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标题: 【讨论帖】冷冻复性 [打印本页]

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:25 标题: 【讨论帖】冷冻复性

是《冻干法复性蛋白》。冻干法不建议随便做，太耗费能源，如果有生产线资源或者捎带的话，可以尝试一下。对以后大量生产EGF，IGF这种蛋白粗品可能会很有裨益。不过现在正好过冬天，气候干燥的地方可以考虑一下。

protocol很简单，就是变性完了冻结，然后抽取早期融化的液体，其中就应该有已经复性的蛋白。
但是很多蛋白可能对冷冻敏感，这个还需要看您的运气了。具体变性液，我是用8M尿素PBS缓冲液Ph8左右加点BME，加9%甘油做冻结保护剂。您完全可以用您实验室的变性液配方，不必限制。
我做过4种蛋白，其中3种确切获得活性。BSE没条件测活，但是获得水溶性。

作者: ukonptp 时间: 2013-11-5 23:26

QUOTE:

原帖由寻梅于 2013-11-5 23:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是《冻干法复性蛋白》。冻干法不建议随便做，太耗费能源，如果有生产线资源或者捎带的话，可以尝试一下。对以后大量生产EGF，IGF这种蛋白粗品可能会很有裨益。不过现在正好过冬天，气候干燥的地方可以考虑一下。

protocol很简 ...

冰块样品早期融化出来的液体里就没有尿素？

作者: 阿司匹林 时间: 2013-11-5 23:26

QUOTE:

请问您做的这四种蛋白是本身就以包涵体形式表达的，还是本身是可溶性，但是加尿素变性？
我希望您提供的方法能对本身就以包涵体形式表达的蛋白质有作用。
如果可能，请贴一张电泳图一饱眼福。（相信有不少人想看图）

作者: bgf5 时间: 2013-11-5 23:26

看了上面老师们的讨论真的很钦佩，学生想请教一个问题，我想做二维电泳的实验，但是因为起初不知道，标本取好以后没有用ＰＢＳ液冲洗，没有去除表面的血液，这样血液中高丰度的蛋白质会在胶上将会掩盖有意的蛋白质点。。。现在标本保存在液氮中，不知道怎样处理才能去除这些血液成分？？因为都已经冻在一起了。。。。十分焦急，谢谢帮助。。。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:27

最先做成的是自己合成的包涵体，大约250aa（在原公司）；之后一种是某大学的包涵体，其后是RnaseB变性灭活做的（用冻干法）；之后是自己灭活BSE（用复性仪）。
BSE的电泳在复性仪的帖子里有，上面的ladder应该是二硫键尚未氧化的结果，用双氧水氧化后，确实减弱。

另外二维电泳似乎对标本要求不是要命的高，解冻之后洗掉血液似乎就可以了。反正冻在液氮（-196）里面该变性的也都变了……估计你不可能之前做过二甲亚砜防冻处理。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:28

冰块样品早期融化出来的液体里就没有尿素？

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也会有点的，但是应该不多，所以提到了用预冷的缓冲液稀释一下防止干扰。

作者: uaubc 时间: 2013-11-5 23:28

1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？

个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。相同样品如果用这种方法做可以复性的话，那么用稀释法应该也是可以完成复性的。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:29

QUOTE:

原帖由 uaubc 于 2013-11-5 23:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？

个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。 ...

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我做的复性仪能直接析出变性盐而不明显冻结试剂，现实条件不允许……只能这样把最原始的protocol摆在这里让诸位有条件的朋友来尝试，以期先发篇论文之后再找深入研究的机会。
反胶团法收率100%，现在似乎也没用……
科研很多程度上近似赌博……

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:30

余下的主要样品部分您可以利用现有的任何方法继续复性，抽出的少许液体基本可以认为对变性液没啥干扰。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:30

发张麻省联系信函的截图，以证所言！

图片附件: 39635515.jpg (2013-11-5 23:30, 40.12 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20048

作者: tangxin_80 时间: 2013-11-5 23:31

1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？

个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。相同样品如果用这种方法做可以复性的话，那么用稀释法应该也是可以完成复性的。

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稀释法的缺点就是样品后来体积大。

楼主的方案除了低温去除变性剂外，还有一个作用恐怕就是利用低温固化蛋白质的互相作用和碰撞接触，降低复性过程中因蛋白互相粘合形成的沉淀

作者: tangxin_80 时间: 2013-11-5 23:31

也会有点的，但是应该不多，所以提到了用预冷的缓冲液稀释一下防止干扰。

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楼主有做过试验么？液体中残留的尿素大概在多少摩尔

作者: ukonptp 时间: 2013-11-5 23:31

稀释法的缺点就是样品后来体积大。

楼主的方案除了低温去除变性剂外，还有一个作用恐怕就是利用低温固化蛋白质的互相作用和碰撞接触，降低复性过程中因蛋白互相粘合形成的沉淀

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恐怕不是固化。“我做的复性仪能直接析出变性盐而不明显冻结试剂”

我猜测是利用低温，但不是很低温条件，可能是在0到-5度左右，Urea、盐酸胍高浓度的变性剂由于温度下降而析出。为了防止溶液冻结，还可能加入了一些盐类，如NaCl，或甘油之类防冻剂。

透析复性的缺点是不均匀，透析袋壁处的变性剂浓度变化太快。
稀释复性也有浓度变化太快问题，另外体积也是太大。
这个冷冻法如果控制好温度的变化，好像可以均匀地控制变性剂的析出，且样品溶液均一性好。
不管这项技术是否真的能够实现，操作方面也不一定比透析、稀释好（温度控制，常规的试验室没有精确低温控制设备），但思路方面是可以试一试的。

作者: dhpbj 时间: 2013-11-5 23:32

发张麻省联系信函的截图，以证所言！

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我想看的不是这张图。
我想看的是电泳图。虽然我知道复性得到的蛋白质浓度可能很低，但是应该浓缩一下，测一下浓度，做个电泳。
另外，我有个问题，您说"早期融化的液体，其中就应该有已经复性的蛋白"，这个“早期”是多早？多少体积算早期？

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:32

QUOTE:

原帖由 dhpbj 于 2013-11-5 23:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
发张麻省联系信函的截图，以证所言！

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我想看的不是这张图。
我想看的是电泳图。虽然我知道复性得到的蛋白质浓度可能很 ...

很遗憾，您问的一切我都没法给您清晰的答案！不是我不想，是现实没给我这种机会（本人正在失业中，已经3年。做生物研发不是个人能承受的，虽然我曾竭力去尝试……）。坦率的说用冷冻复性的蛋白浓度一点不低，甚至由于变性盐的析出，导致溶液体积骤减，蛋白浓度较初始几乎翻倍。
个人感觉做探索有时是跟着感觉走的，想来“早期”就是够您测活一次的量即可。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:33

QUOTE:

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稀释法的缺点就是样品后来体积大。

楼主的方案除了低温去除变性剂外，还有一个作用恐怕就是利用低温固化蛋白质的互相作用和碰撞接触，降低复性过程中因蛋白互相粘合形成的沉淀

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多谢版主！
稍微更正一点，目前采用的方式不是用-5度这种方式。-5会析出一部分盐的但是距离复性的要求应该还是比较远的。
在设备设计上是把冷冻面放在液体底部，盐（尿素，盐酸胍）密度是1.3左右，所以是沉淀在底部的。越浓的溶液比重越大，包涵体密度也是1.3左右。这样的好处是“废物”都在底部……

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:34

楼主有做过试验么？液体中残留的尿素大概在多少摩尔

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我冻过8M的尿素溶液，冰块架在滤纸漏斗上室温融化的结果是下图。很抱歉，没称重估算溶液里面剩余的尿素。您自己有条件估算一下吧！

图片附件: 65022120.jpg (2013-11-5 23:34, 53.95 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20049

作者: finger 时间: 2013-11-5 23:34

非常感兴趣同时也比较困惑。
该方法的实质是一个缓慢降低尿素浓度进行复性的过程，对某些蛋白也许管用，但估计其普及性是不好的，复性的方法如同纯化一样，是没有固定方式可循的。
1、温度对蛋白的折叠有一定的帮助的，有许多的复性就是在18度左右进行的，所以低温有时可能却是一种阻碍；
2、复性缓冲液的组成是相当重要的，楼主使用的配方很简单（当然简单有时也是最适合的），但是我想这样子肯定对许多其他蛋白的作用不大，特别是含有半胱氨酸的；

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:35

QUOTE:

原帖由 finger 于 2013-11-5 23:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感兴趣同时也比较困惑。
该方法的实质是一个缓慢降低尿素浓度进行复性的过程，对某些蛋白也许管用，但估计其普及性是不好的，复性的方法如同纯化一样，是没有固定方式可循的。
1、温度对蛋白的折叠有一定的帮助的，有许多 ...

坦率的说表面上看复性方式是没啥规律可循的，可是有一点是不变的规律——就是变性盐的去除和缓的达到一个临界点复性即开始（蛋白复性始终为两种力量左右，其一是变性盐产生的变性力量，另一是存在于一级结构中的复性力量。这两种力量都有益于复性。变性力能破坏错误折叠，给正确复性以机会；复性力能指引正确折叠。）。这个过程越和缓越具有复性的优势……

作者: yyaxw84 时间: 2013-11-5 23:35

晕
我们意外发现这个现象也已经有3年了，但是由于觉得没法放大，无法应用于生产，所以没能继续进行相关研究。
不过我们用的是2M的尿素，实验过程和你的方法略有异同

知音啊。。。

我们当时还想开发复性试剂盒呢，有空咱多讨论下

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:36

QUOTE:

原帖由 yyaxw84 于 2013-11-5 23:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

晕
我们意外发现这个现象也已经有3年了，但是由于觉得没法放大，无法应用于生产，所以没能继续进行相关研究。
不过我们用的是2M的尿素，实验过程和你的方法略有异同

知音啊。。。

我们当时还想开发复性试剂盒呢，有空咱多讨 ...

非常荣幸能有同行者！一个人走的真的很累……
说实话没能理解您“没法放大，无法用于生产”这句的意思。纠缠于这个设计三年多了，该想的也都想过了。
恕在下愚钝，能否解惑？感觉这方法太适合大规模复性生产了，设备基本就跟冰箱差不多……

作者: ssonglikihi 时间: 2013-11-5 23:38

啥时候咱有空时也搞个变性样品玩玩

作者: 了了 时间: 2013-11-5 23:38

非常荣幸能有同行者！一个人走的真的很累……
说实话没能理解您“没法放大，无法用于生产”这句的意思。纠缠于这个设计三年多了，该想的也都想过了。
恕在下愚钝，能否解惑？感觉这方法太适合大规模复性生产了，设备基本就跟冰箱差不多……

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要用于生产的放大，不是简单的定性问题。
如果需要实现生产，必须要定量计算，比如复兴率是多少？体系中各物质组分是多少？温度如何控制？时间如何控制？产量得率是多少？是否可稳定重复？整个方法体系的容错性可好？是否可通过计算进行生产前投料预估？如果简单通过冻融的话，室温都可以影响融化速度，不均一体系中固体和液体比例出现的波动，蛋白质和盐离子浓度对复性效率的影响等等都无法精确控制和计算，最后导致很不稳定的批间差，生产就难以正常进行了

作者: hyuu 时间: 2013-11-5 23:39

我也请教一个问题，的到的样品如何检测是否复性？非还原电泳么？

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-11-5 23:39

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原帖由 hyuu 于 2013-11-5 23:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也请教一个问题，的到的样品如何检测是否复性？非还原电泳么？

一般低要求的复性，以溶解在无变形计环境下就算

不过高要求的，要测蛋白的活性

作者: cwcwcww 时间: 2013-11-5 23:40

可以解冻上清本身就是溶解的吧，难道用PBS透析再浓缩看看有无沉淀？

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:41

要用于生产的放大，不是简单的定性问题。
如果需要实现生产，必须要定量计算，比如复兴率是多少？体系中各物质组分是多少？温度如何控制？时间如何控制？产量得率是多少？是否可稳定重复？整个方法体系的容错性可好？是否可通过计算进行生产前投料预估？如果简单通过冻融的话，室温都可以影响融化速度，不均一体系中固体和液体比例出现的波动，蛋白质和盐离子浓度对复性效率的影响等等都无法精确控制和计算，最后导致很不稳定的批间差，生产就难以正常进行了

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您确实想的非常长远，在下实自愧不如！
之前跟一个做过大规模复性的人交流过，他说从蛋白生产成本角度而言，通过细菌包涵体复性顶多是养细胞获得的一成。不过细菌蛋白有诸多麻烦，例如：内毒素问题，复性率问题，噬菌体问题等等。而内毒素问题使其难以通过SFDA关……这一切都是现实的大麻烦！不过从更宽广的视角看，可能就有另外一种可能。非得做的很纯很高端吗？非得给人注射，过SFDA吗？做工业酶类，环保酶类，即便是做EGF用于化妆品外用可以吧！还有纯化非得放在复性之后，变性态时就走柱子或萃取排除不行吗？……
这些还都是未知数，想来也正是这些未知数才给这个方法以更大的生存空间。当然这一些都需要努力去获得答案。也许最后证明跟反胶团一样用处不大，……这都是后话。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:41

可以解冻上清本身就是溶解的吧，难道用PBS透析再浓缩看看有无沉淀？

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应该在您稀释的时候就能看出端倪，成功复性用缓冲液稀释一般不会出问题，否则就会有沉淀。
具体方法可以抽取几个微升，加到PBS水里，从侧面对光看有没有白色沉淀就行了。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:42

贴张设备实际运行效果的照片，下面沉淀的是尿素结晶.

图片附件: 95818648.snap.jpg (2013-11-5 23:42, 37.66 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20050

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:42

剑桥的信函，很可惜人家不再做蛋白复性了。

图片附件: 85283330.snap.jpg (2013-11-5 23:42, 56.75 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20051

作者: wanglaoshi 时间: 2013-11-5 23:42

'就是变性完了冻结，然后抽取早期融化的液体'

Because the urea would have lower solubility at 0 C than in RT, this principle behind this, is likely the same as the 'rapid dilution' or 'step-wise dilution'.

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:43

'就是变性完了冻结，然后抽取早期融化的液体'

Because the urea would have lower solubility at 0 C than in RT, this principle behind this, is likely the same as the 'rapid dilution' or 'step-wise dilution'.

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都是降低变性盐的浓度，不过自觉冷析出更“安定”一些……

作者: hyuu 时间: 2013-11-5 23:44

帮楼主顶下。

是个不错的idea，值得进一步尝试。

复性率？能否放大？背后的机制？这些都是很值得研究的问题。

祝楼主早日成功。

作者: xueyouzhang 时间: 2013-11-5 23:44

在下问一个比较弱智的问题，假如把要复性的变性液冷冻成冰球颗粒（要是达到纳米级的话更好），那么放到复性液中，会不会提高复性的效率，呵呵，无知无畏，因为我是外行，但现在负责基因工程干扰素的项目，虽然看了很多资料，但都似懂非懂，让各位见笑了。（主要被楼主启发，结合我们在复性的过程中，好多老师告诉我要逐滴加入，并且时间要慢，但实际操作起来会差别很大）

作者: junhun 时间: 2013-11-5 23:44

干扰素的复性我也做过，没什么特别好的方法，效率不高-我们是中试级别的。

实际上，复性是个很难的问题。低温本身对蛋白而言就是一个极大的伤害（可能并非全部）。

做复性的人会去想很多的替代方法，主要原因是原始的方法效率低，另外，太累人。

这个领域柱上复性前几年比较热，但貌似也没有放大。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:45

在下问一个比较弱智的问题，假如把要复性的变性液冷冻成冰球颗粒（要是达到纳米级的话更好），那么放到复性液中，会不会提高复性的效率，呵呵，无知无畏，因为我是外行，但现在负责基因工程干扰素的项目，虽然看了很多资料，但都似懂非懂，让各位见笑了。（主要被楼主启发，结合我们在复性的过程中，好多老师告诉我要逐滴加入，并且时间要慢，但实际操作起来会差别很大）

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只要您去思考就有您思考的价值，应该没有真正懂得思考价值的人去取笑您！至于其他人，愿意笑就随他们好了。

您的方法应该也是有价值的，只是后续回收和先期的纳米冰粒产生都会比较麻烦。个人认为基本应该还是迅速稀释方法的变形。而稀释法最大的麻烦也就是最终体积变得太大。

作者: 寻梅 时间: 2013-11-5 23:45

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原帖由 junhun 于 2013-11-5 23:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

干扰素的复性我也做过，没什么特别好的方法，效率不高-我们是中试级别的。

实际上，复性是个很难的问题。低温本身对蛋白而言就是一个极大的伤害（可能并非全部）。

做复性的人会去想很多的替代方法，主要原因是原始的方法效率 ...

低温本身对蛋白而言就是一个极大的伤害（可能并非全部）。-------在目前来说，冻结肯定是有伤害的，之前我一直没想通的也就是这个冻结如何解决。最后发现很简单，答案就是上面我询问的那个尿素做融雪剂的“临界温度”。只要把底面的温度维持在这个临界温度应该就有很好的结果出现。尿素会析出，同时由于尿素的存在又能保证水不冻结。这个温度大约应该在零下22度左右，只要溶液不冻结，这个温度对目前多数蛋白造成的损伤应该是可以忽略的。

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