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标题: 空白血杂质跟主药如何分开 [打印本页]

作者: ll5804 时间: 2010-6-8 13:22 标题: 空白血杂质跟主药如何分开

各位大侠，本人处理狗空白全血上液相感觉杂质很多主要在9分钟以前，问题是杂质峰拖尾影响后面的主药出峰，引起基线漂移，最郁闷的是主要出峰的位置空白血也有小峰，想调节流动相错开，调了几次但几乎都在一个位置出峰分不开，请问怎么办？
新买的shim-pack C18柱子，柱温70，流动相先前用乙腈：甲醇：水=70：8：22，现在不用甲醇了，检测波长210nm.

作者: MNOD 时间: 2010-6-8 14:12

朋友，我想你应该用离子对试剂试试

作者: 出国吧 时间: 2010-6-8 15:18

QUOTE:

原帖由 ll5804 于 2010-6-8 13:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位大侠，本人处理狗空白全血上液相感觉杂质很多主要在9分钟以前，问题是杂质峰拖尾影响后面的主药出峰，引起基线漂移，最郁闷的是主要出峰的位置空白血也有小峰，想调节流动相错开，调了几次但几乎都在一个位置出峰分不开，请问 ...

根据您说的情况看，是否没进行好前处理工作。如果是的话：建议您去除蛋白，细胞，盐等，过SPE柱

作者: notrjhn 时间: 2010-6-8 15:19

要不跑跑剃度试试？

作者: dxkuii 时间: 2010-6-8 15:20

得知道您所要考察的是什么类型的化合物，杂质是什么类型的化合物。

根据化合物的类型，进行分析。

欢迎常来论坛大家一起讨论学习。

作者: sacred 时间: 2010-6-8 17:29

原因为三：一是样品进样量太多而造成过载；二是色谱柱有问题；三是流动相有问题，你可在流动相中加点吹尾剂（三乙胺）。

作者: piaoliang110mei 时间: 2010-6-8 17:30

柱温70要这么高要求,做了几次估计柱子也会坏呀.

如果杂质多要用预柱处理或者前处理.
如果流动相中加酸了请在水相和有机相中都加,现在很多地方都习惯只在水里加酸,其实两个相都加就可以克服基线漂移,这个我亲身实践过,即使是乙腈

如果不加的话也会出现漂移.
另外你的流动相比例有机相的起始比例太高,一般分析全血样品要用梯度洗脱更好.

作者: bing0421gs 时间: 2010-6-8 17:31

柱温那么高呀，你把流速降低，乙腈降低调试不行就跑梯度吧

作者: wyznanhang 时间: 2010-6-8 17:32

也可以考虑一下改变其他条件对实验结果的影响！

作者: luffygonww 时间: 2010-6-8 17:32

朋友，可以考虑加点改性剂

作者: ll5804 时间: 2010-6-8 22:12

样品处理过程如下：取全血1ml置于10ml,加一定量内标，加入NaOH溶液2ml,涡旋2min，加无水乙醚(重蒸）4ml,涡旋5min，3000转每分钟离心15分钟，取乙醚层40度水浴氮气吹干，加入酸化甲醇溶液（盐酸：甲醇=1：3）200微升重组，加正己烷0.5ml涡旋30秒，3000转每分钟离心10分钟，弃去正己烷层去下层清夜20微升进样。
大家看处理过程有什么问题？怎么优化？

作者: uovt69jn 时间: 2010-6-8 22:29

柱温这么高啊...

改变一下流动相条件，加点酸、碱、或者是四氢呋等试试

作者: gitde 时间: 2010-6-9 10:13

再降低流动相比例，我有做过一个东西是50：50才分开的，但是出峰确实很慢

作者: 心情se567 时间: 2010-6-9 10:13

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原帖由 ll5804 于 2010-6-8 22:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
样品处理过程如下：取全血1ml置于10ml,加一定量内标，加入NaOH溶液2ml,涡旋2min，加无水乙醚(重蒸）4ml,涡旋5min，3000转每分钟离心15分钟，取乙醚层40度水浴氮气吹干，加入酸化甲醇溶液（盐酸：甲醇=1：3）200微升重组，加正己烷0.5ml涡旋30 ...

柱温有必要那么高吗?柱温过高出峰早不易分开！另外查一下试剂会不会引入干扰！

作者: piaoliang110mei 时间: 2010-6-9 14:01

QUOTE:

处理过程太复杂,重复性会很差;
我读研的时候也是做的兔全血,基本是取血后离心,取上清液即血清部分再用某种有机试剂处理一下,离心,就可以了, 没有整得这么复杂.
你这个处理过程是按某种既定标准(如药典还是客户资料)处理的,还是自己想的?如果是自己想的,建议先看看类似文章再摸索实验条件,想当初我是看了不下100篇的文献的

朋友，常来论坛交流！

作者: kflsjjfdl 时间: 2010-6-9 14:01

1.关于分离度的问题，是不是考虑把水换成盐呢？

2.我记得原来的公司做狗血样品处理时，是取血后立即去离心，然后再样品处理的。

作者: ngoir 时间: 2010-6-9 14:02

怎么不考虑走梯度呢？

作者: bing0421gs 时间: 2010-6-9 14:03 标题: 回复 #11 ll5804 的帖子

样品前处理条件挺好的是不酸有些高呀
损害柱子是不大一些

作者: 358uwcj 时间: 2010-6-9 14:03

我看你的处理过程没有使用固相萃取类步骤，有条件可以试试用固相萃取柱前处理一下样品，把杂质除去。不知道你检测血中哪类物质？

作者: ll5804 时间: 2010-6-9 16:02

主要是检测的主药在血浆跟血细胞里面都溶，大约各占50%吧不稳定所以只有测全血。处理过程是看了文献综合后的方法大部分都是这么处理的，现在在尝试流动相中加入磷酸，三乙胺试下能不能去杂质，实在不行跑梯度，这个波长基线是不是漂的厉害，固相萃取暂时没仪器做不了啊

作者: chengjia6 时间: 2010-6-9 16:24

楼主，你试下固相萃取，在处理血样这块是不错了，可以省去前处理，

我试验室就经常做这个

作者: ll5804 时间: 2010-6-9 16:40

固相萃取我有柱子但是没有仪器，还能怎么做?

作者: 出国吧 时间: 2010-6-9 17:31

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原帖由 ll5804 于 2010-6-9 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
主要是检测的主药在血浆跟血细胞里面都溶，大约各占50%吧不稳定所以只有测全血。处理过程是看了文献综合后的方法大部分都是这么处理的，现在在尝试流动相中加入磷酸，三乙胺试下能不能去杂质，实在不行跑梯度，这个波长基 ...

恩，这个波长已到了紫外的截止区了，大部分物质在这里都会有强烈的吸收，所以干扰很大是必然的，你的样品是什么类型的物质？PH值一定要控制好。你设下梯度试一下，原则是让难保留的物质缓慢流出，容易保留的物质快速洗脱除就行。

作者: 358uwcj 时间: 2010-6-9 17:32 标题: 回复 #20 ll5804 的帖子

210nm确实基线会比较飘。
固相萃取小柱不用什么仪器设备啊，就是那种针管式的俗称SPE操作也很简单方便，现在卖的厂家也很多，有进口的也有国产的，主要是用来除去血液血浆中的蛋白啦、盐啦以及一些乱七八糟的杂质。

作者: ll5804 时间: 2010-6-9 19:53

分析的主药为多肽类抗生素，现在可以肯定试剂没有干扰，就是血样里的杂质

作者: thereyoube 时间: 2010-6-9 20:49

关于血的确实不好分离，况且还是加内标物的。我刚才看了你的流动相，很少人把乙腈跟甲醇配比然后跟水一起用的吧。你要么选择乙腈跟水，要么选择甲醇跟水配比，直接用水应该也不行，得弄个缓冲液，比如说磷酸一类的，具体的哪一种缓冲液，浓度为多少得看你实验需求。流动相设置一个梯度，这样更利于分离。还有，你进样前有没过滤膜？这个很关键哦。

至于那个检测波长，我以前做实验前查的文献中，所用的检测波长不一，你这方法经过改造的，也不能照搬人家所用的波长，建议你拿到紫外分光那边做个全波长扫描，比较好的吸收波长一目了然。

作者: 358uwcj 时间: 2010-6-10 14:04

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原帖由 ll5804 于 2010-6-9 19:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
分析的主药为多肽类抗生素，现在可以肯定试剂没有干扰，就是血样里的杂质

那样的话选择固相萃取小柱绝对能帮你去除杂质

作者: ll5804 时间: 2010-6-10 16:41

那这个固相萃取柱能重复使用吗？实验的重现性跟稳定性怎么样？如果没有固相萃取仪的情况下，怎么设置这个装置？

作者: ross_racheal 时间: 2010-6-10 16:55

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应该是碱性的吧，梯度加阴离子对试剂看看，PH值调到4-5

作者: 实验技术 时间: 2010-6-12 17:53

用洗耳球，加压固相小注上加个注射器，下面用试管等容器接着，上面用洗耳球加压，大体这样是比较简易的方法，你可以试试。

确实应该在样品处理上下些功夫，杂质多大体是处理的问题，当然色谱条件的改变可以分开是最好的。因为没做过此类药物，所以处理上没有更好的建议。用的提取试剂可以用个混合的试试，看看能否有些好转。

作者: swn_nyve_vb 时间: 2010-6-12 17:54

增加一个过滤，也是个好方法！我记得原来处理过鬼臼毒素，方法就是要求用固相小柱先处理，然后进液相的！

作者: 实验技术 时间: 2010-6-12 17:54

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原帖由 swn_nyve_vb 于 2010-6-12 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
增加一个过滤，也是个好方法！我记得原来处理过鬼臼毒素，方法就是要求用固相小柱先处理，然后进液相的！

这些都是没办法的办法，要是有固相萃取仪，俺们也不能这么做滴，是个可以尝试的方法

作者: thereyoube 时间: 2010-6-12 17:55

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原帖由 ll5804 于 2010-6-10 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那这个固相萃取柱能重复使用吗？实验的重现性跟稳定性怎么样？如果没有固相萃取仪的情况下，怎么设置这个装置？

固相萃取小柱是消耗品，用它的主要目的是除去杂质，把杂质保留在小柱上，把你要测的样品洗脱下来，重现性和稳定性基本都不涉及，只是涉及到回收率的问题，就是样品过小柱后含量会降低，不过很少属于正常现象，回收率可以测得。
固相萃取仪多半是自动纯化用的，像一般实验使用没人用设备的，那个破设备简单的要死还侯贵，实验室的条件完全可以简单的使用，关键在于你会不会用，楼主可能没用过。。。。

作者: ll5804 时间: 2010-6-13 09:41

那这个固相小柱能重复使用吗？自己能用硅胶填吗？

作者: chengjia6 时间: 2010-6-18 15:42 标题: 回复 #22 ll5804 的帖子

有六通阀啊，在定量环上接你的萃取柱，通过六通阀的inject与load的变换实现

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