分析测试百科

标题: 【求助】磁珠与抗体的偶联 [打印本页]

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 22:57 标题: 【求助】磁珠与抗体的偶联

本人目前正在摸索磁珠与抗体偶联，出现一些问题，希望高人解答。不胜感激

1.与磁珠偶联之后的剩余抗体应该用哪种方法定量，BCA或Bradford？剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵。

2.抗体在pH9.5的环境下是否失活，抗体能承受的pH范围是多少啊？

作者: 北国毛毛雪 时间: 2013-10-25 22:57

你用的什么磁珠？上面什么基团？

作者: 30moonriver 时间: 2013-10-25 22:58

我用的磁珠是Dynal甲苯磺酰基，不知道你用的是什么磁珠？

作者: 00无名指00 时间: 2013-10-25 22:58

尝试回答：1.BCA或者BRADFORD都是蛋白定量的方法，不过对溶液有要求，如盐离子浓度太高，影响结果准确性，如含有可被还原性物质，也影响结果。硼酸好像有还原性，硫酸铵离子浓度太高的话也不适宜。2.抗体一般在中性的溶液中保存比较稳定，如在短时间内，可以承受ph6-8的范围，如果ph相差更多，则时间越短越好，而且溶液偏酸比偏碱对抗体稳定性影响小。

作者: 短头发 时间: 2013-10-25 22:59

我用的是偶联了亲和素的。

作者: birdfish 时间: 2013-10-25 22:59

剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵，铵在碱性条件下容易分解产生氨，可能会干扰偶连，所以最好去干净或换缓冲液。

作者: milkdog 时间: 2013-10-25 23:00

我也正在做抗体与磁珠的耦联，但没想过要测耦联后剩余抗体的量，我做个抗体梯度，看到哪个量到达平台期，再判断哪个量是最适量。这样可否？

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 23:00

剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵，铵在碱性条件下容易分解产生氨，可能会干扰偶连，所以最好去干净或换缓冲液。

===============================================================================================================

该磁珠的说明书上写到：Addition of ammonium sulphate to a final concentration of 1.2M(1.0-1.5M) will increase the amount of antibody coupled to the beads,and can give an improved performance in some applications.我觉得可能是因为我用的这种磁珠表面是疏水性的，而加入少量的盐能使抗体的疏水区暴露，更有利于抗体与磁珠的结合。但是含硫酸铵的硼酸缓冲液每次开盖用的时候都能闻到刺鼻的味道，可能真的分解产生氨了。

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 23:01

我也正在做抗体与磁珠的耦联，但没想过要测耦联后剩余抗体的量，我做个抗体梯度，看到哪个量到达平台期，再判断哪个量是最适量。这样可否？

===============================================================================================================

我觉得这个方法可以找到最适量，可是在这种最适量的情况抗体也不可能全部连接到磁珠上吧？是不是应当计算出究竟有多少抗体连接到磁珠上，这样也就相当于测了偶联后的浓度。我是新手，也不知道是否一定要给出偶联率。

作者: yhz1973 时间: 2013-10-25 23:01

偶联率未必要给吧，我见文献上也没报道过，只能关于偶联效率的验证。况且我觉得BCA或Bradford测蛋白的量不是很可信，原因是我师兄用好几种方法测蛋白的量，相差都都大的，我不知道该信哪一种。

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 23:01

QUOTE:

原帖由 yhz1973 于 2013-10-25 23:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

偶联率未必要给吧，我见文献上也没报道过，只能关于偶联效率的验证。况且我觉得BCA或Bradford测蛋白的量不是很可信，原因是我师兄用好几种方法测蛋白的量，相差都都大的，我不知道该信哪一种。 ...

非常感谢，不同方法测同一个标本结果不一样，那不同方法测的结果差值（偶联前-偶联后）是不是也不一样啊。

作者: yhz1973 时间: 2013-10-25 23:02

应该是不一样的吧。就像我透析完抗体之后测它的浓度我心里觉得没一种方法我比较信赖的。所以我只能透析之前先根据已知的标准浓度来测，透析后我测了再比例计算。
现在我正在进行微球耦联，每个抗体浓度耦联好之后进行的耦联效率验证我都做复孔，但是每个复之间MFI值都相差挺大的，我已重复几次从耦联开始再实验了，结果都这样，对这样的结果你有什么好建议改进吗？我现在也找不到原因了，照里说复孔是同条件同时同操作的，误差应该不会很大。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2013-10-25 23:02

你好！我最近也一直在做Dynal 磁珠与抗体的偶联时间在。偶联按照protocol肯定是可以成功的，但是需要多长时间才能把所有的活性基团几乎全部偶联上抗体，很难确定。还有，你通过对磁珠偶联之后的剩余抗体定量的方法我间接的测定偶联的效率不是很科学，因为我曾做过时间梯度，发现把抗体加进磁珠的瞬间，通过定量的方法发现抗体的量大大降低，很明显，这些减少的抗体是被磁珠吸附在表面，并没用真正的与磁珠偶联。
我们可以交流一下实验心得。

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 23:03

QUOTE:

原帖由 伊莎贝拉 于 2013-10-25 23:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好！我最近也一直在做Dynal 磁珠与抗体的偶联时间在。偶联按照protocol肯定是可以成功的，但是需要多长时间才能把所有的活性基团几乎全部偶联上抗体，很难确定。还有，你通过对磁珠偶联之后的剩余抗体定量的方法我间接的 ...

磁珠包被抗体时，不同种属的抗体（像兔抗、鼠抗）它们的Fc段会有种属的差异性，这个会影响抗体与磁珠的偶联效率吗？你包被用的抗体是自己制备的还是商品化的抗体？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2013-10-25 23:03 标题: 回复 #14 wu11998866 的帖子

我现在用的是鼠抗，没做过兔抗的，它们种属的不同而导致偶联效率的不同就不清楚了。目前用的抗体是自己制备的。我用的磁珠型号是invitrogen Myone。。不知道你现在的实验进行到哪一步了？

作者: wu11998866 时间: 2013-10-25 23:04

QUOTE:

原帖由 伊莎贝拉 于 2013-10-25 23:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在用的是鼠抗，没做过兔抗的，它们种属的不同而导致偶联效率的不同就不清楚了。目前用的抗体是自己制备的。我用的磁珠型号是invitrogen Myone。。不知道你现在的实验进行到哪一步了？ ...

目前主要还是在摸偶联这一步的条件。现在感觉我最大的问题是抗体在反应体系中的浓度太低，导致了与磁珠偶联的效率很低。我现在用的是商品化的抗体1ug/ul，貌似商品化的抗体浓缩起来比较难吧，不知道有什么方法可以解决。我用的磁珠是 M280，呵呵，我们用的基团是一样的哦。

作者: glass 时间: 2013-10-25 23:05

除了磁珠，还可以用Agarose来偶联，不知道谁做过没有，哪种Resin最好？我也用过M280，感觉也就一半偶联上去了把，文献报道可以连7-8ug/mg磁珠。我觉得时间有点长，室温要一天，不知道抗体有多少会因此而失活，我看一般Agarose偶联也就0.5-4小时的时间吧。

另外，抗体可以用超旅管浓缩，10K和30K的都可以，甘油是可以滤过的。

作者: tangxin_80 时间: 2013-10-25 23:06

如果仅是发表文章，不太考虑成本，直接买用活化好的磁珠，加抗体或蛋白就行了。要的找我

作者: vvmmoy 时间: 2013-10-25 23:06

……我用的是链霉亲和素包覆好的磁珠，自己在抗体上连接生物素。没有检测偶联效率什么的，按说明书来，却不知道为什么总也做不出来反应……

作者: 2541 时间: 2013-10-25 23:06

可能是生物素与抗体没有结合好吧

作者: TAT 时间: 2013-10-25 23:07

本人目前正在摸索磁珠与抗体偶联，出现一些问题，希望高人解答。不胜感激

1.与磁珠偶联之后的剩余抗体应该用哪种方法定量，BCA或Bradford？剩余的抗体溶液中含有pH9.5的硼酸缓冲液，也含有硫酸铵。

2.抗体在pH9.5的环境下是否失活，抗体能承受的pH范围是多少啊？

==============================================================================================================

真的不建议使用这个beads啊～如果抗体没有饱和那就会和加入的蛋白质crosslink～会有很高的背景的～还是用proteinA/G的beads好些啊～交联就是用DSS什么的

作者: TAT 时间: 2013-10-25 23:07

其实的确有个办法确定抗体的偶联效率～就是加了抗体后加荧光二抗～然后流式确定～

作者: eric930 时间: 2013-10-25 23:08

我现在也在做磁珠方面，怎样才能知道抗体偶联达到最大值呢？目前我用的方法就是测上清中剩余抗体的量，但是感觉不准确。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)