Board logo

标题: 【求助】请教蛋白质质谱测序 [打印本页]

作者: cwcwcww    时间: 2013-10-25 22:15     标题: 【求助】请教蛋白质质谱测序


请教各位战友,我现在想用质谱进行蛋白质测序,我的蛋白在电泳上看来是一条带,但是有可能不是一种蛋白,应该是可以用质谱进行测序的吧?我是想直接从凝胶上切下来,然后侧序。另外想请教一下,在质谱测序的时候对蛋白质样品有什么要求?我看见军科院的仪器中心是要求不含有不挥发盐,但是做凝胶电泳时是有很多盐的,是不是测序前要处理样品?用水来置换buffer??
请各位多多指教!谢谢!

作者: sr9971    时间: 2013-10-25 22:15


可参照军科蛋白质组中心cuturl('http://www.proteomics.com.cn')提供的protocol。虽然做凝胶电泳时样品有盐,但电泳过程中盐是会与蛋白分开的,相当于有个脱盐效应。测序前样品处理参照protocol做就可以了,样品用不着特别处理。不过提胶点时要注意带好手套等,防止角蛋白污染。Trypsin用测序级的,EP管和Tip头用硅化过的。

作者: cwcwcww    时间: 2013-10-25 22:16


请问如果一条带里也许不是一种蛋白 ,那么用质谱可以侧序吗??

作者: dreaming    时间: 2013-10-25 22:16

不同的地方对样品的要求不同。有的只要你把目的条带从胶上切下来就可以,这样的地方主要有上海生化细胞所蛋白质组研究分析中心陈薇/呼建文处,可以负责样品的制备,(包括脱盐、酶解,但需要你染色)和上海基康公司,基康的咨询电话是021-69456278转 27或34找田军,或是021-54262636找曹玉玲。
有的地方需要你处理好样品,比如中山大学仪器测试中心 ,中科院化学所 赵振文老师 熊少祥教授处。他只管上质谱鉴定,但一般价格较便宜,一个点300元左右。

作者: cwcwcww    时间: 2013-10-25 22:16


到底一个条带里包含几种蛋白可不可以测序那??基康公司好像只可以用endman降解法。

作者: dreaming    时间: 2013-10-25 22:17


你是用的1D OR 2D Eletrophoresis?

作者: cwcwcww    时间: 2013-10-25 22:17

1D电泳,免疫共沉淀后跑的,想测沉淀下来的蛋白的序列。谢谢!
作者: dreaming    时间: 2013-10-25 22:18



QUOTE:
原帖由 cwcwcww 于 2013-10-25 22:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1D电泳,免疫共沉淀后跑的,想测沉淀下来的蛋白的序列。谢谢!

免疫沉淀后的蛋白再做1D-PAGE应该比较纯了,可以上质谱鉴定!
最近,我也在做这项工作,可IP始终做不好,能否请苏小姐介绍一下你的经验!望不吝赐教!

作者: orangecake    时间: 2013-10-25 22:18


质谱可以测几种蛋白呀。不过要用tandem MS罢了。象一条带里有几种蛋白质的话,酶解后肽段提取物可上ESI-MS/MS获取各肽段的(部分)氨基酸序列,理论上讲,一般一条6AA的准确氨基酸序列就可准确鉴定蛋白质了。不过测MS/MS国内收费可不菲哟,价格在2000~4000左右/sample。另外,你的样品来源是什么?要是基因组测序完成的话还好,要是那些还没基因组测序的话可就惨了。

作者: cwcwcww    时间: 2013-10-25 22:19


谢谢!!我做Ip的时间也不长,我觉得主要是预清除要做好,另外孵育时间也要摸一下。我得到的带不纯,因为我用edaman降解法测不出来,显示是蛋白不纯的缘故,白花了钱。所以现在想用质谱试试!

作者: dreaming    时间: 2013-10-25 22:19



QUOTE:
原帖由 cwcwcww 于 2013-10-25 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢!!我做Ip的时间也不长,我觉得主要是预清除要做好,另外孵育时间也要摸一下。我得到的带不纯,因为我用edaman降解法测不出来,显示是蛋白不纯的缘故,白花了钱。所以现在想用质谱试试! ...

听我师兄介绍说,预清除不是很重要,对结果没有太大影响.
孵育时间的确是个重要因素,按照一般的实验protocol,好像都不够,一抗和agarose的孵育我都是过夜的(>10h),不过我还是看不到我要得条带。能否将您的漂亮ip贴出来,让俺瞻仰瞻仰?

作者: memory    时间: 2013-10-25 22:20


if your band has more one protein,though you can identify them using MS in theory,in fact ,it's difficult.Perhaps,you get a protein list,but which is true?
Someone maybe say you can identify according to the ions scores when you search database,but,it not always is fine.
So,try your best to pure your samples, or, there is nothing even though you use MS.

作者: 薄荷侠    时间: 2013-10-25 22:20

You hit the point!

Score, or so-called MF match factor, is just a product of mathmatics. Many evalution equations and therefore more weight factors are involved. One can hardly judge which result is more resonable from dozens of target proteins with MF of about 40%. However, it's definely ture that better separation brings better identification.

作者: 鲇鱼少爷    时间: 2013-10-25 22:21


我的蛋白上海基康认为为N-末端封闭,请问还有什么方法来测序呀?哪里可以提供解封闭-测序服务?如何来确定是封闭的?是何种封闭?谢谢,急呀!要毕业了,等结果呀!救救我吧!

作者: DNA    时间: 2013-10-25 22:21


蛋白测序和蛋白鉴定不是一个概念 鉴定是根据一定的算法看MS匹配度来推测肽序的 没太懂楼主需要做到那一步?

作者: jingling845    时间: 2013-10-25 22:22

蛋白质测序,如果用EDMAN方法,要样本量多,耗费大,用TANDEM MS要容易点。
蛋白质鉴定,采用的方法不少,根据实验来定吧。测序是比较可靠的了,WB也是啊,若只有大小不同的二个蛋白质,SDSPAGE也行的。。。

作者: DNA    时间: 2013-10-25 22:22


影响质谱分析的因素有哪些?
DTT是否影响

作者: DNA    时间: 2013-10-25 22:22


IP后的蛋白及Protein G Beads一起,如何将他们分开,进行质谱鉴定

作者: langlang    时间: 2013-10-25 22:23


请问LC-MS做出来的差异蛋白中的未知蛋白,只知道蛋白分子量,如何获取呀,我想用来测序?急求





欢迎光临 分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/) Powered by Discuz! 5.5.0