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标题: 【求助】多糖纯化后醇沉无沉淀 [打印本页]

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:44 标题: 【求助】多糖纯化后醇沉无沉淀

水提醇沉一种植物多糖，50度加温复溶，用大孔吸附树脂AB-8，37度24小时振荡除色素，然后用0.45的滤膜除菌，用5000分子量的超滤膜包去除小分子和部分色素，浓缩到非常小的体积，4度过夜醇沉竟然什么都没有~~没有沉淀。
我以上的处理过程不应该有什么问题吧~~为什么没有沉淀呢？？
请各位高手指教！~~~~
纯化过程无限挫折！！！！郁闷死了

作者: 101010 时间: 2013-10-25 20:44

1. 尝试用搅棒摩擦容器壁形成晶核
2. 如果还是没有，能不能查到目标物的溶解度，多糖的量是否足够多
3. 目标物是不是在纯化过程中被吸附、滤除、分解（pH=?）

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:44

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1. 尝试用搅棒摩擦容器壁形成晶核
2. 如果还是没有，能不能查到目标物的溶解度，多糖的量是否足够多
3. 目标物是不是在纯化过程中被吸附、滤除、分解（pH=?） ...

我是用2g溶于1L水。不少了吧~~
ph一直是没变吧~~溶液里除了粗多糖之外一直没加过东西。

作者: 101010 时间: 2013-10-25 20:45

摩擦器壁还是没有吗?　

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:45

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摩擦器壁还是没有吗?　

没有，只有想碎屑一样的东西。我觉得我放的多糖量很多呀~~怎么会这样呢~那步出的问题？

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-10-25 20:46

用大孔吸附树脂AB-8，37度24小时振荡除色素，

是否保证多糖在树脂上没有吸附损失？

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-10-25 20:47

用5000分子量的超滤膜包去除小分子和部分色素
以我的经验，超滤膜包的损失还是很大的，如果你的样品本来就不多，。。。。。。。
你可以试试透析袋，虽然慢一点，但是不会有死体积的损失
另外你最开始水提醇沉得到的多糖是否测过多糖含量？不会是蛋白、色素啊之类的占有太大比例吧？
鉴于你的步骤太多，都做完了很难找到出问题的步骤，建议你每一步做完都测一下多糖含量，这样很快就能找到出问题的步骤

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:47

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用5000分子量的超滤膜包去除小分子和部分色素
以我的经验，超滤膜包的损失还是很大的，如果你的样品本来就不多，。。。。。。。
你可以试试透析袋，虽然慢一点，但是不会有死体积的损失
另外你最开始水提醇沉得到的多糖是否测 ...

大孔吸附树脂除色素，用苯酚硫酸法测，多糖损失量大约50%。我把膜包滤出来的液体用苯酚硫酸法测没有颜色反应（我没加热、没用紫外测）。
谢谢您的建议，我再做一遍，看看到底问题出在哪了。

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:48

透析袋我用过，效果还没有超滤好呢~~我觉得可能是都变性了，因为一透就三天。透析之后醇沉也什么都没有，而且透析之前我还没用大孔吸附树脂去色素。
问题会不会出在多糖上，会不会苯酚硫酸测得多糖不准，粗提物中本来就没有多糖呢~~
我用苯酚硫酸测粗提物中约45%的糖。针对粗提物我用1-萘酚法测有紫环反应，紫外全波长扫描在203nm左右有峰，没有其他的峰。蛋白反应为阴性。

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-10-25 20:48

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透析袋我用过，效果还没有超滤好呢~~我觉得可能是都变性了，因为一透就三天。透析之后醇沉也什么都没有，而且透析之前我还没用大孔吸附树脂去色素。
问题会不会出在多糖上，会不会苯酚硫酸测得多糖不准，粗提物中本来就没有多 ...

苯酚硫酸发实验的手法对结果测定影响较大，但不会是阴性和阳性的差别。如果有45%的含糖量，应该没有问题。
萘酚硫酸法测定时加入浓硫酸后不能震摇，只要发现液面交界处有紫色环就是阳性，不需要紫外扫描。

如果你超滤后多糖都无法检测到，你如何认为这个方法比透析好呢？透析后液体体积会增加，因此要浓缩后才能测。最简单的方法，你把超滤后样品或者透析后样品直接冻干，然后溶解后测糖含量就可以。

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:50

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原帖由 jiushikeshui371 于 2013-10-25 20:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

苯酚硫酸发实验的手法对结果测定影响较大，但不会是阴性和阳性的差别。如果有45%的含糖量，应该没有问题。
萘酚硫酸法测定时加入浓硫酸后不能震摇，只要发现液面交界处有紫色环就是阳性，不需要紫外扫描。

如果你超滤后多 ...

硫酸苯酚和萘酚法的操作是正确的，应该不是手法问题。我的粗提物是棕黄色的，会不会是颜色干扰呢？不过我超滤的滤出液也是黄色，苯酚硫酸法就没有颜色反应。
我现在只要一处理，之后醇沉就没有沉淀。
是不是醇沉没有沉淀就说明没有多糖了呀？

作者: summerxx 时间: 2013-10-25 20:50

用CTAB试试？
离心一下看看。

作者: mogu 时间: 2013-10-25 20:51

我说说我的提取工艺，看对你有帮助没：
脱脂：80%乙醇脱脂后烘干药渣；
药渣称重后按照1:10加水煮3h，煮三次后，浓缩到1g：10ml的浓度后加入乙醇到醇含量为80%后于室温静置，隔夜可见明显分层。（其实加乙醇的时候就能有絮状沉淀，边加乙醇边搅动）
醇沉5次或者三次，脱蛋白采用氯仿正丁醇，外加蛋白酶，脱完后紫外全波长扫描检验效率。
苯酚硫酸法不行的话就采用萘酚法，不要摇，糖颜色会有比较明显色环；
但是一般的糖里面会有小分子的糖干扰，含量往往是不准确的。特别是粗提物，我看见一个帖子里面提到有个换算因子，但是我还没用找到怎么换算。
脱色的话，有篇文献提到不要采用活性炭，双氧水等方法，实际中，除非大量采用树脂，少量可以采用纤维素凝聚来实现脱色效果~不采用树脂主要是损耗太大。
希望这些对你实验有帮助~

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:51

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原帖由 mogu 于 2013-10-25 20:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我说说我的提取工艺，看对你有帮助没：
脱脂：80%乙醇脱脂后烘干药渣；
药渣称重后按照1:10加水煮3h，煮三次后，浓缩到1g：10ml的浓度后加入乙醇到醇含量为80%后于室温静置，隔夜可见明显分层。（其实加乙醇的时候就能有絮状沉淀，边加 ...

谢谢。我也纯化了。用deae-葡聚糖-ff。之前的色素如果去不干净特别伤柱子。我觉得用大孔吸附树脂还是比deae便宜得多。其实脱色我一直也没找到一种行之有效，而且便宜的方法。
我的水提醇沉粗多糖别说紫外了，连双缩脲等化学方法都做了，显示没有蛋白，或是极少量。
我提取的东西里面应该好多多酚黄铜类东西，我就是想把色素尽可能去掉，多糖尽可能提高含量，可是一处理就显示什么都没有了~~不是醇沉沉淀不出来，就是沉淀的东西不溶于水，要不就是溶于水了测不出糖浓度。我一直不知道我究竟是错到哪一步了。都郁闷死了！！！

作者: BUK 时间: 2013-10-25 20:52

纤维素凝聚能够重复利用，而且脱色效果是很明显的~何况凝聚能够再生，有条件的话直接上凝聚。
多糖一般脱色必然伴随糖的损失，特别是采用大孔树脂，这个你实验室要是有人做植化，你可以看看大孔树脂一般用在什么时候~
植物多糖里面蛋白含量一般是比较少的，同时采用氯仿正丁醇方法脱蛋白，多糖损失可达40%左右，但是一般脱4次依然还有中间层，要是精密测含蛋白量，就用生化的凯氏定氮法，但是我觉得不用这么复杂，因为在后续纯化过程中蛋白是越来越少的。
之前脱色素，有人采用石油醚脱色素，要是你的药物中糖分少的话就用它吧~效果还是比较好的~
脱完色素的药渣算产率要按照原始重量算~
一处理就没有了，就换换，一般多糖是水溶的，至少溶于热水。醇沉的时候把握好水提夜的浓度，太稀的话浪费酒精，而且沉淀也很慢~注意好比例再试试~醇沉3次后多糖颜色会较淡~真空干燥和冻干的颜色差别较大。
查查看你的药物里面含糖量有人做过没~有，是多少；没有，看看它的功效或者再找文献。
测不出糖浓度，看看是不是其他干扰，比如试剂问题，苯酚有没有问题，仪器问题~有时候出问题不一定是实验本身的问题，再就是实验要淡定~不要急躁~

作者: PINK 时间: 2013-10-25 20:53

不知道你提的什么，但我做过的一些动物多糖，醇沉的时候需要加一些氯化钠才能沉淀下来，不知你这个提取物要不要这样

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:55

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不知道你提的什么，但我做过的一些动物多糖，醇沉的时候需要加一些氯化钠才能沉淀下来，不知你这个提取物要不要这样

谢谢~~现在问题已经解决了，原来不是以沉淀的形式沉淀的~~而是要过滤一下，用滤膜，结果乙醇虑下去的接近于无色了，而应该有的沉淀就堆在滤膜上。

作者: PINK 时间: 2013-10-25 20:56

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谢谢~~现在问题已经解决了，原来不是以沉淀的形式沉淀的~~而是要过滤一下，用滤膜，结果乙醇虑下去的接近于无色了，而应该有的沉淀就堆在滤膜上。 ...

那可能是你的多糖太少了，沉淀不明显

作者: cbou876 时间: 2013-10-25 20:56

我也想请教一下我多糖用是水提，然后用让含醇量达到80%沉淀，沉淀很多，然后将沉淀用适当的水溶解，基本可以完全溶解但是溶解后水溶液是浑浊的，就是混悬液，然后我用（氯仿-正丁醇）的方法去除蛋白，再用让含醇量达到80%沉淀多糖，结果溶液完全澄清，如何摇晃都是澄清的，我想请教下楼主，我看你说的，你滤过就发现有了，你是用的什么滤膜了？你溶液是否在过滤前也是澄清透明的了？还有我也想用大孔树脂脱色，你觉得效果如何？非常感谢

作者: =pkchen= 时间: 2013-10-25 20:57

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原帖由 cbou876 于 2013-10-25 20:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也想请教一下我多糖用是水提，然后用让含醇量达到80%沉淀，沉淀很多，然后将沉淀用适当的水溶解，基本可以完全溶解但是溶解后水溶液是浑浊的，就是混悬液，然后我用（氯仿-正丁醇）的方法去除蛋白，再用让含醇量达到80%沉淀多糖，结 ...

我就用0.45的滤膜，是可拆卸的那种，不是滤器，所以可以回收。我过滤前也是澄清的，看不出沉淀。大孔吸附树脂我觉得效果不是很好，去除色素不是很多，而且它是按照极性去除色素的，你要注意你的多糖的极性，还有你想要得到什么极性的多糖。

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