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标题: 【求助】空肠、回肠、胰腺的β-actin表不表达？ [打印本页]

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:13 标题: 【求助】空肠、回肠、胰腺的β-actin表不表达？

大家好，我最近做某目的蛋白，是关于能量代谢的一个蛋白，由于做的组织较多，其中包括空肠、回肠以及胰腺。目的蛋白的条带都出了，可用β-actin做内参跑western条带时，因为我是一组5个样品，只出了其中三个，做了三次，还以为是一抗孵育、转膜等等其他问题，可是我避免了这些问题后仍然再做发现，我无论如何做，仍然是条带缺失，仍是有一部分没有条带，按理说，抗体应该是敏感性很强的，我组内用的是进口的抗体，没有质量问题。后来我考虑可能因为蛋白降解所以不出条带，我平常都用-20℃的分装的冻存样本，后来我把-80℃的拿出来又做了次，发现仍然是条带缺失，空肠，回肠。胰腺的β-actin均是如此，用考马斯染过后，证明确实有蛋白存在膜上，但不知道为什么β-actin总是不出，极其郁闷，想请过来人帮忙解答，谢谢！

作者: okhaha 时间: 2013-11-6 11:13

一抗、二抗的稀释度多少？

作者: mysmdbl 时间: 2013-11-6 11:13

因为你不该用bata-actin作为检测肠组织的内参，因为肠组织属于平滑肌，其actin不是bata型的。你或者换抗体或者换内参，应该就可以解决你的问题。

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:14

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2013-11-6 11:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一抗、二抗的稀释度多少？

一抗 1:2000 二抗 1:2000

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:14

QUOTE:

原帖由 mysmdbl 于 2013-11-6 11:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

因为你不该用bata-actin作为检测肠组织的内参，因为肠组织属于平滑肌，其actin不是bata型的。你或者换抗体或者换内参，应该就可以解决你的问题。

楼楼您好，我弱弱的问一下，我没怎么细看b-actin的说明书，上面貌似只说在心肌、骨骼肌不能用，因b-actin是胞浆蛋白吗，几乎其他组织都表达，而且我还有一点想不明白的是，我的条带是部分缺失，一组5个样，前三个有带，后俩没有，如果b-actin不能用作肠子内参，那为何我还出了一部分呢？是不是我切组织的时候，切到部分不是平滑肌的，所以就表达了部分呢？我查阅了一些文献，发现文献里肠子大都是做免疫组化。免疫荧光等等技术比较多，目前在我实验室，我打听到的还没有人做肠子的western,这个课题是老板订的，我需要拿出充分的依据来说服我老板，所以想请问楼楼是以前做过，还是有什么参考文献抑或是其他可靠的依据可以证明这一点，我目前也在找这方面的依据，我做这个快郁闷了，老板只会挑我实验毛病，一味的叫我做，唉，所以还请楼楼指导，谢谢！

作者: lxh031 时间: 2013-11-6 11:15

cuturl('http://biogps.org/#goto=genereport&id=60')

这里查到的表达量看胰腺和胰岛几乎没有ACTB表达，骨骼肌也没有但是心肌和平滑肌里表达量应该很高。小肠里表达量较低，如果你的样品里面恰好有很多结缔组织的话做不出来也是有可能的。换一个内参吧

作者: 66+77 时间: 2013-11-6 11:15

b-actin 作为平滑肌内参可能存在问题，这跟公司抗体制备方法和actin的分型有关（不知道你前三个有条带是什么样子的，淡淡的还是浓粗的？）。如果可能还是尽快换为gapdh内参。仅供参考吧。

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:15

相关疾病：
糖尿病
楼楼，我还想问GAPDH是否与糖代谢有关啊？因为我做的目的蛋白和大鼠造模均与糖尿病胰岛素抵抗以及能量代谢有关，会不会干扰？

作者: 66+77 时间: 2013-11-6 11:16

相关疾病：
糖尿病
GAPDH参与糖酵解，但糖尿病胰岛抵抗模型是否影响GAPDH表达，这个我也说不准，但私下个人以为是没有太大影响的。但你最好先查看下文献，以便应对将来投文章审稿人的质疑。如果，gapdh不行的话，考虑tublin？

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:16

GAPDH参与糖酵解，但糖尿病胰岛抵抗模型是否影响GAPDH表达，这个我也说不准，但私下个人以为是没有太大影响的。但你最好先查看下文献，以便应对将来投文章审稿人的质疑。如果，gapdh不行的话，考虑tublin？

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楼楼你好，我做的目的蛋白是丙酮酸脱氢酶复合体PDH，是丙酮酸氧化脱羧反应的关键酶，也是胰岛素信号通路下的一个分子，目前我只查阅到这个分子在心肌和骨骼肌的论述，带有条带的文章还没查到，其他组织的更是没有，我不求发文章啊，这只是我的硕士毕业课题，学校15号放假，我年前做不完啦，唉，就这b-actin不出，目的蛋白已出。目前组内还没有其他内参可用，我们组就有一瓶b-actin哭死我了老板坑死我了谢谢楼楼指导啊我决定明天和老板去谈判

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:17

弱弱的补一下，就这个分子，我做骨骼肌的时候，b-actin也不出，后来看了说明书才知道，而且做骨骼肌的时候，其蛋白提取方法不同，貌似得匀浆，我组内实验室的那个匀浆机跟大钻子似的，1.5ml的Ep管放进去，不用说匀浆，直接就没了，大鼠的骨骼肌，能有屁大点当时就这个原因和我老板谈判，瞬间被骂没词儿了，“当时取大鼠各个组织器官的时候，取完就放液氮里了，谁还给你专门就骨骼肌拿出来粉碎啊，匀浆啊，我伺候你啊？谁伺候你啊？哪那么多毛病！'这老板原话，我被瞬间击溃！

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:18

弱弱的补一下，就这个分子，我做骨骼肌的时候，b-actin也不出，后来看了说明书才知道，而且做骨骼肌的时候，其蛋白提取方法不同，貌似得匀浆，我组内实验室的那个匀浆机跟大钻子似的，1.5ml的Ep管放进去，不用说匀浆，直接就没了，大鼠的骨骼肌，能有屁大点当时就这个原因和我老板谈判，瞬间被骂没词儿了，“当时取大鼠各个组织器官的时候，取完就放液氮里了，谁还给你专门就骨骼肌拿出来粉碎啊，匀浆啊，我伺候你啊？谁伺候你啊？哪那么多毛病！'这老板原话，我被瞬间击溃！

作者: kuaizige 时间: 2013-11-6 11:19

网页应该能打开的，或者你到别的数据库里找一下资料就好了。小肠不好说，胰腺和胰岛确实是不表达ACTB的, 自然不会有阳性

作者: kuaizige 时间: 2013-11-6 11:20

弱弱的补一下，就这个分子，我做骨骼肌的时候，b-actin也不出，后来看了说明书才知道，而且做骨骼肌的时候，其蛋白提取方法不同，貌似得匀浆，我组内实验室的那个匀浆机跟大钻子似的，1.5ml的Ep管放进去，不用说匀浆，直接就没了，大鼠的骨骼肌，能有屁大点当时就这个原因和我老板谈判，瞬间被骂没词儿了，“当时取大鼠各个组织器官的时候，取完就放液氮里了，谁还给你专门就骨骼肌拿出来粉碎啊，匀浆啊，我伺候你啊？谁伺候你啊？哪那么多毛病！'这老板原话，我被瞬间击溃！

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骨骼肌里长长的都是a-actin, b-actin能做出才奇怪了...

样本少的话手动匀浆不行么...

作者: abc816 时间: 2013-11-6 11:20

楼楼您好，每个样本，我跑western时用蛋白裂解液已经提取了一部分，目前还没有进行下一步处理，正在寻找骨骼肌蛋白提取的资料和文献，剩下的组织不多了，我没敢妄动，还得摸条件合不合适，估计不够我霍霍的。。

作者: JK.jon 时间: 2013-11-6 11:20

不会吧，大家都说骨骼肌中没有beta-actin，那我以前做出来的条带是什么呢？........
大家可以参考下面两篇文献
cuturl('http://www98.griffith.edu.au/xmlui/bitstream/handle/10072/40252/71166_1.pdf?sequence=1')
cuturl('http://ajpendo.physiology.org/content/294/2/E345.full')

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:21

不会吧，大家都说骨骼肌中没有beta-actin，那我以前做出来的条带是什么呢？........
大家可以参考下面两篇文献
cuturl('http://www98.griffith.edu.au/xmlui/bitstream/handle/10072/40252/71166_1.pdf?sequence=1')
cuturl('http://ajpendo.physiology.org/content/294/2/E345.full')

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楼楼您好，我跑骨骼肌b-actin跑了2次，几乎不显。。。

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:22

这篇文献里的条带还可以分割开啊，我寡闻了

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:27

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原帖由 boom 于 2013-11-6 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这篇文献里的条带还可以分割开啊，我寡闻了

这个确实有点过分，呵呵。不过根据我自己做的和别人做的betaactin肯定是可以再骨骼肌中检测出来的，而且非常非常多。

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:27

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原帖由 zwsyrt 于 2013-11-6 11:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个确实有点过分，呵呵。不过根据我自己做的和别人做的betaactin肯定是可以再骨骼肌中检测出来的，而且非常非常多。

楼楼您好，是western检测到的吗？我查看b-actin说明书貌似有说心肌和骨骼肌不能用b-actin作内参，请问你用的哪个型号哪个公司的b-actin,产品
票数+收藏+

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:28

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原帖由 boom 于 2013-11-6 11:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼楼您好，是western检测到的吗？我查看b-actin说明书貌似有说心肌和骨骼肌不能用b-actin作内参，请问你用的哪个型号哪个公司的b-actin,产品
票数+收藏+
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那我也不知道怎么提高了，不过有时候抗体浓度过高或者是样品丰度太高是也会出现条带消失的情况，因为二抗消耗底物的速度太快，根本等不到曝光就已经萃灭了，我们实验室以前碰到过这种情况。

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:28

楼楼您好，是western检测到的吗？我查看b-actin说明书貌似有说心肌和骨骼肌不能用b-actin作内参，请问你用的哪个型号哪个公司的b-actin,产品

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客气了，我做的是western blot啊，文献上的图片也是WB的啊。我用的是个国产的一个公司的，北京

京天成生物技术公司，这个公司老板是我导师的师弟，呵呵，当时我就用他公司给我的试用装用的，很好用

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:29

楼上您好，我一抗和二抗比例均是1:2000.上样按50ug计算的

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:29

一抗换成1：5000，二抗换成1:10000，上10ug试试

作者: wood533 时间: 2013-11-6 11:30

楼楼，您给我彻底搞迷糊了，可否发一份贵公司的b-actin说明书，我组内是用的cell singal的

作者: wood533 时间: 2013-11-6 11:30

一抗换成1：5000，二抗换成1:10000，上10ug试试

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您这个比例都超出抗体说明书的范围了。。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:30

尽信书，不如无书。我觉得没有什么原则性问题。因为这个是内参蛋白，量非常大

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:31

貌似并不是所有的组织都有b-actin表达，照您这么说，我举个不恰当的例子，作为医生，我可以不顾禁忌症和药物有效剂量随便开药吗

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:31

楼楼若想说服我，请拿出可靠的依据，谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:32

当然不是你说的那种情况了，我是根据组织的目的蛋白丰度来决定抗体比例和上样量得。你这种质疑的精神还是不错的，当然有时候还是需要结合实际情况，实践出真知。祝你实验顺利

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:32

QUOTE:

原帖由 boom 于 2013-11-6 11:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼楼若想说服我，请拿出可靠的依据，谢谢！

我已经把我知道的该说的都说了，并且也没有想说服你的意思，实验是你自己的，我只是提供你一个可能的建议，至于听不听完全在于你。呵呵

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:32

可能的建议样品10ug 二抗稀释1；10000 那岂不更稀？？您这么做过？

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:33

QUOTE:

原帖由 boom 于 2013-11-6 11:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可能的建议样品10ug 二抗稀释1；10000 那岂不更稀？？您这么做过？

当然做过，总是觉得信号还是太强

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:33

那您提的蛋白浓度多高

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:34

具体多高没算，反正是一个12孔的细胞样品可以做7，8次，我先下了，有空交流

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:34

您不测浓度就上样啊- - 喔。。

作者: jujuba 时间: 2013-11-6 11:35

不会吧，大家都说骨骼肌中没有beta-actin，那我以前做出来的条带是什么呢？........
大家可以参考下面两篇文献
cuturl('http://www98.griffith.edu.au/xmlui/bitstream/handle/10072/40252/71166_1.pdf?sequence=1')
cuturl('http://ajpendo.physiology.org/content/294/2/E345.full')

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actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin，alpha-cardiac muscle actin，alpha-smooth muscle actin，和gamma-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。
各种亚型actin序列间具有高度的同源，你确定你杂出来的是beta-actin，而不是由于抗体原因实际杂出的是alpha-actin？

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:35

actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin，alpha-cardiac muscle actin，alpha-smooth muscle actin，和gamma-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。
各种亚型actin序列间具有高度的同源，你确定你杂出来的是beta-actin，而不是由于抗体原因实际杂出的是alpha-actin？

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应该是那种广泛分布的吧，就是所谓的beta-actin(β-non-muscle)

作者: hustwb 时间: 2013-11-6 11:36

大家好，我最近做某目的蛋白，是关于能量代谢的一个蛋白，由于做的组织较多，其中包括空肠、回肠以及胰腺。目的蛋白的条带都出了，可用β-actin做内参跑western条带时，因为我是一组5个样品，只出了其中三个，做了三次，还以为是一抗孵育、转膜等等其他问题，可是我避免了这些问题后仍然再做发现，我无论如何做，仍然是条带缺失，仍是有一部分没有条带，按理说，抗体应该是敏感性很强的，我组内用的是进口的抗体，没有质量问题。后来我考虑可能因为蛋白降解所以不出条带，我平常都用-20℃的分装的冻存样本，后来我把-80℃的拿出来又做了次，发现仍然是条带缺失，空肠，回肠。胰腺的β-actin均是如此，用考马斯染过后，证明确实有蛋白存在膜上，但不知道为什么β-actin总是不出，极其郁闷，想请过来人帮忙解答，谢谢！

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样品是什么种属？

作者: moonlight45 时间: 2013-11-6 11:36

应该是那种广泛分布的吧，就是所谓的beta-actin(β-non-muscle)

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你在muscle里杂出很浓的β-non-muscle actin(beta-actin)条带，不觉得很奇怪吗？

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:37

你在muscle里杂出很浓的β-non-muscle actin(beta-actin)条带，不觉得很奇怪吗？

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并不奇怪啊，β-actin是一种广泛存在的细胞骨架蛋白，参与骨骼肌细胞骨架的形成，而你们所认为的a-actin则是形成肌纤维的蛋白，二者都是存在的。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:37

actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin，alpha-cardiac muscle actin，alpha-smooth muscle actin，和gamma-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。
各种亚型actin序列间具有高度的同源，你确定你杂出来的是beta-actin，而不是由于抗体原因实际杂出的是alpha-actin？

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你自己的帖子里都说了beta actin是广泛存在于各个组织中的，难道骨骼肌不是很常见的组织么？

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:38

样品是大鼠组织

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:38

看了内参大讨论内个帖子了，貌似有说N-末端那个b-actin制品检测不到骨骼肌信号，而c-末端的b-actin制品可以检测到骨骼肌信号，我组内用的是N-末端制品，

作者: 831226 时间: 2013-11-6 11:39

看了内参大讨论内个帖子了，貌似有说N-末端那个b-actin制品检测不到骨骼肌信号，而c-末端的b-actin制品可以检测到骨骼肌信号，我组内用的是N-末端制品，

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没错，b-actin与a-actin在c端具有较高的同源性，因此针对b-actin C端序列制备的抗体是可以同时检测b和a型actin，这类抗体能够检测到骨骼肌中的信号也就不足为奇了，因为那根本是误打误撞的a-actin，这也就是楼上一位战友一再坚持的依据。

作者: 831226 时间: 2013-11-6 11:39

并不奇怪啊，β-actin是一种广泛存在的细胞骨架蛋白，参与骨骼肌细胞骨架的形成，而你们所认为的a-actin则是形成肌纤维的蛋白，二者都是存在的。

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哦？骨骼肌细胞骨架不就是肌原纤维吗？我记得骨骼肌细胞属于特化的细胞。另，"广泛分布"似乎并不能意味着所有组织均有分布。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-6 11:40

哦？骨骼肌细胞骨架不就是肌原纤维吗？我记得骨骼肌细胞属于特化的细胞。另，"广泛分布"似乎并不能意味着所有组织均有分布。

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看来您的基本概念有点问题，好好看看细胞骨架的定义吧。如果骨骼肌这种最常见的组织里面都没有的话，他这个广泛分布就不能成立，应该就特别指明出了骨骼肌之外广泛分布，而不是直接说广泛分布。

作者: 831226 时间: 2013-11-6 11:41

看来您的基本概念有点问题，好好看看细胞骨架的定义吧。如果骨骼肌这种最常见的组织里面都没有的话，他这个广泛分布就不能成立，应该就特别指明出了骨骼肌之外广泛分布，而不是直接说广泛分布。

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嗯，好的，我会再好好看看文献，纠正下自己的基本概念。
如果你认为骨骼肌里有b-actin，好的。如果你认为其量非常非常的多，也ok。不过，如果你能向你老板的师弟打听到制备抗体所用的抗原氨基酸序列，就更好了。如果再有心，拿b-Actin和a-actin做个序列比对，就完美了。
如果我对b-actin＂广泛分布＂的解读与你有异，这可能与我英语水平有限有关，要不你维基百科下actin的说明？

作者: boom 时间: 2013-11-6 11:41

楼楼们，有骨骼肌蛋白提取方法么？成手的偷懒啦

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