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标题: 【求助】有关Triton X-114提取膜蛋白的问题 [打印本页]

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:04 标题: 【求助】有关Triton X-114提取膜蛋白的问题

各位同仁：
小弟我现在想用Triton X-114提取膜蛋白，Triton X114能与水在4度混溶，而在37度能形成水相和去污剂相。但我在做试验时将Triton X114水溶液37度水浴5min后，Triton X114溶液并没有变混浊，离心后也不会分层。这究竟是什么原因,敬请各位赐教！

作者: qumm1985 时间: 2013-10-12 13:04

一般使用triton114含量是1-2%，除此之外还要在溶液中加入tri和nacl作为缓冲体系，你可先用配好的试剂做一个空白试验，应该是可以的

先用40mmtri破碎细胞，然后再用triton114处理

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:07

我是在将细胞重悬在10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS中，然后加入终浓度1％的Triton X-114 。在4度混匀、离心取上清，移到37度没有预计的云雾状出现。再请问市售的Triton X-114 是液体的吗，国外的材料上好像说是固体的。

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:07

是液体的.我们用的就是一个大瓶子,纯的非常粘稠
你是室温离心吗？

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:08

是啊。上清移到37度没有一点cloudy的感觉，然后放在室温（至少20度）5000rpm离心10min，没有分层。空白实验我也做了，就是把1ml的Triton X-114 溶解在100ml的10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS中，混匀后移到37度，没有...

作者: yychen 时间: 2013-10-12 13:09

Triton-114是很粘稠的，国内华美、生工都有分装。
它的溶解原理是在低温（4度）的时候溶解度高，根据有机物相似相溶的原理这时膜蛋白就会和Triton-114相溶；在37度反而溶解度低，从而将大部分Triton-114连同膜蛋白一起析出分在下层有机相。
根据你的描述，没有分层可能有三个原因
1.可能你用的管太大，1.5mLEp管和50mL离心管的分离效果差很多
2.离心的时候要用水平转头，2000rpm 离心5－10min就行，离心完毕，小心取出就可以看到分层。
3.可能你Triton-114的配制方法不对，我是将Triton-114加入TBS（10mMTris，150mM NaCl，pH7.4）中形成终浓度1%的Triton-114，保存在4度，用时直接重悬细胞，冰浴作用30分钟后放入37度作用5-10分钟（根据管子大小），水平转头离心。

一些后续步骤：将上述沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）加入9倍体积冰冻丙酮，冰浴40分钟，10000rpm离心20-30分钟，这时就可以将上层的丙酮和Triton-114一起去除，从而得到膜蛋白。

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:10

另外，是否可以用肉眼看到37度形成的云雾状？如果将含有1%Triton-114的TBS（10mMTris，150mM NaCl，pH7.4）从4度移到37度5min是否也能分层？

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:10

这也主要取决于你用的管大小，小管可以看到云雾状，大管可以看到明显的分层界限，从4度移到37度理论上来说应该也能分层。

作者: qumm1985 时间: 2013-10-12 13:11

我用的也是1.5ml的离心管，可就是没有云雾。我的试剂是Amresco分装的，应该不会有问题。另外，为什么用水平转子，用角转子不行吗。谢谢

作者: yychen 时间: 2013-10-12 13:11

水平转头在高速旋转的时候容易使有机相和水相保持分层状态，而角转子是不可能保持两相分离的状态，自然就达不到分离膜蛋白的目的呀，两种不同转子离心原理不同啦。建议你按我上述的方法操作一遍。

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:12

还有一事请教。终浓度1％的Triton X-100的TBS作用，约1ml（置于1.5mlEP管中）离心后通常可以得到的去污剂相有多大体积？

作者: yychen 时间: 2013-10-12 13:15

有机相体积有多大，小于0.5ml吧，这很重要吗？我觉得你只要分层清晰就行了。

作者: vivian4123 时间: 2013-10-12 13:15

沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）可以直接加sds loading buffer跑SDS PAGE么？

作者: 831226 时间: 2013-10-12 13:16

我用角转也能分层啊~
你的样本中是否还有其他成分,如高浓度的盐影响分层?

作者: 831226 时间: 2013-10-12 13:16

沉淀（Triton-114与膜蛋白的混合物）可以直接加sds loading buffer跑SDS PAGE么？

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没问题

作者: greenbee 时间: 2013-10-12 13:17

我把去垢相（Tritonx-114与膜蛋白的混合物）加水调至和水相相同的体积，直接加loading buffer，跑SDS-PAGE，去垢相几乎没有什么带，水相的蛋白带很清楚，这是怎么回事啊？

作者: 831226 时间: 2013-10-12 13:19

我把去垢相（Tritonx-114与膜蛋白的混合物）加水调至和水相相同的体积，直接加loading buffer，跑SDS-PAGE，去垢相几乎没有什么带，水相的蛋白带很清楚，这是怎么回事啊？

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那就沉淀一下吧

作者: 7437654 时间: 2013-10-12 13:19

请教各位战友是否膜蛋白的提取方法和胞浆蛋白的提取方法不一样?用的裂解液也不同吗?感谢

作者: mogu 时间: 2013-10-12 13:20

我用角转也能分层啊~
你的样本中是否还有其他成分,如高浓度的盐影响分层?

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我的裂解液是10mMTris，150mMNaCl，pH7.4的TBS，10mM的PMSF和10ug/ml的Aprotinin，盐浓度不会很高啊，不致影响分层。而且，我用纯水配成1％的TritionX114溶液，可是37度也没有cloudy。按照楼上的建议，我用水平转子离心，可是结果一样。

作者: 7437654 时间: 2013-10-12 13:21

为什么没有人回答我的问题啊,tritionX114是那个公司的啊，那里有售，再次感谢那为高手说一下啊，急等用啊，感谢

作者: qumm1985 时间: 2013-10-12 13:22

我也按楼上的方法做的,用丙酮沉淀以后可以看到白色的渣渣状东西,可是离心后放一会就变的透明,我师姐说那些可能是糖类,跑一向电泳,没有条带,成弥散状,就象瀑布一样,请问这是怎么回事?如何解救呢??
我做的是酵母

作者: tuuu2 时间: 2013-10-12 13:22

TBS含Triton X-114重悬细胞后是否影响超声裂解细胞？

作者: bamboo16 时间: 2013-10-12 13:23

请问tritonX114和tritonX100有什么区别呢？

作者: 18270881747 时间: 2017-8-16 18:36 标题: 回复 #2 qumm1985 的帖子

请问有提膜蛋白的配方和protocol吗？

作者: fengzhoajie 时间: 2023-2-8 15:05

请问这种方法是不需要超离的纯化膜蛋白方法吗？哪里有具体的protocol呀？

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-7 11:11

Triton X-114是一种非离子表面活性剂，具有相变温度（cloud point）。在低于其相变温度（约20-30°C）时，Triton X-114以单一相形式存在，并能与水混溶。但当温度升高到其相变温度以上（通常为约37°C），Triton X-114会分为两个相：水相和去污剂相。这种相分离的现象可以用于膜蛋白的富集和提取。

在您的实验中，Triton X-114溶液未能在37°C下形成两个相的可能原因有几种：

温度不够：确保实验中的水浴温度达到37°C，并在37°C下持续一定时间。确认温度计准确性并使用适当的水浴设备。

Triton X-114浓度问题：确保使用正确浓度的Triton X-114溶液。过低的浓度可能导致相分离失败。

溶液制备问题：Triton X-114溶液的制备需要充分搅拌和均匀混合，以确保化合物溶解均匀。确保在制备过程中没有发生漏液或其他不良因素。

溶液纯度问题：如果Triton X-114溶液受到污染或存在其他杂质，可能会影响其相分离的能力。使用新鲜的、纯净的Triton X-114溶液进行实验。

如果问题仍然存在，可以尝试调整实验条件，如增加Triton X-114的浓度、延长处理时间或改变提取方法。另外，与同行或相关领域的专家讨论，获取更具体的建议和解决方案也是一个好的选择。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 15:48

Triton X-114是一种非离子表面活性剂，通常用于提取膜蛋白以及水相和脂质相的分离。在正常情况下，Triton X-114在低温下（如4°C）与水混合是可以溶解的，而在37°C时会相分离为水相和脂质相。如果你在实验中发现Triton X-114的水溶液没有在37°C时产生混浊现象，有可能是以下几个原因：

1. Triton X-114质量问题：首先要确保你使用的Triton X-114质量良好。可能的原因之一是试剂出现质量问题，导致其在37°C下没有像预期那样分离。

2. 试剂保存条件： Triton X-114可能对温度和湿度比较敏感。如果试剂曾暴露在高温或湿度条件下，可能会影响其性能。确保试剂在正确的存储条件下保存。

3. pH影响： Triton X-114的性能可能受到pH值的影响。如果水溶液的pH值不适当，可能会影响其相分离的能力。

4. 不适当的混合：在将Triton X-114水溶液暴露在37°C时，确保你充分地混合溶液，以促使相分离的发生。使用适当的混匀设备或方法来确保均匀混合。

5. 使用的水质：水的质量可能会影响试剂的性能。使用纯净的去离子水来制备试剂，以避免不必要的影响。

如果你仍然遇到问题，最好的方法是与实验室同事、导师或其他在使用Triton X-114的研究人员交流，以获得更多的经验和指导。在实验中，确保遵循正确的操作步骤，并进行必要的实验控制，以确保获得准确的结果。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:17

Triton X-114是一种非离子表面活性剂，可用于膜蛋白的提取和富集。它在低温下与水相混溶，在高温下则会形成两相体系，其中一个相是富含去污剂的有机相，另一个相是富含水的水相。这种相变特性是由于Triton X-114的亲水性和疏水性部分的不同引起的。当在高温下形成两相体系后，膜蛋白会在两相的界面上分配，从而实现富集。

如果你在37°C水浴下使用Triton X-114没有观察到相变和相分离，可能有以下一些可能的原因：

1. Triton X-114质量问题：首先要确保你使用的Triton X-114是优质的，没有受到污染或分解。使用新鲜的、密封良好的Triton X-114试剂。

2. 水相和有机相的浓度： Triton X-114的相分离取决于其浓度。确保你的溶液中Triton X-114的浓度足够高以触发相变。一般来说，相变浓度通常在15-20%之间。

3. 混合不均匀：在高温下混合样品时，确保混合是均匀的，以确保Triton X-114充分与膜蛋白接触，促进相分离。

4. 离心条件：当样品在高温下与Triton X-114混合后，离心条件对于相分离的成功也很重要。确保使用适当的离心参数（速度、时间等）以实现相分离。

如果你已经尝试了以上步骤但仍然没有观察到相分离，可能需要仔细检查每个步骤是否正确操作，确保溶液的质量和浓度是合适的。如果问题仍然存在，你可以考虑咨询实验室同事或导师，或者尝试不同的提取方法来寻找更适合的方案。

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