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标题: 【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？ [打印本页]

作者: 鹿奔奔 时间: 2013-10-10 15:52 标题: 【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？

我用的是bio-rad的western blot电泳仪，以前转膜时，用的都是恒压，70v，150min。最后也能出结果，但结果不好，在论坛上，我看大家用的都是恒流，我想知道是不是我转膜条件错了。谢谢各位大侠！

作者: yjf1026 时间: 2013-10-10 15:53

我用的是恒流，270mA，100min。没有失败过一次。

作者: bling 时间: 2013-10-10 15:53

我用100v 100 min 也没失败过一次

作者: fox_79 时间: 2013-10-10 15:53

用稳流效果很好，不妨换换试试

作者: avi317 时间: 2013-10-10 15:54

我通常用恒压，100v， 60 min，效果还可以。
转膜缓冲液最好用新配制的，加上预染MARKER吧，可以监测一下转膜的情况，具体操作大家的可能差不多，多注意一下细节问题就是了，比如说在作“三明治”的时候注意一下速度，冰块降温，根据蛋白的大小和实验室的具体情况选择不同的膜等等。
在刚开始作WB的时候摸条件是必需的，失败也是正常的，继续加油哈！

作者: 鹿奔奔 时间: 2013-10-10 15:54

谢谢各位大侠，我去试试恒流。

作者: qumm1985 时间: 2013-10-10 15:54

请问各位大侠，有没有做过170kd的蛋白呐，我用过250mA 2h和100v 1h均没能转成功，后来索性换成400mA转了2h倒是转到了膜上，但是转移液发热太明显，感觉外面和内部的冰浴效果不明显，不知对转膜电流和电压有没有上限啊，请高手指点下，如何才能使转膜效果更好呐。另外，不知pvdf膜一定需要甲醇活化吗，我先把它放进水里根本不能浸透的
bio-rad mini型的western blot电泳仪，操作步骤、转移液应该也没问题吧

作者: 49888 时间: 2013-10-10 15:55

楼上：
70kd的蛋白我们都是 100v 转1.5h，你170kd至少要2h
所以我觉得是你转的时间短了。
转完后你可以考染一下你的胶，看看转的情况。

PVDF用水是浸不透的，一定要甲醇。版内搜索一下PVDF，有很多帖子的。

综上所述：你的问题主要是PVDF膜没活化，其次是转的时间不够。

作者: 49888 时间: 2013-10-10 15:55

我们的蛋白分子量65KD，用的是伯乐得，恒压转，100V，120min～～用了几年了，效果很好

作者: gmjghh 时间: 2013-10-10 15:56

我用的是恒压，湿转，bio－rad，100V2H,老是效果不好，我的蛋白58KD，我发现恒压的过程中，电流基本上都在1A以上，缓冲液都沸腾了，因为我是在跟国外的博士后后面作实验，我想换条件，但是他老不换，所以转膜一直在折腾，效果一直不好，快一个月了烦死了，天天在弄这个．以前在学校用的半干转，恒流，效果很好，到这里只有伯乐的湿转仪．晕啊，我认为还是恒流好，不知道为什么恒压１００v，电流怎么那么高，buffer boiling
大家帮我看看

作者: 831226 时间: 2013-10-10 15:56

我转40-50da的蛋白，70v,120min.
20kda蛋白，200mA,120min,
bio-rad仪器，湿转，效果都很好的。

作者: luoliqiong 时间: 2013-10-10 15:56

我们用300MA 1小时效果不错以前也看到园子里有伙伴认为恒流比恒压好，我复制过来大家参考参考

建议恒流,理由如下:
1.转膜中热量产生很多,导致缓冲液甲醇的挥发消耗,缓冲液成分变化,如果恒压会导致电流不断改变,转膜过程不平稳.
2.调节到恒流后,电压会变化,但是缓冲液中带电粒子运动稳定,有利于转出高质量的膜.
3.一般小分子蛋白(<50KD)可以300mA 1.5小时,大分子蛋白300mA 2.5h ,效果不错.

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-10 15:57

100V 90min就够了

作者: 89tongzijun 时间: 2013-10-10 15:57

80ma，70min也够了

作者: ffaa 时间: 2013-10-10 15:58

恒流，300ma，一个小时足够了

作者: TAT 时间: 2013-10-10 15:58

我是用国产六一的转移槽，蛋白是66kd，100mA，45min就可以把目的蛋白转到膜上去了。用的是PVDF，0.22uM

作者: wsll 时间: 2013-10-10 15:58

楼主提出的问题我觉得分析应该更全面一些。现在大部分人做WB实验应该都是用bio-rad装置吧，转膜时既可以采用恒压亦可以采用恒流，但不管你采用何种方法都是为了将目的蛋白尽可能多的转到膜上。每个实验者都是根据自己目的蛋白分子量大小，表达位置，表达量多少，是否容易降解来选择实验条件。比如说你要检测大分子量蛋白，蛋白表达又比较少，且易降解，那么最好是当天提蛋白、当天做实验，剩余的蛋白样品保存在-70°而不是贪图方便放在-20°冰箱，转膜时就适宜选择恒流（如楼上所说防止在恒压条件下，电流变化过大，产热多，目的蛋白降解，甲醇挥发凝胶不稳定），转移液最好是新鲜配制的（最多用2~3次，转以后最好保存在4°冰箱）。。。

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-10 15:59

我用的是恒流，270mA，100min。没有失败过一次。

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请问，你的转膜缓冲液是这样的吗： 144g甘氨酸，30.3ｇTris碱，用双蒸水定容至1L，即为10×转膜缓冲液？？谢谢。因为我们实验室用的湿转， bio-rad 公司的仪器，加水到快满的样子。常规我们用120mA, 60min 转膜，基本上100kd以下的都没问题，电压一般是33V左右。而你用了270mA, 100min, 是不是时间太长了啊，小点分子的会转到对面滤纸吧？？或者是叫缓冲液位置不同呢？

作者: 11_hjx 时间: 2013-10-10 15:59

pvdf膜是需要用甲醇活化的，膜的正面反面放在甲醇中各15秒，然后放在水中2分钟，此时膜会在水上打转，没关系，你可以用镊子将其按压至水中。

作者: 11_hjx 时间: 2013-10-10 16:00

活化后的膜更容易将蛋白转移至膜上。

作者: 11_hjx 时间: 2013-10-10 16:00

关于转膜时候的散热，建议你可以放一个冰袋，洗干净的放在转膜的盒子里面，同时在盒子里面放上一个转子，那样散热相对快，盒子可以放置在冰盒里面转膜。还有一点，转膜液配好后，将其放置四度冰箱。综上，好效果的散热是可以达到的

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