分析测试百科

标题: 【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗? [打印本页]

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-9 16:53 标题: 【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?

最近做western blot ,电泳,转膜感觉没问题,转出的膜用丽春红染色,条带清晰,用5%的脱脂奶粉封闭1小时,加一抗,一抗用TBS稀释,另加5%BSA,4度过夜,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,加二抗,二抗用TBS稀释,37度孵育1小时,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,显影,定影,结果没有任何条带,感觉步骤没有问题,就是不出带,是不是一抗孵育不上的原因吗?谢谢大家.

作者: 7437654 时间: 2013-10-9 16:54

条带没有出来原因可多了要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了可以加少量二抗与发光液混合在暗室里观察有无荧光，如有表明二抗与发光液是没有问题的
显影定影是最后一步，如果抗体结合的好但压片不成功也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！

作者: gogo 时间: 2013-10-9 16:57

我最近做western也是这样，条件跟以前一样。郁闷。

作者: am10 时间: 2013-10-9 16:57

还要看看你的样品保存的怎么样，不会目的蛋白降解了吧，用新样品试试。

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-9 16:57

谢谢,我把二抗和发光液混在一起,发现荧光很亮,看来二抗没问题,不清楚是不是抗体浓度的问题?我一抗1:1000稀释,二抗1:20000稀释,用这个稀释浓度,有一个蛋白可以出条带,但另一个蛋白不出条带,不知道是什么原因?

作者: 8s5g 时间: 2013-10-9 16:58

是否存在其中一个降解的问题？
两个蛋白的上样浓度是一样的不？

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-9 16:58

同一个总蛋白，检测的目的蛋白不同，上样浓度也一样

作者: DONT 时间: 2013-10-9 16:59

我也碰见和你一样的情况，现在我二抗4度过夜可以看到蛋白，我怀疑是一抗和二抗结合能力较差，所以没有条带

作者: yysr238 时间: 2013-10-9 17:01

条带没有出来原因可多了要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了可以加少量二抗与发光液混合在暗室里观察有无荧光，如有表明二抗与发光液是没有问题的
显影定影是最后一步，如果抗体结合的好但压片不成功也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！

您说得很有道理，我有一个问题想请教一下，那如何排除一抗是不是过期失活了的问题呢？谢谢了

作者: 33号 时间: 2013-10-9 17:02

也有可能是一抗和二抗结合能力太差，我也碰见这样的情况，二抗与发光液混合在暗室里观察有荧光，我也怀疑是一抗的问题，后来二抗4度过夜，就有了条带，而且很漂亮，你也可以试一下

作者: PINK 时间: 2013-10-9 17:02

原因估计有以下几种：
1.目的蛋白量不够。
虽然你同样的上样，其他蛋白可以检测到，并不代表这种蛋白就一定可以。不知道你目的蛋白是什么，在哪里表达。你查过该蛋白的表达量如何吗？建议你确定下再说。因为有的蛋白表达量很低的，尤其是细胞核内蛋白。（不妨加大量试试，不犯法的）

2.一抗问题。
你看不到条带，而转膜和二抗似乎都没有问题。那就应该是一抗的问题了。
你可以把提高一抗浓度，过夜，完了第二天再室温摇一个小时，然后洗三次，每次5分钟。注意严格控制时间，一抗不要洗过了。

如果重复几次还不行，估计你就要找公司说说了，有时候不见得他们的抗体都没问题。

作者: 04906 时间: 2013-10-9 17:03

我的目的蛋白是钙调蛋白激酶二（CaMKII），提的是总蛋白，上样100微克

作者: PINK 时间: 2013-10-9 17:03

该蛋白应该不会有太大问题，重点看一抗吧。估计问题就是它了。

作者: plaa 时间: 2013-10-9 17:04

大家的一抗浓度都很低啊，我买的说明书上建议从1：200开始，可是这个浓度什么都没有看到，难道应该降低浓度？
测浓度梯度是不是直接在膜上直接点样+一抗+二抗+显色剂，还是要跑胶？

作者: veiwu 时间: 2013-10-9 17:04

我最近也出现这样的问题，条件和以前一样，但是就是没条带，检查抗体应该都没问题，最后总结可能是抗体浓度还需要调整我做的的分子量是80KD，要不就是样品需要新鲜的

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)