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标题: 【求助】求解蛋白质相互作用的新方法 [打印本页]

作者: 龙小好汉 时间: 2013-11-15 17:41 标题: 【求助】求解蛋白质相互作用的新方法

想请问一下蛋白质相互作用有什么新方法?SPR技术的原理是什么?与酵母双杂交相比有什么优缺点

作者: avi317 时间: 2013-11-15 17:41

新的就算表面等离子共振（SPR）技术表面和酵母双杂交技术了。

等离子共振（SPR）技术是一种利用物理光学原理分析生物大分子间相互作用的新型生物传感分析技术，生物分子相互作用分析方法（BIA）是基于表面等离子共振（SPR）技术的一种生物分子相互作用分析方法。实验时，先将一种生物分子固定在生物传感芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液或细胞提取液流过芯片表面，检测器能实时检测两者生物分子间的相互作用，并定量求出其相互作用强弱的结合常数和解离常数，而不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。SPR技术主要应用于测生物大分子间（蛋白，核酸等）的动力学常数和在不同条件下的平衡常数。另外在药物筛选，配体垂钓，酶反应，信号传导，分子识别等许多领域都有广泛的应用。

比起酵母双杂交技术技术，更显得直接，简单

作者: yonger 时间: 2013-11-15 17:42

强相互作用：用biocore，就是SPR技术拉，好像是能测定到mM的水平。
弱相互作用： transfer-NOE 和 ITC ，好像可到nM的水平，其中transfer-NOE（一种NMR技术）较多用去筛选，ITC（量热法）则较多用于测KM。

^_^扎个砖，看看有人投个玉出来

作者: 箭头儿 时间: 2013-11-15 17:42

SPR1.基本原理

表面等离子共振(SPR)是一种物理光学现象。当入射光以临界角入射到两种不同透明介质界面(如镀在玻璃表面的金属银或金的薄膜)时，可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量从而使反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度称为共振角(SPR角)。SPR随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。
生物分子相互作用技术(biomolecular interaction analysis,BIA)则是基于SPR原理的新型生物传感分析技术，它在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯化各种生物组分的天然条件下，通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程,并通过分析软件获取生物分子结合/解离、亲和性/特异性、协同/拮抗、反应速率/浓度变化等互作动力学参数。

AmershamBioscience公司是实现该技术商业化最成功的公司，其推出的仪器商品名为BIACORE,现有BIACORE1000/2000/3000/X等产品系列，BIACORE系统由微射流卡盘、传感器芯片和SPR光学检测系统3个核心部分组成，其工作原理是基于SPR技术来实时追踪生物分子间的相互作用。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，再通过微射流卡盘将含有相互作用的分子溶液传送至传感器芯片表面，SPR光学检测系统则跟踪检测溶液与芯片表面的分子结合和解离的全过程，数据分析软件BIAEvaluation处理实验过程中获取的各种特异性信号，并将其整合成最终的实验结果。由于其高度的自动化和灵敏特异性且具常规仪器方法难以比拟的实时、动态监测优点，BIAcore广泛地应用于各种生命现象分子机理研究。

作者: 箭头儿 时间: 2013-11-15 17:43

酵母双杂交系统的发展和应用
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
1. 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）

作者: 箭头儿 时间: 2013-11-15 17:43

蛋白质相互作新方法：

1。酵母双杂交。
2。SPR技术
3。噬菌体展示技术
4。免疫共沉淀
5.PULL-DOWN方法

作者: 箭头儿 时间: 2013-11-15 17:43

SPR的优点：
表面等离子共振（SPR）技术是一种利用物理光学原理分析生物大分子间相互作用的新型生物传感分析技术，生物分子相互作用分析方法（BIA）是基于表面等离子共振（SPR）技术的一种生物分子相互作用分析方法。
1。它能实时检测生物分子间的相互作用，并定量求出其相互作用强弱的结合常数和解离常数，而不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。SPR技术在生物大分子间的相互作用，药物筛选，配体垂钓，信号传导，分子识别等许多领域都有广泛的应用。
2。酵母双杂交的假阳性结果较高，而SPR不会，它能实时快速定量的检测蛋白间的相互作用。
3。SPR能更质谱结合，对相互作用的分子进行分离并鉴定。

作者: 龙小好汉 时间: 2013-11-15 17:44

蛋白质相互作新方法：

1。酵母双杂交。
2。SPR技术
3。噬菌体展示技术
4。免疫工沉淀
5.PULL-DOWN方法

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1。Y2H 没做过，听说用来筛选新的binding蛋白基本没可能。不过是个经典的老方法，通常在map protein-protein interaction中有很大的作用，最近的一篇TOP的文章（PNAS or Nature)中用来map protein-protein interaction in yeast or E.coli.

2. SPR,，很好的一个仪器，biocore，定性，定量，一次完成，方便快捷。也可以用于大规模筛选，只限于强相互作用。一台好像要40万美金，前年。

3。 phage display: very powerful tool. 没做过，在药物设计方面有无法比拟的作用，与之相抗衡的只有 natural product library screen or chemical library screen.

4。没做过，没了解过。
5。pull down,便宜，方便，快捷，不过不能单独用，基本上要配合其他的几个试验一起作。

作者: 箭头儿 时间: 2013-11-15 17:45

你过奖啦！！
你说的BIACORE现在没有那么贵啦，一个BIACORE X型现在只要80万RMB啦
BIACORE3000就要200万RMB了，你说其只适用强相互作用，其实不然，它非常灵敏的。
你说NMR你想知道什么，看我能不能为你解答！

作者: ending 时间: 2013-11-15 17:46

还有种方法似乎用的不多：分析型超速离心
分析型超速离心机也可用于研究蛋白质的相互作用，可研究分子间的解离与聚合
国外也有相关论文发表
只有BECKMAN一家能生产
国内好象只有一台，在北京的哪家单位就不清楚了

作者: bring 时间: 2013-11-15 17:46

蛋白质相互作新方法：

1。酵母双杂交。
2。SPR技术
3。噬菌体展示技术
4。免疫共沉淀
5.PULL-DOWN方法

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我的一点看法：

1. 我做过的有YTH，co-IP, pull down, 细胞内共定位等。
我觉得方法各有长处，最好是先筛，或看相关资料找到你感兴趣的相互作用，然后有条件的话用其中3种以上的方法论证之。这样的结果可信度较高（我发在JBC上的一篇文章就用了前面说到的三种方法来证明我的目的蛋白之间的相互作用）。
2. 还有就是in vivo和in vitro的关系。结合你蛋白的in vivo的功能设计你的实验。
你所感兴趣的相互作用最终是要说明什么问题？你目的蛋白的功能还是别的什么？因为仅仅找到相互作用或者证明蛋白相互作用不是最终目标吧。
这些技术只是你通往阐明你最后结论的路径而已。

3. 希望大家介绍自己看到或做过的新方法

作者: 龙小好汉 时间: 2013-11-15 17:47

相对于transfer NOE来说，biacore还算不是很灵敏了，因为biacore只能到mM的灵敏度，而transfer NOE可以到nM的灵敏度。弱相互作用在药物设计中有很重要的地位。

PS：我现在已经完成了backbone 的那对NMR试验。进行backbone assignment.请问protemics 有没有什么好的方法，或者是经验share 。：）

作者: ssonglikihi 时间: 2013-11-15 17:47

噬菌体展示技术的详细步骤有人有吗？

作者: 30moonriver 时间: 2013-11-15 17:47

请问在Y2H中诱饵蛋白的选择有什麽讲究呢，换言之就是，目的蛋白需要具备什麽条件才可能作为候选呢，请指教！

作者: windy+++ 时间: 2013-11-15 17:48

PULL-DOWN方法原理是什么？谢谢

作者: 6327555 时间: 2013-11-15 17:48

其实,transfer NOE不算很灵敏，而且对于很强和较弱的相互作用是不适用的.
它主要可用于一些筛选. 而biacore并非不存在假阳性, 可用于筛选,也可以用于
相互作用的动力学研究,如结合解离常数.两者目的不同,偶联的方法也不一样.
如何在偶联过程中保持了生物分子的天然结构和活性是需要考虑的。SPR技术不必使用荧光标记和同位素标记，实时，快速是优点。
不对之处多指教。

作者: 龙小好汉 时间: 2013-11-15 17:48

其实,transfer NOE不算很灵敏，而且对于很强和较弱的相互作用是不适用的.

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是的，transfer NOE 不适用于强相互作用，是有一个范围限制的。
不过还有很灵敏的方法么？

还有另外两种方法可以用来研究相互作用
1。CD
2。fluorescence

是基于binding 发生后，结构也随之发生变化。

但是效果一般

作者: u234 时间: 2013-11-15 17:49

nmr本来就是不灵敏的方法，否则还要inept，同位素标记干吗？nmr对于揭示蛋白质的结构信息有帮助，尤其是动力学研究有着优势（与x－ray相比）。祝贺你，开始主链归属，你的蛋白有多大了？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-11-15 17:49

biacore也可以到nM级别。

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