分析测试百科

标题: 【求助】浓缩胶 [打印本页]

作者: 12xunmei 时间: 2013-10-7 13:50 标题: 【求助】浓缩胶

我的样品在浓缩胶里总是浓缩不好,浓缩不成一条线,大概有0.3毫米那么粗,我师兄说浓缩不好是温度太低的原因,可是有一个人他同时跟我跑电泳,他的就很好,不过他用的bio-rad的仪器，难道是我配的胶的问题吗？

作者: ii077345 时间: 2013-10-7 13:50

可能和样品浓度太高有关吧,有的时候样品太粘稠浓缩胶有弥散的感觉

作者: yes4 时间: 2013-10-7 13:51

也可能是你的样品处理有问题把

作者: abc816 时间: 2013-10-7 13:51

和样品有关，我的样品经常在浓缩胶里并不成一条直线，但加大电压到分离胶后就成一条线了。

作者: 12xunmei 时间: 2013-10-7 13:51

我的分离胶电压80v,浓缩胶100v.电压不低啊.我估计是样品的浓度有关,大家都把样品的浓度调成什么浓度啊

作者: duoduo 时间: 2013-10-7 13:52

对于SDS-PAGE gel 垂直电泳们根据电流进行电泳。mini gel 1枚stacking gel 10mA,running gel 20mA,2枚成倍。standard gel1枚stacking gel 20mA,running gel 40mA。可根据需要加快电流时间，但要防止产热玻璃破碎。

作者: yonger 时间: 2013-10-7 13:52

分离胶电压80v,浓缩胶100v，电压条件可以了，不知道你染色出来的条带清晰不？

作者: yes4 时间: 2013-10-7 13:52

我有和他类似的问题！我是在浓缩胶里很好，但是到了分离胶，越跑越宽，不规则弥散

图片附件: 12185625.jpg (2013-10-7 13:53, 26.62 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=19086

作者: yes4 时间: 2013-10-7 13:53

而且，跑完没有明显的条带，从上到下拖尾很严重，不知道是怎么回事～～～谁能指教一二啊！

图片附件: 49108274.jpg (2013-10-7 13:53, 30.98 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=19087

作者: rxcc33 时间: 2013-10-7 13:53

从第一张图看染料似乎多了，你上样量很大吧，染料多倒也不影响分离效果，即使没有浓缩成一条线也没关系。从第二张图看分离效果不好，或者是样品有降解，你跑个marker看看分离效果如何，现在不知道你用的是什么配比和浓度的胶，也不知道是什么样品及其浓度，如果是浓度很大的样品，可尝试稀释后再加样品缓冲液。泛泛的分析原因，不知有没有帮助。

作者: yes4 时间: 2013-10-7 13:54

第一张图是还没染色的，箭头是溴芬兰，很扩散，不成一条细线，我没说清楚，对不起。第二张是第一张的胶染色，脱色后照的照片，我样品加了复合蛋白酶抑制剂，应该不会降解把？我提取的是淡色库蚊总蛋白，液氮粉碎虫体，按照1克组织加5ml裂解液（8M尿素，4％CHAPS, 65mMDTT），4度一小时，不时颠倒混匀，10000rpm，30min,取上清，15000rpm,20min,取上清，-80度保存。我又跑了一个胶，加了MARKER，MARKER跑得很好，但是没有我提取的蛋白质条带，仍然是拖尾，上样倍比稀世了，1/2，1/4，1/8都没有明显条带，蛋白样品测了浓度，相当于每个孔50微克蛋白，并不高啊！请问分离胶，浓缩胶的Tris的PH，还有电泳缓冲液的PH,是不是都要调得很准？否则就是拖尾？

作者: 12xunmei 时间: 2013-10-7 13:54

我的SDS跑出来还是能分的清条带的,但是我是marker跑的总是很丑陋，条带象个棒槌，不是很归整的那种，我用的marker是低分子量的，４.１ＫＤ－６６ＫＤ，我跑的是Ｔricine-SDS-PAGE,分离胶的浓度为１６.５％

作者: eric930 时间: 2013-10-7 13:54

老兄：浓缩胶电压大了40-50v试试

作者: newway 时间: 2013-10-7 13:55

我的分离胶电压80v,浓缩胶100v.电压不低啊.我估计是样品的浓度有关,大家都把样品的浓度调成什么浓度啊

===========================================================================================================

浓缩胶和分离胶的电压是不是搞反了！一般分离胶的电压要比浓缩胶的大，一般我跑蛋白电泳，浓缩胶80~90V,分离胶150~160V，没问题的，跑出来的胶也很漂亮。而且用小胶bio-rad的，也跑得很好。如果觉得蛋白浓度高的话，可以减少上样量，一般是没什么问题的。

作者: newway 时间: 2013-10-7 13:55

第一张图是还没染色的，箭头是溴芬兰，很扩散，不成一条细线，我没说清楚，对不起。第二张是第一张的胶染色，脱色后照的照片，我样品加了复合蛋白酶抑制剂，应该不会降解把？我提取的是淡色库蚊总蛋白，液氮粉碎虫体，按照1克组织加5ml裂解液（8M尿素，4％CHAPS, 65mMDTT），4度一小时，不时颠倒混匀，10000rpm，30min,取上清，15000rpm,20min,取上清，-80度保存。我又跑了一个胶，加了MARKER，MARKER跑得很好，但是没有我提取的蛋白质条带，仍然是拖尾，上样倍比稀世了，1/2，1/4，1/8都没有明显条带，蛋白样品测了浓度，相当于每个孔50微克蛋白，并不高啊！请问分离胶，浓缩胶的Tris的PH，还有电泳缓冲液的PH,是不是都要调得很准？否则就是拖尾？

===========================================================================================================

到了分离胶，溴芬兰开始扩散，通常可能是电极缓冲液配的不对或用的次数太多了，没有足够的离子强度推动蛋白向前移动，由于分离胶和浓缩胶的作用不一样，在分离胶中蛋白的移动完全是靠蛋白的分子量，并不具有浓缩效应，所以在分离胶中就开始扩散，一般在跑的时候可以发现跑得很慢。也可能是pH调的不准，在我看来跑胶的时候PH很重要，所以配的时候要注意这一点。蛋白MARKER跑得好，而目的蛋白却不好，有可能是你稀释的太多了，通常在高表达的时候，有必要稀释，一般提取先不要稀释看看，问题不是很大的，而且拖尾不是蛋白浓度高导致的，是因为有杂质，上样前先离下心，比较好。而且就从你的第二张图上看到，也有些像没配浓缩胶，光用分离胶跑的，光用分离胶跑的话，跑出的蛋白条带就是不是一条带，有些散的，而且拖尾很严重。所以也有可能你的问题在浓缩胶上面，没配好浓缩胶。

作者: 12xunmei 时间: 2013-10-7 13:56

是我把两个电压写反了,电压过大会不会产热太厉害啊,我以前用过浓缩胶跑40V电压的，跑的非常慢,差不多两个小时才把浓缩胶跑完

作者: yes4 时间: 2013-10-7 13:56

我跑得胶有浓缩胶，我把它切掉了。我重新配了电泳缓冲液，Tris－cl（6.8/8.8），希望会出结果。GOD BLESS ME!

作者: cwcwcww 时间: 2013-10-7 13:56

嗯我也觉得是电泳缓冲液老了

我现在都是新配着用 stacking得很平

重复用一次就没有新配得好从条带上看很明显

作者: 8黑眼圈8 时间: 2013-10-7 13:57

热扩散在电泳中的控制极端重要，一般的条带变粗都与温度升高引起热扩散有关。接冷凝水循环降温！会有很好的效果！做个预试摸一下最佳的样品浓度。

作者: 8黑眼圈8 时间: 2013-10-7 13:57

电泳液一般我就用三遍！

作者: 04906 时间: 2013-10-7 13:57

我心急，170V从头到尾70分钟；
我节俭，电泳液一直在用；
但条带（考染）都很好呀！

作者: dog002 时间: 2013-10-7 13:58

蛋白大小不同，对胶的浓度要求不同，要看清，分辨条带还是要慢跑。缓冲液用久了，当然电泳效果不好，离子浓度变化了嘛。
我们上半缓冲液只用一次，下半可反复使用。

作者: am10 时间: 2013-10-7 13:58

跑恒压电泳可以是浓缩胶100V ,分离胶60v,这个没问题的，完全可以的。我跑过很多次，都很好。并不是写反了。尽管有许多文献是分离胶电压比浓缩胶高。
我的感觉就是浓缩胶和分离胶的PH一定要调准。
其二是蛋白量是不是可以少点？我一般都只上20～30ug, 跑出来比较好。
夏天跑电泳最好加冰浴，冬天跑就不必了。用bio-rad 的挺好。
电泳液可用4～5次的。内液和外液分开回收。外液有时我都用7～8次。
我比较同意楼上的观点，即浓缩胶大点电压，尽量在短的时间内压窄，而分离胶慢点跑，分得开些。就像赛跑一样，100米短跑可能看不出差别，但1000米，5000米跑慢慢地就拉得开距离了，呵呵。一个不太贴切的比喻吧。供参考。

作者: woshituzhu 时间: 2013-10-7 13:58

我做sds－page的时候也是跑不到一条线上
很郁闷
一些师兄师弟都说很奇怪
他们都能跑到一条线上
难道是因为我的样品没弄好？？
说浓度过高的话，可是又没条带
不过里面含有很多糖，我现在就是担心是糖的影响
很麻烦

作者: wsll 时间: 2013-10-7 13:59

很奇怪！
有的实验书上说要保持恒压，有的要恒流，到底应该怎样？
我在的实验室都是恒流跑电泳的。

作者: wsll 时间: 2013-10-7 13:59

我觉得和胶的浓度有关。我用人血清稀释100、200、400.、800、1000、2000倍后作为样品，在4%浓缩胶与12%分离胶中就能压缩成细线，但是在5%浓缩胶和15%分离胶中就不能压缩成细线，总有1~2毫米宽。但不管如何，染色后的条带还是清楚的。

作者: flower-201 时间: 2013-10-7 14:00

我们是浓缩胶、分离胶都160V，有BIO-RAD的小胶，也有六一的大胶，跑出来都非常好

作者: qiangren789 时间: 2013-10-7 14:00

这个我也有点疑问，按照物理知识，恒流的话，也就是恒定的产热，不考虑温度对电阻的影响，这个时候，电压是持续上升的，我以前跑恒流30ma，到后来，电压都到300v，但效果也还可以（bio－rad的mini），而且很省时间，一个多小时吧，后来跑恒压，效果也还可以，就是时间稍微长点，一般我在分离胶时用150v，刚开始这个时候电流可以达到60ma。
所以，我的理解是恒压恒流都可以，但要根据设配提供的限度，我看有些人做得时候先用恒流跑，跑到电压上去了，再用恒压跑，呵呵，谁知道效果是不是更好呢！

作者: yueban-1147 时间: 2013-10-7 14:01

我有一段时间跑SDS-PAGE的时候指示剂也是跑得比较宽，在浓缩胶里无论如何也压不成一条细线，那时我用的是按照《抗体技术实验指南》配制的10X电泳缓冲液。在此之前几个月我首次学着跑SDS-PAGE，用的是别人配的缓冲液，用同样配比的胶跑的，在浓缩胶和分离胶界面的地方压缩得很好。我重新配了各种缓冲液、仔细地调了pH，可还是同样跑得很宽。看了不少资料，最终找到了原因。后来指示剂在到达浓缩胶和分离胶交界面的时候都能跑直、并且成为一条细线。

这个原因是挺不起眼的：《抗体技术实验指南》中10X电泳缓冲液的配制那里说要把pH调到8.3；而后来看到另外一本经典的分子生物学技术书籍上说这种10X电泳缓冲液是不需要调pH的，稀释成1X的以后pH约为8.3，一些别的书也有这样的说明。于是配了一次不调pH的10X电泳缓冲液，别的没有换，跑得就很不错了。如果你在操作方面没什么问题，注意一下所用溶液方面是否存在问题——盐浓度、pH等方面。

有时出问题的因素就是那么不起眼的，好好研究研究，会找到原因的。

作者: zsxan1990 时间: 2013-10-7 14:01

热扩散在电泳中的控制极端重要，一般的条带变粗都与温度升高引起热扩散有关。接冷凝水循环降温！会有很好的效果！做个预试摸一下最佳的样品浓度。

作者: zsxan1990 时间: 2013-10-7 14:01

这个原因是挺不起眼的：《抗体技术实验指南》中10X电泳缓冲液的配制那里说要把pH调到8.3；而后来看到另外一本经典的分子生物学技术书籍上说这种10X电泳缓冲液是不需要调pH的，稀释成1X的以后pH约为8.3，一些别的书也有这样的说明。于是配了一次不调pH的10X电泳缓冲液，别的没有换，跑得就很不错了。如果你在操作方面没什么问题，注意一下所用溶液方面是否存在问题——盐浓度、pH等方面。

有时出问题的因素就是那么不起眼的，好好研究研究，会找到原因的。

======================================================

"10X电泳缓冲液是不需要调pH的，稀释成1X的以后pH约为8.3".学习了！

作者: zsxan1990 时间: 2013-10-7 14:02

这个我也有点疑问，按照物理知识，恒流的话，也就是恒定的产热，不考虑温度对电阻的影响，这个时候，电压是持续上升的，我以前跑恒流30ma，到后来，电压都到300v，但效果也还可以（bio－rad的mini），而且很省时间，一个多小时吧，后来跑恒压，效果也还可以，就是时间稍微长点，一般我在分离胶时用150v，刚开始这个时候电流可以达到60ma。
所以，我的理解是恒压恒流都可以，但要根据设配提供的限度，我看有些人做得时候先用恒流跑，跑到电压上去了，再用恒压跑，呵呵，谁知道效果是不是更好呢.

====================================

恒流时，电压会渐升；恒压时，电流的变化呢？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)