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标题: 【求助】跨膜蛋白的原核表达 [打印本页]

作者: 爱老虎游tt 时间: 2013-10-27 17:15 标题: 【求助】跨膜蛋白的原核表达

我现在在做一个跨膜蛋白的原核表达，载体是PGEX-4T-2,膜蛋白大小是64KD,菌株：BL21，我改变了诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度，但仍然没有表达，测序证实读码框是正确的。同时空质粒PGEX-4T-2的融合蛋白也没有表达。我看到PRP曾经发了帖子说他把膜蛋白穿膜攀区域去掉，才能够表达，大家能给我提些意见吗？具体给我分析一下。我刚开始做，希望大家给我些指点，谢谢！

作者: seagate 时间: 2013-10-27 17:15

你怎么知道它没有表达？SDS-PAGE？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2013-10-27 17:16

诱导前后在相应大小的marker对应处没有条带，这不就说明没有表达吗？
再就是我的蛋白表达出来是为了制备抗体，并不一定要有活性，这样需要加信号肽吗？

作者: yes4 时间: 2013-10-27 17:17

如果是这种情况最好是换载体和表达菌株。

作者: qhyu 时间: 2013-10-27 17:18

我去年十月作也是这样，有个夸膜区，用了PET30-a(+),pGEX-4T-1做载体都不行，用过0.5mol/L,1mol/L,2mol/L,4mol/L的IPTG进行诱导，和用BL21（DE3）及ROSETTA等大肠杆菌表达都不行。只好重新设计引物，把跨膜的6－19个氨基酸去掉，再用BL21（DE3）表达，就表达出来了，用1mol/LIPTG就行，1h就表达，量较大！
别人也告诉我有跨膜区用大肠杆菌表达可以表达，但我没作出来，那位高人指点一下！！

作者: zhezhe 时间: 2013-10-27 17:18

主要还是因为你的蛋白分子量太大了，既然你做多抗用，那么就选取其中一段，最好知道是胞外段用来免疫兔子好了，应该能制备出来多抗的。

作者: 大白菜 时间: 2013-10-27 17:19

去掉跨膜的个氨基酸必要，但去掉跨膜区以后，所剩C端最好要有5-10亲水氨基酸，如果还是疏水氨基酸，一样表达困难。个人经验，未必通用。

作者: yychen 时间: 2013-10-27 17:19

我也正在做原核表达，我的蛋白29KD，多种软件预测都有一个跨膜区，位置在90-110AA处。载体是PGEX-4T-3,菌株：BL21。表达的结果是全蛋白的表达量很高，去掉包含跨膜区的N端110AA的蛋白SD-PAGE表现出的量却很低，而且有分子量更低的杂带。在这里我有几个问题想请教：
1.原核表达的跨膜蛋白在菌体中会与膜系统结合吗？
2.去掉包含跨膜区的N端110AA的蛋白SD-PAGE表现出的量低是层析时出现的问题吗？

作者: 大白菜 时间: 2013-10-27 17:20

我做的蛋白跨膜区位于C端。biocrysrain 的结果：好象跨膜区位于N端不影响表达。去掉包含跨膜区的N端，如产生了宿主菌易降解序列，蛋白表达量会下降。

作者: yychen 时间: 2013-10-27 17:20

从全蛋白和截短的蛋白的SDS-PAGE结果看，截短的蛋白确实部分降解了。不知道有没有什么办法可以降低这种酶解？

作者: changlhsyo 时间: 2013-10-27 17:21

是否分泌到上清或胞周质

作者: rxcc33 时间: 2013-10-27 17:21

我做的就是膜蛋白的表达,我的蛋白有12次跨膜,用遍所有的原核表达体系都没能将其的成熟肽表达出来,后来选了最大的胞外区片段用pGEX-4T-2在BL21(DE3)coden plus宿主菌中才表达,而且我也遇到空载体在BL21中不表达.只在CP-RP中表达.还有pMAL也是很好的表达体系,我的基因这套系统也表达了

作者: BUK 时间: 2013-10-27 17:22

不知有没有人把几个非跨膜区的亲水部分连成一个多肽进行表达然后制备抗体呢？

作者: wawa 时间: 2013-10-27 17:22

我以前表达过一个120kd的跨膜蛋白，跨膜区在N端，约在全长的1/4处，表达出来的蛋白必须添加表面活性剂才能可溶。而且我的这个蛋白本来就来自原核。

你的空载体都不表达gst，肯定是有问题的，换个载体看看，我也遇到过pGEX载体序列突变的情况。多试几个载体，东方不亮西方亮。

你的基因如果来自真核，最好用带有稀有密码子的宿主菌，如BL21（DE3）codon plus，或者rosseta系列，这两个原理一样，只是不同公司的产品，我的基因有的用普通的BL21（DE3）不能表达，用coden plus就能表达，而且表达量很高。

最好同时做一个去掉跨膜区的试验，这样更保险。

作者: yysr238 时间: 2013-10-27 17:23

我想咨询一下，你们表达跨膜蛋白全蛋白用的什么原核表达载体和宿主菌呀！我也出现过上面的情况，用PET-32a和PGEX-4T-2表达载体都没有表达出来！

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