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标题: 【求助】pET22b 诱导表达问题加入IPTG工程菌生长很慢 [打印本页]

作者: sistis 时间: 2013-10-22 14:51 标题: 【求助】pET22b 诱导表达问题加入IPTG工程菌生长很慢

我将目的基因通过BamH1 和Hind111，插入pet22b，目的基因有自己的起始和终止密码子，将重组质粒导入宿主菌EcoliBL21a(DE3)，加入IPTG 后打算诱导，可是 4h,后准备收集菌体，发现菌生长很缓慢，与未诱导的相比，菌浓基本和诱导之前差不多，延长诱导时间到7h，菌弄才有所增加，破碎细胞收集粗酶液做SDS,发现诱导过得样品和空载体诱导的条带一样，并未有过表达的蛋白，而之前将目的基因连接到Pet30a中，导入EcoliBL21a(DE3)，诱导的话菌体都能正常生长，请大家帮忙看看，我刚做原核表达，希望高手多多指点！
下图，从左到右，1为IPTG诱导的空载体EcoliBL21a(DE3)--pET22B,2--Maker3---5为IPTG诱导含目的基因的工程菌细胞裂解上清，IPTG浓度分别为0.4，0.6,0.8 。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=19541

作者: ending 时间: 2013-10-22 14:51

外源蛋白可能有毒性，建议摇到较高OD再低温诱导4-6小时后收菌

作者: www.1 时间: 2013-10-22 14:52

what happened to pet30 expression?

作者: sistis 时间: 2013-10-22 14:52

pET30a 表达的蛋白大小不对，所以换的载体

作者: www.1 时间: 2013-10-22 14:53

QUOTE:

原帖由 sistis 于 2013-10-22 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

pET30a 表达的蛋白大小不对，所以换的载体

有没有做mass spec确认大小？sds page的大小会有误差。

作者: H2O 时间: 2013-10-22 14:53

外源蛋白可能有毒性，建议摇到较高OD再低温诱导4-6小时后收菌

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请问是怎么判断有毒性的呢？较高OD有没有具体点的值？低温到多少度呢？我也碰到了相同的问题，不过是pGEX-4T-1载体的，外插基因片段大概130kD，请问楼主的问题解决了吗？

作者: ending 时间: 2013-10-22 14:54

请问是怎么判断有毒性的呢？较高OD有没有具体点的值？低温到多少度呢？我也碰到了相同的问题，不过是pGEX-4T-1载体的，外插基因片段大概130kD，请问楼主的问题解决了吗？

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看你表达的是什么蛋白，大部分膜蛋白，在菌体内能直接影响细胞代谢和信号传导通路的可溶蛋白基本上多少都有毒性。如果可溶表达量很少而且加入IPTG后生长停滞基本上可以肯定有毒。

LB的话隔夜摇菌的OD大约是2，低温诱导一般是16-18度。

作者: toy 时间: 2013-10-22 14:56

会不会在包涵体里面，就是破碎细胞的沉淀里？

作者: lixi559 时间: 2013-10-22 14:57

看你表达的是什么蛋白，大部分膜蛋白，在菌体内能直接影响细胞代谢和信号传导通路的可溶蛋白基本上多少都有毒性。如果可溶表达量很少而且加入IPTG后生长停滞基本上可以肯定有毒。

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LB的话隔夜摇菌的OD大约是2，低温诱导一般是16-18度。
学习了，我的是个浆蛋白，由于实验室无法测OD600，所以一般将小摇好的菌液以1:100的比例稀释后37°C摇1-2h，至目测菌液似混非混的时候（曾用其他实验室的机器测过，此时的OD600大概是0.4-1.0），直接加入IPTG，再诱导表达（试过37°C 4h和25°C 10h），收菌的时候菌液是混的，可是就是表达的很少，插入的目的片段是3700bp左右，是不是大片段用GST载体不好表达呢？

作者: toy 时间: 2013-10-22 14:57

学习了，我的是个浆蛋白，由于实验室无法测OD600，所以一般将小摇好的菌液以1:100的比例稀释后37°C摇1-2h，至目测菌液似混非混的时候（曾用其他实验室的机器测过，此时的OD600大概是0.4-1.0），直接加入IPTG，再诱导表达（试过37°C 4h和25°C 10h），收菌的时候菌液是混的，可是就是表达的很少，插入的目的片段是3700bp左右，是不是大片段用GST载体不好表达呢？

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看是什么蛋白了，可能需要分子伴侣才能表达

作者: fox_79 时间: 2013-10-22 14:58

蛋白中会不会有很多稀有密码子呢？

作者: sistis 时间: 2013-10-22 14:59

看你表达的是什么蛋白，大部分膜蛋白，在菌体内能直接影响细胞代谢和信号传导通路的可溶蛋白基本上多少都有毒性。如果可溶表达量很少而且加入IPTG后生长停滞基本上可以肯定有毒。

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LB的话隔夜摇菌的OD大约是2，低温诱导一般是16-18度。
我用pET30表达就可以表达出来一个很明显的条带。同样的宿主菌，只是换个载体却不行了。我的蛋白也没有毒，用Pet22b的话乳糖诱导就可以生长很好，但是还是不表达。请问这个载体有关系吗?

作者: sistis 时间: 2013-10-22 14:59

会不会在包涵体里面，就是破碎细胞的沉淀里？

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那么怎么检测是不是有包涵体形成呢，如果有包涵体，破碎完离心之后包涵体和菌体碎片是混在一起的，该怎么分离呢

作者: sistis 时间: 2013-10-22 15:00

请问是怎么判断有毒性的呢？较高OD有没有具体点的值？低温到多少度呢？我也碰到了相同的问题，不过是pGEX-4T-1载体的，外插基因片段大概130kD，请问楼主的问题解决了吗？

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现在还在不不断尝试中，问题仍然没有解决……

作者: sistis 时间: 2013-10-22 15:02

那么怎么检测是不是有包涵体形成呢，如果有包涵体，破碎完离心之后包涵体和菌体碎片是混在一起的，该怎么分离呢

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拿沉淀来进行SDS-PAGE，就和上清一样。

作者: yueban-1147 时间: 2013-10-22 15:04

我用的PET30A，一般我是摇到OD0.6那样再加终浓度0.5mM的IPTG的，前期让菌体长多点，后期长慢也无所谓了

作者: 8s5g 时间: 2013-10-22 15:05

你有没有检测过你的片段插入后ORF对不对？

作者: yueban-1147 时间: 2013-10-22 15:05

一般在加入诱导剂后，如果目的蛋白有表达的话，细菌的生长速度会减慢许多，我表达的大多数蛋白都是这样，有少数没有表达，也发生生长速度降低的情况，大多数外源蛋白放进早期非融合表达载体中的时候，如果不能表达，可以考虑采用novagen公司后来的融合表达载体，如thx系列，或nusa系列，或者ge公司的gst融合表达载体，往往能获得理想表达，因为蛋白表达跟mrna 5'端二级结构有密切关系，所以融合蛋白表达往往是比较终极的手段，如果你不愿意融合，可以考虑优化5'端的编码序列，有时能取得意想不到的结果，至少我成功过一次。希望对你有帮助。

作者: 30moonriver 时间: 2013-10-22 15:06

另外，诱导时机很重要，普通的摇菌过了1再诱导，表达量会明显下降。切忌。iptg浓度不需要摸，1mM就可以，温度可以试试，但低温一般可增加可溶的可能，如果是真核分泌蛋白，则低温长时间意义不大，即便是可溶的，也极有可能得到可溶性互聚物，凝胶过滤一看便知。希望对你有帮助。

作者: 66+77 时间: 2013-10-22 15:15

应该是有毒性

作者: ii077345 时间: 2013-10-22 15:15

不知道你IPTG浓度加的浓度是多少，看你提到过用乳糖诱导可以长得很好，我还是建议你摸一下IPTG浓度。因为pET系列的载体

采用的是T7启动子，原理是Lac操纵子，有时候会有一定程度的本底表达，也许本底表达会影响你的菌体生长，你可以试着降低一下IPTG

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