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标题: 【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达 [打印本页]

作者: skytree 时间: 2013-11-15 20:40 标题: 【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达

大家好，问题是这样，两个蛋白MW分别是36KD和56KD,突变任何一个都失去特异底物的降解能力。
经过序列比对估计这两个蛋白是共同起作用，一个氧化一个还原，从而降解底物。
因此我想设计载体对二者分别表达，同时想做一个共同表达，不知道能不能把两个蛋白连起来放到一个载体里实现共同表达？

谢谢

作者: finger 时间: 2013-11-15 20:41

好像风险很大，两个蛋白如果连在一起表达，表达出来的就是这2个蛋白的融合结合蛋白了

是否还能保持各自亚基的功能就很难说了。

如果想在一个载体上，单独的，分别表达出2个单体蛋白，貌似不显示，这样需要一个质粒上有2个翻译起始端，我个人是没有看到过这样的文献

作者: feima+ 时间: 2013-11-15 20:41

完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。
如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。
如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。
Novagen新出的一款载体pETDuet-1，使用两个T7启动子、两个RBS分别表达两个基因，不过只有一个T7终止子，可以满足楼主的需要。

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-11-15 20:42

QUOTE:

原帖由 feima+ 于 2013-11-15 20:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。
如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。
如果是大肠 ...

学习了

新的pETDuet-1这个容易理解，还真有我猜测的 2个翻译起点这样的表达质粒

但是兄台写的真核方案我不是很明白，两段序列放在同一个真核表达质粒上，是不是也像原核一样，需要两个RBS和2个启动子？

我们这边有把2段蛋白，分别构建到同一种载体上，然后共转染293细胞，实现共表达的。

另外我又想到了一个问题，大肠杆菌为什么不能实现2个含有不同表达序列的质粒的共转化和共表达？

作者: jiushikeshui371 时间: 2013-11-15 20:42

查了一下资料，有人说两个质粒只要是不同的复制子是可以共转化大肠杆菌

作者: skytree 时间: 2013-11-15 20:43

QUOTE:

原帖由 finger 于 2013-11-15 20:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

好像风险很大，两个蛋白如果连在一起表达，表达出来的就是这2个蛋白的融合结合蛋白了

是否还能保持各自亚基的功能就很难说了。

如果想在一个载体上，单独的，分别表达出2个单体蛋白，貌似不显示，这样需要一个质粒上有2个翻译 ...

[size2]谢谢关心~
这两个蛋白要么是一个全酶的不同部分，要么在催化过程中共同作用
不过具体的还要再验证

作者: HP007 时间: 2013-11-15 20:44

但是兄台写的真核方案我不是很明白，两段序列放在同一个真核表达质粒上，是不是也像原核一样，需要两个RBS和2个启动子？

我们这边有把2段蛋白，分别构建到同一个载体上，然后共转染293细胞，实现共表达的。

另外我又想到了一个问题，大肠杆菌为什么不能实现2个含有不同表达序列的质粒的共转化和共表达？

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我所说的一个表达框，包括启动子、终止子、读码框等:）嘿嘿。。得包含完整的表达元件。不过真核生物不是用的RBS，AUG的有效起始需要的是Kozak序列。

2段蛋白分别构建到同一个载体上，共转染293是可以实现共表达的，因为：在瞬转的情况下，基因不需要复制即可表达；在稳转的情况下，基因可以同时整合到基因组中，同样可以共表达。
而在大肠杆菌中，大肠杆菌分裂很快，质粒如果不能在大肠杆菌中复制，会在培养的过程中迅速丢失。如果需要两个质粒分别携带不同基因转化后共表达，需要两种质粒都稳定复制。因此这两个质粒属于不同的不相容群，携带不同的抗生素，则可以在双抗生素压力下实现共表达。当然也有人将同一不相容群的不同抗性的质粒转化大肠杆菌，同时使用两种抗生素的压力维持两种质粒的存在而实现共表达。

作者: feima+ 时间: 2013-11-15 20:45

我所说的一个表达框，包括启动子、终止子、读码框等:）嘿嘿。。得包含完整的表达元件。不过真核生物不是用的RBS，AUG的有效起始需要的是Kozak序列。

2段蛋白分别构建到同一个载体上，共转染293是可以实现共表达的，因为：在瞬转的情况下，基因不需要复制即可表达；在稳转的情况下，基因可以同时整合到基因组中，同样可以共表达。
而在大肠杆菌中，大肠杆菌分裂很快，质粒如果不能在大肠杆菌中复制，会在培养的过程中迅速丢失。如果需要两个质粒分别携带不同基因转化后共表达，需要两种质粒都稳定复制。因此这两个质粒属于不同的不相容群，携带不同的抗生素，则可以在双抗生素压力下实现共表达。当然也有人将同一不相容群的不同抗性的质粒转化大肠杆菌，同时使用两种抗生素的压力维持两种质粒的存在而实现共表达。

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长见识了

传送门
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Kozak序列－－一个重要的名词
Kozak序列, 名词, 三元, 转录, GTP
Kozak sequence
KOZAK是一个女科学家，她研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：——G/N-C /N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。
(在真核起始过程中，由Met-tRNAi，eIF-2和GTP形成了三元复合体（ternary complex）再结合40S小亚基形成前起始复合物(preinitiation complex)。此复合物的形成分为二步：首先GTP和eIF-2结合，以增加此因子与Met-tRNA．结合的效率。然后三元复合体再与40S亚基结合。核糖体结合位点由起始密码子所决定，在某些起始密码子上游邻接序列也可能十分重要，被称为Kozak序列(ACCAUGG)，它相当于原核的S-D序列。前起始复合物结合5′7meG帽结构并沿着mRNA扫描，借助Kozak序列搜寻第一个起始密码子。)

所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
(1) 第4位的偏好碱基为G；
(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；
(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；
(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。
Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说，满足前两项即可。

KOZAK写的那篇关于KOZAK序列的文献：
文献名字：Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs
作者：Marilyn Kozak

作者: njkph 时间: 2013-11-15 20:56

原核的共表达Novagen　有专门的pET共表达载体
楼上兄弟的文章也有涉及到
Merk的技术资料中，最多可在一个菌中用4个复制原点互不相同的质粒载体表达８个不同的蛋白
每个质粒复制原点不同，因而可以在一个菌种共同复制
每个质粒上都有两个独立的表达盒，用于表达两个外源基因
真核细胞内的共表达与此类似

有图为证

图片附件: 11803614.snap.jpg (2013-11-15 20:56, 30.1 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20445

作者: guagua 时间: 2013-11-15 20:56

原核一般多个RBS就可以了真核也很方便，至少三到四种策略

作者: 101010 时间: 2013-11-15 20:57

原核的共表达Novagen　有专门的pET共表达载体
楼上兄弟的文章也有涉及到
Merk的技术资料中，最多可在一个菌中用4个复制原点互不相同的质粒载体表达８个不同的蛋白
每个质粒复制原点不同，因而可以在一个菌种共同复制
每个质粒上都有两个独立的表达盒，用于表达两个外源基因
真核细胞内的共表达与此类似

有图为证

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这个问题其实有点类似于多个抗原混合免疫了，一举多得

请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？

一个是T7一个是tac启动子

作者: 101010 时间: 2013-11-15 20:57

在实际生产和科研中，这样共表达的实用性和成功率如何？

也没有做过的战友，介绍介绍经验

作者: bluelake 时间: 2013-11-15 20:58

两个蛋白的生产中很普遍了最常见就是表达抗体，重链轻链要一起表达，我这三个蛋白共表达原核，真核都有表达成功的例子

作者: 101010 时间: 2013-11-15 20:59

QUOTE:

原帖由 bluelake 于 2013-11-15 20:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个蛋白的生产中很普遍了最常见就是表达抗体，重链轻链要一起表达，我这三个蛋白共表达原核，真核都有表达成功的例子

真核共表达比较常见，对原核的共表达有点兴趣，像您所说的3个蛋白共表达，3个都是包涵体还是可溶？分别用的什么载体？3个蛋白共表达时和单独表达时，表达量有明显变化吗？

作者: yes4 时间: 2013-11-15 21:00

就用一个载体将三个基因用RBS连接后克隆到载体的一个表达盒里转录出一条mRNA链条再依靠RBS分别翻译出三个蛋白。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-15 21:01

这个问题其实有点类似于多个抗原混合免疫了，一举多得

请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？

一个是T7一个是tac启动子

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我想你有点混淆了
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号

通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例Big Smile）

然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在　Amp 和Kan　共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-15 21:02

就用一个载体将三个基因用RBS连接后克隆到载体的一个表达盒里转录出一条mRNA链条再依靠RBS分别翻译出三个蛋白。

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构造多顺反子也是可行方案，最常见的例子就是乳糖操纵子了。
但要考虑启动子启动能力强弱与作用距离以及基因大小等问题。

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:04

我想你有点混淆了
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号

通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例Big Smile）

然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在　Amp 和Kan　共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。

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那按您的意思是可以共存，那能都表达么？
有这方面经验的朋友么

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:04

就用一个载体将三个基因用RBS连接后克隆到载体的一个表达盒里转录出一条mRNA链条再依靠RBS分别翻译出三个蛋白。

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这3个用RBS序列连接的不同基因，用的是同一个阅读框钱的启动子？

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-15 21:05

这3个用RBS序列连接的不同基因，用的是同一个阅读框钱的启动子？

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是的，这种多顺反子模式的原型可参见乳糖操纵子的3个结构基因表达模式。
乳糖操纵子包含三个结构基因、启动子、终结子及操纵基因。这三个结构基因称为lacZ、
lacY及lacA(框线内的部分）。3个结构基因的转录会由RNA聚合酶与一个位于基因上游独
特的DNA结合位点结合开始，这个位点称为启动子（Terminator)。由这个位点开始，RNA
聚合酶会开始转录所有三个基因（lacZYA）为mRNA,然后在核糖体内由一条mRNA翻译成3个
蛋白质。

图片附件: 75747560.png (2013-11-15 21:05, 16.41 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20446

作者: yes4 时间: 2013-11-15 21:06

楼上正解，蛋白产量可溶性活性都还不错能形成三亚基复合体

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:07

QUOTE:

原帖由 yes4 于 2013-11-15 21:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上正解，蛋白产量可溶性活性都还不错能形成三亚基复合体

不是单体？

如果是复合体，那和融合表达有什么区别么？
我理理思路
2个蛋白在一个菌中表达，有以下几种共同表达的情况

1，两段基因融合，在同一个阅读框里，表达出融合的蛋白
2，两段基因在同一个质粒的不同的阅读框里。分别表达出单体
3，两段质粒在不同的质粒上，但在同一个菌里，也分别表达出单体

是这样几种吧，请楼上的几位战友把自己说的分分类吧，我有点糊涂了

共表达应该指后面2，3吧，1应该算融合表达吧

作者: yes4 时间: 2013-11-15 21:08

QUOTE:

原帖由 101010 于 2013-11-15 21:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不是单体？

如果是复合体，那和融合表达有什么区别么？
我理理思路
2个蛋白在一个菌中表达，有以下几种共同表达的情况

1，两段基因融合，在同一个阅读框里，表达出融合的蛋白
2，两段基因在同一个质粒的不同的阅读框里。分别表达 ...

我想这位兄弟说的其实是是他自己做多顺反子表达出的3个独立蛋白可形成复合体。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-15 21:08

复合体不是融合蛋白，其实是由不同的蛋白在同一个细胞或细菌内各自表达后会结合到一起，组装起来形成的蛋白质复合物，这样的每个单个蛋白通常称为该复合蛋白的亚基（subunit），一个蛋白质亚基就是一条多肽链，而一条多肽链是由一个基因所编码，这就意味着每个亚基都一个编码蛋白，通俗的讲就是几个小蛋白结合到一起形成一个大的蛋白。这样的蛋白有很多，比如抗体：重链和轻链就可以看做两个亚基
比如激动型G蛋白（Gs）由α、β、γ三个亚基组成
比如T细胞受体CD3（TCR／CD3）有四个亚基

作者: birdfish 时间: 2013-11-15 21:08

Glioma-Derived Mutations in IDH1 Dominantly Inhibit IDH1 Catalytic Activity and Induce HIF-1a
这篇science文章原核共表达了野生/突变二聚体，采用的是novagen的pRSFDuet-1共表达质粒。

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:10

是的，这种多顺反子模式的原型可参见乳糖操纵子的3个结构基因表达模式。
乳糖操纵子包含三个结构基因、启动子、终结子及操纵基因。这三个结构基因称为lacZ、
lacY及lacA(框线内的部分）。3个结构基因的转录会由RNA聚合酶与一个位于基因上游独
特的DNA结合位点结合开始，这个位点称为启动子（Terminator)。由这个位点开始，RNA
聚合酶会开始转录所有三个基因（lacZYA）为mRNA,然后在核糖体内由一条mRNA翻译成3个
蛋白质。

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再请教一下，一条mRNA，怎么翻译出3个单独的蛋白？每段蛋白的结尾是什么？

启动子--操纵子--RBS--目的基因1--- ？---RBS--目的基因2--- ？---RBS--- ？---目的基因3--终止子

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:11

当初没有好好学习，书到用时方恨少啊

-------------------1．“乳糖操纵子”的基本组成

1．1 结构基因群

　　操纵子中被调控的编码蛋白质的基因称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个，各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。

乳糖操纵子含有Z、Y和A共3个结构基因。Z基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)（也称异乳糖），再分解为半乳糖和葡萄糖；Y基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；A基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。Z基因5＇侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosome binding site，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。由于Z、Y和A 3个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上脱落下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，依次合成这个基因群所编码所有的蛋白质。

1．2 启动子

　　启动子(promoter，P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5＇侧上游，控制整个结构基因群的转录。

　　虽然不同的启动子序列有所不同，但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的规律，它们一般长40-60bp，含A-T碱基对较多，某些段落是很相似的，这些相似的保守性段落称为共有性序列(consensus sequences)。启动子一般可分为识别（R，recognition）、结合（B，binding）和起始（I，initiation）三个区段。转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1）最常见的是A；在-10bp附近有TATAAT一组共有序列，因为这段共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒（Pribnow box）；在-35bp处又有TTGACA一组共有序列。

不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子。

1．3 操纵基因

操纵基因（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵基因序列上，会影响其下游基因转录的强弱。

乳糖操纵子的操纵基因（O）序列位于启动子（P）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。仔细分析这这操纵子序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构造。不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。

1．4 调控基因

　　调控基因（regulatory gene）是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的调控方式称为负性调控（negative regulation）；与操纵子结合后能增强或起动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的调控方式称为正性调控（positive regulation）。

　　某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质称为效应物（effector），其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂（inducer），能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂（corepressor）。

　　乳糖操纵子中，调控基因Rlac位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵基因O紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵基因特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖，也称异乳糖）就是诱导剂，与R结合，起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因的转录。

许多调控蛋白都是变构蛋白（allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:12

1．5 终止子

　　终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。

　　终止子按其作用是否需要蛋白因子的协助至少可以分为两类：一类是不依赖ρ 因子（蛋白性终止因子）的终止子，这类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列（inverted repeat sequence），其后跟随一段富含AT的序列（见图7-6），因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。另一类是依赖ρ因子的终止子，即其终止转录的作用需要ρ因子的协同，或至少是受ρ因子的影响。

不同的终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全停止转录；有的则只是部分终止转录，一部分RNA 聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果一串结构基因群中间有这种弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（antitermination），这种蛋白因子就称为抗终止因子（antiterminator）。

以上5种元件是每一个操纵子必定含有的。其中启动子、操纵子位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting element）。调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物──调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA 链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），调控基因就属于反式作用元件（trans-acting element），其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子（trans-acting factor）。由此也可窥测到基因表达调控机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。

2．乳糖操纵子的表达调控

2．1 阻遏蛋白的负性调控

　　当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此R基因在其自身的启动子PR控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β－半乳糖苷酶及透过酶的生成。

当有乳糖存在时，乳糖受β－半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与O的亲和力，与O解离，基因转录开始，使β－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。

2．2 CAP的正性调控

　　细菌中的cAMP 含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解释放能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为 CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。

在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵子的结构基因表达下降。

　　由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开始，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这种机制，细菌优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。

不难看出，CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵基因，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是一个调控基因，不过它并不在lac操纵子的附近，CAP可以对几个操纵子都起作用。

作者: zwsyrt 时间: 2013-11-15 21:12

启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子---terminator

不好意思原核不叫POLYA 老弄真核习惯了

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:13

多顺反子看来应该是这样的

启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止子---RBS--目的基因2---终止子---RBS---终止子---目的基因3--终止子

RNA聚合酶识别启动子启动转录，生成mRNA，然后核糖体识别mRNA的RBS区，启动翻译基因，然后到达第一个终止子的时候，停止翻译，但是翻译结束后，后面还有RBS区，就使得核糖体没有马上脱落，开始了下一段的翻译

作者: 101010 时间: 2013-11-15 21:14

启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子---polyA

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谢谢，谢谢

那复制子是从ORI开始到什么结束？

以上面的多顺反子为例
阅读框就是：“启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子---polyA”

ORF就是：启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子

作者: jujuba 时间: 2013-11-15 21:15

QUOTE:

原帖由 101010 于 2013-11-15 21:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子---polyA

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这里laboy的理解可能有个非常严重的错误，ORF不应该包括启动子、操纵子、RBS；启动子之后的序列可能称为转录框比较合适，转录子发生剪切之后才形成阅读框编码的蛋白质。

另外，“RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子”模式似乎也不应适用于原核生物，尤其是作者提到顺反子（顺反子是不是只能用于原核生物的概念？），个人理解是否应该是RBS序列不需要反复出现？而用于原核表达的话，甚至是不应该携带？因为基因来源的细菌是到另一个宿主表达，转而应该用宿主的识别表达系统而非原来的识别表达系统？

举例来说，目标基因：“RBS--P启动子--起始密码子--目的基因1---终止密码子---间隔序列1--起始密码子--目的基因2---终止密码子---间隔序列2--起始密码子--目的基因3---终止密码子”，如果我要做目标基因1，2，3的表达供研究之用，那么我是否只需直接克隆“---起始密码子--目的基因1---终止密码子---间隔序列1--起始密码子--目的基因2---终止密码子---间隔序列2--起始密码子--目的基因3---终止密码子”，然后连接到载体导入宿主菌表达就OK了？因为载体上应该携带表达所需的附件“RBS--P启动子--”？

需要说明的是间隔序列可以是RBS也可以不是？因为我看到过间隔序列只有一个碱基的！

以上观点仅供讨论，谢谢你们的讨论，收益良多，欢迎继续交流探讨。

作者: Ao7 时间: 2013-11-15 21:16

我也想知道第一段基因的终止子与第二段基因的RBS 之间有没什么序列的要求

作者: idoww 时间: 2013-11-15 21:17

是个好地方！我觉得在一个载体上同时表达2个蛋白是完全可以的，就看你怎么构建这个表达载体了！

作者: vtongli 时间: 2013-11-15 21:18

谢谢，谢谢

那复制子是从ORI开始到什么结束？

以上面的多顺反子为例
阅读框就是：“启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---RBS--目的基因2---终止密码子---RBS--- ---目的基因3--终止密码子---polyA”

ORF就是：启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子

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阅读框ORF是起始密码子开始，终止密码子结束的编码某个蛋白AA的一段序列，这里终止子和终止密码子要区别开来，两个是不同的东东。上面的多顺反子根据Novgen的共表达载体图谱，我的理解是这样的。
启动子--操纵子--RBS--目的基因1ORF---间隔序列---RBS--目的基因2ORF---间隔序列---RBS---目的基因3ORF---终止子

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