分析测试百科

标题: 【求助】超滤和过滤技术答疑园地:有问尽管来提 [打印本页]

作者: njkph 时间: 2013-10-22 20:35 标题: 【求助】超滤和过滤技术答疑园地:有问尽管来提

膜分离是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一门分离新技术。膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生物、环保等各个领域。康宁生命科学的过滤、超滤产品在生物医学及制药研究领域有着及其广泛的应用，适合药品及生物制品的澄清、分离、纯化和浓缩等各个环节。

本人有多年的膜过滤技术经验，受丁香园和Corning（康宁中国）公司委托，特开超滤和过滤技术答疑园地，对站友们提出的问题给予解答，希望能够和大家相互学习，共同进步。

任何与超滤和过滤有关的实验问题和产品问题，大家尽管在此提出，本人尽力解答，也欢迎站友们来参加讨论。

作者: tuomu45 时间: 2013-10-22 20:36

请问可不可以将微生物的膜转运蛋白分离并提纯？怎样才能得到非常好的结果？谢谢！

作者: 33号 时间: 2013-10-22 20:36

我想请教在用超滤膜进行血浆蛋白结合实验时，离心机转速在12000rpm时，血浆不能完全滤过，该采取怎样的方法进行改进？我用的超滤管是30k的

作者: 小游abc 时间: 2013-10-25 19:42

能否根据膜材质的不同将过滤的物质分类列表，因为据我所知，有些溶剂如DMSO会溶解某些材质的滤膜。这样将来用得时候只要对照列表就知道过滤时选取相应的滤膜就行。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:44

请问可不可以将微生物的膜转运蛋白分离并提纯？怎样才能得到非常好的结果？谢谢！

===============================================================================================================

感谢您在开题后半小时就关注到该论题！
膜分离技术的条件是膜孔径的大小，该技术是基于膜孔大小对物质进行分离的一种方式，是随着科学技术的发展，近年来日益兴起，并不断发展完善的一门技术。现如今该技术在生命科学领域已经达到非常重要的地位，具有极大的神秘魅力，引发无数的科学技术工作者投身于此。
对于特定的分子量的微生物的膜转运蛋白--膜转运蛋白会因为功能的差异有很多种，所以需要特定--我们可以借助膜技术进行分离纯化，但是膜方法的分离毕竟是粗纯，进一步的纯化需要借助更精细的方法--Chromatography （层析）方法，甚至层析的组合加上膜分离以及其他方法的组合去完成--这就是所谓的下游技术。
想得到更好的结果，需要考虑的因素，除了最重要的分子量的选择外，还需要考虑膜分离时候的条件，比如样品的处理，膜分离时候的跨膜压力，其他还有温度，膜材质的选择。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:44

我想请教在用超滤膜进行血浆蛋白结合实验时，离心机转速在12000rpm时，血浆不能完全滤过，该采取怎样的方法进行改进？我用的超滤管是30k的

===============================================================================================================

我想您测定血浆蛋白结合率，是用某种药物或者活性成分和血浆蛋白在一定条件下，结合一段时间后，然后用超滤膜把小分子的游离药物或活性成分（未结合部分）离心分开，然后测定含量并进而计算结合率的实验。
该实验中膜上应该是和血浆蛋白结合的结合物，血浆蛋白因为分子量大不会离心下去。那么我猜您说的“血浆不能完全滤过”应该是血浆中的液体成分不能完全虑过，那么还有一些游离药物活性成分不能离心下去，所以无法计算。
我的建议是：
1，可以用更稀浓度的血浆液有利于离心，离心后再次加入缓冲液洗滤；
2，选择合适的分子量的膜；
3，增加压力。
供参考，祝成功！

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:44

QUOTE:

原帖由 小游abc 于 2013-10-25 19:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

能否根据膜材质的不同将过滤的物质分类列表，因为据我所知，有些溶剂如DMSO会溶解某些材质的滤膜。这样将来用得时候只要对照列表就知道过滤时选取相应的滤膜就行。 ...

您给出一个很好的建议！
这个问题归属于化学兼容性的问题。
顺着您的问题，我把过滤（超滤）膜使用选择时候需要考虑的因素list如下：
1，分子量大小；Vs蛋白形状类型（球蛋白，纤维蛋白等） Size，可以参考开题附件“过滤指南”里面的P1表1和P14表3；
2，蛋白吸附；Adsorption可以参考开题附件“过滤指南”里面的P1表2；
3，材料溶出； Extractable，一般研发时候不在意，但是由研发转入生产的时候需要考虑；
4，化学兼容性：Compatibility 可以参考开题附件“过滤指南”里面的P3表3和P17表6;
5，样品量和流速，影响因素很多：可以参考开题附件“过滤指南”里面的P3表4和P15表4及其前文所述诸多因素;
6, 离心力：可以参考开题附件“过滤指南”里面的P16表5.
综合这些因素，您就可以优化选择康宁的超滤器。各种超滤器特点可以参考开题附件“过滤指南”里面的P5表5和P14表2.

作者: ha111 时间: 2013-10-25 19:45

聚醚砜膜不能高压，那么酒精消毒是否会彻底？有没有细点的指导，比如浸泡的时间，如果需要无菌，不高压灭菌是否影响消毒效果？

作者: zhihui小新 时间: 2013-10-25 19:47

我想请教在用超滤膜进行血浆蛋白结合实验时，离心机转速在12000rpm时，血浆不能完全滤过，该采取怎样的方法进行改进？我用的超滤管是30k的

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

这个实验我当时做过，楼主所说的问题确实存在，如果加大转速或延长时间的，会使血浆蛋白的温度升高，对实验产生很大的影响，所以如果有能力的话，可以采用低温高速离心机，保证结果的准确。当时我的实验室地龙蛋白，稀释确实是一个不错的方法，但是可能会使你的实验结果中的药物不易检出，小于最低限。
我觉的如果材料足够的话，可以选用平板膜，时间可以很大的节约，而且效果相当好。但由于生物实验，所得样品相当宝贵，所以这个方法只适合其他药品的制备。
离心超滤对膜管得选择也很重要，可以试一下，10k和1k，测定蛋白的保留率，选择合适的膜管。

作者: caihong 时间: 2013-10-25 19:47

楼主所说 “超滤”和心脏手术中体外循环的“超滤”是否同一概念？如果不是，其各自定义说什么？

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:49

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2013-10-25 19:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

聚醚砜膜不能高压，那么酒精消毒是否会彻底？有没有细点的指导，比如浸泡的时间，如果需要无菌，不高压灭菌是否影响消毒效果？

大多数的超滤膜不能够耐受高温，所以需要用其他方法进行灭菌。
附件文件推荐用70%酒精消毒，或者某些消毒气体进行灭菌。酒精消毒属于一般消毒，灭菌效果当然不能和高温消毒同日而语。但是就方法而言，该方法确实有效。
也可以考虑用NaOH消毒，但是需要考虑的是材质，不是所有的超滤膜材质都能够达到这样的化学兼容性。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:50

QUOTE:

原帖由 caihong 于 2013-10-25 19:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主所说 “超滤”和心脏手术中体外循环的“超滤”是否同一概念？如果不是，其各自定义说什么？

原理一样，但是有诸多不同：
1，应用领域不一样；分别是医学和生命科学；
2，硬件设施不一样；
3，驱动力不一样；
4，目的不一样；
5，膜不一样；
6，操作不一样。

作者: c86v 时间: 2013-10-25 19:50

请问超滤管接负压抽滤的设备在哪里可以买到？我们这里做纯化的人太多，离心机天天排队用

作者: 小野花 时间: 2013-10-25 19:51

超滤膜的尺径范围在不同的资料上得到不同的结果，有说100-1nm的；还有的说500-1nm。我做出的膜层在200-300nm 到底是不是超滤膜啊！

请问更加接近真实的超滤膜范围...谢谢了

作者: 了了 时间: 2013-10-25 19:51

以前有用过MILLI 30K的，超滤完后发现30K以下的还是很多，理论上是不是30K以下的要基本上滤出？

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:52

QUOTE:

原帖由 c86v 于 2013-10-25 19:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问超滤管接负压抽滤的设备在哪里可以买到？我们这里做纯化的人太多，离心机天天排队用

负压抽滤的泵和真空瓶有很多公司可以提供，不知道您要进口产品还是国产产品。您可以和我电邮联系，我给您一些供应商。我得邮箱是wangym@yahoo.cn.
我担心这里给您供应商，有做广告的嫌疑。请谅解。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:52

QUOTE:

原帖由 小野花 于 2013-10-25 19:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

超滤膜的尺径范围在不同的资料上得到不同的结果，有说100-1nm的；还有的说500-1nm。我做出的膜层在200-300nm 到底是不是超滤膜啊！

请问更加接近真实的超滤膜范围...谢谢了 ...

您的问题很好！很有代表性。这个是关于过滤概念和孔径大小的问题。我下面分别谈谈。
过滤从大类上分为死端过滤（Dead Flow Filtration，DFF)和切向流过滤（，也有叫错流Crossflow Filtration, Tangential Flow filtration，TFF).
死端过滤是一个进口一个出口的过滤方式---所谓死端。从作用上看有澄清，稳定和除菌三种。除菌包括食品饮料行业的除菌（0.45um），制药行业注射剂除菌（0.22um），除支原体（0.1um），除病毒。这些孔径都是微米级别。
切向流过滤是一进口两出口的方式，出口分别是透过口--小于膜孔的成分的出口，和回流口--大多数是大于膜孔的成分的出口。所以叫错流或切向流。
根据孔径的大小，切向流分为微滤和超滤2种方式。微滤是微米级别孔径的分离，超滤是分子量级别的分离。
微米大小比较清楚，一般的澄清都是微米级别的。
超滤是分子量级别的，那么如何折算成纳米级别的？这个只能是一个近似的计算，因为蛋白质的分子形状不一样，球形，纤维性状和椭圆形状的差异导致分子大小的差异。如何换算大小就成为麻烦，因为有不确定。大体上---很粗的数据--大约9万分子量相当于1nm。注意这个数据仅供参考啊。
您说的200~300nm，属于微滤范畴，也就是0.2-0.3um，但是可以用切向流的方式去处理。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:53

QUOTE:

原帖由了了于 2013-10-25 19:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

以前有用过MILLI 30K的，超滤完后发现30K以下的还是很多，理论上是不是30K以下的要基本上滤出？

很好的问题，可以解决大家关于截留率的疑问。
对于MWCO 30K的膜，其意义是对于30K的球状目标物质大约有90%的截留。那么如何达到近似100%截留？一般说来，用1/6~1/3目标物质的分子量作为孔径。
同样的，对于希望去除的小分子，孔径也需要选择3-6倍目标物质。当然越小越好！同时我们还有考虑小分子穿过膜的动力学状态，小分子穿膜也有速率的问题。毕竟水分子更快地穿过的。所以有时候为了更好的去除小分子，需要反复的加缓冲液洗滤（Diafiltration）。我曾经试验过氯离子的去除，用1K膜反复洗滤12个周期，才达到0.1M Ag+检不出。

作者: junhun 时间: 2013-10-25 19:54

很好的问题，可以解决大家关于截留率的疑问。
对于MWCO 30K的膜，其意义是对于30K的球状目标物质大约有90%的截留。那么如何达到近似100%截留？一般说来，用3-6倍目标物质的分子量作为孔径。
同样的，对于希望去除的小分子，孔径也需要选择1/6~1/3目标物质。当然越小越好！同时我们还有考虑小分子穿过膜的动力学状态，小分子穿膜也有速率的问题。毕竟水分子更快地穿过的。所以有时候为了更好的去除小分子，需要反复的加缓冲液洗滤（Diafiltration）。我曾经试验过氯离子的去除，用1K膜反复洗滤12个周期，才达到0.1M Ag+检不出。

===============================================================================================================

用3-6倍目标物质的分子量作为孔径。-----------------这个说反了吧？？？？？应该是1/6~1/3目标物质

对于希望去除的小分子，孔径也需要选择1/6~1/3目标物质。当然越小越好？？？？？？？？应该是3-6倍目标物质-----不知道我说的对不对，请指教，谢谢！

作者: #问号# 时间: 2013-10-25 19:55

我想分离两个蛋白，分别大小为22和45kd左右，目标是纯化22kd的，请问我要用多大孔径的膜？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-10-25 19:56

LZ你好，我想把我通过胃蛋白酶切好的F(ab)2和Fc fragments分开，但是比较微量，40ug溶在500ulPBS中，请问可以用怎么样规格的超滤管去除Fc并浓缩？谢谢！

作者: greenbee 时间: 2013-10-25 19:56

如何正确理解水通量的概念?谢谢

作者: luoliqiong 时间: 2013-10-25 19:56

LZ你好。我想既然是膜分离技术，必然有一定的膜吸附残留，我做过一些蛋白和多糖的超滤和透析，感觉残留损失很大。请对如何避免膜吸附残留损失指点一二。谢谢

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:57

我想分离两个蛋白，分别大小为22和45kd左右，目标是纯化22kd的，请问我要用多大孔径的膜？

========================================================================================

这2个蛋白很难通过膜分开，因为分子量差异不大。
在开题附件的文件中已经说过，该技术不大适合蛋白分级分离(Fractionation)，尤其是分子量差异不大的2中蛋白。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:57

QUOTE:

原帖由 xueyouzhang 于 2013-10-25 19:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

LZ你好，我想把我通过胃蛋白酶切好的F(ab)2和Fc fragments分开，但是比较微量，40ug溶在500ulPBS中，请问可以用怎么样规格的超滤管去除Fc并浓缩？谢谢！

你的挑战有2个：
1，分子量的差异。抗体的Fab段和Fc段分子量大小差异大不大？分别是多少？知道了才好选择哪种孔径的膜；
2，成分微量。对于500ul体积的样品浓縮是有超滤管的，浓縮应该没有问题。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:58

QUOTE:

原帖由 greenbee 于 2013-10-25 19:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如何正确理解水通量的概念?谢谢

水通量Flux，是指在一定的温度（比如说25摄氏度）和一定的压力下（比如说1Bar），单位面积的膜单位时间（一般一小时计）透过的水的量。
Flux= XX LMH@25C*1Bar

注意水通量有新膜水通量和恢复水通量。前者是第一次使用前的新膜测定得出的水通量，这个数值测定后作为该膜用后清洗恢复率的水通量标准。恢复水通量是指用过的膜经过清洗之后，测定膜的水通量，并计算恢复百分比。一般该百分比不能小于80%。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 19:58

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-10-25 19:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

LZ你好。我想既然是膜分离技术，必然有一定的膜吸附残留，我做过一些蛋白和多糖的超滤和透析，感觉残留损失很大。请对如何避免膜吸附残留损失指点一二。谢谢 ...

一下几点需要考虑：
1，膜的材质；
2，蛋白浓度的选择；不宜太浓，
3，缓冲体系的pH选择，尽可能选择膜吸附小的环境--需要找条件；
4，离心力（速度）和离心时间的考虑；
5，回收样品时候的细致--尽可能全面回收；
认真处理好这些问题，应该可以得到理想的结果。
祝您成功！

作者: cocacola 时间: 2013-10-25 19:59

楼主你好。
请问超滤管可以用来浓缩病毒吗？我在做慢病毒包装，需要对培养基浓缩来提高病毒滴度。本来最好是用超速离心法来浓缩，实验室没有超速离心机，有人在网上说可以用超滤法来浓缩，不知道楼主有没有相关的经验？谢谢
。

作者: qqq111 时间: 2013-10-25 20:00

如何制备浓度较稀的血浆？是不是用pbs相应的稀释一下就可以？还有其他的方法？请指教！

作者: bluelake 时间: 2013-10-25 20:00

:LZ你好，我想把我通过胃蛋白酶切好的F(ab)2和Fc fragments分开，但是比较微量，40ug溶在500ulPBS中，请问可以用怎么样规格的超滤管去除Fc并浓缩？谢谢！

===============================================================================================================

你的挑战有2个：1，分子量的差异。抗体的Fab段和Fc段分子量大小差异大不大？分别是多少？知道了才好选择哪种孔径的膜；2，成分微量。对于500ul体积的样品浓縮是有超滤管的，浓縮应该没有问题。
F（ab'）2是110kd,Fc已经被切成了几个Kd的小片段,而不是50Kd的整段。

作者: ROSE李 时间: 2013-10-25 20:01

软骨细胞培养过滤需要用多少目的筛网？

作者: ilovegaga 时间: 2013-10-25 20:02

1请问四种糖：A(分子量666)，B（分子量504），C（分子量342），D180.想得到高纯度的A，应该选用何种型号。
2请问三种糖：B（分子量504），C（分子量342），D（分子量180）.想得到高纯度的B，应该选用何种型号。

作者: kulee 时间: 2013-10-25 20:02

楼主你好。
请问超滤管可以用来浓缩病毒吗？我在做慢病毒包装，需要对培养基浓缩来提高病毒滴度。本来最好是用超速离心法来浓缩，实验室没有超速离心机，有人在网上说可以用超滤法来浓缩，不知道楼主有没有相关的经验？谢谢
。

==============================================================================================================

当然可以。
给您说个故事，由于超滤膜可以浓缩病毒，美国鬼子为了避免恐怖组织用超滤膜做生物武器，所以要求购买超滤膜产品时申请出口许可证，申请时需要提供足够的证据证明该产品是用于民用，而非军事用途。由于超滤离心的膜面积比较小，弄不成大气候，所以没有要求申请。一般大的膜产品就需要申请了。
这种申请不仅限于美国产品，也包括日本鬼子，德国鬼子等的类似产品。

作者: kulee 时间: 2013-10-25 20:02

如何制备浓度较稀的血浆？是不是用pbs相应的稀释一下就可以？还有其他的方法？请指教！

==================================================

可以。注意保持等渗/等张。当然其他缓冲液也可以，比如Tris。

作者: kulee 时间: 2013-10-25 20:03

你的挑战有2个：1，分子量的差异。抗体的Fab段和Fc段分子量大小差异大不大？分别是多少？知道了才好选择哪种孔径的膜；2，成分微量。对于500ul体积的样品浓縮是有超滤管的，浓縮应该没有问题。
F（ab'）2是110kd,Fc已经被切成了几个Kd的小片段,而不是50Kd的整段。

==================================================================

您用SPIN X UF500试试。分子量可以选择30KD或者10KD.
FC段越小越好，对于分开越重要。注意可以加缓冲液多次洗滤，利于FC段的透过。

作者: kulee 时间: 2013-10-25 20:03

1请问四种糖：A(分子量666)，B（分子量504），C（分子量342），D180.想得到高纯度的A，应该选用何种型号。
2请问三种糖：B（分子量504），C（分子量342），D（分子量180）.想得到高纯度的B，应该选用何种型号。

=====================================================================

很抱歉，您的几种物质分子量都是同一个数量级，Log MW=2,xxxx,所以无法用该法分离。

作者: kulee 时间: 2013-10-25 20:04

软骨细胞培养过滤需要用多少目的筛网？

===========================================

一般说来180~200目可以用。相当于孔径75~85um。

作者: caihong 时间: 2013-10-25 20:04

当然可以。
给您说个故事，由于超滤膜可以浓缩病毒，美国鬼子为了避免恐怖组织用超滤膜做生物武器，所以要求购买超滤膜产品时申请出口许可证，申请时需要提供足够的证据证明该产品是用于民用，而非军事用途。由于超滤离心的膜面积比较小，弄不成大气候，所以没有要求申请。一般大的膜产品就需要申请了。
这种申请不仅限于美国产品，也包括日本鬼子，德国鬼子等的类似产品。

=========================================================

再请问选用分子量Cutoff多少的超滤膜能保证浓缩的质量并且兼顾速度？

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:05

QUOTE:

原帖由 caihong 于 2013-10-25 20:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
当然可以。
给您说个故事，由于超滤膜可以浓缩病毒，美国鬼子为了避免恐怖组织用超滤膜做生物武器，所以要求购买超滤膜产品时申请出口许可证，申请时需要提供足够的证据证明该产品是用于民用，而非军事用途。由于超滤离心的膜 ...

一般地，选择膜的孔径大小: 目标蛋白分子量=3~6倍膜孔MWCO。
这样能够保证浓縮的回收率高。球形蛋白偏向于3倍。椭圆形，长条形蛋白需要6倍或者更多。

作者: caihong 时间: 2013-10-25 20:06

QUOTE:

原帖由 njkph 于 2013-10-25 20:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一般地，选择膜的孔径大小: 目标蛋白分子量=3~6倍膜孔MWCO。
这样能够保证浓縮的回收率高。球形蛋白偏向于3倍。椭圆形，长条形蛋白需要6倍或者更多。 ...

谢谢楼主。我的这个问题问的不清楚。我是想问如果我用超滤管来浓缩慢病毒，选择多大MWCO的比较合适？

作者: yes4 时间: 2013-10-25 20:07

请问对于MWCO 100K的超滤膜，用于浓缩病毒培养液，但是病毒培养液中含有5%的蔗糖，如果浓缩10倍体积的话，由于蔗糖分子量远远小于100K，这样最终的浓缩液中蔗糖的含量是否有变化，而且培养液中含有酚红，酚红的含量是否有变化？

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:07

QUOTE:

原帖由 yes4 于 2013-10-25 20:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问对于MWCO 100K的超滤膜，用于浓缩病毒培养液，但是病毒培养液中含有5%的蔗糖，如果浓缩10倍体积的话，由于蔗糖分子量远远小于100K，这样最终的浓缩液中蔗糖的含量是否有变化，而且培养液中含有酚红，酚红的含量是否有变化？ ...

理论上说，100K的膜对于小分子的蔗糖和酚红是全部穿透的，所以浓度应该保持不变。但是实际的情况是和蔗糖以及酚红的穿膜动力学常数有关，动力学过程决定浓縮液中小分子成分的含量。如果穿膜的动力学常数和水近似的话，则含量基本无变化，如果有差异，则浓度稍微偏高。
理论上，浓縮只是对于大分子而言（相对于膜孔）。对于小分子不存在浓縮效应。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:08

谢谢楼主。我的这个问题问的不清楚。我是想问如果我用超滤管来浓缩慢病毒，选择多大MWCO的比较合适？

=============================================================================

抱歉没有看到该问题。
病毒都是纳米级别的，小至二十纳米，大到几百纳米。按照分子量计算，怎么也得1000k以上。
所以不管是那种病毒，用100K或者300K浓缩，都是安全的，不会有损失的。
您可以试试。

作者: @STAR@ 时间: 2013-10-25 20:08

您好！我想再问一下，既然不同物质的穿膜动力学常数不同，那么水的穿膜动力学常数应该是最大的吧，是否有一些常用化学生物物质的穿膜动力学常数表。如果病毒收获液中加入人白（分子量大约66KDa），那么使用300K的超滤膜浓缩十倍后，人白的浓度如何变化？谢谢！

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:09

QUOTE:

原帖由 @STAR@ 于 2013-10-25 20:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！我想再问一下，既然不同物质的穿膜动力学常数不同，那么水的穿膜动力学常数应该是最大的吧，是否有一些常用化学生物物质的穿膜动力学常数表。如果病毒收获液中加入人白（分子量大约66KDa），那么使用300K的超滤膜浓缩十倍后 ...

据我所知，目前没有该常数表。
300K膜孔之于66k蛋白，接近5倍。理论上会有比较小的浓缩效应，即上游浓度稍大于下游浓度，具体数据需要试验检验。您可以实际测定看看。

作者: @STAR@ 时间: 2013-10-25 20:09

QUOTE:

原帖由 njkph 于 2013-10-25 20:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

据我所知，目前没有该常数表。
300K膜孔之于66k蛋白，接近5倍。理论上会有比较小的浓缩效应，即上游浓度稍大于下游浓度，具体数据需要试验检验。您可以实际测定看看。 ...

因为66k蛋白是300k膜孔的1/5，理论上是应该基本进入膜下液被除去，在膜上浓缩液中浓度会比以前降低吧? 是否正确，请指正。

作者: greenbee 时间: 2013-10-25 20:10

LZ好，感谢开此话题，从中学习到很多东西！
想问一下：1、买的Spin-X 8162的过滤管，上面是0.45um，这个应该不可以作为超滤管用吧？从理论上讲的话，一般WB用的硝酸纤维素膜也是0.45um的，蛋白也一般不会转过头，所以就问一下，谢谢！
2、有没有截留蛋白大小与孔径大小的那种对应关系？
3、超滤管最大的承受离心力为多大？是不是都不能超过6000rpm？
4、超滤管使用前需不需要做什么处理？用后如果再重复使用的话，有没有什么保存的注意事项？
5、买的milipore的15ml超滤管，截留分子10KDa，但是从浓缩的结果来看，总觉得损失好多，不知道是残留在膜上的太多，还是有滤出去的？
谢谢楼主！辛苦了！期待您的指点！

作者: #问号# 时间: 2013-10-25 20:11

谢谢楼主的介绍和经验。
两个问题：
1，分子量和膜孔径的关系，你给出一个蛋白的粗约估计，90kd/1nm，不知有无出处？我们用激光动态光散射仪，DLS ( dynamic light scattering)，测得单链抗体分子量约42kd，分子直径约3nm; 90kd的约为4nm.
2. 微滤膜和超滤膜的清洗，也就是如何重复使用。一是这些滤器贵但质量不错，值得重复使用；二是环保，减少塑料垃圾。当然厂家不会高兴，你越浪费他们越高兴。广州一家公司说是可以提供专用清洗液，号称微孔滤器可重复使用十次以上，也不知真假。不知楼主有无经验？

作者: idoww 时间: 2013-10-25 20:12

因为66k蛋白是300k膜孔的1/5，理论上是应该基本进入膜下液被除去，在膜上浓缩液中浓度会比以前降低吧? 是否正确，请指正。

===============================================================================================================

这样说不正确。如果你使用缓冲液反复洗滤，浓缩后的白蛋白浓度可能会低于浓缩前（同洗滤的液体量及次数有关）。要是没有洗滤的过程，水分子还是会比白蛋白更容易通过滤膜。

作者: nn255 时间: 2013-10-25 20:12

你好。我想请问下问题。我现在用超滤管直接浓缩我的水稻根系分泌物中的蛋白样品，对于其中所含的糖类以及一些小分子盐类能不能都除去？还有，超滤到最后一般要按什么比例进行洗滤，是不是洗的多了会损失蛋白？如果我只是用水溶解蛋白的话，会不会造成蛋白凝集？谢谢啦。

作者: nvdabing 时间: 2013-10-25 20:13

LZ好，想问一下：哪种材质的超滤器可以高压？

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:14

LZ好，感谢开此话题，从中学习到很多东西！
想问一下：1、买的Spin-X 8162的过滤管，上面是0.45um，这个应该不可以作为超滤管用吧？从理论上讲的话，一般WB用的硝酸纤维素膜也是0.45um的，蛋白也一般不会转过头，所以就问一下，谢谢！
2、有没有截留蛋白大小与孔径大小的那种对应关系？
3、超滤管最大的承受离心力为多大？是不是都不能超过6000rpm？
4、超滤管使用前需不需要做什么处理？用后如果再重复使用的话，有没有什么保存的注意事项？
5、买的milipore的15ml超滤管，截留分子10KDa，但是从浓缩的结果来看，总觉得损失好多，不知道是残留在膜上的太多，还是有滤出去的？
谢谢楼主！辛苦了！期待您的指点！

=============================================================================================================

1，用分子量计量标准的是超滤，比如1K,3K,5K,.....1000K.
用微米表示的是微滤，比如0.1um，0.2um，0.45um等。

2，我曾经回答过，这个没有很明确的对应关系，况且蛋白的直径vs分子量，并不是和分子量有那样明确的的线性关系。在蛋白中心区，分子量的增加会导致直径增加比较快速，而当分子量再增加时候，蛋白直径增加变慢。蛋白的分子形状也会影响分子量。

3，在开篇附件里面有介绍，过滤指南里面有关于最大推荐离心力的表5，可以参考。对于小的离心管，可以超过6000rpm。

4，使用前用纯化水冲洗一下，去除一下易润湿液即可。离心管可以重复进样，但是膜不好反复使用。因为上一次的污染清洁如何，很难验证。

5，判断损失，您可以在下游取样看是否有漏过。是否在膜上，您可以再次清洗膜，看是否有洗出来的。不管怎样，总能找到损失的原因和目标蛋白的去向。并针对解决。

欢迎提问！

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:15

谢谢楼主的介绍和经验。
两个问题：
1，分子量和膜孔径的关系，你给出一个蛋白的粗约估计，90kd/1nm，不知有无出处？我们用激光动态光散射仪，DLS ( dynamic light scattering)，测得单链抗体分子量约42kd，分子直径约3nm; 90kd的约为4nm.
2. 微滤膜和超滤膜的清洗，也就是如何重复使用。一是这些滤器贵但质量不错，值得重复使用；二是环保，减少塑料垃圾。当然厂家不会高兴，你越浪费他们越高兴。广州一家公司说是可以提供专用清洗液，号称微孔滤器可重复使用十次以上，也不知真假。不知楼主有无经验？

===============================================================================================================

1，这个完全有可能。在那个微观水平讨论的尺寸，本身就面临很大挑战。如果有工具实测分子大小，那实测的可以作为参考。所以我反复强调，这个事很粗的参考。
2，您的意见很好。在不是要求很严格的情况下，如果寻求到清洗的办法，反复使用是值得考虑的。至于厂家是否高兴，那个管不了太多。但是反复使用有清洗验证的挑战。对于不同的材质经历的不同蛋白污染，清洗条件是不一样的。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:15

你好。我想请问下问题。我现在用超滤管直接浓缩我的水稻根系分泌物中的蛋白样品，对于其中所含的糖类以及一些小分子盐类能不能都除去？还有，超滤到最后一般要按什么比例进行洗滤，是不是洗的多了会损失蛋白？如果我只是用水溶解蛋白的话，会不会造成蛋白凝集？谢谢啦。

==============================================================================================================

选择合适分子量的膜孔可以达到浓缩蛋白去除小分子盐和糖。洗滤可以加等量的缓冲液或者水。只要分子量选择合适，蛋白不会损失。会不会造成蛋白凝集，需要看您的蛋白的特性。

不客气。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:16

LZ好，想问一下：哪种材质的超滤器可以高压？

======================================================

PES不可以高压。70%乙醇或者一些气体可以灭菌。具体见指南。

作者: windy+++ 时间: 2013-10-25 20:16

以前有用过MILLI 30K的，超滤完后发现30K以下的还是很多，理论上是不是30K以下的要基本上滤出？

============================================================================

其实用膜包在挤压过程中，一定会造成过滤孔径变形，那么直接影响的就是过滤品质，这是其一。
另外产品的分子结构在至目前的经验中，感觉也会对过滤品质造成影响，并不能达到完全滤出。
比如分子呈长线链装结构时，在过滤时受压，也会出现堵塞膜孔现象。
因此，应该是根据需要选用不同的膜来进行处理，那么效果会完全不一样，然后再进行比对来进行选择。
单说MILLI不行也不一定。同类分子量级的中空纤维膜也可以试试看的。

作者: windy+++ 时间: 2013-10-25 20:17

我想分离两个蛋白，分别大小为22和45kd左右，目标是纯化22kd的，请问我要用多大孔径的膜？

==============================================================================================================

如果单单是球状蛋白的话，理论上直接采用30KD的膜即可。取决于膜的分子切割精度。但是在具体的工况中，由于两者的分子量过于接近，有可能比较困难。

作者: windy+++ 时间: 2013-10-25 20:17

水通量Flux，是指在一定的温度（比如说25摄氏度）和一定的压力下（比如说1Bar），单位面积的膜单位时间（一般一小时计）透过的水的量。
Flux= XX LMH@25C*1Bar

注意水通量有新膜水通量和恢复水通量。前者是第一次使用前的新膜测定得出的水通量，这个数值测定后作为该膜用后清洗恢复率的水通量标准。恢复水通量是指用过的膜经过清洗之后，测定膜的水通量，并计算恢复百分比。一般该百分比不能小于80%。

===================================

补充一下，还有一个同一温度的条件下。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-10-25 20:17

相关疾病：
结肠癌
楼主，您好！
我做的结肠癌SW480细胞上清液的浓缩。具体的做法是，10mm皿细胞长到70%汇合时，撤血清，以无血清的L-15培养基培养20小时后取上清，经过离心，0.22um过滤后，将每皿10mL，共20mL的上清加到corning20ML，cut off：5K，超滤浓缩管中浓缩至1mL，加入生理盐水后混匀，继续离心3次，直到酚红的颜色退掉，浓缩至0.75mL。用BCA试剂盒测蛋白浓度为：0.7ug/uL。请问，您觉得这个浓度低吗？我的操作有什么问题吗？
谢谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-10-25 20:18

我想请教在用超滤膜进行血浆蛋白结合实验时，离心机转速在12000rpm时，血浆不能完全滤过，该采取怎样的方法进行改进？我用的超滤管是30k的

===============================================================================================================

超滤分离蛋白质和小分子，必须洗滤，因为超滤是蛋白质浓缩过程而不像固液分离那么完全。血浆蛋白质浓度很高，需要多次洗滤。不断洗滤就会稀释小分子浓度，很难测定。最好的方法是沉淀蛋白质，离心分离。常用的沉淀剂有乙醇、PEG等，你可以根据是否影响药物测定来选择。沉淀剂加到一定浓度就可以基本完全沉淀蛋白质，乙醇可以通过蒸馏、抽真空、旋转蒸发、冻干再溶解等不同的方法去除。我是做血液制品的，有问题联系我。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:19

楼主，您好！
我做的结肠癌SW480细胞上清液的浓缩。具体的做法是，10mm皿细胞长到70%汇合时，撤血清，以无血清的L-15培养基培养20小时后取上清，经过离心，0.22um过滤后，将每皿10mL，共20mL的上清加到corning20ML，cut off：5K，超滤浓缩管中浓缩至1mL，加入生理盐水后混匀，继续离心3次，直到酚红的颜色退掉，浓缩至0.75mL。用BCA试剂盒测蛋白浓度为：0.7ug/uL。请问，您觉得这个浓度低吗？我的操作有什么问题吗？
谢谢！

====================================================================

我的粗略的看法如下：这个浓度不算低，还可以。当然如果您能够更进一步浓缩，当然更好。
还是请有经验的人回答。再次致歉！

作者: 印花铅笔 时间: 2013-10-25 20:21

楼主的专业知识让人佩服！

我想请教两个问题，关于过滤和微滤的。

1、猪肝研磨后的悬浆不离心只过滤，大体应该使用什么设备和怎样设计步骤呢？
几年前我研发这个猪肝提取RNA项目，过滤就是一个重大阻碍。猪肝研磨后一些粗大的组织很容易去除，到了5μm级别就很难过滤了。借用别人的三足式离心过滤机效果也一般。我们的考虑是不购买大容量离心机，所以只能单纯考虑过滤方案。

2、蛇毒蛋白溶液经2300g离心后再过0.45μm滤膜，用抽滤瓶负压过滤，需要频繁换膜且速度很慢。是不是可以加一些助滤剂帮助过滤呢，还是在离心步骤之前加一些能帮助小颗粒沉淀的物质？
最终目的就是要缩短整个离心、过滤的时间而且损失的蛋白要少。

谢谢关注
祝顺

作者: ii077345 时间: 2013-10-25 20:21

请问超滤膜包使用一段时间后是否会发生膜包分子截留量的变化，就是原来能截留30k蛋白的膜包会不会变成只能截留50K的蛋白的膜包了，以前使用过millipore的TFF的膜包发现同样的30K 旧的和新的会不一样，如果有为何会出现这样的情况，谢谢

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:22

楼主的专业知识让人佩服！

我想请教两个问题，关于过滤和微滤的。

1、猪肝研磨后的悬浆不离心只过滤，大体应该使用什么设备和怎样设计步骤呢？
几年前我研发这个猪肝提取RNA项目，过滤就是一个重大阻碍。猪肝研磨后一些粗大的组织很容易去除，到了5μm级别就很难过滤了。借用别人的三足式离心过滤机效果也一般。我们的考虑是不购买大容量离心机，所以只能单纯考虑过滤方案。

2、蛇毒蛋白溶液经2300g离心后再过0.45μm滤膜，用抽滤瓶负压过滤，需要频繁换膜且速度很慢。是不是可以加一些助滤剂帮助过滤呢，还是在离心步骤之前加一些能帮助小颗粒沉淀的物质？
最终目的就是要缩短整个离心、过滤的时间而且损失的蛋白要少。

谢谢关注
祝顺

=================================================================

您好！谢谢来访！
关于您的问题，我认为不妨试验一下方法：
1，用切向流的技术试试。小体积用离心管，大体积用大面积的膜。
2，同样可以试试切向流，或者选择合适的膜，个人认为您的膜选择可能有问题。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:23

请问超滤膜包使用一段时间后是否会发生膜包分子截留量的变化，就是原来能截留30k蛋白的膜包会不会变成只能截留50K的蛋白的膜包了，以前使用过millipore的TFF的膜包发现同样的30K 旧的和新的会不一样，如果有为何会出现这样的情况，谢谢

=============================================================================

您是对的。超滤膜随着使用的时间推移，会产生孔径逐渐变大的情况。所以新膜和旧膜不宜混用。
原因吗，使用过的膜孔径当然会变大，生活中很多这样的现象。

作者: 969 时间: 2013-10-25 20:23

请问楼主是在国外实验室么？好几次关注你的答复都是在凌晨。

辛苦了～

作者: greenbee 时间: 2013-10-25 20:24

楼主你好，
请问超滤管可以用来提取exosome吗？我在做肿瘤细胞exosome(直径约30-200nm的膜小体)相关的实验，需要对用肿瘤细胞培养基来提取exosome。文献上一般是采用是分级离心法来浓缩，但是很耗时，而且实验室没有超速离心机，请问可不可以采用超滤离心的方法来提取exosome？急盼回复，万分谢谢！！！

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:25

楼主你好，
请问超滤管可以用来提取exosome吗？我在做肿瘤细胞exosome(直径约30-200nm的膜小体)相关的实验，需要对用肿瘤细胞培养基来提取exosome。文献上一般是采用是分级离心法来浓缩，但是很耗时，而且实验室没有超速离心机，请问可不可以采用超滤离心的方法来提取exosome？急盼回复，万分谢谢！！！

===============================================================================================================

分离纯化有多种方法，原理之一是SIZE的大小。那么size也有2种，一种是分子筛，一种是密度梯度离心。前者的应用是膜法分离，就是现在的离心管式，后者是根据密度梯度--但是需要专门的离心机。
用膜法当然是可以的，您可以浓缩，可以分级分离，可能效率如何是需要看杂质和目标物的差别大小。
在您的粒子的孔径范围里面选择，原则还是前文讨论过的。

作者: 8s5g 时间: 2013-10-25 20:25

不知道有没有用过Millipore或者Sartoris的半自动超滤系统，关于整个系统的死体积，我以前只是知道死体积越小越好，不知道有没有具体的一个指标来规范整个死体积，比如多大面积的膜包对应的整个系统的死体积必须小于多少才算合格？

作者: 8s5g 时间: 2013-10-25 20:25

如果单单是球状蛋白的话，理论上直接采用30KD的膜即可。取决于膜的分子切割精度。但是在具体的工况中，由于两者的分子量过于接近，有可能比较困难。

========================================================================

只是理论上可以，参照供应商关于30kd的定义，可以发现它是没法分离22kd和45kd蛋白的。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:27

不知道有没有用过Millipore或者Sartoris的半自动超滤系统，关于整个系统的死体积，我以前只是知道死体积越小越好，不知道有没有具体的一个指标来规范整个死体积，比如多大面积的膜包对应的整个系统的死体积必须小于多少才算合格？

非常感谢

============================================================================================================

不知道你说的是哪个型号？可否提供。

关于死体积问题，以下几点供参考：

1，死体积并不是所有的工艺都那么关注。比如我们在脱盐的时候，更换缓冲液的时候。我们在必须关注的地方给与考虑，那么如何考虑？

2，死体积主要是管路连接，阀门连接，压力表三通连接进出口连接泵连接粗细长短导致。膜包本身死体积并不大。
3，对于特定的工艺，我们要求死体积最好不要大于多少，是我们使用者的要求，至于是否做到，看厂家的设计。
4，厂家可以通过对于上述2的条件进行设计，一般可以达到理想结果。但是也有极端的案例。
5，如果我们要的是浓缩端的料液，那么可以在超滤结束时候用空气顶出来，再少量清洗下。
6，如果我们要的是透过液，损失是在所难免的。

综合以上条件，再和厂家题要求，基本能够满足。

作者: njkph 时间: 2013-10-25 20:27

只是理论上可以，参照供应商关于30kd的定义，可以发现它是没法分离22kd和45kd蛋白的。

==================================

您说的对的。

我建议还是可以用离心管试验下。方便快捷。

作者: 49888 时间: 2013-10-25 20:28

请问楼主，我们配制BSA携带的palmitate。分别用过0.45uM的PES和PVDF膜过滤除菌，感觉两次过滤不一致，PVDF膜滤过后，液体更清亮，担心蛋白损失。PES膜过滤比较困难。请问楼主，选用怎样的滤膜更适宜

作者: PPT 时间: 2013-10-25 20:28

PVDF 和PES两种材料对蛋白质的吸附量是有差异的，因此适宜过滤的液体性质也是有差异的。一般来说，PVDF对蛋白质的吸附量更低，更多用在比较珍贵的蛋白质产品的除菌过滤上；PES材料对蛋白质吸附稍微多一些，而且很多厂家的PES材质的滤膜是多层渐变孔径的膜（就是说上层孔径大，下层孔径小），这样的滤膜更适合过滤一些比较“脏”的液体。

作者: PPT 时间: 2013-10-25 20:29

楼主的专业知识让人佩服！

我想请教两个问题，关于过滤和微滤的。

1、猪肝研磨后的悬浆不离心只过滤，大体应该使用什么设备和怎样设计步骤呢？
几年前我研发这个猪肝提取RNA项目，过滤就是一个重大阻碍。猪肝研磨后一些粗大的组织很容易去除，到了5μm级别就很难过滤了。借用别人的三足式离心过滤机效果也一般。我们的考虑是不购买大容量离心机，所以只能单纯考虑过滤方案。

2、蛇毒蛋白溶液经2300g离心后再过0.45μm滤膜，用抽滤瓶负压过滤，需要频繁换膜且速度很慢。是不是可以加一些助滤剂帮助过滤呢，还是在离心步骤之前加一些能帮助小颗粒沉淀的物质？
最终目的就是要缩短整个离心、过滤的时间而且损失的蛋白要少。

谢谢关注
祝顺

===============================================================================================================

关于您的问题，我认为不妨试验一下方法
1、如果想对动物组织匀浆只过滤不离心，使用中空纤维切向流过滤系统应该是比较好的一个选择。中空纤维是开放式的泳道，不容易堵塞，比较适合用在一些高固形物含量样品的浓缩上。
2、蛇毒样品室粘度比较高的一类样品，如果您每次处理的样品想对比较多的话，我个人觉得您可以应用中空纤维过滤；另外如果你的蛇毒样品可以稀释的话，可以稀释以后过滤，然后再浓缩，这样就会容易过滤一些。

作者: 49888 时间: 2013-10-25 20:30

PVDF 和PES两种材料对蛋白质的吸附量是有差异的，因此适宜过滤的液体性质也是有差异的。一般来说，PVDF对蛋白质的吸附量更低，更多用在比较珍贵的蛋白质产品的除菌过滤上；PES材料对蛋白质吸附稍微多一些，而且很多厂家的PES材质的滤膜是多层渐变孔径的膜（就是说上层孔径大，下层孔径小），这样的滤膜更适合过滤一些比较“脏”的液体。

===========================================

谢谢楼主
那么请问这两种材料在脂肪酸的滤过上是否有差异呢?

作者: PPT 时间: 2013-10-25 20:30

PVDF 和PES两种材料对蛋白质的吸附量是有差异的，因此适宜过滤的液体性质也是有差异的。一般来说，PVDF对蛋白质的吸附量更低，更多用在比较珍贵的蛋白质产品的除菌过滤上；PES材料对蛋白质吸附稍微多一些，而且很多厂家的PES材质的滤膜是多层渐变孔径的膜（就是说上层孔径大，下层孔径小），这样的滤膜更适合过滤一些比较“脏”的液体。

===============================================================================================================

谢谢楼主
那么请问这两种材料在脂肪酸的滤过上是否有差异呢?
PES材质的膜属于水系膜，不适合过滤有机溶剂，PVDF材质的有些膜产品是水系膜，也有PVDF有机膜专门由于有机试剂的过滤，建议你购买有机系顾虑膜过滤你的脂肪酸。

作者: 49888 时间: 2013-10-25 20:31

谢谢楼主的耐心解答。我的脂肪酸是NaOH配制，再结合到不含脂肪酸的牛血清白蛋白，此种液体我试过0.45um 的PES和PVDF两种膜，过滤阻力相对而言PVDF更小些，但是滤过稀释进培基在显微镜下观察可以看见较多脂滴。PES偶尔出现无法滤过的情况，稀释后不易见脂滴。不知道这个是什么原因？

作者: ssonglikihi 时间: 2013-10-25 20:32

楼主我样品3000 k ，用10000k 的超滤但是取下清，跑小肽总是没有东西什么原因。。。多谢

作者: PPT 时间: 2013-10-25 20:32

楼主我样品3000 k ，用10000k 的超滤但是取下清，跑小肽总是没有东西什么原因。。。多谢

==============================================================================================================

根据超滤膜选择的原理，让样品透过超滤膜需要选择的膜孔径是分子量大小的5-10倍大，也就是说你需要选择15-30k超滤膜，30k超滤膜有产品，你可以试一试。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)