吗

H2O 4ml

30% PAGE 3.3ml

Tris PH 8.8 2.5ml

SDS 100ul

10% APS 100ul

TEMED 20ul

2 Marker 的选择有特殊吗,依据PSD-95的分子量来定吗

3 电泳时间：积层胶30min 分离胶1h

4 转膜时间：6h 4度电流选择多少比较合适

5 一抗是兔PSD-95抗体

二抗是羊抗兔IgG/HRP

以上是部分步骤设计，请问可行否谢谢指点

作者: tuomu45 时间: 2013-9-22 16:58

我是刚开始做western的菜鸟,有几个问题请教大家:
1,提取组织蛋白时,大概50mg组织要用多少裂解液比较好?裂解时间要多少啊?太长蛋白会不会变性?
2,一抗,二抗孵育用杂交袋好用吗?要加多少ml抗体?如果用小的培养皿呢?要加多少ml抗体啊?一抗,二抗可以回收利用吗??如果可以,怎么保存啊??(偶是穷人啊)
3,一抗,二抗孵育后的膜可以保存起来暂时不做化学发光,显影定影吗??如果可以,怎么保存?
4,我要做半定量,请问是用凝胶成象系统好还是用分析软件好?最好介绍下什么分析软件好用以及用法说明在哪里找?
5,内参actin是什么,什么时候加,它能起到什么作用?能举个例子吗?偶比较笨,不好意思

问题有点菜,呵呵,希望能有详细点的解答,谢谢

作者: H2O 时间: 2013-9-22 16:58

再问下，我现在做HIS标记的融合蛋白的抗体，有必要再做1只兔子，只注射HIS来作为对照吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-9-22 16:59

本人用大鼠肺动脉干做western，目标蛋白是SERCA-2a，分子量是114kD左右。现在分离胶用10％，积层胶用5％，开始电压80V，到分离胶后调到160V，2小时。半干转膜，用NC膜，转膜电流60mA，1个半小时。丽春红染色后条带很清楚，一抗4℃过夜，二抗37℃1个半小时，用ECL发光。但最后内参β-actin 每次的条带都很好，但是目标蛋白都没有条带出现，甚至连背景都没有，做了好几次都是这样。但是以前曾用该目标蛋白的一抗做心肌组织有明显的条带出现过。现在不知道哪里出问题了目标蛋白一直没有结果。请园子里老师们帮我分析一下吧！不胜感激！谢先了！

作者: 131415 时间: 2013-9-22 17:01

最近做WB遇到了很大的问题。GST-PULL DOWN 样品跑电泳转膜后杂某种蛋白，结果出了如图所示的结果。背景的杂带几乎把目的条带淹没了，根本找不到我要的带在哪里。 4度过夜封闭，一抗1：1000室温1小时。二抗1：1000室温50分钟。洗膜都是三次，每次10分钟。（我做免疫沉淀的样品也是按照这个条件做的，虽然有杂带但是很少。结果还可以）

可能是抗体和我的融合蛋白降解产物非特意性结合了。因为，图中最右边上的是我的GST融合蛋白，这种蛋白非常容易降解。我的样品加了蛋白酶抑制剂，在-20度放了能有两个月了。我做免疫沉淀的样品也是放了这么长时间才杂的，结果也还可以。

请忙分析一下我该怎么办？我也不知道怎么了，最近实验很不顺利，毕业难啊！

图片附件: 75536351.snap.jpg (2013-9-22 17:01, 18.08 KB) / 该附件被下载次数 18
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作者: ladyhuahua 时间: 2013-9-22 17:04

补充一句，图中最左边是GST做的PULL DOWN，第二道是CONTROL，第三第四道是阳性，第五道上的是GST-融合蛋白。

作者: glass 时间: 2013-9-22 17:07

我做的是组织标本的 western blot ，做了几次感觉条带很奇怪，显影曝光后中间为黑色条带，四周还有白色，是不是和蛋白质的上样量有关，我的浓度是1.25mg/ml ，请赐教。

作者: glass 时间: 2013-9-22 17:08

菜鸟请教高手达人，我即将开始做Western Blotting，看RhoC 的表达情况，分子量大小21kD，请问应该注意些什么？？？
先谢谢了

作者: cocacola 时间: 2013-9-22 17:08

一抗二抗的比例一般调整到怎样呢？

作者: nut6694 时间: 2013-9-22 17:08

我做western时，同样的实验有时条带出来的非常不明显，而有时是非常清楚。我尽量使每次做的条件相同，但是western程序繁多，不知道问题出在哪儿。
我在转膜后有时用圆珠笔在膜上做标记，我怀疑圆珠笔液是不是对结果有影响呢？

作者: PINK 时间: 2013-9-22 17:09

你好！想请教个问题，希望你能够不吝回复！
大鼠心肌组织蛋白（thioredoxin 1，12kd）--15%分离胶--半干转膜（25v for 30~40min）--5% 脱脂奶粉封闭-- santa 一抗（多抗） 1：200/500 4℃ 过夜-- 羊抗兔 37℃ 1h--化学发光发检测，wb结果显示没有目的条带。我想请问：
1. 15%的分离胶能否达到要求？切胶的时候会不会切掉目的条带（溴芬兰最上层切胶）？
2. 恒压与横流转膜有无区别？哪一种效果更好一些？转膜时间多少？
3. pvdf膜是否需要选择孔径比较小的那种？

作者: mamamiya 时间: 2013-9-22 17:09

请问，在做western blot 试验的电泳这一部分中，如何确定所测定的混合蛋白的分子质量？？急用，谢谢！

作者: flower@@ 时间: 2013-9-22 17:09

我即将做磷酸化Akt的WB，分子量为60KD，文献上内参用的多是总AKT，请问可以用b-actin吗？总Akt应该包括磷酸化Akt吧？那么其分子量为多少呢？是不是56KD啊？磷酸化Akt电泳时分离胶和浓缩胶的电压多大？转膜时电压多大，时间多少合适呢？请早日回复！谢谢！

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 17:10

我是新手
1、我要做分子量分别是194、170、58、21KDa的几个指标，我用的是5％的浓缩胶和10％的分离胶，不知道能不能把这些蛋白都分离开？如果不行请各位大侠明示。
2、我用的是湿转的方法转膜（0.45um的PVDF膜），不知道有什么样的条件可以把这几种蛋白都分别转到膜上？
3、我以前就是听师姐师兄们的话不管做哪个蛋白都用一个电泳和转膜条件：浓缩胶60V，分离胶80V，跑到底；恒压100V,1.5h，最近发现Marker总是转过了，才考虑条件的问题，我应该怎么改啊？是不是Marker转过了就意味着与之相同分子量的蛋白质也就转过了呢？
4、actin是不是一定回每个泳道都很均匀？（粗细一致我，是先用紫外分光光度计测蛋白浓度再来计算每个泳道的上样量的）

作者: changlhsyo 时间: 2013-9-22 17:10

你好！我用的是碧云天的强RIPA裂解液，第一天裂解，第二天电泳，所测蛋白为细胞表面受体，电泳结果发现好像在所需位置没有目的蛋白出现（200kd）是不是有蛋白降解的可能，我用的是胰酶消化，有没有影响

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-9-22 17:10

做WB需要的最低蛋白浓度是多少??一个17KD的蛋白质的转膜条件怎样更好?需要注意的问题有哪些呢??

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-22 17:11

我做的是膜蛋白，分子量是120kd，用多大的胶浓度跑，上样量多少 .

作者: 079777chao 时间: 2013-9-22 17:13

我按以下配方配了丽春红的浓缩液
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
加水至100ml
但我配的浓缩液放4度冰箱却是凝固状态的
以前师姐留下的很浓稠，但不凝固，
这是什么原因啊？
求高人解答

作者: caihong 时间: 2013-9-22 17:14

我们现在的蛋白分子量是13.5KD,PVDF膜一定的用0.2um的吗?是不是蛋白能转过去啊?
实验室现在有0.45um的,能不能用哈?

作者: utt0989 时间: 2013-9-22 17:14

我用细胞提取的蛋白做WB，应该在210KD与145KD出现两条带，可是跑胶完染色后并没有在相应位置看见，反而在其他地方有很清楚的带。
用这个提取的蛋白做WB，一抗是我做的单抗，二抗是羊抗鼠IGg，DAB试剂盒显色。只有一次，210与145KD出现过两条带，但是颜色很淡（我想是本身表达量就低吧，考染都不出），之后就再也没做出过结果。

作者: xingyi08 时间: 2013-9-22 17:15

您好：我想问个问题，我现在在做药物对细胞MMP2（活性：63kd，前体：72kd）蛋白表达的影响，提取了细胞蛋白，裂解液配方是：1mol/LTris-cl（PH8.8）2.5ML；NaCl 0.438g；Triton-100 0.5ml 加蒸馏水到50ml 临用前加PMSF母液，提出蛋白后测了蛋白含量，上样之前用PBS调整了蛋白浓度，每孔上样30ul 浓度为2mg/ml，分离胶浓度为：12% 浓缩胶4% 浓缩胶恒压80V 分离胶恒压110V 一直跑到溴酚蓝完全跑出胶为止，转膜时电压上不去，怀疑是滤纸接触短路了，一般转一个半小时，MARKER全部转到膜上去了，一二抗均是Santa Cruz的，封闭二小时，一抗4度孵育过夜，二抗孵育一个小时，显影的时候发现杂带不少，而我的目的蛋白很不清晰，大约在26-35kd之间有一条杂带非常清晰，我也搞不清怎么回事，是哪一步出了问题，盼回复！！谢谢！急啊~~

作者: ending 时间: 2013-9-22 17:15

今天在曝光的时候遇到很奇怪的问题，在红灯开着的情况下肉眼都能见到的荧光背景，依次曝了1.5,2,3分钟，结果胶片上几乎什么都没有，只有一个小黑点。同样的胶片之前还曝了其他蛋白都没问题，估计应该不是胶片的问题，请高手给指点迷津！

作者: 松子儿 时间: 2013-9-22 17:16

大师，请教我用TRIzOL提取RNA后提蛋白，用1%SDS溶解，浓度上不来，怎末办？谢谢。

作者: windy+++ 时间: 2013-9-22 17:21

你好：
我看了好多这里的帖子，觉得你很牛
现在我有一些问题请教
1 我做的是心肌磷酸化，做了有1个多月了，发现抗体结合率很底，我一般是4度过夜或室温2小时，每次洗的时间比较短，我怕洗的时间长了把抗体洗掉了，我现在洗2次每次3分钟左右（我做过3次5分钟的曝不出来），有条带，但是不清楚。为什么？有什么办法解决码？
2 我做出来的条带有点不直（曝光后看出来的），在跑电泳的时候我是80V开始，分离胶是100V，电泳过程中直到电泳结束，条带都很直，MARKER也很好，从电泳方面来看，条带应该很直的，转膜条件是湿转300MA，1小时，15％的胶，目的条带7KD，膜是6*8PVDF膜，甲醇泡3－5分钟。为什么会出现这种情况？怎样该？谢谢！！！

作者: luoliqiong 时间: 2013-9-22 17:21

请问楼主我现在在做分子量3.8kD-8KD蛋白的westernblot 用的是tris-tricine系统，做了好几遍结果都不没有。遇到如下几个问题：
1.蛋白上样量把握不好，每孔得蛋白量应该加多少才比较合适，最少不低于多少？最大不大于多少？
2.跑胶过程结束后考马斯亮蓝染色发现好像胶并没有完全跑开，在大分子量处有条带但小分子量处几乎没有条带。有人跟我说是小分子蛋白扩散了，不知道对不对？还是跑胶时间太短了导致下面的小分子蛋白压根就没于被分开？但溴酚蓝已经跑的很低了。我用横流40mA两块胶跑了2h。但奇怪的是marker好像跑开了，而且最下端的条带也出现了啊！
3.转膜条件文献上多用恒压，但我调到恒压100v时开机就报警，根本没法转只能用横流才能转？这是怎么回事？难道是短路了？怎么处理？转膜过程中如果用恒压时间上到底应该是多少？我用横流转膜之后marker全转过去了但是用抗体标记蛋白后发现目的条带位置根本一点都没有？但是在大分子量处倒是有两条带？难道还会有marker跑开了但目的蛋白没有跑开这种事情？？分子量一样应该迁移率也一样吧？

作者: wood533 时间: 2013-9-22 17:23

各位前辈，我现在有以下问题搞不清楚想请教大家：
我现在在做原核表达和Western，遇到这样一个问题：就是我想表达的基因在大肠杆菌BL21中主要以包涵体的形式表达，我用的载体是pET32a，我想问的是我从包涵体中纯化出来的蛋白是否带有His标签？能不能用His亲和柱进行纯化回收？

我从包涵体中提出的蛋白质经过SDS-PAGE电泳后发现其分子量和预测的分子量是相同的，所以想问你是否能用His亲和柱进行纯化回收，还有就是能不能用带有His标签的一抗进行Western？

作者: u234 时间: 2013-9-22 17:24

你好，我最近在做KDR western 一抗用的是cst 的，稀释比例为1：1000（推荐比例）方法均是按照抗体推荐的常规方法，裂解液用的是碧云天的强RIPA裂解液，细胞先用PBS洗涤，细胞刮刀刮，离心收集后加入裂解液。做了三次都没有出结果，就总蛋白也没有出来，不知什么原因。

作者: 987789 时间: 2013-9-22 17:24

我做的蛋白分子量不等,有6kd 和20kd左右,我提取的是皮肤蛋白.我存在以下问题:
1.在提取蛋白之后,发现蛋白液浑浊,不知是何原因,若在-20放置一段时间,溶解后会更浑浊.
2.就是电泳,转膜时间的控制上,我是用0.45微米的NC膜,转膜和电泳时间均为两小时,是不是时间太长了,电泳所用浓缩胶是5%,分离胶12%,是否合适?在电泳时发现,当样品要跑完浓缩胶时并未压成一条直线,这是什么原因造成的?对结果有无影响?
3.转膜时间虽为两小时,但将转完膜的胶进行一次考染,发现仍然存在条带,难道还是没完全转过去?
4.有一次当做完ECL显色后,没有条带,然后又紧接做DAB显色,却出现了条带,是何原因?
5.我想做定量,是不是一定要用内参呀?但它分子量是40KD左右,能在同一块胶上做吗?不然该怎么办?
以上问题困扰我好长时间,十分希望你们能够认真的帮我解答一下,万分感谢!!

作者: chuntian1983 时间: 2013-9-22 17:24

你好，我做的Western blotting 出现了一个问题，在最后用ECL试剂盒显色时，荧光消失很快，不到一分钟，根本都没法曝光，刚开始以为是ECL试剂盒有问题，因此又用了别人的ECL试剂盒，荧光还是消失很快，别人的试剂盒别人用的时候可以荧光可以维持半个小时以上，所以我现在可以排除ECL试剂盒的问题。
这是内参beta-actin，抗体稀释：1：5000，二抗：1：5000，以前用同样的条件做出的条带很好，荧光可以维持好长时间，约十分钟以上。
请问现在荧光消失很快到底是什么原因？我配的TBST试剂 pH7.6。

作者: shenkunjie 时间: 2013-9-22 17:25

请问行磷酸化Akt蛋白检测时，是不是提取总蛋白？磷酸化Akt蛋白是不是全部位于细胞浆，还是有部分在细胞核？谢谢！请早日赐教！

作者: bananapeople 时间: 2013-9-22 17:25

请教，我跑的胶出了点问题。把图片贴在这里，希望老大指点，出了什么问题，如何预防？
箭头所指处（第7、8 lane）应该有条带，强度应该和左边第1、2 lane的强度相似。但是没有。是转膜的问题，还是加1抗的问题？我加1抗的时候把两条膜放在一起，rocker上4度过夜。但是另外一条膜比这条缺失带要宽。

图片附件: 89175964.snap.jpg (2013-9-22 17:25, 9.13 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18660

作者: mod=8048 时间: 2013-9-22 17:26

电泳时marker很清楚，转膜时只有marker，蛋白转不上，立春红染以前的膜能染的上，应该不是立春红的问题，没转过蛋白的胶上考染能看见条带，转过蛋白的胶上也有少量的条带。电泳条件是60v30min，然后100v60min90（内槽新配），转膜条件恒压恒流都试过，新的液体电阻大，恒流的话电压很高产热液很高，就80v恒压，43JKD以上所有的蛋白一起转1个小时。都没有蛋白，
我们实验室用了别人的转膜液，自己又用别人的试剂配了新的转膜液，后都不行，后来用了别人的膜，现在marker能转上去，蛋白转不上，难道是蛋白处理出了问题，真的想不出来，都是定好量了，加四分之一体积的5×buffer100度煮7分钟，然后12000rpm离心，4度保存。什么时候准备再别人的实验室做一下看看。帮帮我吧！

作者: 喜乐lele 时间: 2013-9-22 17:26

封闭用10%的脱脂牛奶37度2小时，这个条件怎么样呢？有时用37度一小时发出来的背景很深，好像没有封闭好。

作者: lagua123 时间: 2013-9-22 17:27

请问诸位大侠：
我在做western的时候发现个问题，当我在样品里加了SDS-loading buffe, 然后95度加热5分钟，跑电泳检测蛋白，目标蛋白几乎检测不到。但是如果我只是加了loading buffer，而不再95度加热，只在室温下放置15分钟，（据说和95度加热效果相同），然后跑电泳，western后我就可以检测到蛋白的带（虽然不是很强）。有人知道原因吗？或者听说过这样的事情吗？

作者: yes4 时间: 2013-9-22 17:27

可以用0.45um的PVDF膜，我在用，结果挺好的。

作者: abc816 时间: 2013-9-22 17:27

请问蛋白剥脱影响不影响检测啊？有没有无巯基乙醇的配方啊？很急啊，谢谢楼主了

作者: 小野花 时间: 2013-9-22 17:28

17kD和57kD的蛋白同时转用什么条件？
还有我用的预染marker转完淡得看不清，有什么方法可以增强吗？上样了5ul marker.
请帮我看下附件的照片，为什么跑出来的带突然变宽了？最前面的那条细线是什么啊？

图片附件: 41621822.jpg (2013-9-22 17:28, 55.84 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18661

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-22 17:28

请教一个问题：如何配制清除蛋白印迹的bf, 不需要70度，我在有的公司手册上看到相关产品，就是不知道配方！谢谢！

作者: dmg 时间: 2013-9-22 17:29

电转后用立春红染色，见有条带，需要怎样洗脱后继续封闭，孵一，二抗呢？另外封闭液用的是５％脱脂奶，一，二抗稀释液还能用１％的ＢＳＡ吗？

作者: wiwi 时间: 2013-9-22 17:29

分子量230KD胶用的是 6%的转膜条件是 100V 3H,丽春红染后看不到目的条带请教如何改进?,

作者: baidukk 时间: 2013-9-22 17:30

我要检测的蛋白是跨膜蛋白，提取总蛋白后跑电泳，但未能见到目的条带（116kd），一直找不到原因，是否需要提取膜蛋白跑电泳？谢谢!

作者: lxh031 时间: 2013-9-22 17:30

分子量21KD，求助半干转膜的电压及时间。谢谢

作者: cocacola 时间: 2013-9-22 17:30

17kD的蛋白，用什么孔径的PVDF膜比较好，湿转
谢谢

作者: jude 时间: 2013-9-22 17:41

我今天做了表达,目的蛋白的分子量是85KDa,而我用的是10%的分离胶，出现的带比较淡，不知道是不是这个原因影响效果？是不是应给用7.5%的再跑一次？请教一下高手。

作者: DDD 时间: 2013-9-22 17:41

你好!
我是个新手,最近在做Western ,总是做不出来,目的蛋白分子量16.5KD,跑胶2h,转膜4h ,恒流电压90v,5%脱脂奶粉封闭2h,一抗(santa cruze)稀释1:200(建议1:100~1:10000)孵育过夜,二抗1:400,2h,DAB显色总没结果
是不是转膜电压太高了,条件怎么定?郁闷中...........
请高人指导指导

作者: dream2013 时间: 2013-9-22 17:47

最近很郁闷，WB一直做得不顺，主要是转膜效果太差（转了多少次了？忘了，反正没成功过）。

我用的是millipore 0.45um的硝酸纤维素膜，但每次转出的膜都是花的（局部呈半透明），MARKER不清晰，扭曲分散，丽春红染色也是条带不清、模糊。有人说因为我转膜前用含20％甲醇的转膜缓冲液泡了NC膜10多分钟，破坏了NC膜。这种说法有道理吗？如果换用ddH20泡，再在含20％甲醇的转膜缓冲液中转膜一小时，这个过程中甲醇会对NC膜有破坏吗？

急需您的指点！

作者: ero11 时间: 2013-9-22 17:48

我想做大鼠心肌胶原I和III的WB的.请问:1.如何溶解.提取.制样?2.是不是具备商业化的抗体.能现成买到的?3.用5%的SDS-PAGE胶跑会太浓吗?WB的条件?电泳.转膜时间,封闭剂的选择?谢谢!

作者: 2541 时间: 2013-9-22 17:53

我目前也在做这个.现有困惑,需要您来解答! 我跑的样品为大豆抗原蛋白及其酶解产物,SDS-Page电泳上可以看到酶解后的蛋白明显被降解为分子量稍低的多种蛋白产物.而且转印是较完全的, 但是经底物显色后, 只有大豆抗原蛋白出条带,而降解产物一点都没有,是说降解后免疫活性就没了吗?但是按理说不应该,全没啊? 我的上样量为0.8mg/ml,20ul,也不低吧? 请高手快指点下

作者: ha111 时间: 2013-9-22 17:55

你好，你可以上样前煮下样品。stacking gel 用8M的Urea配置

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我的stacking gel用8M的Urea配置的，但是拔了梳子以后加样孔东倒西歪的（影响上样，而且条带也不漂亮），而且加样还往外飘，不加urea的胶就没有这种情况发生，请问该怎么避免上述问题呢？多加上样缓冲液会增加我的上样体积。
请答复，谢谢。

作者: caihong 时间: 2013-9-22 17:57

本人初做western，目的蛋白68KD,胶12.5%，用的是BIO-RAD的，半干转，按1.2mA/cm2恒流转膜2h，但就是转不上，胶用考马染还能看见好多条带，膜用丽春红染无任何条带，请指点！谢谢！

作者: superboy 时间: 2013-9-22 17:58

你好!
我是个新手,最近做一个新药作用真菌后对其蛋白的影响，用western可以做吗？
谢谢！

作者: wanglaoshi 时间: 2013-9-22 18:09

跑电泳的时候突然停了，不是机子的问题。因为这是我第二次做，第一次是再别人实验室做的，一切度很顺利，有些试剂是自己配的，有些使用人家回收的。今天再自己实验室做，所有实际是自己配的，然后跑到大约刚进分离胶的时候不知什么时候就停了，总提示有问题。这是为什么呢？好着急！

作者: hold住 时间: 2013-9-22 18:13

你好：
我做的是肠粘膜损害的机制研究，要用WB测小肠粘膜中NF-KB的含量，再用EMSA检测其核蛋白的活性。
刚开始接触实验，想在年前做好标本，所以想问问此项检测留取标本要怎么留，要怎么保存，能保存多久，还有我们有64只大鼠，每只一个标本，要花费多少钱哦，问题很多，麻烦了，谢谢。
能给我发一份WB的具体操作流程以及一些注意点吗，麻烦了，谢谢！

作者: popo520 时间: 2013-9-22 18:13

我做的是成骨细胞中I型胶原蛋白的WB,基本步骤:首先单去污裂解液提取细胞中的总蛋白，变性后跑SDS-PAGE电泳（积层胶5％，分离胶6％），说明书写的分子量是140KD－220KD之间, 所以转膜3个半小时（半干转）,之后BSA封闭4个小时，一抗(SANTA单抗)4度过夜，2抗常温2－3个小时。做了好多遍了目的蛋白没有结果。b-actin倒是还不错。
请教一下：1 我提蛋白的方法是不是有问题？2 电泳的浓度，转膜时间合适吗？3 b-actin是48KD，这样是不是不能和目的蛋白在同一个胶上跑，只能分开跑？
谢谢！谢谢，盼详细回答！

作者: lxh031 时间: 2013-9-22 18:14

我做WB，actin内参，100V转60min，5%BSA 4度封闭过夜，一抗天津津脉actin，1：200稀释，室温孵育1.5h，然后用TBST洗6次，每次15min，二抗天津津脉1：4000稀释，室温孵育1.5h，TBS洗4次，每次10min，用ECL（Perice）显影，压片1min，背景特高请高人指点谢谢！
还有一个问题，就是转完膜后用立春红染膜，什么也看不到，为什么？谢谢

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作者: KGZ564 时间: 2013-9-22 18:14

看见牛人了，呵呵，有几个问题想请你指教一下：
1，我是做定量western blot，蛋白上样量怎么确定，用考马斯亮蓝吗？
2，我打算买的‘预染蛋白质分子量标准’说明书上说：本预染蛋白质分子量标准用1X SDS-PAGE上样缓冲液配制，不适用于非变性PAGE胶。那我的配胶也要配非变性的胶了，会不会影响蛋白的电泳？

作者: ffooll 时间: 2013-9-22 18:15

你好
我做western 用的是5%的脱脂奶粉封闭1小时,抗体浓度1:1000, 用ECL显影
没有出来条带
我现在想请问如果不封闭行不行

作者: 3648755 时间: 2013-9-22 18:15

我想问：一抗二抗比应该是多少呢？我们实验室多用santa cruz的抗体

作者: 12xunmei 时间: 2013-9-22 18:15

我用的是北京六一DYY-8C电泳仪，半干转，石墨板。
蛋白电泳后用考马斯亮蓝染色条带挺好，试过用0.8MA/CM、1.5MA/CM、2MA/CM,时间从一小时到五小时不等，但转完之后丽春红染膜都看不到条带，而且转膜时间长（4-5小时），膜和胶之间会出现气泡。也有人说过用恒压转，15V，1小时，但我的电泳仪电流只要超过100MA就会报警超载，自动停止。
胶>=膜>滤纸
电极方向膜在正极一边，应该没问题.
请教高手，究竟怎么回事？先谢过啦

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 18:17

请教SD大鼠主动脉平滑肌mdm2 (90KD) 的Western blot 电泳及转膜条件?
我用的条件：湿转，电泳 100V, 2h；转膜 100V, 90min ;北京六一仪器，胶的厚度约1.5mm.谢谢！

作者: 33号 时间: 2013-9-22 18:17

我做过120-120kd的蛋白条带，用的是10%的胶，转膜条件是恒压24V，45min左右，有结果出来。

作者: avi317 时间: 2013-9-22 18:17

我最近在做WB，遇到了点问题，我将一抗用GAPDH和我自己制备的抗体做时，最后显出好几条条带，但只用我自己制备抗体作为一抗处理后，一条带也没有，一抗我做之前刚测了效价，在10-4—10-5之间，按理说应该出条带的，不知是什么原因？

作者: remenb 时间: 2013-9-22 18:22

17kD的蛋白，用什么孔径的PVDF膜比较好，湿转

我用0。45和0。2 的都可以做出来13kd左右的蛋白，当然我还是推荐0。2的比较保险。bio-rad mini western system 100v转60分钟，电流在130mA左右，20％的甲醇电转液。

作者: 3N4G 时间: 2013-9-22 20:04

问一下大侠我用的是BD公司的单克隆抗体,HRP-ECL显色方式,抗体在第一次用的时候效果很好 ,可回收后用第二次就没有条带了抗体很贵现在很郁闷,期盼答复

作者: 831226 时间: 2013-9-22 20:05

请教各位高手：
做caspase9的western blotting，用abcam公司的一次抗体检测cleaved cas-9(37kD)。一抗浓度为1:400,另用anti- rabbit IgG HRP 二抗，浓度为1:8000,电泳定电流40mA,放在大box里湿法转膜定电流30V,4度过夜，同时用42kD的b-actin作内参。转膜后膜上marker 的印记非常明显，应该转膜没问题，再ECL 显色。结果显影后每次B-actin均能清楚显示，而37kD的casp-9则一片空白，仅在10-25kD之间有几条模糊的杂带。参考其他论文，用顺铂处理后的肺癌细胞H69应该有cas9发现，但本人试下来也是一片空白，但实在想不出问题会在哪里？

作者: wmp1234 时间: 2013-9-22 20:05

我也做WB，但是转膜以后用丽春红染色，膜上只有一条带，用考马斯亮蓝G250染胶，胶上没有条带。第二次跑完胶直接用考蓝染色，发现胶上只有一条宽宽的透明带，似乎没有染上色，其它地方没有条带。很是着急，请教高手这是怎么回事？？
十分感谢！！

作者: cj_mondy 时间: 2013-9-22 20:06

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问，但是我的时间有限，问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

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最近做WB，跑完胶，上样空下面总有白色沉淀！
我开了贴，请赐教！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=11065577&sty=1')

图片附件: 63333869.jpg (2013-9-22 20:06, 28.94 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18690

作者: owanaka 时间: 2013-9-22 20:07

有两个问题想请教，
1 蛋白样品煮和不煮有什么差别？为什么有时候不煮反而能出结果？
2 转移缓冲液中加SDS作甚么？我看到一个配方竟然在1000ml中要加50克，是不是弄错了？

作者: owanaka 时间: 2013-9-22 20:07

问一下大侠我用的是BD公司的单克隆抗体,HRP-ECL显色方式,抗体在第一次用的时候效果很好 ,可回收后用第二次就没有条带了抗体很贵现在很郁闷,期盼答复

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一抗要保存好，我的经验是用加BSA的抗体稀释液，里面要加防腐剂，并且要及时放入冰箱－20保存。最好两次间隔不要超过一周。

作者: 8s5g 时间: 2013-9-22 20:09

您好！
最近做了几次western，电泳考马斯亮蓝染色挺好，转膜用biorad设备湿法转，100V恒压转2h，丽春红染色后在膜上仅有几条明显的条带，对转过膜的胶染色发现大部分蛋白还在胶上，胶上的蛋白有比膜上的大也有比膜上的小，在转膜时认真赶过装置中的气泡，转膜过程在冰浴中进行，为什么会出现这种结果？电压或电流较大会导致这种结果吗？我的目的蛋白是140kd左右。
先谢谢了

作者: qqq111 时间: 2013-9-22 20:09

我想请问做免疫器官12KD分子量的蛋白用SDS-PAGE跑，目标出现的很淡；一抗1：100，二抗1：2000；而且条带出现在24-36Maker之间，请指教一下。

作者: jkobn 时间: 2013-9-22 20:10

大侠啊！我昨天做实验忘记收进冰箱了！大概20多小时！会不会失效啊？？？谢谢啊

作者: she 时间: 2013-9-22 20:11

最近在做细胞通路，p-Akt和Akt。我现在是p-Akt能出条带，但是Akt老是没有，或者条带不全，已经重复几次了都这样。我用的是同一张膜，先加p-Akt一抗，曝光后第二天再加Akt一抗。以前我师姐也是这样做的，有结果。两种一抗、二抗都是师姐留下来的，没过有效期。我不知道到底什么地方出问题了，给我出出主意吧。多谢了！

作者: wmp1234 时间: 2013-9-22 20:12

一抗一定要在4度下摇动吗，谢谢

作者: gogo 时间: 2013-9-22 20:12

我是一位新手，现在开始准备做western,请问，对装所配试剂的瓶子有何要求呀？谢谢！

作者: glass 时间: 2013-9-22 20:13

我做这个实验好长时间了，目的条带始终没出，现在说说我的实验步骤，望大侠指教啊！
8%的分离胶，电泳时恒流20MA下层30MA，跑四五个小时左右，250MA湿转1小时，5%奶粉封闭1小时，一抗孵育过夜，TBST洗两次，每次10分钟，二抗孵育一小时，TBST洗膜后ECL显色。
蛋白定量后，总蛋白加100-200微克，转膜后立春红染色蛋白条带清晰，内参粗，目的条带细，但是显影无条带。
我曾经做出来过内参，很整齐，说明内参的一抗和二抗都没有问题，但是现在内参也做不出来了，不知道是什么原因，而且发现凝胶比以前慢尤其是上层胶更慢。
请大侠不吝赐教啊！

作者: nut6694 时间: 2013-9-22 20:14

每次转膜封闭孵育一抗二抗后发光整张PVDF膜都发光根本看不到有特异性条带请问这是为什们呢？

作者: 分子式 时间: 2013-9-22 20:15

请问如果是大分子量蛋白，该怎么做呢？我的蛋白有290kD，最大的maker250转过去了，可是western却什么都没有。我用了5%的分离胶和5%的积层胶。用100V transfer 6hr，不知道是什么原因，可以帮忙分析下吗？

作者: 2541 时间: 2013-9-22 20:16

我是一位新手，现在开始准备做western,请问我的蛋白是155KD，按理说应该用7.5%的分离胶，那麽积层胶应该用多少？还有我看国外的一篇文章三个蛋白一起电泳，分别为155KD，140KD，130KD，用的是12%的胶，我不明白，能用那麽大的胶跑吗？他是湿转，100V，1小时，我看你前面介绍170KD的湿转是48V，10h~16h,他的方法可行吗？

作者: TNT 时间: 2013-9-22 20:17

审稿人说我的wb需要CBB pattern as loading control,我看到一篇文献上确实有CBB作为loading control 的，但是我发现那上面的都是一条带，难道是这样做这个control的吗：上样后只电泳一小会就去染色吗？那样总蛋白才不会分开才会只显示一条带？

作者: 二丫头466 时间: 2013-9-22 20:24

我做的蛋白是IL-2，分子量大约在15KD，做western blot 一次也没做出来， X-光片是空白的，封闭是5%脱脂牛奶，封闭2h，封闭后漂洗10min,包一抗。一抗是单抗，用的是ABCAM稀释比例为1：800，二抗稀释1：2000，37度各孵育一小时，漂洗一小时，与发光低物反应1min,压片5min ,转膜没有问题已排除，没有条件作阳性对照。指点一下问题出在那里，谢谢!

作者: biabiade 时间: 2013-9-22 20:24

15kd比較小...一般膜20kd的蛋白就開始有點模糊

我覺得用0.22的PVDF膜比傳統0.45的膜有助於改善

除非swusong 兄同一張上面有比15kd更小的band出現

作者: biabiade 时间: 2013-9-22 20:25

關於蛋白質的轉移
有兩個方向
一個是高電壓短時間
另外一個就是低電壓長時間

一般來說同時要轉兩三個蛋白
低電壓長時間結果會比較sharp一點點

高電壓會比較模糊一點點

作者: PCR 时间: 2013-9-22 20:25

谁从外周血提取过单核细胞？请赐教不胜感激

作者: kuaizige 时间: 2013-9-22 20:26

我做WB已经有半个月了，可是没有跑出条带。转膜之前的步骤我已经没有问题，做了几次后都用丽春红进行了膜的漂染，有蛋白条带，这说明蛋白我已转到膜上，没有出现条带的问题可能出现在后面的步骤中。
转膜后先摇床上用TBST洗3遍，每次5分钟，我是放在培养皿里的，用5%的脱脂牛奶（TBST配制）室温摇床上封闭1h，封闭后再用TBST洗3遍，每次5分钟，我一抗是兔抗（S Curz），1：200稀释（TBST稀释），将膜按Marker标志把目的蛋白位置处的膜剪下，置于杂交带中，把一抗加进去（这样做是为了节省抗体），4度过夜。
第二天，TBST洗3遍，每次5分钟，加入二抗（我是国产的，羊抗兔，1：10000TBST稀释），摇床室温1.5h，然后TBST洗3遍，每次5分钟。
化学发光剂进行发光5min，在此过程中我已经注意了膜的正反面。然后就去暗室进行曝光，曝光了很多次，数秒至数分钟，可是都没有出来。
请麻烦看一下，我的问题出在哪？是不是抗体有问题？
还有，我看了一些资料说，可是用点杂交的方法对抗体进行验证，请问具体怎样进行，还有什么方法可以对这后面的各环节进行验证的没？
静候回复，谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-9-22 20:27

做内参两个多月，一直调不平，而且一直出现四条带，根本不知道哪个是，用的是santa cruz 本身说明书说的43kd的大小可它的date上的条带却明显低于43 。急啊，望高手指点

作者: #问号# 时间: 2013-9-22 20:27

我想问一下，一抗跟二抗放了-80几天会不会有问题。说明书上都是说放-20的。但是因为实验室停了几次电，因此放了-80保温几次。现在刚做了之后连以前做有条带的都没有条带了。是什么问题呢？？

作者: 969 时间: 2013-9-22 20:28

现在刚刚开始做western blot，内参做出来了，可是目的条带始终没有出来，一抗是进口原装的。我的电泳胶是glysine-SDS-PAGE胶，12.5%分离胶，5%积层胶，考马斯亮蓝染色在17KD以上的蛋白条带很好，条带之间非常清楚，可是17KD以下蛋白的跑不出来或者很模糊，而我的目的蛋白14.4KD，为什么呢？电泳积层胶75v,分离胶100V。并且，全部western体系可以做出43kd的内参啊。急求原因啊。另外我使用裂解液中加入了PMSF、EDTA、Aprotinin，什么原因引起这个的呢？有什么特殊注意的嘛？感激不尽！我给你邮件发不出去。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-9-22 20:29

请问有没有将胰岛素用荧光素标记的方法，有没有试剂盒。谢谢

作者: 8princess8 时间: 2013-9-22 20:30

请教一下前辈，我做的抗体的分子量是33kd，上样量是60ug，浓缩胶是5%，分离胶是10%。转膜的时间也对，膜也用甲醛泡了，为什么做的结果目的条带还是不明显呀？？还有33kd的转膜多长时间、电流多少、？？

作者: yueban-1147 时间: 2013-9-22 20:30

我想做Western blot ，可是在蛋白提取的时候普通的RIPA对皮肤组织根本没有作用，RIPA：2.5M Nacl ，Triton X-100，脱氧胆酸钠，20%SDS，1M Tris-Hcl
（pH7.4），PMSF，所以我想问一下，提皮肤蛋白的时候的裂解液配方是什么啊？谢谢！！

作者: Ao7 时间: 2013-9-22 20:32

请教高手：１、提取蛋白时如何防止ＨＩＦ降解？２、能否给一个ＨＩＦ转膜的条件做以参考。谢谢！

作者: jkobn 时间: 2013-9-22 20:33

在线求助————WB，孵育完一抗后，PVDF膜忘记正反面了，用的是ECL试剂。不知道该如何进行下去？急啊！！！

作者: yapuyapu 时间: 2013-9-22 20:33

没接触过蛋白方面的东西。
问的不入流，还请大家多包涵啊～
提前谢谢各位热心帮忙

亲手发帖小声土问一句：不同物种的磷酸化抗体是否可以通用，如何判断？提前谢谢各位热心帮忙

作者: zzzz 时间: 2013-9-22 20:34

我想请教一次，我是新手呀，见笑了，我现在做的TNF-a,17Kd,之前用一抗1：400，二抗1：1000做出来还可以，之后总是背景很脏，条带淡，原来转膜时间是两个小时200mA，后来调整到一小时，200mA,但效果都不好，想请教一下该怎样调整

作者: kulee 时间: 2013-9-22 20:35

请教
我的western突然做不出来了。
2个星期以前我的western做得非常的顺利，可是由于上次停顿了几天没有做，然后就一直都做不出来了。我的目的带是磷酸化的检测，我用的条件和抗体都是一样的，只是蛋白样品不一样，起初我以为是蛋白样品的问题，然后我用之前我做出来过的样品做，同样也没有做出来。然后我又重新做了几次，这次我检测了转膜效率并且优化了转膜条件，用丽春红染色检测膜上的蛋白条带，结果表明转膜没有问题。难道是抗体的问题？我的一抗是从CST公司购买的，保存在-20度一年半了，二抗是几个月以前购自Amersham公司的。我杂了好几次，有几次都有背景，就是没有目的带，表明二抗是没有问题的，难道是一抗不行了吗？
在线等。谢谢。

作者: cwcwcww 时间: 2013-9-22 20:35

相关疾病：
头痛
专家呀，关于western，我有一很头痛的问题，做完后发现膜上有条带（在干燥时看见很清楚，干燥后再放入水的瞬间更清楚），不过不是那种曝光很强留下的棕黄条带，是那种淡淡的对着光能看见的条带，用丽春红染色后显出的条带与前面看的一致，但是就是做不出结果，一抗二抗ECL显影液等各环节都没有问题，请问有可能是蛋白降解导致的呢？连actin都做不出来。我百思不得其解啊。请赐教

作者: 911 时间: 2013-9-22 20:36

最近做WB出现了很奇怪的现象。曝光后胶片上黑色带状影纵向沿上样孔的两侧分布（每个上样孔均是如此），与横向的条带相连。形成一个“∏”的形状。
请问问题可能出在哪里呢？！
谢谢！

作者: 分子式 时间: 2013-9-22 20:36

最近做western 跑胶时各组样品分不开，连成一条线，这是怎么回事啊？多谢高手指点

作者: 分子式 时间: 2013-9-22 20:36

最近连续做了六次western，但是就是发不出β-actin来，目的蛋白很清楚，找了很多原因，改了很多次，还是发不出来。我是用全蛋白提取试剂盒提的蛋白，提好后-20保存，电泳是biorad mini 100V 120min,转膜是200mA 内参60min,目的蛋白130min.一抗是santa的，二抗是北京中杉的。以前师姐按照这个条件都能做出，为什么我做不出来呢而且是内参发不出来。请各位高手指点，谢谢

作者: wiwi 时间: 2013-9-22 20:37

老师您好，我这几天做western遇到一些问题，请教您一下。我做western两个多月了，摸索了较为合适的条件，出了几张还可以的图。但从上个月24号那天开始，用ecl显色做出的图貌似显色发生了反转，蛋白条带反而不亮了，如下图1；然后我用相同的western操作，最后用DAB显色得到图2，蛋白条带能看到，麻烦您看看，是不是能确定我的显色底物出了问题。谢谢！

图片附件: 94852816.snap.jpg (2013-9-22 20:37, 7.77 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=18691

作者: huifeng0516 时间: 2013-9-22 20:37

最近做western 跑胶时各组样品分不开，连成一条线，这是怎么回事啊？多谢高手指点

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我想可能原因：1：上样量太大
2.上样速度慢，蛋白扩散
3.样品中有沉淀，就是加完样，开始电泳后10min内可看到有一部分样品积在胶上方，过久一点才会下去，我觉得这些沉淀破坏了胶的形状，导致了你说的“成一条线”，不知你有没有碰见过

作者: 33号 时间: 2013-9-22 20:38

想问一个关于制抗体方面的问题，我要合成一个13个氨基酸的小肽，之后制它的抗体，问了一下上海生工，他们可以合成，但是因为小肽太小，要偶联一个BSA之类的蛋白才能打兔子制抗体。我看国外的文献又用17个氨基酸的小肽直接制抗体的，不知国内的公司是不是都要偶联蛋白，还有哪个公司做这方面比较强的？

作者: 薄荷侠 时间: 2013-9-22 20:38

你好啊！我做P16 分子量16KD，用的是abcam的抗体，一抗说明书上一抗的浓度是500-2000 我500做过一次 250做过一次都没出结果。lysis buffer提细胞总蛋白上样量100微克,转膜是半干转1h，内参43kd能出来很好的结果.用的0.22微米PVDF膜,5%奶粉封闭4个小时,一抗4度过夜,二抗1:2000 室温一个小时,ECL发光.请给我指导一下.多谢了

作者: zhenxin 时间: 2013-9-22 20:38

我做caspase3的17KD的wb，用12%的胶，跑完后进行半干法转膜，条件是15v，30分钟，转后用丽春红染色结果没有蛋白条带，请指教，谢谢
关于17KD的WB在跑胶，转膜，抗体孵育的过程中，你给些建议好吗？谢谢

作者: 89tongzijun 时间: 2013-9-22 20:39

请教各位前辈,我现在要做一个7KD的COX17蛋白,用的Tricine胶,20V,4度过夜转膜,膜是0.22的PVDF膜.

做了几次,蛋白上样量从10微克到100微克都做过,一抗1:1000室温2小时孵育后,内参都没问题,但目的蛋白一直做不出来.

请问:
1,7KD的蛋白用银染可以染出来吗?有什么条件吗?

2,我加抗体染不出来,可能的原因是蛋白量还是太少?还是因为蛋白压得不够紧?还是抗体浓度的问题?

有没有人做过类似的实验呢?请教教我,万分感谢!!!

作者: shanzhapia696 时间: 2013-9-22 20:39

请教高手，我第一次做WB，目的蛋白分子量是13kd，我选了5%的浓缩胶和15%的分离胶，电泳时浓缩胶用80V ，分离胶用120V ，样品的浓度是5mg/ml,上样量是20ul.结果电泳时发现泳道上没有明显压缩的条带，而是像一团云雾，且弥散到旁边的泳道，marker起初还能分离做出条带，不过是歪歪扭扭的，且到后面小分子量的条带都没跑出来。后来我换成了5%的浓缩胶和10%的分离胶，电泳时可以看见泳道上有明显压缩的条带朝胶的底部移动，且marker的条带很清晰，很直。但是用考马斯亮蓝染胶后，泳道上没有蛋白条带。我怀疑是我的胶的配方有问题，我提的蛋白也有问题。我的5%浓缩胶（5ml）的配方是：双蒸水3.42ml；30%Arc/Bic 0.833ml；1M Tris-Hcl（PH6.8） 0.625ml；10%SDS 50ul；10%APS 75ul；TEMED 7.5ul。15%分离胶（10ml）的配方是：双蒸水2.35ml；30%Arc/Bic 5ml；1.5M Tris-Hcl（PH8.8） 2.5ml；10%SDS 100ul；10%APS 50ul；TEMED 5ul。

作者: nvdabing 时间: 2013-9-22 20:40

我做P21（WAF1）蛋白，理论上应该是21kD，可是我做了几次，做出来大小都是34kD 左右。请问这是什么原因呢？？

作者: nikonun 时间: 2013-9-22 20:40

看到这么牛帖子，不禁大吃一惊。。。
我最近想用western 检测胰岛素。。。
看了很多文章，只有一到两篇通过western检测出来了胰岛素。。。
因为胰岛素分子量特别小么。。。我用的18%的胶
而且成熟的胰岛素是A和B链通过二硫基连接起来的。。。
不知道是不是对western有没有影响？

作者: lgm 时间: 2013-9-22 20:41

您好，我想咨询一下，分子量是170Kd的话，该选用什么膜呢，如何根据分子量来选膜及两种胶的浓度呢，谢谢您

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-9-22 20:41

楼主您好！

我最近正做werstern blot，目标分子是心肌细胞肌浆网上的RyR2受体，分子量565kD，不知楼主是否对大分子蛋白的western blot经验如何？？？

我碰到的问题非常多：

1. 蛋白样品是采用全细胞蛋白还是肌浆网蛋白：前者比较简单，但由于RyR2受体在全细胞蛋白中的比例有限，不知该上样多少ug，后者比较麻烦，而且肌浆网我也没有提取过。
2. 大分子蛋白转膜条件的摸索，湿转的电流、时间如何控制、摸索？？

愿楼主不吝赐教，万分感激！！！

作者: =pkchen= 时间: 2013-9-22 20:41

请教一个问题。我最近跑HIF-ALPHA。但是出现个问题是条带总是呈一条线。而且即使我只加样4个孔，做出来还是再一张膜8cm宽的上还是一条线。我用考马斯亮蓝染了结果一样的。有人给我说是胶的问题，我不太懂，所以请教你。（先不考虑上样量和蛋白本身的问题）

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-9-22 20:42

做了好多次WB，总是发现曝光往往不尽如人意，我用的是FUJIFILM LAS 4000进行曝光，经常出现虽然有目的条带，但是背景色很浓的情况，不知道是什么原因？？
有人说这个可能和显影液有关，我用的是超敏的，有人建议我用下非超敏的，有人又说和显影液没有关系的？
我每次曝光时也没有对机子进行过任何的设置。。。是不是曝光时间过长了，我是10s每次？
我做出来的条带

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作者: afruit 时间: 2013-9-22 20:54 标题: 回复 #1271 pencil菲的帖子

做个经心脏全身生理盐水灌注即可将肝血窦中的血冲出来。

作者: guokezi 时间: 2022-7-18 15:54 标题: 磁珠偶联抗体

磁珠偶联抗体时，抗体从-20℃拿出来，发现有沉淀颗粒物，最后做出来的一抗测值偏低，是抗体问题吗？

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-8 16:39

非常感谢您的反馈和分享经验！我会尽量提供具体和详细的回答，以便您和其他人更好地理解和解决问题。如果您有任何具体的问题或疑问，欢迎随时提出，我将尽力给予帮助。同时，如果您愿意在帖子中分享您的经验和技巧，那将对其他人非常有益。谢谢您的支持！

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