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标题: 【求助】WB方面求助 [打印本页]

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:11 标题: 【求助】WB方面求助

请问WB时整块膜都发光是什么原因啊？非常感谢！

作者: 911 时间: 2013-10-10 17:11

我也是WB新手，帮你分析下原因哈：
1、没有封闭或者封闭的不好；
2、一抗（或二抗）没有洗干净；
3、发光液孵育后，发光液没有用滤纸吸干，且用保鲜膜包得不够严密，导致背景太强；

希望对你有用：）

作者: idea2011 时间: 2013-10-10 17:12

二抗浓度对实验有什么样的影响呢？谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:12

那我的这块膜再清洗过后，是否还可以用呢？非常感谢！

作者: dog002 时间: 2013-10-10 17:13

抗体的浓度高，会导致条带很强，一般不会导致整张膜都有信号。如果不是发光液导致的，现在再清洗应该没有很大用。如果你的膜一直保存在洗膜缓冲液中，可以试一下用stripping buffer把抗体都洗掉，再重新封闭和孵育抗体，或许有用。

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:13

那么膜与发光液的接触时间长短会对实验有影响吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:13

跑电泳时，如何把胶底下的气泡排尽？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:14

测beta-actin时，最后得到的胶片为什么什么都看不到呢，是什么原因呢?在我做的上一天一个师兄也是得出同样的结果。

作者: Tooooom 时间: 2013-10-10 17:15

路过，看看，学习一下

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:15

和以上的操作基本一样测另一种蛋白，且是同时进行的，在该蛋白的膜上却是整块膜都发光，这又是为什么呢？当跑电泳时，已经跑到底部，可蛋白间

距还是很小该如何处理呢？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:16

条带连成条状师什么原因呢？谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:16

请问β-Arrestin 2的分子量是多少？谢谢!

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:17

WB是，两次上样量一样，操作一样，可是两次的A-actin的天带确相差很大呢？一个挺明显而一个确很弱？测其他蛋白时，为什么会显示出很多的天带，这是为什么呢？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:19

为什么是用5%的牛奶封闭呢？它不会同时把自己想要测的蛋白封闭吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:20

β-arrestin2的分子量是多少啊？怎么说明书上显示的和p50的一样啊，那在做western blotting 的时候该如何确定啊？谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:25

这两天做WB基本什么都显示不出来，可是这之前都能坐出来，而且操作一样，这是为什么呢？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:26

测p65和p50用哪个公司生产的抗体特异性好？谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:26

western blot 中5%脱脂牛奶是做什么作用而使用的呢？谢谢1

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:27

western blot中每套设备的灵敏度是不是都不一样，所以其中的电压或电流都要自己摸索吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:28

检测出来的条带呈“微笑”状，是什么原因造成的呢，如何防止这种现象的发生呢？有的现象是上样时明明已经加了蛋白样品可是检测出来的结果是少了一个条带，这又是为什么呢？不胜感激！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:28

b-actin也会降解吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:29

动物组织在-80度条件下能保存多长时间？

作者: jrwyyplt 时间: 2013-10-10 17:29

条带连成条状师什么原因呢？谢谢1

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上样量太多了。

作者: jrwyyplt 时间: 2013-10-10 17:30

动物组织在-80度条件下能保存多长时间？

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起码半年到一年……反正我们实验室是这么干的……

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:31

那保存时间超过了一年了影响大吗？我感觉都做得不怎么好了，调整也不好调整。相同的一批蛋白我第一次做BCA实验时标准曲线的R为0.9967，但是做出的b-actin不一致，有两个组相对较高，我怀疑我定量不准，隔了一天又定量了一次，R为0.9911，测出的数据变化不大，做出的条带和钱一次的还是基本一样，我以前也是这样定量，一做b-actin基本都一致了，可是这次新提的蛋白却出现这种结果，是不是组织放久了，出问题了？

作者: wmp1234 时间: 2013-10-10 17:31

β-arrestin2的分子量是多少啊？怎么说明书上显示的和p50的一样啊，那在做western blotting 的时候该如何确定啊？谢谢！

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应该是50KD。
你也做这个蛋白吗？用的哪家的抗体呢？效价怎样？特异性好吗？希望可以交流一下。
当然WB技术也可以讨论。

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:32

Cell signaling，之前做了一下，条带很弱

作者: www.1 时间: 2013-10-10 17:32

Cell signaling，之前做了一下，条带很弱

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CST的C16D9兔单抗？我之前也用的这个抗体，效价很差，郁闷。。。
你做的组织还是细胞？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:33

组织，而且存放了挺久了，所以现在都不怎么好做

作者: 2541 时间: 2013-10-10 17:33

换抗体或者提供新鲜样本做一次，并且降低一抗浓度

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:34

通过BCA法检测了蛋白浓度很高了都没有显出来或者非常的弱，该如何调整呢？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:34

我用western blotting 检测磷酸化P65只是很弱地显示若干个条带，磷酸化IkBa完全不显示出来，而且抗体浓度已经很高了，还是不出来，我到底应该要怎么改进呢？谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:35

转膜时温度较高磷酸化会降解吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:35

动物组织的磷酸化的IkBa和磷酸化的P65有没有谁做过，能否分享感受？我做了很多次都做不出来。

作者: kewanqi2011 时间: 2013-10-10 17:36

为什么我做的western 条带没有或者是很弱很模糊呢？而别人的是很清晰，蛋白提取过程会影响很大吗？请问是什么原因呢？非常感谢！

作者: Ao7 时间: 2013-10-10 17:36

请问WB时整块膜都发光是什么原因啊？非常感谢！

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整张膜发光，在WB中叫做“背景高”，原因主要有经下几方面。
1.一抗二抗浓度高了，主要是二抗，一般二抗稀释都在5000倍以上（有些二抗说明书上要求1000-10000，但做的过程中稀释到10000倍以上的也有），你可以做个二抗稀释度（即在空白的膜上，在不同的位置，用不同稀释度的二抗滴1ul在膜上，在室温下自然凉干，然后用直接发光鉴定）。
2.洗膜的时候不到位，也就是洗膜没洗干净。如果你是15分钟三次的话，可以试试8分钟5次洗膜。
3.实验过程中污染。很多人在做实验时，有些地方根本没蛋白样品，却发光了，就是这种情况。
4.封闭也可以造成背景高，但不是主要原因。有些人省去做封闭的步骤，也不会背景高，这个要看自己的实验。

作者: Ao7 时间: 2013-10-10 17:36

那我的这块膜再清洗过后，是否还可以用呢？非常感谢！

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只要保证转膜的时候，蛋白已经转了上去，是可以重新结合一抗和二抗的，首先把这张膜用TTBS洗，洗膜建议8分钟5次。然后结合一抗、洗膜、结合二抗、洗膜、发光鉴定。

作者: Ao7 时间: 2013-10-10 17:37

那么膜与发光液的接触时间长短会对实验有影响吗？

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肯定有影响啊，发光液滴在膜上，要和结合了蛋白的抗体发生反应，促使原子中的电子越迁（这个是高中物理知识，也是光产生的原理），产生光波，只是WB中使用的是生物化学发光而已（主要是结合了辣根过氧化物抗体与发光液的氧化还原反应）。所以要让他们充分反应，才能使氧化还原反应更完全，发光最亮。当然有时肉眼看不到有荧光，但也能显影，这主要是反应中的不可见光引起的。

作者: Ao7 时间: 2013-10-10 17:37

测beta-actin时，最后得到的胶片为什么什么都看不到呢，是什么原因呢?在我做的上一天一个师兄也是得出同样的结果。

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1.首先确定beta-actin和二抗是否过期，没过期的话beta-actin和二抗可以重新配制。
2.要注意二抗和beta-actin是否配套，如果beta-actin是鼠抗，二抗要用抗鼠的。
3.看二抗是碱性磷酸酶标记（AP）的还是辣根过氧化物标记（HRP）的，如果是AP标记的是不能用ECL发光法测的。
4.可能是蛋白上样量少了（这个可能性不大）。
5.一抗、二抗孵育时间不够。（一般一抗要37度2个小时，或4度过夜。二抗要37度2个小时）
6.还有就是转膜的时候蛋白根本没有转上去（湿转转膜时间视目的蛋白大小而定，时间长了没关系，但不要短，有些人说转膜会转过了，但在我做实验过程中没发现会转过的情况，建议200mA 2个小时，这个条件90kd以下的基本上都能转上去）。

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