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标题: 【讨论帖】大家就跑胶时的细节,如电压,PH,离子浓度,溴芬兰 [打印本页]
作者: 米囡    时间: 2013-11-15 21:22     标题: 【讨论帖】大家就跑胶时的细节,如电压,PH,离子浓度,溴芬兰

很多新战友在SDS-PAGE时发现溴芬兰不能压成一条线,很弥散,就着急,生怕电泳跑不好,其实暴光出来条带还是很漂亮的.

那么电泳时溴芬兰形态和什么有关系呢?大家可以讨论讨论,
先看一个图

这是刚电泳不久的图片,大概6,7min的时候,
我们看到溴芬兰条带压的挺整齐的,
但是第一个marker孔还是弥散,

样品是用TCA沉淀的,溶解的buffer主要成分是:8M urea, 10mM DTT, 20mM Tris, 23mM Glycine, ph 8.8
这是fermenta的一个中分子量marker, 主要含62mM Tris( ph7.5), 1mM EDTA, 2%sds, 10mM DTT,1.5mM NaN3,33%GLYCEROL. 用相同的 buffer补齐体积.

所以样品及上样缓冲液的离子浓度和ph值对溴芬兰条带的影响是很大的.

图片附件: 33146996.snap.jpg (2013-11-15 21:22, 25.86 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20447

作者: 米囡    时间: 2013-11-15 21:23


这是同时跑的另外一块胶,
我们看到溴芬兰还是挺整齐的,但是条带压的不如第一块胶紧,
所有的上样buffer都一样,两块都是连续胶,都没有积压胶只有分离胶,都是12%的

唯一的区别是第一块胶里加了40%甘油

有时候在NATIVE-PAGE里会加甘油,或是区分有些磷酸化和未磷酸化蛋白时的glycerol-urea PAGE时,
甘油的存在主要是为了使一定电荷差异的,如相差了一个磷酸基团的蛋白,分辨率更好,

图片附件: 28884774.snap.jpg (2013-11-15 21:23, 27.04 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20448

作者: 米囡    时间: 2013-11-15 21:24


这是跑到后来的形状, 都压成一条线了
以前有讨论,说溴芬兰弥散压的不齐使因为浓缩胶不够长,PH不对,或电泳缓冲液陈旧,我觉得都不是这些问题.

这次电泳的缓冲液已经是第四次用了,
缓冲液旧了,相同电压下,起始电流大,但是随着电泳的进行,电流下降的幅度也大,缓冲能力减弱
我喜欢用旧的缓冲液,因为每次用新配的,起始电流只有五十几mA,而旧的有八十几,甚至一百十几mA,(我用的是300V的电压),而终末电流都差不多,11或12mA.

因为第一块胶里加了甘油,所以电阻比第二块胶大许多,我们知道,电泳时两块胶是并联的,电压一样,所以第二块胶的电流大,溴芬兰条带跑的比第一块胶快.

在第一块胶里,因为离子浓度不一样,
所以marker已经在挤压旁边的甬道.marker跑的比较宽

图片附件: 57871633.snap.jpg (2013-11-15 21:24, 26.79 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20449

作者: greenbee    时间: 2013-11-15 21:25


好像如果上样体积不一样的话 ，marker会被压得快些，可以补充些 上样缓冲液，压的线 就比较平。可以试试。我也遇到这样的情况，上样体积差异大会有影响的
作者: greenbee    时间: 2013-11-15 21:26


上样体积要一致，样品稀释后的PH值要一样，不然溴芬兰也会变形，浓缩胶不能太短，否则压不成直线，上样体积不能太大，否则浓缩不好，溴芬兰也会比较宽，配胶的tris-Hcl PH值要准，不然溴芬兰也会压不平，越跑越弥散，样品注入的时候要小心注入到底部，弄好了就要电泳，不要等太久了，不然会弥散。
作者: abc816    时间: 2013-11-15 21:26

虽然很少出现溴芬兰变形的情况，但还是要谢谢iris的图文总结以及xiaohua62003和cake2003两位战友的经验分享，受益匪浅啊。
作者: nikun230    时间: 2013-11-15 21:29


恩，楼上说得很有道理啊~
前段时间溴芬兰老是跑得很弥散，重新配了Tris-HCl之后，果然好多了~
作者: idea2011    时间: 2013-11-15 21:30

上样体积要一致，样品稀释后的PH值要一样，不然溴芬兰也会变形，浓缩胶不能太短，否则压不成直线，上样体积不能太大，否则浓缩不好，溴芬兰也会比较宽，配胶的tris-Hcl PH值要准，不然溴芬兰也会压不平，越跑越弥散，样品注入的时候要小心注入到底部，弄好了就要电泳，不要等太久了，不然会弥散。

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总结下自己做过的电泳,我觉得样品及上样缓冲液的离子浓度和PH值最重要了,
跑SDS-PAGE 的时候往往溴芬兰会迷糊,压的远不如这两张图好看,\
上样体积是其次的,因为我同时试过40ul和20ul 的上样,都压很好,粗细有别而已.
浓缩胶也撇开不说,因为不用浓缩胶也压的很好.
至于配胶的tris-Hcl PH值,曾经因为有个师哥溴芬兰条带压不好,而隔壁实验室压的比他好,我们借过隔壁的Tris,但是发现他们Tris的PH值还没有我们的准确.

除此之外,胶也有关系,比如加了甘油之后,同样的条件,压的更紧些.
作者: remonte    时间: 2013-11-15 21:32


顺便讨论一下，溴芬兰和电压有没有关系？看到iris用300V的电压，吓了一跳，电压太高会不会散热不行？好像是电压越高，样品的分辨率越高，是不是越高越好（在散热可以的情况下）？和目的蛋白大小的关系是什么？昨晚就查了《蛋白质技术手册》和《蛋白质电泳指南》，都没有答案
作者: seagate    时间: 2013-11-15 21:41


我的样品在浓缩胶里都没跑两下溴酚蓝就散开了，根本看不到一条一条泳道呀，不过结果也不错。可是这几次跑到分离胶（12％）接近底部时就歪了，很难看，甚至有一次结果每条带（22kD）都呈大雁样。郁闷，改用15％胶又好一点。不知什么原因。有人说是电压太高，95v和135V，一块胶电流只有20mA左右，跑得非常慢，好像又不太像这个原因
作者: bluelake    时间: 2013-11-15 21:46

胶浓度大压的也会紧一些的

另外PH不对会影响压的效果，比如加完loading buffer后溶液都是黄的时候，如果跑胶就会很弥散，甚至把别的泳道都给挤掉了
作者: ffaa    时间: 2013-11-15 21:47



QUOTE:
原帖由 bluelake 于 2013-11-15 21:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
胶浓度大压的也会紧一些的

另外PH不对会影响压的效果，比如加完loading buffer后溶液都是黄的时候，如果跑胶就会很弥散，甚至把别的泳道都给挤掉了

溶液发黄，说明是buffer过酸，过酸会有什么不良后果？
作者: bluelake    时间: 2013-11-15 21:48



QUOTE:
原帖由 ffaa 于 2013-11-15 21:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


溶液发黄，说明是buffer过酸，过酸会有什么不良后果？

溴芬兰带拖得很长,甚至会拱形峰形,碰到过两次这种情况了.

cake说得电压,是这样子得,
我跑SDS-PAGE的时候,用80V 100V最多,

如我前面所说,我的胶里加了甘油,电阻很大,而我的电泳仪最大只能达到300V,所以如果两块胶都加甘油,电流相当小了,打到300V,电流只有2-3mA,电泳仪不WORK,又不可能去买个高压电泳仪,
所以就想了这么一个法子,另一块就做normal gel,这样电压到300V时电流就上来了,能达到六十几mA,怕散热不好,所以我都放冰里电泳的,否则胶到后面加样孔都变形了,Sad

做SDS-PAGE的时候,溴芬兰普遍压的没有这三个图好看,不是电压的原因,因为甘油胶电流还是小的,而且我个人认为SDS-PAGE时电压的问题是不大的,如100V和60V压的差不多,电压再高我就没有试过了.
大家可以来些图片
作者: gogo    时间: 2013-11-15 21:48


个人认为电压有一定影响，我有时候是60V开始跑上层胶，然后去吃饭，回来一般已经开始跑到下层胶了，这时溴芬兰弥散，但是我将电压升上去到140V跑下层胶以后，也就10min左右就又压成一条线了，不知道是什么原因Stupid
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2013-11-15 21:50


参加讨论，看了iris的图片，300v,我也觉得有点大，而且一直恒压， 其实我自己也是一直用恒压来跑浓缩胶和分离胶，主要是嫌麻烦，而且也没有觉得有什么太大影响，不过仔细想想，为了跑出漂亮的结果，还是应该用不同电压。

一般的protocol都指出浓缩胶和分离胶 用不同的电压跑，
浓缩部分用低电压或低电流（50至70v,20至40mA），待样品在浓缩胶底部浓缩成一条直线后，再加大电压或电流（150至200v，40至60mA），待溴芬兰指示剂到达底部边缘时即可停止电泳

浓缩胶 (stacking gel), 名字也可以看出来，目的是使loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白在后面的蛋白之前进入分离胶。其实分离理想效果是应该在小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2013-11-15 21:59


另外，电压大小对跑胶的质量是有影响的，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好
作者: yapuyapu    时间: 2013-11-15 21:59

那就是说电压小点是没关系的了，我跑胶时电流非常小，跑得很慢，所以经常加大电压跑，可能这样也有影响吧，有时跑得跟大雁样。
作者: HP007    时间: 2013-11-15 22:02


看了一些资料，补了一下基础知识，终于找到答案了。

配胶缓冲液系统 pH对电泳的影响很大。

制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
作者: ero11    时间: 2013-11-15 22:02


说实话，我一般很少遇到过sds问题呵呵，可能人品比较好。
一般来说出原因，我遇到的
1，内槽液在跑的过程中外漏，这样会跑出拱形
2，如果内槽液PH出现问题那么胶下半部分会很弥散。
我们都是上层胶一块胶跑20mA，下层胶跑40mA恒流，感觉效果不错，而且速度快，所有的配方都是从分子克隆上的。
作者: cocacola    时间: 2013-11-15 22:03


我遇到的问题是我的电泳液最近在70V电压下电流显示50mA左右。当分离胶时我把电压调到120V,此时的电流高到100mA。所以我的条带跑的很不好看，弥散很大。以前可没出现过这种情况。另外我的电泳液是新配5X的。用时直接稀释1X的用。大家看看问题出在哪里啊？



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