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标题: 【讨论帖】于蛋白电泳问题总结 [打印本页]
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 10:51     标题: 【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

一、SDS电泳

SDS-PAGE前两条Marker样品弥撒原因

我最近跑SDS-PAGE前两条Marker样品总是很弥撒，不知道是什么原因，我想问题出在胶上或电泳缓冲液，请高手指点！/b]

[ 本帖最后由 fqswdzd 于 2013-11-16 11:04 编辑 ]
作者: tangxin_80    时间: 2013-11-16 10:51



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一、SDS电泳

我最近跑SDS-PAGE前两条Marker样品总是很弥撒，不知道是什么原因，我想问题出在胶上或电泳缓冲液，请高手指点！

样品盐浓度太高.....电泳时发热,没放到4度下跑.....
作者: yjf1026    时间: 2013-11-16 10:51



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一、SDS电泳

我最近跑SDS-PAGE前两条Marker样品总是很弥撒，不知道是什么原因，我想问题出在胶上或电泳缓冲液，请高手指点！


这种现象我偶然也会遇到！
不知你现在解决了没有？
估计可能是SDS在低温状态溶解不好所致，因为以前（夏天）做的都不存在这个问题；此外，样品没有脱盐也会出现扩散的。个人认为倒是不必4度下跑的。
作者: bling    时间: 2013-11-16 10:52



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一、SDS电泳

我最近跑SDS-PAGE前两条Marker样品总是很弥撒，不知道是什么原因，我想问题出在胶上或电泳缓冲液，请高手指点！

我们实验室遇到过三楼说的问题，后来找到原因了，是因为冬天温度太低胶凝得不好。后来我们冬天做电泳都要把空调开到三十度然后制胶，热死了。没有空调间的话可以把胶放到三十度的培养箱里。我们一开始是这样的，后来发现那样不容易放平，所以后来一直是在空调房里做。楼主的问题可能也差不多。
作者: ending    时间: 2013-11-16 10:52



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一、SDS电泳

我最近跑SDS-PAGE前两条Marker样品总是很弥撒，不知道是什么原因，我想问题出在胶上或电泳缓冲液，请高手指点！

其实在冬天可以将AP和TEMED分别增加少许,就可以促进胶的聚合了.
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 10:53


SDS我是放在37度温箱中溶解的，胶凝的很好，只要试剂新鲜没有问题，聚合时间延长胶可以聚合得很好，温度升高是可以加快胶聚合的。蛋白条带弥散，我想原因有
１.样品没有脱盐（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl)，有最简单的脱盐方法吗？如果是样品盐浓度太高，为什么marker也出现同样的问题？
３.是不是上样buffer的问题？需要重新配制吗？
作者: junjie05    时间: 2013-11-16 10:53



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SDS我是放在37度温箱中溶解的，胶凝的很好，只要试剂新鲜没有问题，聚合时间延长胶可以聚合得很好，温度升高是可以加快胶聚合的。蛋白条带弥散，我想原因有
１.样品没有脱盐（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl)，有最简单的脱盐方法吗？如 ...

你的Marker是自己用粉剂配的么？如果是，可以90%肯定是你上样Buffer的问题，需要重配。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 10:54     标题: 回复 #7 junjie05 的帖子

Marker是用粉剂配的，配成20ul在-20度保存，我准备重新配上样Buffer。
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 10:54

我觉得还是配胶时聚合的问题，我们组里现在那帮小朋友就时好时不好的，SDS的现象不知wangjun2002274 刻意注意过没有啊?

如果发现别的原因还望不吝赐教。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 10:55

我也不能保证每次配胶的时候都能１００％的聚合得好，个人认为如果室内温度达２５度，分离胶聚合时间超过６０分还没有聚合的话，应该考虑试剂的问题，ＡＰ、ＳＤＳ和３０％储备胶最容易出问题，如果分离胶能聚合，浓缩胶聚合就没有问题。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 10:55



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原帖由 8princess8 于 2013-11-16 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我觉得还是配胶时聚合的问题，我们组里现在那帮小朋友就时好时不好的，SDS的现象不知wangjun2002274 刻意注意过没有啊?

如果发现别的原因还望不吝赐教。 ...

我认为ＳＤＳ一次不要配得太多，反复在温水中溶解容易导致胶不聚合。碰到这种情况马上重配！
作者: H2O    时间: 2013-11-16 10:55


我也遇到楼主的问题,不知道您是否已经解决.
更奇怪的是不仅marker小分子量的弥散,而且总蛋白电泳的时候蛋白条带也弥散.问了不少人现在总结一下:
1.最多的观点是样品的离子强度和胶存在差异,一般是样品的离子强度高了
可以通过透析来解决
2.上样缓冲液的问题,可以重配的,我换了一下没有什么改观
3.分离胶聚合的不好,有建议分离胶室温过夜的,还有4度过夜的,我试过了反正没有解决我的问题
4.pH值和所用水的问题
后来在我SDS-PAGE电泳的时候,我不上样,这样可以排除是不是样品的问题,我只加上样缓冲液,结果发现溴酚兰依然很弥散,因此我推测,不大可能是样品的问题.上样缓冲液我用别人正在正常使用的,还是不行,我想也不是上样缓冲液的问题,最后我推测问题还是出在胶上,但我试剂已经重新配制了一遍,结果没有改观,今天又重新配制试剂了,换了水.有了结果再和大家交流.
昨天重新配制tris－SDS8.8试剂后定pH,原来的问题已经解决啦
看来pH值对SDS电泳的影响很大。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:05

二、SDS-PAGE电泳中溴酚兰指示带弥散的问题

本人在用组织匀浆跑12%的SDS-PAGE电泳时，发现溴酚兰指示带不紧凑，在泳道的前沿好像有一些弥散的颗粒状东西，这样跑出来的电泳条带和western blot结果也不好看。
1. 不会是匀浆缓冲液的问题。我试过用PBS和Tis-HCl等缓冲液匀浆组织，然后上样。结果都是这样，电泳前沿的蓝色指示带弥散有一些小颗粒，随着电泳前移。 而我们用PBS配的蛋白质Marker却没有这种情况。
2. 不会是点样量的原因。经定过蛋白定量后上样（每道40ug），也没有改善。
3. 也不会是SDS-PAGE胶的原因。因为同一块胶上点的蛋白质Marker泳道很正常。
4. 样品在上样前经过离心，取上清点样。
5. 我用这种匀浆的样品做IP后，再用IP产物跑SDS-PAGE电泳，结果还是一样。
我觉得是样品出了什么问题，但不知如何解决。  
请哪位有过这方面实验经验的高手指点！
作者: yonger    时间: 2013-11-16 11:05

是由于你的裂解液中SDS未完全溶解，使蛋白变性不完全所致。回想一下，这种情况是不是只在气温低时出现？夏天时没有这种现象吧。裂解前，先将裂解液稍温，使SDS溶解即可。试试吧。记得告诉我你的试验结果。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:06     标题: 回复 #14 yonger 的帖子

你说的很对。这个问题我后来在样品中重新加入SDS Loading Buffer 后有了改善。现在想来，确实是因为变性不完全所致。
非常感谢你的提醒和帮助！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:06

三、电泳时蛋白条带弥散

不知为什么近几次跑电泳时，感觉浓缩胶没什么作用，样品依然很弥散，只是配的胶的浓度从8%提高到12%，各种溶液没有改变，，我用的上是20ul样品加20ul 2*加样缓冲液，混匀后煮沸5分钟，样品加样前12000转离心1分钟，现在我的电泳液只用一次，但问题依然没有解决。请各位帮忙。
作者: caihong    时间: 2013-11-16 11:07


你可以重新配过胶试试，看是否是胶的问题。
另外，加样一定要加到孔低，否则也会出现这种情况，我就有好几次是这样。
还有，浓缩胶一定要有一定的宽度。
我想问你，你每孔的蛋白上样量是多少？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:07


我加样时都加到孔底的，加样量是10ul样品加10ul上样缓冲液。
我陪胶的液体都是原来的，就算是失效都不应该发生在一夜之间吧，只有我的30%的丙烯酰胺是新配的，我问了一下别人，怀疑是它没过滤的事。
作者: ritou1985    时间: 2013-11-16 11:07


如果经常电泳，凝胶一般不会突然出现问题。
是不是蛋白不溶解，上样时好好离心一下。
或者样品中盐浓度太高了。
作者: cwcwcww    时间: 2013-11-16 11:08


你肯定是蛋白弥散吗？
是否是上样量不够？你每孔的蛋白总量是多少ug？
作者: sunnyB    时间: 2013-11-16 11:08


含盐量可能太高了！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:09


应该不是，因为前几次条带在积层胶压成一条线，而且现在是所有的样品都这样。同时问一下，如果是样品含盐多，应该怎么办？
同时问一下，同实验室的兄弟现在跑电泳时总是成波浪形，将胶用我的液体配，电泳液重新配过，且现在电泳液只用一次，情况好一些，但是仍存在，不知该怎么办？
作者: sunnyB    时间: 2013-11-16 11:09


同时问一下，同实验室的兄弟现在跑电泳时总是成波浪形，将胶用我的液体配，电泳液重新配过，且现在电泳液只用一次，情况好一些，但是仍存在，不知该怎么办？

是否所做的胶的底部不平，呈锯齿状？如果是这样，跑的蛋白条带就是呈波浪形。我们用的是bio-rad垂直电泳槽，做胶时垫在玻璃板下的那块垫子一定要干燥，起码要搽干，否则做出的胶就是这样。
一起共勉！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:09


谢谢各位的关心。现在电泳的情况好些，可能是浓缩胶的长度不够，另外同实验室兄弟的电泳条带仍不很理想，现在用60V电压慢跑好些。但是最近我做的磷酸化蛋白一直没结果，连非特异性条带都没有，我现在是严格按照说明书做的。各位有何高见。
作者: 小野花    时间: 2013-11-16 11:09


我没有见过bio-rad的说明书，我的师姐教我做胶的时候，总是让我把垫片用水湿润一下，理由是不容易漏胶。这样做的胶片跑胶后，也没有波浪型。
另外我想问一下，是不是天气太热了，胶凝固的质量不会是太好？
作者: bling    时间: 2013-11-16 11:10


我觉得有时候电泳的问题很难讲的。建议最好重新配制分离胶buffer和电极buffer。
作者: NBA    时间: 2013-11-16 11:10

你好，你提的问题不是很清楚，你跑蛋白电泳是做blot还是考染？蛋白电泳条带弥散可能有以下几个问题：
1。样品上样量比较大，12％的胶，蛋白超过40微克条带肯定会弥散，但这不会影响各种蛋白质的分离，我曾上样超过100微克，转膜后条带很清晰。
2。2×的SDS上样缓冲液中的DTT容易失效，可以临时补加，不放心可以重配。也要保证其它溶液没有配错。
3。蛋白裂解时超声或抽吸要充分，尽量减少不容性蛋白。
4。条带成波浪型有可能是分离胶凝固的不均匀，灌分离胶时一定要快，不要担心会有气泡，只要用异丙醇封顶，气泡就会消失。
作者: c86v    时间: 2013-11-16 11:10

封顶最好用饱和正丁醇，异丙醇和水互溶
作者: ladyhuahua    时间: 2013-11-16 11:11


建议把制好的胶在4度放一晚再电泳； 也可能需要更换电泳系统。
作者: tie8    时间: 2013-11-16 11:11


1.电压、电流。
2.上槽液用时间长。
3.样品高盐。
4.点样孔塌胶。
5.分离胶浓度不正确。
6.样品有糖基化位点。
7.样品缓冲液发生沉淀或结晶
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:12

四、蛋白质电泳的问题

大家好，我最近在做蛋白质的活性电泳，但是蛋白质老跑不到分离胶中，我的分离胶浓度为6%，最初用的浓缩胶浓度为5%，后来看到有些战友认为把浓缩胶浓度改为3%就可以跑出条带，但我今天试了一下也没有见到条带，我真不知道是什么原因，蛋白质浓度应该没有问题，因为前两天我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带，请大家多多指教，看问题出在哪？
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 11:13

因为前两天我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带，

什么意思啊？困惑！你说跑不到分离胶中，那么就是说在浓缩胶中罗？！还是浓缩胶中也没有？如果两者中都没有，可能是你后来的染色、脱色有问题，而如果是前者的话，我觉得不可思议啊！你的蛋白质分子量多少？！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:13     标题: 回复 #32 fei1226com 的帖子

“我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带”，是指我最初做活性电泳的时候，由于不小心用了含SDS的Tris buffer配制上样buffer。
非常感谢fei1225com，我这两天发现，可能是蛋白质的PI与浓缩胶的PH接近，所以蛋白质跑不出来，我今天直接用连续电泳，染色以后有条带出现，这也可以作为后来者的借鉴！
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 11:14

好啊，对我也有启示，你可以预测PI的啊，试试看是不是真的接近，然后麻烦反馈一下结果，谢谢！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:14     标题: 回复 #34 fei1226com 的帖子

Sorry,由于我们实验室目前还不能做IEF，而且我正在纯化它，还没有它的全序列，不然可以用DNAman等相关软件预测PI，所以只有等以后结果出来在通知你，好吗？
作者: is2011    时间: 2013-11-16 11:14

可以放在冰箱中进行，有可能是电泳过程中蛋白质失活了
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 11:15

你如果知道DNA序列或者氨基酸序列就可以直接上网预测它们的PI啦！
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 11:15



QUOTE:
原帖由 is2011 于 2013-11-16 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可以放在冰箱中进行，有可能是电泳过程中蛋白质失活了

一般SDS-PAGE电泳都会置于液体冷凝系统中进行的啊，这个我想应该不会成为问题吧？！
作者: vivian4123    时间: 2013-11-16 11:15


按你说的情况，最主要的问题可能是你的配制凝胶时间没有加入SDS，这样的话，由于我们的电泳是SDS系统电泳，必需有SDS与蛋白质结合，蛋白质才能在凝胶中移动，所以我们的凝胶和电泳buffer、样品buffer均应含有SDS，要不然，SDS电泳就不叫SDS电泳系统了。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:16

要说明一下，蛋白质的活性电泳是不能加包括SDS在内的任何变性剂的，不然蛋白质就会失去活性！
欢迎大家继续对本问题的讨论，有什么好的经验大家可以共享！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:17

五、SDS-PAGE怎么跑不出带？

我跑了两次SDS-PAGE，但都没有跑出带，连MARKER都没有，如果是我的目的蛋白有问题，应该有MARKER的。我怀疑是降解了，是不是考马斯亮蓝用久了就会有蛋白酶？
请帮帮我，谢谢！
作者: tuuu2    时间: 2013-11-16 11:17


建议可以整块胶一起考染，不要把浓缩胶剥下来，看看蛋白是不是在浓缩胶上。
作者: glass    时间: 2013-11-16 11:17


呵呵
我认为你连MARKER 都没有跑出来，不应当首先考虑蛋白降解问题，再说电泳时的蛋白是变性的。。。我想你应当考虑：1）你的电泳系统是否有问题，比如缓冲液、电泳的条件等。2）样品处理和MARKER本身是否有问题。3）染色液和脱色液的问题。建议你用别人跑过的样品做一个阳性对照
作者: eric930    时间: 2013-11-16 11:18


建议：
1.用新的marker。
2.染色液和脱色液的问题，我认为这种情况较少，没有染上或脱色过度，重新配制染色液和脱色液。
3.样品是如何处理的，重新处理样品。
4.电泳问题或胶的问题，根据你目的蛋白的分子量选择合适的胶。电泳的时候你看到染色剂跑下来了吗？
总之，不论哪一个环节出错了都可能出现这种情况，所以你要一一排除！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:18


我用的是新的HMW，染色液和脱色液也是新配的，根本没用上脱色液，染完一看就没上色，样品的处理也是按照规定程序进行，电泳时能够很清楚看到染色剂跑下来，而且跑得很好。
但是电压是140V时，电流还是13A，是不是电流太小啊。但如果是电流问题，为什么染色剂跑得那么漂亮？
作者: dongdongqiang    时间: 2013-11-16 11:18

可能是染色液太久了，浓度低了，换银染试试。
作者: tangxin_80    时间: 2013-11-16 11:19


依我之见还是完成一下脱色，有时候光靠染色并不能直接判断电泳的结果。

尤其是当上样量很小或者染色液过浓的情况下。
作者: tangxin_80    时间: 2013-11-16 11:19


染色都没有条带，脱色后也不会有的，可能是你的染色液和上样缓冲液的问题，你要确性其中的成分没有错。如果样品中有蛋白，应该能染出来，用银染要敏感一些。
作者: DNA    时间: 2013-11-16 11:20


能否说一下你的详细步骤，包括你的胶浓度。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:21


我把上样缓冲液重新配一下看看，步骤应该是一样的，灌好胶后，用2倍样品缓冲液10ml混合样品10ml，沸水煮5分钟。marker是HMW，配置前是蓝色粉剂，用100微升融解，我取了5微升，我不知道生产商的marker是用什么染色的，可能是二甲苯青，一起煮，接着上样。我用的是12％的分离胶和3％的浓缩胶。我刚有用6％的分离胶与10％的浓缩胶跑了，还没跑完，待会看看。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:21

六、SDS-PAGE求助高手


本人在做SDS电泳，发现电泳结果显示的蛋白带比我原来估计的要少了很多，不知是啥原因，那位高手可以解释一下，会不会有蛋白丢失的现象！！！
急！！！。
作者: 66+77    时间: 2013-11-16 11:22


marker正常，你的电泳就没问题，问题在你的样品上
作者: windy+++    时间: 2013-11-16 11:22

我曾经出现过MARKER条带少两条的情况，至于蛋白质条带没有显现的情况也遇到过，我想首先要保证你的样品中包含蛋白质，如果的确有，那么可能是蛋白质浓度不够高。我把MARKER的浓度增加一倍后，每个条带都显现出来了，试试看加大蛋白浓度。
作者: zranqi_1    时间: 2013-11-16 11:23



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原帖由 fqswdzd 于 2013-11-16 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
六、SDS-PAGE求助高手


本人在做SDS电泳，发现电泳结果显示的蛋白带比我原来估计的要少了很多，不知是啥原因，那位高手可以解释一下，会不会有蛋白丢失的现象！！！
急！！！。 ...

提供几种可能：
1、蛋白已降解。
2、胶浓度是否合适。
3、样品是否完全溶解，并且进入泳道。
4、染色是否确定无误。
5、上样量的问题。
作者: ha111    时间: 2013-11-16 11:23


可能是你胶的浓度小了。
作者: shenkunjie    时间: 2013-11-16 11:24

我也说两句，结合自己的经验
1、胶的浓度是不是合适，因为有的胶如8%得胶，小分子全跑没了，marker肯定要少。
2、转膜时间够不够，如转膜时间不够，有的条带还没有转上去，转的时间太长，marker可能丢了（这种情况少）。建议不转，用考马斯亮蓝染，就知道有几条带了。
3.蛋白丢失可能性不大，不过不排除降解的可能。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:25

七、关于SDS电泳脱色的一种快速有效方法！

PAGE胶染色完毕后，如果用一般的甲醇－乙酸脱色液进行脱色，一般至少需要2－3h，但是我们实验室一般都利用蒸馏水煮的方法：
1.先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中，在电炉上煮沸。
2.将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中，煮3～5min。
3.将DD水倒掉，看胶是否已经脱净，如果还不好，可以用少量水再煮一次。
一般整个脱色过程最多15min即可搞定！
各位可以试试，可以避免每次脱色时搞得到处都是醋酸味！
作者: flower-201    时间: 2013-11-16 11:25


相关疾病：
普通感冒
我是用乙醇-乙酸配成的脱色液,胶放入后微波加热10秒钟至微热,上摇床,10分钟后,倒掉,换新的脱色液重复一次,不超过半个小时也好了.关键是不用甲醇了,避免毒性.醋酸倒没什么,还防感冒呢
作者: remenb    时间: 2013-11-16 11:25


那你的配方是什么
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:25



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原帖由 remenb 于 2013-11-16 11:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那你的配方是什么

乙酸：乙醇：水=1：2：7
作者: INK    时间: 2013-11-16 11:26

用高温煮对你蛋白不会有影响吗？
作者: qianqin1977    时间: 2013-11-16 11:26


我们是直接用脱色液加热到60度左右,摇10min中,再换过新的脱色液同意超作.效果不错呀.
作者: yychen    时间: 2013-11-16 11:26


关于“用高温煮对你蛋白不会有影响吗？ ”

蛋白上样之前已经煮过了，所谓死猪不怕开水烫。

而且SDSPAGE就是变性的条件。
作者: ending    时间: 2013-11-16 11:27

PAGE胶染色完毕后，如果用一般的甲醇－乙酸脱色液进行脱色，一般至少需要2－3h，但是我们实验室一般都利用蒸馏水煮的方法：
1.先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中，在电炉上煮沸。
2.将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中，煮3～5min。
3.将DD水倒掉，看胶是否已经脱净，如果还不好，可以用少量水再煮一次。
一般整个脱色过程最多15min即可搞定！
各位可以试试，可以避免每次脱色时搞得到处都是醋酸味！

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我用过，好象效果不好呀！
作者: greenbee    时间: 2013-11-16 11:27


深圳国家生化中心有一种方法，不用醋酸和醇染色脱色，用的是什么我没试过，听说还不错，一点味道都没有，速度也快，感兴趣的不妨去他们网站去看看。我是用醋酸和乙醇脱色，就是电炉上煮，染色和脱色30分钟就可见结果
作者: 68943512yao    时间: 2013-11-16 11:28

还有人直接放在微波炉里呢
作者: gogo    时间: 2013-11-16 11:28


我今天试用蒸馏水炮胶，并放在微波炉里加热，效果很好，而且速度快。

前几天我还看到一个有关快速染色的帖子。方法是胶放在染色液里，并在微波炉煮沸，再摇三分钟即可看结果。效果似乎不是很理想，脱色后看到胶染色不均匀。不知道是不是因为染色业放少了，给蒸发了？

另外我想问，用这种快速染色的方法。加热时甲醇，乙酸都已经蒸发了不少，这种染色业是否还可以重复利用。
作者: birdfish    时间: 2013-11-16 11:28


加热脱色是比较快。
另外，深圳国家生化中心的网站我去看了，没有发现关于此类帖子呀？
作者: 6327555    时间: 2013-11-16 11:29

前几天我还看到一个有关快速染色的帖子。方法是胶放在染色液里，并在微波炉煮沸，再摇三分钟即可看结果。

是不是热染 用的R350啊？

各位酶切的时候用什么脱色啊？本人都是用100mM NH4HCO3脱色，有时候也会放在37度水浴或者超声什么的，但是还是会有些顽固分子脱不掉色，郁闷。。。
作者: ha111    时间: 2013-11-16 11:30


我用的是R250,这个没什么太大差别，只是染色物质不同而已。

你说的酶切染色是什么意思？我用的这个脱色方法脱色非常完全。
作者: PCR    时间: 2013-11-16 11:31


我们加入甲醇－乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去，能吸去很都染料，加快脱色，效果不错
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:31



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原帖由 PCR 于 2013-11-16 11:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们加入甲醇－乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去，能吸去很都染料，加快脱色，效果不错

tissue的毛毛会不会粘在胶上影响做质谱啊？
作者: jrwyyplt    时间: 2013-11-16 11:31


把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦!(不要和胶混在一起）
作者: tuuu2    时间: 2013-11-16 11:32


就算和胶混在一起也没关系的，我做过，用的经典的老方法，脱色的时候，放入几张纸，脱色加快了。
最近从同学那学到一种新的，至少对我而言是的，脱色液用的是0.5％mol/l的氯化钠，不但没有了刺鼻的怪味，脱色效果也不错。
作者: utt0989    时间: 2013-11-16 11:33


用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热，我们一直都在用，
效果很好。
只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了！
作者: ritou1985    时间: 2013-11-16 11:33


"脱色液用的是0.5％mol/l的氯化钠"

What does that mean? How to make it? Thanks!
作者: DNA    时间: 2013-11-16 11:33


对于蛋白质SDS电泳脱色，蛋白质性质有关，对于R-250着色强的蛋白质，采用经典方法、或加热方法都可以，如果着色差，都不好。
作者: yapuyapu    时间: 2013-11-16 11:34

脱色液用NaCL可以,效果不是很好,感觉胶胀的厉害!
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:34


我今天试试用水的方法，用经典的方法我得脱色过夜才行。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 11:34

试了，效果不错 ，大约十分钟左右脱好的。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:22

八、想从sds胶里面回收蛋白，几个相关的问题

想从sds胶里面回收目的蛋白，用来免疫。看原来有大侠说过切下胶条装入透析袋中，水平电泳，然后浓缩。
请问1、水平电泳用的缓冲液是不是也是tris－gly，透析袋中一般加入多少缓冲液，是不是越少约好（估计蛋白50－100ug的样子）。
2、考马湿亮兰怎么除去，（用不用除去，如果用于免疫的话）
3、最后得到的浓缩蛋白是还用电泳缓冲液溶着？
作者: 49888    时间: 2013-11-16 14:24

我看过他们的贴子，你可能没有理解透彻：
1、电泳用的缓冲液可以是你即将要用的缓冲液，或者是使你的蛋白质稳定的缓冲液，缓冲液的量应该是使得胶完全被浸盖，不宜太多。
2、染色的只是你胶的一个很小的部分（一个电泳条带），目的是为了指导你切取其他电泳带的相应目的条带位置，而不是全部染色。
3、我觉得最后的保存缓冲液可以根据你的需要更换，也可以冻干等等，即可以按照蛋白纯化产品同样的方法处理。
作者: ritou1985    时间: 2013-11-16 14:25

我的一点经验：
１、电泳的凝胶用250mM的KCL染色，只需要几分钟就可以使蛋白条带呈现乳白色，根据位置切下需要的条带即可，脱色可以用ddH2O，可以不脱。非常方便快捷，无染料污染问题。
２、水平电泳回收后一定要取回收的样品再电泳看看回收效果。因为水平电泳回收过程中会产热造成蛋白降解，这方面我有惨痛的教训啊，让我浪费了大量的时间及金钱！
作者: guagua    时间: 2013-11-16 14:27


一个弱的问题：
从SDS胶中切下的条带中回收的目的蛋白目的蛋白纯吗
理论上说一个条带中应该含有很多种蛋白才是啊

我现在实验中的一个难题是如何从SDS胶上选取含目的蛋白的条带，又能否确保这个条带中蛋白质复合物较少。
WB？或其他方法？
谢谢
作者: tie8    时间: 2013-11-16 14:27

理论上确实相同分子量的蛋白都会处于同一条带中，所以需要证明其纯度。就我们实验来说，在原核系统中表达蛋白做抗体，诱导与未诱导电泳对照，目的蛋白条带只在诱导的全菌体中出现，而在未诱导中没有，再经wb确证，说明该条带只对应的目的蛋白。然后将蛋白初步纯化，使电泳时目的蛋白附近没有其他杂蛋白条带，这样切胶回收的蛋白纯度就比较高了。
作者: guagua    时间: 2013-11-16 14:28



QUOTE:
原帖由 tie8 于 2013-11-16 14:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
理论上确实相同分子量的蛋白都会处于同一条带中，所以需要证明其纯度。就我们实验来说，在原核系统中表达蛋白做抗体，诱导与未诱导电泳对照，目的蛋白条带只在诱导的全菌体中出现，而在未诱导中没有，再经wb确证，说明该条带只对应 ...

你的方法很妙，在做有差异的蛋白方面见长
我的问题是没有对照的，而是寻找标志性蛋白，不知道还有别的方法没
作者: yhz1973    时间: 2013-11-16 14:29


相关疾病：
头痛水疱

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我看过他们的贴子，你可能没有理解透彻：
1、电泳用的缓冲液可以是你即将要用的缓冲液，或者是使你的蛋白质稳定的缓冲液，缓冲液的量应该是使得胶完全被浸盖，不宜太多。
2、染色的只是你胶的一个很小的部分（一个电泳条带），目的是为了指导你切取其他电泳带的相应目的条带位置，而不是全部染色。
3、我觉得最后的保存缓冲液可以根据你的需要更换，也可以冻干等等，即可以按照蛋白纯化产品同样的方法处理。

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1.电泳用的缓冲液就是电泳缓冲液。
2.部分切胶染色，头疼的问题是染色和脱色时胶会缩小，这样就不容易对齐，容易切错位置，如果分离胶短，就更容易切错！当然可以用水泡使其涨大，注意要及时终止。我现在用的一种方法是，整块胶染色切下目的条带，洗脱后将染色的目的蛋白洗脱液再次直接上样电泳，之后部分切胶染色（步骤同第一次)，染色后对齐切胶，因这次蛋白较纯，可以切宽一点， 即使稍不对齐， 也不影响蛋白纯度。第二次电泳后考马斯亮蓝染料就和蛋白分离了。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:30

九、SDS-PAGE电泳后可以回收再复性吗？

我的蛋白在E.COLLI里未融合表达，25度下为全部可溶状态
NATIVE-PAGE跑的不好，有很多差异，不知道哪个是我的蛋白
但是我的SDS-PAGE跑的很好，知道我的目的蛋白在哪里，能不能SDS-PAGE电泳后可以回收再复性？
作者: u234    时间: 2013-11-16 14:30

你可以试试吧,好象没有听说这么做的.估计是悬.
作者: IAM007    时间: 2013-11-16 14:32


相关疾病：
电击伤
我认为可以试一下，郭尧君编著的----蛋白质电泳实验技术----上是这样写的：在常规PAGE电泳以后，在凝胶中或洗脱后可以检测天然蛋白质的生物活性。SDS电泳后也有这种可能性。从蛋白质中除去所有的SDS，许多蛋白质会恢复活性，或至少恢复部分活性。因为SDS不一定导致不可逆变性，但有许多因子影响活性的恢复。
1）SDS的纯度：市售的SDS常含有DDA等杂质，它们与蛋白质的结合比SDS紧，因而影响蛋白质活性的恢复；
2）蛋白酶的影响：在样品的准备过程中，蛋白酶降解蛋白质，因而影响蛋白质活性的恢复；
3）二硫键对活性没有贡献的蛋白质和非均一亚基组成的蛋白质，最容易被恢复活性；
4）尽可能慢地排除所有结合和非结合的SDS，使变性蛋白质有足够的时间去恢复天然的构象而复性，所需的时间取决于蛋白质的结构；
5）在恢复活性所用的缓冲液中应该包括在电泳过程中被迁移出的辅助因子和辅酶。高浓度底物、氯化钠、甘油和硫还原试剂如DTT的存在也将对酶的活性恢复有利；
6）疏水蛋白质恢复活性时，必须用无离子去污剂或两性离子去污剂替代SDS，以保持蛋白质的可溶性。
希望以上的资料能对你有用！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:32


可是具体如何操作呢？
割胶，然后透析？
作者: avi317    时间: 2013-11-16 14:32


回收是可以,复性恐怕就难咯.
作者: 66+77    时间: 2013-11-16 14:33


在凝胶中复性是可以做到的。用2.5％triton x-100 洗脱45分钟X2，即可将SDS洗脱出来。可以试一试。先回收再复性的方法我就不太清楚了。
作者: am10    时间: 2013-11-16 14:33


以前好象有个师兄做过。割胶，打碎，装在透析袋中，低温电泳，在离心取上清，具体的我没做过。希望对你有帮助。
作者: windy+++    时间: 2013-11-16 14:34


有的蛋白可以复性，方法是用将胶在2.5％triton x-100 沁泡1小时，37度摇荡。然后在缓冲液中泡1小时，37度摇荡，再上样前不能加热。不过，只有很少一些蛋白可以复兴，最好的办法环视跑活性电泳，不加SDS
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:34

十、用什么方法保存二维电泳SDS胶？

请教各位高手用什么方法保存二维胶比较好，最长能保存多久？胶存放久了对后面的质谱分析有什么影响？先谢谢了！
作者: vcve    时间: 2013-11-16 14:35

我们主要用的是配制的保存液
乙醇 75ml
甘油 11.5ml
双蒸水 定容至250ml
一般对质谱影响不大，具体没作对照研究，但是保存1-2个月后作质谱，效果还可以。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:36

十一、SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥保存方法

请问各位是怎么把SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色的凝胶干燥后保存的?没做过,很疑惑.盼复,谢谢!
作者: mimili_901    时间: 2013-11-16 14:36


有专门的干胶仪，把胶夹在两层滤纸里，放干胶仪的一块光板上，上面盖上，然后打开就会加热，胶就干了，跟纸一样，夹在书里就可以了。
作者: dotaaa    时间: 2013-11-16 14:36

if你没有干胶仪的话，我推荐你个很好用的方法（以前在公司跑完的胶都这么保存）！
1、你可以割两块一样大的玻璃；
2、四个大点的“夹子”（以前，金属的，带弹簧的，用手指捏，很有劲的那种就可以。）；
3、四个铝合金的“┒”形状的，和玻璃的边缘差不多的小条；
4、一张玻璃纸；
5、在水盆里把玻璃纸预泡15min，（记得在水盆里呀，否则，不好弄，）把玻璃纸在玻璃上铺平，把胶放上，玻璃纸折回，把胶覆盖，记得赶尽气泡（很重要哦）；
6、用夹子夹起四周，放他一天左右就干了，如果熟练的话，包的好的话，一点也不裂，可以夹到实验记录里。

适合没扫描仪，无干胶仪的朋友！
作者: remenb    时间: 2013-11-16 14:37


多谢！把胶封在玻璃纸里时需要特殊的液体吗？或只是用水就行了？
作者: owanaka    时间: 2013-11-16 14:37


用3％的甘油70％的乙醇，你会有更好的结果哦！！
作者: linlinstar    时间: 2013-11-16 14:37

离开水的鱼的办法是不错
放置的时候要在阴凉的地方，
赶气泡的时候要让玻璃纸和胶之间只有水，而不要有空气，这是保证干好的胶不裂开的关键。
作者: hot_hot_hot    时间: 2013-11-16 14:38

用干胶架和玻璃纸即可.
玻璃纸打湿一端铺在干胶架的一块板上,然后将凝胶放在中央,盖上另一半玻璃纸,一定要排除气泡,再压上另一块干胶架, 四周夹上夹子放通风处晾干即可.
作者: qhyu    时间: 2013-11-16 14:38


SDS-PAGE胶的干燥
凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。
(1)试剂与配制：
固定液：冰醋酸:甲醇:水（10:20:70）
(2)电泳后的凝胶用5～10倍体积固定液在室温下固定，酸性固定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消失后，继续固定5min。为防止凝胶破裂，在进行步骤(2)之前可将凝胶浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中过夜。
(3)将凝胶标记好方向后放在保鲜膜或玻璃纸上面，上面放一张比凝胶四周长出1～2cm的Whatman 3MM滤纸。
(4)另将一张滤纸放在凝胶干燥器上。将Whatman 3MM滤纸/凝胶/保鲜膜或玻璃纸，放在凝胶干燥器上的滤纸上面，保鲜膜或玻璃纸在最上面。
(5)放下凝胶干燥器的盖子，抽真空使凝胶四周封闭以干燥凝胶，干燥时间常由厂家提供，一般0.75mm厚凝胶干燥2h，如50～65℃可加快干燥进程。
释放真空。如加热状态下干燥，则先停止加热并自然冷却10min后再释放真空。
摘至：周俊宜（编著）.分子生物学基本技能和策略，北京：科学出版社，2003.8
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:39

十二、about SDS-PAGE

我的蛋白等电点为9.7，那么经SDS sample buffer混合后，应该也是带负电荷 吧？所以我应该可以采用通用的SDS-PAGE system 了？但是否有可能在转膜过程中，凝较经不含SDS的trans buffer 平衡后，凝较中的SDS被洗脱了出来，使得蛋白带正点荷了呢？（我所用的trans buffer 的PH=8.3）
请各位 大虾相助！
作者: fox_79    时间: 2013-11-16 14:39


SDS和蛋白的结合是不可逆的，因此无论是否经TRANS BUFFER平衡，结合SDS的该蛋白理论上都是带负电荷。
作者: DDD    时间: 2013-11-16 14:40


蛋白上的SDS在转膜的过程中一般洗不掉，所以不管你蛋白的pI是多少，只要转印的条件合理，总会转到膜上。但是，SDS是可以去掉的。蛋白结合到膜上后，如果可以去掉SDS，则可以提高一抗的结合效率。洗的方法是转膜结束后，用1%NP-40洗30分钟即可。效果很好。
作者: fox_79    时间: 2013-11-16 14:40



QUOTE:
原帖由 DDD 于 2013-11-16 14:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白上的SDS在转膜的过程中一般洗不掉，所以不管你蛋白的pI是多少，只要转印的条件合理，总会转到膜上。但是，SDS是可以去掉的。蛋白结合到膜上后，如果可以去掉SDS，则可以提高一抗的结合效率。洗的方法是转膜结束后，用1%NP-40 ...

谢谢你的提醒，SDS和蛋白的结合是不可逆：这是秉承以前的前辈的“成果”，不过对于非离子型去污剂NP-40可驱除SDS上的蛋白 ，我确认一下。以前我用它也洗过膜，作用似乎同Triton X-100，Tween 20并没有发现结合一抗的效率提高。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:41

十三、我在SDS-PAGE中所犯的错误 [

前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：
1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。
2 AP用别人旧的，结果胶不干
3 A液，B液用旧的，不干。
结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。
4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝
5 电泳时长板接负极，反了
6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。
再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 14:42

我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。
作者: dodoit    时间: 2013-11-16 14:42


我对跑PAGE也是深有体会，说出来与大家共享。
1.我们的AP一般分装后放在－20冰柜中，用时拿出融化，这样使用保存时间很长。
2.上样时一定同时在实验记录上记下你的上样顺序，因为如果你跑整块胶一定是不同的样，因此，脱色后可以根据记录大致判断出加样顺序。还有，上面的仁兄说得中间偏向空一个孔，两边加不同数量的样也可；再或者记住marker的位置，同样不会弄错左右面。
作者: 66+77    时间: 2013-11-16 14:43

老弟真行，别人遇上一个二个问题也就罢了，你竟然全碰上了，真有你的。呵呵。

SDS-PAGE 所用的溶液一般有效期为一个月左右。但是10%SDS溶液的有效期为一周，且常温保存。如4度保存会结晶。AP的有效期也为一周。

我用的电泳仪是BIO-RAD的电泳仪，灌胶时不用封底。
作者: wu11998866    时间: 2013-11-16 14:43

10%SDS溶液我常温存了半年多还是可以用的
作者: 脱水萝卜    时间: 2013-11-16 14:43


我们溶液除了AP和temed都在室温放着，时间都在一个月以上（AP，三周以上），以前没有出现任何问题！不过最近靠近上边的带没有跑出来，就是缺带了，可能是时间太久了（有半年了），马上重配，再试试！
作者: gogo    时间: 2013-11-16 14:44


我和同学做实验时配了1000ml 10%SDS，结果全科人用了一年多将近两年也没见出什么问题，也就是常温放置。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 14:44


sds没问题的，但是低浓度ap最好当天使用，半衰期很短
作者: one    时间: 2013-11-16 14:45


sds一般可以常温保存不会失效，但AP最好每次都要新配，如果低温保存一般的保存时间是一周，最好不要超过两周，以免失效，反正我们可以少配。剥胶时我们可以一边撬玻璃板一边用流水冲洗，一会就可以完整的剥下来。
作者: zhenxin    时间: 2013-11-16 14:45

我这里AP在－20度放置，temed在4度放置，其他在室温放置，基本上多半年无问题。我的体会是，电泳缓冲液很重要，最好用数次就弃去，还有上槽液和下槽液要分开，用几次后，可以将上槽液改为下槽液，弃去下槽液。当然这是针对Bio－Rad这种上下槽分开的系统。
作者: vera+    时间: 2013-11-16 14:46


我的AP是分装成小管，放－20保存，每次用一管，印象中半年是没问题的。TEMED是放4C。其它常温放置。另外配制顺序最好是TEMED先加，然后再加AP，因为没有TEMED，AP也可以引发聚合反应，只不过速度稍慢一些，对于学过高分子的人这些最清楚。
作者: 9900    时间: 2013-11-16 14:46


请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com
作者: 131415    时间: 2013-11-16 14:46


琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！
作者: 大尾巴    时间: 2013-11-16 14:46

我跑12%的胶，没出现过你说的深带。
我一般是细菌沉淀直接加样品buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，效果还行
作者: memory    时间: 2013-11-16 14:47


1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。
作者: memory    时间: 2013-11-16 14:47

琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

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你用的琼脂粉是多大浓度的，我用2%都不能好。
作者: qqq111    时间: 2013-11-16 14:48


我用1%的琼脂封胶效果很好，有时候琼脂的质量不同，用的浓度就不同，我们实验室发现即使是同一厂家不同的批次质量都不同，你的琼脂可能质量不好，你可以加大浓度试试。
作者: 3N4G    时间: 2013-11-16 14:48


细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？
作者: plaa    时间: 2013-11-16 14:48


胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？
作者: wu11998866    时间: 2013-11-16 14:49

胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

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我参考的是：汪家镇的＜蛋白质技术手册＞，那本书还是很常用的。
作者: wu11998866    时间: 2013-11-16 14:49

1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。

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TEMED可以加倍，只要在10ul以下，AP可以加二到三倍。
作者: wu11998866    时间: 2013-11-16 14:49


有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。
作者: avi317    时间: 2013-11-16 14:52



QUOTE:
原帖由 wu11998866 于 2013-11-16 14:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。

弓虽！
请问他是用什么板配的？多厚？是不是要跑双向？
作者: 49888    时间: 2013-11-16 14:52

如果有条件，可以用Bio-rad的电泳仪，就不用封了，非常方便。
至于APS可以先配好，放到-20度冰箱冻存。
作者: qhyu    时间: 2013-11-16 14:52


请问跑小肽分子，除了加甘油及胶浓度还有哪些好办法？能否具体提供帮助？谢谢了
作者: wood533    时间: 2013-11-16 14:55


我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。
作者: 6327555    时间: 2013-11-16 14:56

应该是过硫酸铵，但我知道另外有种缓冲液的缩写也是AP。
作者: 987789    时间: 2013-11-16 14:56


1%琼脂粉封边很好用
作者: 7437654    时间: 2013-11-16 14:56


我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。

我们用一种特殊的枪头，比10ul的长许多，专门用来加样的。
作者: wood533    时间: 2013-11-16 14:57

我可能见过的，也是白色的那种，有点像200微升的那么长是吗？
作者: duoduo    时间: 2013-11-16 14:57


每次跑的时候，电压小点，时间长点，带就不会歪了。
作者: wood533    时间: 2013-11-16 14:57

每次跑的时候，电压小点，时间长点，带就不会歪了。

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那么请教你们一般电压是多少呢？我是在积层胶用8V/CM,分离胶用15V/CM
作者: jujuba    时间: 2013-11-16 14:58

请问我跑2DE时，横纹有点多，大分子蛋白很少，请问有什么解决方法呢，急！
作者: 987789    时间: 2013-11-16 14:58

我做SDS-PAGE时用Bio－Rad的电泳槽，一直都很好用。但是用的时间长了有时会出现漏胶的现象。不过总体来说还是很好用的。很方便，但就是价格也很贵。关于AP我看还是现用现配，每次称100mgAP，加1ml水就行了。很麻烦吗？我觉得比拿出来解冻要省时间。其实SDS-PAGE做的好坏关键在于你的样品好坏。还是在制样上多花点心思比较好。至于加样的问题可以用微量进样器，要注意每次用完后洗干净，否则容易堵。有条件的话也可以买专门上样的枪头，200ul的那种，我们实验室有，很好用。
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 14:59


相关疾病：
头痛
我刚进实验室,近一周做SDS-PAGE时也遇到了头痛的问题:分离胶凝后总是双层,上层大约2mm;跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?
作者: tianmei001    时间: 2013-11-16 14:59



QUOTE:
原帖由 mysmdbl 于 2013-11-16 14:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

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我刚进实验室,近一周做SDS-PAGE时也遇到了头痛的问题:分离胶凝后总是双层,上层大约2mm;跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故? ...

我也遇到同样的问题。我认为这是上层密封液（水或饱和正丁醇）与下层胶的缓冲带，其中也含被稀释的胶液，因此也可聚合，但是因为浓度稀，聚合时间短而无法形成凝胶，只能形成一个折光系数不同的液相。一般我是如此解决，就是当估计下面已经完全聚合时，倒去上层密封用的饱和正丁醇或水，这时，上面那条细带也一起被倒掉了，然后用水冲洗，继续灌制浓缩胶即可。
此处的关键是一定不要聚合过长时间，否则，上面那条细带就也聚合成凝胶，而无法冲洗掉了。
哪位还碰到过这个问题，同时你又是如何解决的，大家一起讨论，看能否找出真正的原因和最佳解决方案。
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 15:00     标题: 回复 #146 tianmei001 的帖子

谢谢您的指教。我又做了一次，速度加快了不少，封水时动作轻些，胶凝得很好。
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2013-11-16 15:00

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我刚进实验室,近一周做SDS-PAGE时也遇到了头痛的问题:分离胶凝后总是双层,上层大约2mm;跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?

跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?
这个问题是怎么回事啊，我在实验中也出现这些细的条带，不知道该当何解释？
作者: ero11    时间: 2013-11-16 15:00


分离胶凝后为双层,我作实验没有遇到过.会不会是gel solution没有配好.

跑胶时出现的细条带是不是小分子条带?
作者: qianqin1977    时间: 2013-11-16 15:01


胶所用的浓度可根据<分子克隆实验指南>中的分子量而定，一般情况尽量将目的条带放在范围中间，这样跑出的带很好，还要注意电压，但我们有时从头到为都用200v效果也很好，可以试试
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 15:01


很奇怪，我同学灌的分离胶就没有分层的情况发生，不过他的胶是0.5mm的，会不会跟胶的厚度还有关系？
作者: yychen    时间: 2013-11-16 15:02


上样液好像至少是2倍的，最终使加样时样品向孔内沉降，不大会出来的。

别的感觉就是按照书上的就可以，关键时缓冲液要时新的
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 15:02


我今天灌分离胶之前，将它复温至室温，结果未出现分层的情况，我想大概胶的温度很重要吧，
作者: 草木叉    时间: 2013-11-16 15:02



QUOTE:
原帖由 mysmdbl 于 2013-11-16 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我今天灌分离胶之前，将它复温至室温，结果未出现分层的情况，我想大概胶的温度很重要吧，

灌分离胶之前？？

应该什么分层呀？
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 15:03     标题: 回复 #154 草木叉 的帖子

将分离胶gel solution 复温至室温后使用可以避免分离胶聚合后出现分层.
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 15:03


遇到一怪事：电洗脱后的蛋白SDS-PAGE，银染后发现蛋白泳道呈金黄色，而其他区域背景是棕色，不知是何原因，各位高手请指教！
作者: windy+++    时间: 2013-11-16 15:03


sds比较稳定，一般可以常温保存不会失效，但AP很容易失效，我的经验是将其干粉定量分装于EP管中，固体状态可以长期保存，临用前加入ddH2O溶解就可以了。
作者: 49888    时间: 2013-11-16 15:04


若使用用了长时间的系统灌胶，又漏的话：可用封口膜在装好的二玻璃板封口，压紧，就少漏了。
作者: BUK    时间: 2013-11-16 15:04


AP确实需要现配现用，不能存在侥幸心理，我开始做的时候就因为不重视吃了亏；另外我的TEMED（4度保存）和SDS（常温保存，温度低了易结晶，可以放到温箱中溶解）一直用了半年都没有问题；电泳液短期使用没有问题，稀释后使用建议不要超过三次！
作者: 3648755    时间: 2013-11-16 15:04

现配的AP可以让胶凝的好一点
而且有时AP潮了也会出现胶不凝

我们用微量加样器，就是50ul的注射器，针头是像细铁丝一样的
很方便
作者: 小游abc    时间: 2013-11-16 15:05

我们教研室配的10%SDS100ml刚开始溶得很好，不过在室温放置2~3周就出现灰网状物，刚开始怀疑是瓶子不干净，倒掉重配又是这样，不过倒是还能用。不过用的时候让人提心吊胆，大家有解决的好办法吗
作者: c86v    时间: 2013-11-16 15:05


我跑SDS－PAGE的时候，会在最两边的加样孔加入等量的纯加样缓冲液。这样可以防止边缘效应使胶比较容易跑齐；而且我加样的时候习惯在MARK后面空一个胶孔，也可以帮助记忆点样的位置的。
作者: lixi559    时间: 2013-11-16 15:05


我用2%琼脂封胶，效果不错，关键是槽内要多到点儿，否则易漏胶。
作者: vivian4123    时间: 2013-11-16 15:06

我们教研室配的10%SDS100ml刚开始溶得很好，不过在室温放置2~3周就出现灰网状物，刚开始怀疑是瓶子不干净，倒掉重配又是这样，不过倒是还能用。不过用的时候让人提心吊胆，大家有解决的好办法吗

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换SDS吧（换个厂家的或者换个经销商的），我也遇到过，后来SDS就永远不和那家经销商做了，问题也再没有出现过。
作者: 豆龟    时间: 2013-11-16 15:06


蛋白质电泳配的10×TBE母液,使用时用1×TBE时,是不是取一份10×TBE母液,加9份水啊？若用０.5×TBE，是不是取一份母液加１９份水啊？

实在不好意思，太简单的问题
作者: BOSS2011    时间: 2013-11-16 15:07

SDS-PAGE中AP的质量与新旧比较重要，我们一般将其分称于几个EP管中，用时再用ddH2O溶解，一般只用一周左右；
SDS应该不会出现什么问题，放一年左右都没大问题；
电泳缓冲液一般只可用2次，多次重复使用会出现拖尾带
作者: BOSS2011    时间: 2013-11-16 15:07


蛋白质电泳用的缓冲液应是Tris-甘氨酸，TBE是用来电泳核酸的；
10×一般指的是10倍深度，用时稀释成1倍。
作者: BOSS2011    时间: 2013-11-16 15:07

虽然此帖发了快一年了,但我还是和大家分享一下我的经验,希望对后来者有些须帮助:
1.用琼脂糖封胶好象优点奢侈,除了用琼脂粉以外还可以用12.5%的淀粉,煮沸致透明即可.
2,APS配好后可用EP管分装,保存于-20度
3,一般的电泳仪的正负接头都有颜色指示,红色示正极(bio-rad),有的(大板)红色指示的却是负极.
4,marker点了就好分辨点样顺序,可不用切角,但不点marker时却必须点上.
5,剥胶时可把浓缩胶刮掉,一边用流水冲洗一边剥,这样比较保险.
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 15:08


请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com

回答:
1,正常;
2,12%跑20kD没问题的;
3,细菌沉淀我们是加1倍的buffer,沸水煮8-10min,小离心机12000rmp5-10min;煮的时候要小心EP管,没盖严或崩开的话样品就会有特浓的情况发生.
4,这里有很多做过蛋白表达的,本人做过三年.
作者: 33号    时间: 2013-11-16 15:09

今天做胶,所用凝胶储液,分离胶和浓缩胶BUFFER都是去年11月底的,居然也凝固了,不知这样的胶能否用来电泳?
另外在灌胶时发现分离胶和浓缩胶溶液里都有少量白色絮状沉淀,不知是不是溶液放置太久之故还是本身就有的,因为以前做实验时也发现过类似的现象.
谢谢指点!
作者: eve_49    时间: 2013-11-16 15:09


最近一直跑同工酶，不知道大家凝胶时是什么温度？个人认为高温下使凝胶快速聚合比较好，特别是4mm的厚板，根本不用封水，特别平。常温下自然聚合经常会出现锯齿状的边缘，就是不知道对电泳有没有影响。感觉没什么差别
作者: 2541    时间: 2013-11-16 15:09


琼脂是可以封底的，我们实验室一直在用哦，而且效果很不错。凝固几分钟就可以了
作者: xyw5    时间: 2013-11-16 15:10


我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?
作者: DNA    时间: 2013-11-16 15:10

琼脂粉可以用的，我就是用这个，其实没什么影响的，2％的琼脂粉凝结的很慢，我每次用4％啦，从没出现过漏胶的问题。另外SDS我也是常温放着的，TEMED我是常温避光放置，AP 4度保存。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能久置，最好新配。其它的问题也就是熟练而已啦。
作者: 大脑门儿儿    时间: 2013-11-16 15:10


最近我在跑SDS-PAGE时，发现胶上部分条带出现山峰状的高耸，有点象心电图的样子。第二个问题是：肉眼看胶的背景很干净，可是用Amersham的
Image Scanner进行凝胶扫描时，调整对比度后却发现有显色比较深的竖条带贯穿在某个样品的蛋白条带上下。请问各位高手这是什么原因导致的？以前丁香园曾有帖子说这是因为存在不溶性蛋白的缘故，可我的样品全都是可溶性蛋白。
我想把自己的“问题”凝胶上传给大家分析，可是我发现可以上传的那个项目好像消失了，所以我不知道该如何让大家看见我的胶。抱歉，只能口述了。
作者: 大脑门儿儿    时间: 2013-11-16 15:11


对于大家上述谈到的问题，我也说说自己的体会。
（1）AP我们一般是现用现配，配好后未用完的一般在4度保存一周。一周后的必丢弃。
（2）10%SDS在室温保存一年，感觉也没什么问题。气温下降时可能会出现白色絮状物，当时碰到这个问题，我是把旧溶液丢弃，重新配制。后来我们实验室的技师说，加温溶解后应该还可以用。但本人没试过。供大家参考。
（3）1M Tris(pH6.8)和1.5M(pH8.8)我也放在4度保存，理论上说在室温保存即可。可我们室温保存的Tris曾发现絮状物，我不太清楚什么原因，可能是配置时间太长了？但我感觉放4度保存效果很好，已经大半年了，没有出现絮状物的情况。
（4）TEMED我们是4度避光保存，丙烯酰胺棕色瓶4度保存。理论上，TEMED是易吸湿的无色液体，吸水则加速氧化变成黄色，会降低其增速作用，最好不要用。暂不用者最好密封保存在深冻冰箱中。但我们4度保存的TEMED通常都是黄色的，感觉用起来也没什么问题。丙烯酰胺理论上4度可保存一个月，但我们通常都会超过这个时间期限，可能至少也有2、3个月，也没什么问题，但还是建议大家配制溶液时一次少配点，譬如50ml或100ml。
作者: 大脑门儿儿    时间: 2013-11-16 15:11


另外我们实验室用的是Amersham的电泳仪，是用凡士林来封底的。用起来也很方便。
作者: xingyi08    时间: 2013-11-16 15:12


大家有用5*LOADING BUFFER的吗??配方就是分子克隆的浓缩一下是吗?
作者: nn255    时间: 2013-11-16 15:12


为何我跑的胶老是歪的？用的是国产电泳仪
作者: 7437654    时间: 2013-11-16 15:12


经验而已,用1.5%的琼脂糖封胶相当好!
当然,其实各实验室都有自己的一套东西,希望大家多交流。俺是新的手啦，不懂的很多。
作者: am10    时间: 2013-11-16 15:13

maker可以放在一测，另外我们做完分离胶后用异丁醇封顶，效果挺好的，不妨试一试
作者: bs4665    时间: 2013-11-16 15:13


我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢，分离胶就没有，为什么啊？
而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到，要么变成很细的很近的两条带，是怎么回事呢？换了一管新的也是一样！
作者: shenkunjie    时间: 2013-11-16 15:14



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我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢，分离胶就没有，为什么啊？
而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到，要么变成很细的很近的两条带，是怎么回事呢？换了一管新的也是一样！ ...


胶凝的慢不用说，肯定是试剂的问题，想解决，那就把temed多加2ul，，aps增加10左右，保证快些，另外你的aps建议重赔，此外凝的时候放在37度也会快点。
你的marker其他带怎么样，而且最大的本来就比较浅，出现两条带可能使你跑胶的问题
作者: yes4    时间: 2013-11-16 15:14

我也有问题想问一下，为什么跑胶中会出现条带的歪斜
作者: finger    时间: 2013-11-16 15:14


如果是试剂的问题的话为什么分离胶可以在30分内就可以凝好呢？我APS是配好后分装，拿了一管新的也是一样啊！我想我现在跑胶是有点问题，可到底是什么问题我还不知道，在注意一下拉！
作者: fsdd817    时间: 2013-11-16 15:15

问大家一个问题，我最近跑胶时，发现分离胶下边距离边缘1cm的地方经常出现比较大的气泡状的东西，今天更坏的是下边的分离胶竟然裂开了，而我这次配胶是昨天晚上配的，今天早上用，刚开始并没有气泡产生，过了几个钟头之后才开始出现气泡的，而且溴芬兰遇到气泡后就变成了黄色。我今天加了冷凝水，应该不是温度的事情，请问谁知道该解决这个问题，我已经遇到这个问题不下6，7次了，谢谢！！！
作者: shenkunjie    时间: 2013-11-16 15:15



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原帖由 fsdd817 于 2013-11-16 15:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
问大家一个问题，我最近跑胶时，发现分离胶下边距离边缘1cm的地方经常出现比较大的气泡状的东西，今天更坏的是下边的分离胶竟然裂开了，而我这次配胶是昨天晚上配的，今天早上用，刚开始并没有气泡产生，过了几个钟头之后才开始出 ...

我们曾出现过这种情况，主要因为玻璃板不平或不干净所致，胶凝时会收缩，与玻璃板之间如果结合不紧密的话，那就会出现气泡或者裂开了，你只要换一块板或者好好洗洗，就应该没有问题了
作者: DONT    时间: 2013-11-16 15:16

我在铬酸中泡过玻璃板，应该挺干净的，至少比我以前的干净，不过，下次再好好洗洗试试。另外，可能的原因我想是不是ap，我的ap用了好久了，今天我重新配了，到现在为止胶还没裂，因为我现在跑14%的胶，可能ap对他影响比较大。
作者: wu11998866    时间: 2013-11-16 15:16


大概没有比不拆封胶边条更让人郁闷的了，尤其有一次已经跑了近一个小时。可别忘
作者: abc816    时间: 2013-11-16 15:16


我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?

1、当然电压大了，胶跑的快，时间短，分离效果差，所以如果要跑胶的样品蛋白的分子量差别不大的话，要用的电压要小，这样分离效果好；如果分子量差别大的话，就用大电压，可以快速看到结果。
2、菌液样品一般要小电压，因为它的蛋白多，电压大不容易分开
作者: 04906    时间: 2013-11-16 15:16


根据我们实验室的经验。一般使用的是恒流。压缩胶15mA,分离胶30mA.
作者: 雪花子    时间: 2013-11-16 15:17

还是恒压好，100V
作者: u76mp    时间: 2013-11-16 15:17

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。 好嘿人哦！
如果有条件，可以用Bio-rad的电泳仪，就不用封了，非常方便。

不过我研究了bio-rad的制胶装置，然后自己做了一个同样的，效果不错哦！
我下面用的是一般的软泡膜，不过上面有一层透明胶，然后用我自制的夹子把两个玻板夹在上面，灌胶，效果完全与bio-rad 的媲美，为什么国内就没人搞过这个了，象6.1那个烂厂，就没有想过人性化吗，十多年了还是老产品。
作者: xyw5    时间: 2013-11-16 15:17


如要做8%的分离胶，我知道8%是指丙烯酰胺在凝胶中的百分比，但是我不知道它是怎么算得的，请大家帮帮我。谢谢！
作者: nut6694    时间: 2013-11-16 15:18


请教:细菌粉碎后是用上清还是沉淀来跑电泳?
作者: lixi559    时间: 2013-11-16 15:18



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原帖由 nut6694 于 2013-11-16 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教:细菌粉碎后是用上清还是沉淀来跑电泳?

你若是不知道表达的蛋白究竟是在上清，还是在沉淀，那你就得用“细菌超声粉碎后上清和沉淀”一起跑电泳，通过PAGE胶就晓得究竟是上清，还是沉淀有你所需要的目的蛋白。

沉淀可适当用蒸馏水稀释，和上清一样的方式处理SDS-PAGE模板。

再次推荐以下好的网站，图文并茂地分析了SDS-PAGE常出现的问题。愿对战友有所帮助！
SDS-PAGE: Examples of bad gels
cuturl('http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html')
作者: yysr238    时间: 2013-11-16 15:19


我们在蛋白质印迹中发现：APS固体在室温保持的时间不长。有段时间我发现胶始终凝不了，用了师兄的APS（从我这里分装然后保存于－20°c）来配10％的APS后，胶就凝固了，所以我认为过硫酸氨最好是在低温保存。仅供参考。
作者: sunnyB    时间: 2013-11-16 15:20


我用的是分子克隆提供的方法，配制12%的分离胶，水饱和的正丁醇封，但是总有少量的不凝，就是跟正丁醇接触的部分，请问是怎么一回事啊？我倒是一直这样做的，倒也能出来，今天看见大家在这里讨论，还是想问一问。谢谢！
作者: ha111    时间: 2013-11-16 15:21


我做SDS-PAGE时用Bio－Rad的电泳槽，一直都很好用。但是用的时间长了有时会出现漏胶的现象。

我们试验室也会出现类似的状况，我认为主要是卡口没有卡紧，可以用滤纸垫在卡口处，这样玻璃与低下的皮垫之间的接触会更紧密，那么就基本不会漏胶了
作者: 101010    时间: 2013-11-16 15:21


我想问一个问题,为什么我最近加完浓缩胶加好梳子以后,等干了以后浓缩胶却在两端有部分的干裂??
请指教
作者: avi317    时间: 2013-11-16 15:22

细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？

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有时1×buffer会降低样品浓度，导致条带不清晰
作者: glass    时间: 2013-11-16 15:22

我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。

有专用的上样枪头啊，适合20ul加样枪用的。大的耗材公司都有卖。
作者: glass    时间: 2013-11-16 15:22



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原帖由 101010 于 2013-11-16 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想问一个问题,为什么我最近加完浓缩胶加好梳子以后,等干了以后浓缩胶却在两端有部分的干裂??
请指教

可能是最近天气干糙的缘故，水分蒸发得快。我是每次把梳子都插到底，不让胶和空气有太多接触。
作者: glass    时间: 2013-11-16 15:23

我用的是分子克隆提供的方法，配制12%的分离胶，水饱和的正丁醇封，但是总有少量的不凝，就是跟正丁醇接触的部分，请问是怎么一回事啊？我倒是一直这样做的，倒也能出来，今天看见大家在这里讨论，还是想问一问。谢谢！

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其实用双蒸水封闭效果很好，胶的上沿压得很平，只要加水时小心不要冲淡了下面的胶液，凝固后胶很整齐很少不凝的。
作者: glass    时间: 2013-11-16 15:23

我也遇到同样的问题。我认为这是上层密封液（水或饱和正丁醇）与下层胶的缓冲带，其中也含被稀释的胶液，因此也可聚合，但是因为浓度稀，聚合时间短而无法形成凝胶，只能形成一个折光系数不同的液相。一般我是如此解决，就是当估计下面已经完全聚合时，倒去上层密封用的饱和正丁醇或水，这时，上面那条细带也一起被倒掉了，然后用水冲洗，继续灌制浓缩胶即可。
此处的关键是一定不要聚合过长时间，否则，上面那条细带就也聚合成凝胶，而无法冲洗掉了。
哪位还碰到过这个问题，同时你又是如何解决的，大家一起讨论，看能否找出真正的原因和最佳解决方案。

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加水封闭是，尽量小心轻轻加，不要让水和胶液混在一起冲淡了胶液。这个考手艺了
作者: zhihui小新    时间: 2013-11-16 15:23

SDS-PAGE中，相对于分离胶而言，浓缩胶一般加多少？

蛋白快跑到分离胶底部时，出现严重拖尾现象，会不会因为浓缩胶加得太少，这样，蛋白在浓缩胶里80V的低电压时间就比较短，是因为这个原因吗？

新手成长中，望指教！
作者: leifengta    时间: 2013-11-16 15:24


我要说两点：
1。琼脂粉可以用来封底，不会漏，如果封不住，那是因为琼脂粉用的时间太长了，或者太稀、太浓了，经验上1-2%的最好用，
2。10%SDS室温放置，用半年以上没有问题
作者: 喵咪    时间: 2013-11-16 15:24


（1）10%SDS本身浓度很高，在4℃时肯定会结晶析出，而且SDS很稳定，配好以后直接放在室温保存即可。
（2）对于电泳的所有试剂而言，包括各种Buffer、gel solution等最好使用三重蒸馏水。原料有条件的尽量选进口的。
我有一次用国产的丙烯酰胺，最后胶稠而不凝，好不容易才找到原因。
（3）对于电泳中分离胶Buffer和浓缩胶Buffer要用pH计调。
（4）分离胶用水封即可，要慢，慢工出细活！
作者: youyou99    时间: 2013-11-16 15:24


我认为有几点是十分重要的：
1，丙烯酰胺和甲叉*的质量十分关键。进口的比较值得信赖，如果用国产的，一定要加上滤纸过滤这一步骤方可放心。
2，ph值调整的十分精确是相当重要的，对于出来漂亮的结果很关键。
3，电泳缓冲液的清洁和ph值正确也是很重要，1*buffer室温不可久置，容易长菌，然后一电泳胶上就十分不干净。
4，样品盐浓度和其他杂质对条带的漂亮不漂亮影响很大，透析一下往往会有好结果。

此外，有说低温长时间聚合对跑胶好的，也有认为让温度高一点快速聚合了对跑胶好的，我的对比是感觉差不多，如果急用，温度高点没有关系。按照我的体会，10％AP在－20度下半年后依然有效。
作者: 喜乐lele    时间: 2013-11-16 15:25

我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？
作者: 喵咪    时间: 2013-11-16 15:25

浓缩胶中的样品跑了一段时间后，临近两个上样孔之间会出现一丝的泄漏，可是是胶没有凝结好的原因。但是延长凝结时间不能解决这个问题，请问有什么好的办法吗？
作者: xue258    时间: 2013-11-16 15:25


我也是新手，做SDS的时候也犯了好多错误，刚开始的时候胶要好几个小时才凝，后来发现是AP失效了；还有经常出现漏胶的问题，后来发现是我封底的时候封的不好；前两天还犯了一个错误，最近天气热了，我用琼脂糖封的时候晾的时间短，在胶加入的最后一刻一下给漏了，嘿嘿；还好，没有出现正负极接反的情况，因为这一环节是师兄特意给我强调过
作者: XYZQ    时间: 2013-11-16 15:26


浓缩胶黏稠但不凝,是AP的问题?
作者: shanzhapia696    时间: 2013-11-16 15:26


我是新手，觉得这个主题不错，也来说几句，大家不要笑我。我现在最痛恨的是自己的毛手毛脚，前几天配染色液时把甲醇撒身上了，昨天配胶时不但没凝，插梳子时用力过猛居然喷出来到脸上了。搞的我郁闷的不行，估计象我这样的白痴错误没有几个人会犯，还是写出来，希望同样毛手毛脚的人引以为戒，可都是毒物啊
作者: 30moonriver    时间: 2013-11-16 15:27


大家共勉吧 我觉得做实验应该把要用的东西都事先想好，免得要的时候找不着甚至还要现配很郁闷的 个人今天犯的错误就是加一抗封膜的时候没封好，一抗居然露出来了，还好是tubulin的抗体，要不老板要郁闷死
作者: 大海啊故乡    时间: 2013-11-16 15:27

小肽可以用TRICIN-SDS-PAGE
区分正负极电泳缓冲液
作者: bamboo16    时间: 2013-11-16 15:28


剥胶时，为什麽切角?胶有正反面吗?PVDF膜有正反面吗?请求大虾指点.
作者: 3648755    时间: 2013-11-16 15:28


切角主要是让你自己能够知道你加样的顺序，避免自己都不知道什么是什么的。胶和PVDF膜都没有正反面，both OK。
作者: bring    时间: 2013-11-16 15:29


说实在的,我用的AP曾经在4摄氏度放置了两三个月还能正常使用!
作者: zsxan1990    时间: 2013-11-16 15:29

这些问题处在一个人身上真是够牛的，不过，我开始做的时候还真没有遇到这样的错误，我就是犯了一个低级的低级的错误，都不好意思说。这里有很多的经验之谈，开始做的时候就是在这里查了好多经验的整理，还是很有借鉴。
作者: zsxan1990    时间: 2013-11-16 15:31

请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com

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离心后，上清点样不会很浓，一般都比较好上样。但沉淀很粘，上样会比较困难，跑出来也不是太好看。不过有时候不能排除目的蛋白是否是包含体，所以沉淀也必须上样。
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 15:32


我刚做时胶老是不凝，后面分析与AP有极大关系，虽然是现配，但配好后一直放在外面，且没有塞子隔绝空气。另外我还发现冬天胶凝得较慢，所以配好后可以适当的加热，可以大大缩短凝胶的时间，但一定要把握好时间，感觉烧杯底部温热即可，否则还没有灌胶就已经凝了。阿
作者: flower-201    时间: 2013-11-16 15:32

其实我也犯过很多错误，比如有一次煮溶液的时候没检查，居然进了水，结果有好几个样跑出来都是空白，当时那个悔啊！
作者: 831226    时间: 2013-11-16 15:34


好像根据气温的不同要调整AP和TEMED的剂量，而且我个人认为低浓度的AP还是当时配比较好
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 15:42

前后Tris 的PH值搞错，胶一般不会出现不凝,除非试剂失效了,主要考虑APS和TEMED，其中APS放置过久最易导致失败。制胶时TEMED可根据季节温度的不同，酌情加多或减少，不至于天热时胶凝的过快天凉时长时间不凝。另外天热时，储液可放在4度，制胶时会延缓凝胶过快。把握一个温度高化学反应速度快，低温速度慢的原则。

经常电泳的，APS -20分装保存，每管装几百微升，可反复冻融至用完或感觉不爽的时候。偶尔做电泳的最好新配。
TEMED可分装几百微升到EP管，4度或室温，室温放时最好避光，找个棕色小瓶能放下EP管即可。
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 15:42

要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。

列举一些新人犯的错误：
配胶时加错试剂；
电泳时未通电或未及时通电；
先上样后加缓冲液；
正负极搞反；
缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；
样品煮完没离心；
电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；
电泳过程中漏液等
作者: 33号    时间: 2013-11-16 15:43

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。
？？
不会吧，我只要多加了一倍，胶就特别粘，连梳子都拔不出来，拔出来胶都变成了丝状，跑不了电泳的
作者: 分子式    时间: 2013-11-16 15:43

记得有一本《电泳技术》的书，里面对跑胶写的非常详细，有问题或者刚开始做还是先参考参考！
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 15:48


SDS一般可以常温保存半年不会失效，但AP最好低温保存，一般的保存时间是一周，TEMED很会受潮，放在四度冰箱一定要密封好，不然TEMED吸水后浓度变低，接着按常量加胶凝不了。
作者: duoduo    时间: 2013-11-16 15:48


我最近跑得胶总是带特别粗，电流也不是很大，是什么原因阿？
作者: 831226    时间: 2013-11-16 15:49


我的SDS-PAGE 用了半年却还能用。10%SDS溶液两年了目前号好着呢，他是结晶的用前热水浴溶解即可，常温保存。AP用一个月肯定没有问题。快过期的甲叉试剂会使胶凝固时，梳子的齿处长短不齐。
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2013-11-16 15:49


哪位老师同学能帮我跑个SDS－PAGE，这只是我实验的一小部分，觉得没必要购置整套设备与药品，就做一次实验，太浪费了哦
我在北京哦，谢谢
作者: bamboo16    时间: 2013-11-16 15:50

我们用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做过GFP，也列下错误：
1. 用错了running buffer,跑出来的带呈彩虹弧形，而且跑得非常慢
2. 第一次抗体浓度过高（1/500），跑出来的带看不出浓度差异，第二次一级抗体和耳机抗体的稀释比率分别是（1/1000和1/4000），效果比较理想。
3.目前正在进行中的是一次跑两批蛋白(两张胶），但是出来结果一张有一张白版，不知道是什么原因。。。
作者: toy    时间: 2013-11-16 15:50


10%SDS溶液的有效期为一月，常温保存。
作者: toy    时间: 2013-11-16 15:52


我也是刚进实验室，尽犯些不该犯得小却致命的错误，每次都懊恼得想撞墙，现得一结论，做实验一定到认真，每次都把protocol重写一边，做到哪划到哪，省得出错。
作者: 8s5g    时间: 2013-11-16 15:52


90－100KDA分子量的蛋白大约用多少浓度的胶啊？
作者: remenb    时间: 2013-11-16 15:53


我也要做小肽分子，77.5-12.5kd的，请问我的胶要多大浓度为佳。
谢谢指教
作者: qumm1985    时间: 2013-11-16 15:53


今天第一次灌胶 所用设备为BIO-RAD 为防止漏胶 先在下层小心铺一层速凝胶
（可在加TEMED之前取0。5ml分离胶液于另一小器皿中 然后加入10微升TEMED 然后灌速凝胶）静置3分钟后按常规方法灌分离胶 浓缩胶，结果未见漏胶情况发生。另外本人在流水冲洗下拔梳子 结果未见梳孔歪斜情况发生。第一次灌胶即比较成功。
作者: any333    时间: 2013-11-16 15:54

在做胶完成后放入4度冰箱过夜后，第二天胶与固定板接触的下缘会出现一小段空的和少量液体，像是没有固化好，为什么？
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 15:58

速凝胶封底时出现一现象 就是剥胶时发现凝胶底部出现胶皱褶现象 不知如何排除 望高手指教！
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 15:58

我的错误才搞笑，刚进实验室时做胶，
分离胶的配方和浓缩都弄成一样的了．
还和别人讨论错误在哪里？怎么总是在分离胶就有带
狂晕ing～～
作者: tuuu2    时间: 2013-11-16 15:58


一次有个师弟过来告诉我,他的SDS-PAGE上不了样
我有些奇怪,过去看究竟,果然,他把样品加入点样孔之后,样品不是沉到底部,而是象兰色烟雾一样从孔内飘起来,很快飘散干净
感觉是样品忽然变轻了,或者----电泳缓冲液变重了
后来发现原因是后者,原来他倒错了电泳缓冲液,把10倍的缓冲液倒进了电泳槽,换回来就行了
作者: PINK    时间: 2013-11-16 15:59

我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？

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胶凝固后体积会缩小。你可以加少许缓冲液后把槽倾斜，将气泡赶掉。
作者: PINK    时间: 2013-11-16 16:01


我所犯的错误也不少。
没加BUFFER就煮蛋白样品，结果全沉淀了，样品只能扔掉。
转膜忘了冰浴。不过，作出来的结果没有受到影响。
膜上面忘了标记号，做完了不知道是什么样品了。建议用铅笔在MARKER的位置标个记号。
胶冬天气温低时不容易凝固，可以将AP，TEMED加倍，放在37度里。
AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最长可能用了2个月没问题，SDS放在室温，1年了，好像没什么影响。
不要迷信进口抗体，进口抗体也会有时候做不出来。
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 16:01


我们也是加大AP浓度来加快凝胶速度的，不过有一次加大太多，凝得太快跑出来条带有点歪歪扭扭的，不好看，建议30min左右聚合就可以了，太快也不好。
另外我们图便宜，用了国产的槽。还不错，跟借来的Bio-rad差不多，不用封，也不漏胶，只是没有那个塑料剥胶板，便宜啊！这样已经不错了！
作者: fei1226com    时间: 2013-11-16 16:02

对了最近做试验出了点新问题，新买的mark跑的时候溴酚兰居然比我的样品溶解液中的溴酚兰跑的快，老mark同时跑就没有这样的问题，不知道怎么回事，请高人指点！
PS：新mark是预染mark，是不是跟这个有关啊？！
作者: 气泡    时间: 2013-11-16 16:03

我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。

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我就是这样干的，个人有点懒，就经常用这个方法
作者: 气泡    时间: 2013-11-16 16:03

前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：
1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。
2 AP用别人旧的，结果胶不干
3 A液，B液用旧的，不干。
结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。
4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝
5 电泳时长板接负极，反了
6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。
再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)

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我们也是biorad的不用封底， 对于APS个人觉得每个实验室应该形成一种规则，就是所有配置的溶液都写上日期和标签，并注明操作的人名，这样是一种负责的态度，除了问题很溶液找到来源，另外日期可以很明白判断是否过期，APS一般一个星期4度下， 浪费也是可耻的，不要把实验室的东西不挡自己的。另外配置母液的时候最好用超纯水，这样配置的缓冲液放一年都没有什么问题。
作者: koook5695    时间: 2013-11-16 16:04

要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。

列举一些新人犯的错误：
配胶时加错试剂；
电泳时未通电或未及时通电；
先上样后加缓冲液；
正负极搞反；
缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；
样品煮完没离心；
电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；
电泳过程中漏液等

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我弱弱的问一句
样品煮完离心的目的是什么？是不是怕盐分太高
除去盐分？
我做原核表达，样品是裂解的菌液，也有这个问题吗

我不怕你们笑话
我做SDSPAGE时犯的错误几乎可以让你们喷饭：
我上样前都没有煮变性！
作者: finger    时间: 2013-11-16 16:05

离心是为了去除不溶性颗粒，不然会影响电泳。
菌液电泳时，
我感觉更应离心的彻底一些以除去细胞碎片。
作者: koook5695    时间: 2013-11-16 16:05


哦
我煮之前和上样buf结合时已经用的是上清
作者: flower-201    时间: 2013-11-16 16:05


看完大家的讨论受益匪浅啊
我也说一下自己遇到的问题
1.胶凝时放入37度温箱，谁知温度比设置的高了一两度，胶凝后发现边缘不平整，所以后来我一直将温度调在34度，没出过问题，呵呵
2.配好分离胶后，液面用异丙醇封闭，用枪加异丙醇时太猛了，使胶边缘凝聚的不平整。所以以后加异丙醇时要轻轻的 。
作者: newway    时间: 2013-11-16 16:06


我用bio-rad的剥胶用的塑料板照样弄碎胶，大家说操作胶的时候，这么办，才不容易把胶弄碎？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:11


我原来跑DNA分子标记的，80ml的那种大胶板，除了TEMED和AP其它的都是混一起放在4度，后来我开始做SDS－PAGE，都是和跑DNA的大板子用一套TEMED和AP的，直接从4度冰箱捞出来的，大家说的AP，我们都是用50ml的大管子配一管子，放在4度慢慢使的，没有出过什么问题！没有必要搞到－20度，用前还要解冻多麻烦！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:12


还有做DNA大板子的心得，如果还是有朋友觉得很难从板子上剥下来可以买硅化剂涂玻璃板，很好使，0。5平米的板子都分得巨好的，蛋白质胶简直就是小case！：）
作者: pengke1983    时间: 2013-11-16 16:12


还有做DNA大板子的心得，如果还是有朋友觉得很难从板子上剥下来可以买硅化剂涂玻璃板，很好使，0。5平米的板子都分得巨好的，蛋白质胶简直就是小case！：）
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 16:14

缓冲液混浊，电泳图像波浪
作者: finger    时间: 2013-11-16 16:14


Bio-rad的电泳仪，Marker 带在分离胶的下半段才出现，而且模糊，蛋白带很清楚，哪位高手帮我分析一下原因。
作者: cocacola    时间: 2013-11-16 16:15


封底这个......到现在也没有想出来好办法。我们实验室用的Bio-Rad的，不用封，但是有的时候还是会漏。
AP一定要新鲜，最好每次用1.5mL EP管配，4度放置两周之内用完。
Tris，10%SDS我们都是放在室温的，可以放很长时间。其它几种成分都在4度。
等胶凝的时候，如果室温太低，尤其是冬天的时候，可以放在烘箱或者培养箱，不过要注意防止丙烯酰胺污染。浓缩胶这个时候尤其凝结的很快，不容易因为胶缩而产生坏道。
剥胶时，可以将胶连着板（一边）一起在染色液里面浸一下，然后用剥胶的板子（一定要湿的，可以先用染色液沾沾）沿着纵向的方向划两下（“口”型的胶版，上面为加样孔，底边在染色液里面浸泡一下，左右用剥胶的板子划一划），很容易就弄下来了。
切角倒不是必需的吧，在不同的位置加Marker就行了。第一块在第一道加Marker，第二块在第二道加Marker，以此类推。但是我曾经犯过很愚蠢的错误，第二块在最后一道加的Marker，结果染色之后，发现这两块胶完全是分不出来的......呵呵。
我犯的错误没有老兄你多哈哈，最常见的就是分离胶缩水（或者说漏胶）的问题，有的时候真是好心情被破坏干净了。
作者: cocacola    时间: 2013-11-16 16:16

Bio-rad的电泳仪，Marker 带在分离胶的下半段才出现，而且模糊，蛋白带很清楚，哪位高手帮我分析一下原因。

---
前两天作银染的时候和你一样的问题......试试新的Marker吧，可能Marker被污染或者降解了。
作者: rxcc33    时间: 2013-11-16 16:17


最近一段时间做的时候，跑的时候总是会出现电泳条带分为两层现象，不知道什么原因，就把所用的各种溶液重新配，可是还是一样分层。我都纳闷，以前没出现这样的情况的？
作者: wmp1234    时间: 2013-11-16 16:19

最近一段时间做的时候，跑的时候总是会出现电泳条带分为两层现象，不知道什么原因，就把所用的各种溶液重新配，可是还是一样分层。我都纳闷，以前没出现这样的情况的？

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我也有出现过，用silver staining,会有两层的感觉。。。不知道是什么原因？而且两层的迁移率又不同哦,好像一个蛋白都能跑出两条条带出来。。。
作者: dog002    时间: 2013-11-16 16:20


封底胶的作用是什么啊？是在分离胶上边加的那个东西么？还是在哪封底
作者: 6327555    时间: 2013-11-16 16:21



QUOTE:
原帖由 dog002 于 2013-11-16 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

封底胶的作用是什么啊？是在分离胶上边加的那个东西么？还是在哪封底

是为了防止在制胶的时候漏胶，在玻璃板的外底部热封的琼脂胶。

这主要是针对那些比较老型的电泳制胶设备。

现在的电泳一般不会有漏胶现象，有的话换一根底部的密封胶条就可以了。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:22

十四、蛋白电泳时20KD以下的条带跑不出来该怎么办?

请问:各位大侠: 蛋白电泳时20KD以下的条带跑不出来该怎么办?
作者: kuaizige    时间: 2013-11-16 16:43


1.可以适当的提高胶的浓度!
2.增加缓冲液的摩尔浓度，并且用三羟基甲基氨基甘氨酸代替甘氨酸作为终止离子!
作者: wsll    时间: 2013-11-16 16:43


提高你的分离胶的浓度应该就可以解决的
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 16:44

如果上述方法仍不可行，可以用tricine sds-page, 具体做法是：
一.液体配制
阳极缓冲液：200mMTris pH 8.9
阴极缓冲液：100mMTris /100mMTricine/0.1%SDS
以上两者可以配成10乘的储存液，临用时稀释。
胶缓冲液：3.0MTris，pH 8.45/0.3%SDS
stacking acrylamide:48%acrylamide/1.5%bis-acryulamide
separating acrylamide:46.5%acrylamide/1.5%bis-acryulamide
二.凝胶制作：
separating gel:
15% gel :2ml separating acrylamide
2ml 胶缓冲液
2ml 50%甘油
10% gel :1.22ml separating acrylamide
2ml 胶缓冲液
2ml 50%甘油
0.78ml ddH2O
催化剂:75ul 10%AP,7.5ul TEMED.
stacking gel:
0.25ml stacking acrylamide
0.75ml 胶缓冲液
2.0ml ddH2O
催化剂:20ul 10%AP,2ul TEMED
灌胶速度要快，分离胶和积层胶同时灌制，分离胶几分钟之内会凝固，积层胶稍慢。电泳阳极缓冲液的pH对电泳结果影响较大，建议用之前校正。恒流25-35mA电泳，电泳时间比较长，我是用恒流电泳过夜，染色及脱色方法同普通的SDS-PAGE。

参考文献：Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa. Anal. Biochem. 166, 368–379 Medline 1st Citation. ...
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:49

十五、分离胶的浓度问题

我在跑非变性电泳时，在接近溴酚蓝端有比较多条带，我希望这些带能比较接近胶的中部，请问我该如果调整，能不能反分离胶的浓度变大
作者: u234    时间: 2013-11-16 16:50

我想可以适当提高分离胶浓度，另外不必等溴酚蓝跑到胶的底部。
作者: 雪山飞鹿    时间: 2013-11-16 16:50

不让溴酚蓝跑到底部应该是比较难把握的
一是重复性方面的控制
另外，不跑下去即相当于分离胶长度比较短，是否会造成蛋白分离不充分

提高凝胶浓度可取！
作者: qqq111    时间: 2013-11-16 16:50

其实,你不一定要把那些带都处理到中间,只要能把目的条带和其他杂带分离开来就行, 可以根据目的蛋白的大小选择相应的分离胶浓度,如果分离效果还不好的话可用梯度胶试试!
作者: niangao1980    时间: 2013-11-16 16:50


你的目标蛋白分子量应该比较大吧

增加分离胶的胶浓度应该可以解决这个问题

我觉得一般目标蛋白处于胶的中间1/3范围之内比较好。
作者: flower-201    时间: 2013-11-16 16:51

我先是跑了均匀胶，带位于接近溴酚蓝的地方，请问，这说明我所要的目标蛋白分子量是偏大还是偏小，怎么根据带的位置选择分离胶
作者: 小鱼鱼    时间: 2013-11-16 16:54



QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2013-11-16 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我先是跑了均匀胶，带位于接近溴酚蓝的地方，请问，这说明我所要的目标蛋白分子量是偏大还是偏小，怎么根据带的位置选择分离胶

你的意思是目标条带接近电泳胶末端了？

那这样的话说明你的目标蛋白分子量较小，应该增加分离胶的胶浓度才可以是条带往上移。
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 16:54


对应该增加分离胶的浓度，凝胶浓度的选择是跟分子量相联系的，参考如下：36kd-205kd 5%;24kd-205kd 7.5% ;14kd-205 kd 10%; 14kd-66 kd 12.5%; 14kd-45 kd 15%(from amersham pharmacia biotech)
作者: 66+77    时间: 2013-11-16 16:55


原来胶浓度和分子量之间还有这么具体的对应关系哦，我前段时间跑一个MARKER（14KD）的一直没跑出来，后来就增加胶浓度到15%，结果还行，以后我就更知道用什么浓度胶了，谢谢！
作者: zhenxin    时间: 2013-11-16 16:55


你可以先做一个SDS来确定你的分离胶的浓度，再根据你做双向的图谱和你的目标蛋白来摸索你的分离胶的浓度，比如我近来做的一个样经过SDS和一次双向最终确定为11.5%较合适。
作者: 831226    时间: 2013-11-16 16:56


非变性胶跟SDS-PAGE不太一样，SDS-PAGE的电泳缓冲的PH一般是不变的，而非变性胶的话这个是要摸索的，楼上几篇回答都只考虑到了分离胶的浓度这个因素，其实PH对native PAGE来说也是很重要的条件。
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 16:56


我的经验是20KD一下的蛋白跑18－20％的分离胶，分离胶长度为3.5-4cm，溴酚兰跑到底部，WB出来的条带很直，也很匀。另外我用的电压是100-140v。原来用12－15％的胶的条代就不如现在：）
作者: dongdongqiang    时间: 2013-11-16 16:56

我想问问你们如果是3KD的蛋白用SDS-PAGE如何选择浓度还有如何才能跑出这么小的带来谢谢！
作者: plaa    时间: 2013-11-16 16:57

我想问问你们如果是3KD的蛋白用SDS-PAGE如何选择浓度还有如何才能跑出这么小的带来谢谢！

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这么小？
试试tricine－sds page吧！
作者: hustwb    时间: 2013-11-16 16:57


除了胶浓度外，应该考虑改变缓冲体系。
作者: lxh031    时间: 2013-11-16 16:57

我也来问一个问题，仅是对电泳电压的讨论。如果在一块胶上小分子（10kd-20kd）的蛋白分离不好，并且弥散，但是大分子的蛋白分离效果好，我通过改变电压能否改善分离效果？是不是电压高，大分子分离效果不好，小分子分离好？
作者: fox_79    时间: 2013-11-16 16:57


我做的2DE图片重影严重怎么回事，我用的是15%分离胶，分的是IEF standard
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:59

十六、蛋白电泳“阅片”——看看有什么问题

就下面的12个片子，你有何高见？
一张张评书最好！


图片附件: 81960241.snap.jpg (2013-11-16 16:59, 49.33 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20469

作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 16:59


这两的原因是？（补充）

大家先发表以下高见，过几天我讲我的看法写上，以便共同学习提高！

图片附件: 22110923.jpg (2013-11-16 16:59, 21.31 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20470

作者: 喜乐lele    时间: 2013-11-16 17:00

天哪，我看没有一张可以用的。
作者: any333    时间: 2013-11-16 17:00


图中所示的情况有些在实验中遇到过，有些是第一次看到。下面发表一下自己的拙见：首先，很多电泳图样品量过大，条带重叠在一起，无法区分。图1样品中的盐浓度可能太高；图11分子量较小的蛋白成一团而不是紧密的条带，应增大分离胶浓度或采用Tricine SDS-PAGE;图12蛋白在分离胶中移动缓慢，说明可溶性不好,应离心后取上清上样；第二章彩图所示电泳图谱可能是由于分离胶在凝结过程中有晃动，造成分离胶的上下层不均一。
作者: 6327555    时间: 2013-11-16 17:01


1,3,12,14:
PAGE不均匀。

5，6，13：
样品不纯，有不溶性物质或基因组DNA污染。

2，3，11：
上样量过大，或者盐浓度过高
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:01

天哪，我看没有一张可以用的。

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呵呵，一语道破天机，说出了大家的心理话。不过，跑成这样，肯定是有原因的。大家不妨继续再说说为什么会是这个样子，如何改进呢？
作者: yjf1026    时间: 2013-11-16 17:01


图1：图像模糊不清楚，而且没有出现完整的条带，很有可能是：1）样品盐浓度过高，2）电极缓冲液ph发生了变化，3)电泳时间过长，蛋白质在泳动发生了扩散

图2，3，4，11：上样量过高，再上样的过程中，孔中的样品向周围孔道中弥散，从而成团状。

图5，6：样品未处理好，有拖尾的现象。

图7，8，9：上样量不足

图10：有比较明显的条带出现，但是电泳的时间不够长。

图12，13：样品根本就没有跑出浓缩胶，问题应该出现在浓缩胶里面

图14：样品向中间聚集，有可能：1）样品盐浓度过高，2）分离胶不均匀

所跑得电泳中，大部分上样量过高，而且蛋白都成团状，而不是像图14那样呈月牙状，这说明：1）蛋白浓度过高，2）loading buffer出了问题，可能是DTT挥发了，蛋白质没有完全与SDS结合。
作者: 羊咩咩    时间: 2013-11-16 17:02


大多数样品上样量都过高。
图4、5、6、7、8、9分离胶浓度过低，且呈递减现象，很明显蛋白已聚集在颜料前沿，图9已出胶；另外图6分离胶也聚合不好，胶面呈锯齿状。
图11除上样量过高外，分离胶浓度可能过高，条带没有分开。
样品处理、胶的聚合（天冷、SDS析出）可能也有问题。
作者: junhun    时间: 2013-11-16 17:02


我觉得啊是配胶时没有配好啊。看1.2.3张就很明显，分离胶应该是AP失效了，要不就是太稀了。建议加大浓度浓度尝试
其余可能是上样量过大，而且没有平衡好，所以出现偏离。
作者: yueban-1147    时间: 2013-11-16 17:02


一、综合判断：
1. 胶的配制及聚合应该没有太大问题，配胶时的主要问题是浓缩胶的高度不一、梳孔不够整齐、浓缩胶与分离胶接合部不平整等，这些都影响分离效果。
2. 上样量及样品处理：样品过浓及溶解性不好影响电泳效果。
二、具体分析：
1. 图1、2、3、11、12：主要是上样量过大，分离胶顶部不平。
2.图4、5、6：效果不错，marker带分离得很好能说明问题。部分泳道效果不好与上样量过大（图4）、分离胶顶部不整齐呈不规则锯齿状（图5、图6）有关。
3. 图7、8、9：上样量偏低，图7、8分离胶顶部与图5、6有些相似，部分泳道样品可能不够新鲜或可能处理不好。
4. 图10：上样量较合适，分离得还不错，可惜分离胶太短。
5. 图13：样品处理不好，可能是非还还原SDS-PAGE（上样Buffer中未加还原剂）。
6. 图14：梳孔不平整或样品中含盐过高。
作者: douding66    时间: 2013-11-16 17:03

点样点的也不好
作者: u234    时间: 2013-11-16 17:04


1. 图2、3、4、11、：上样量过大。
2.图5、7、8、9：上样量不足
3. 图1、3、12、13、14：配的胶不均匀，浓度也不对，蛋白没有跑出浓缩胶。
4. 图10：看起来跑的最好的一个，但电泳时间过短。
5.图6、11：样品未处理好，可能盐浓度过高。
作者: flower-201    时间: 2013-11-16 17:05


呵呵，摸条件要慢慢来，不要同时变动很多因素，不然就根本不知道是哪个地方出了问题啦。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:24

看来大家基本都说全了。我就结合我 的想法稍微的总结一下，以便大家进一步的讨论学习。

Example 1
“Smearing”， 导致拖尾效应有很多的原因，最终要的是丙烯酰胺灌制的不够均匀和样品量过大！这是当时学生制胶时底下已经凝固，然后再重新补上一部分的浓缩胶和分离胶所致！当然重叠在一起，无法区分也是难免了。

Example 2
样品量过大而出现了样品“交叉”污染，正常的当载样在20 to 40 micrograms/well 将会很漂亮。

Example 3
样品量过大，当然胶灌制的也不够均匀。由于过量的样品影响了个别泳道的电场，使的有些条带宽，有的窄些。

Example 4
“Smearing”（注意泳道4），这可能和样品中的含有大量脂类的膜相关蛋白引起的：由于不连续的胶中，样品被浓缩的很厉害。所有样的迁移速率在样品过积层胶后都会慢下来，当到达分离胶时，PH的改变使得聚集的膜相关蛋白有沉降的倾向，但另一个方面，电泳过程又不断的溶解这些蛋白，因此便出现了泳道4中连续的黑色托尾，通过WESTERN验证后，这些都是一个组分造成的！

Example 5
这张还不是太糟糕。泳道4还加上飞纹，原因是样品未能处理好，上样量控制的也不够好，另外跑的过程可能电压过大；另外这张胶当时做的时候，分离胶凝固的并不是很好，蛋白穿过胶孔时，浓度并不均一，因此形成了飞纹而不是一片黑色托尾。由于样品跑的比较直且齐整，因此电场还是比较均匀的。泳道5中的蛋白没有很好的溶解。

Example 6
简直一塌糊涂！首先做好分离胶时，没有封闭。另外，样品很快的沉降到不平整的脚面上，随着电泳的进行，样品不断的融解，以至形成托尾而不是一条条清洗的条带。
另外，这个样品可能含有杂质比较多（不溶性杂质或基因组DNA），可见上样前的充分离心也是必要的!

Example 7
条带太淡。背景脏且不够均匀，说明电泳缓冲液有污染（杂质在电泳过程中不断的进入胶中），或者板子没有洗干净。在溴芬兰线的后面还有连续的细线，说明上样不够小心，致使样品飞了出孔，同时也污染了其他的相临样品。

Example 8
完全是染液重复利用惹的祸，对于这张（只有下面着色），只要重新再染，效果还是可以的。

Example 9
这是一张银染的结果。本来一切都小心奕奕的，结果把胶放到去离子水中回家了，过了一夜，第二天染色结果变成这个样子了，呵呵~~
原因：固定在胶中的蛋白都溶到水里了。

Example 10
电泳停的太早。如果能继续再跑，效果就好了，当然，缓冲液必须有足够的缓冲能力，否则会引起扩散。

Example 11
这张图大家最主要的看看是胶孔作的不够齐整（我用箭头标出了）。另外，可能由于选用旧的上样缓冲液，致使2-mercaptoethanol 挥发，电泳的样品没有完全处于变性状态下，这使得跑出的结果难以很好预测。

Example 12
胶的浓度过大（不是自己的，浪费也不心疼），只有少量的小分子蛋白能入胶；由于胶的浓度过大，聚合不够均匀，载样过大，出现上面的情况自然是必然的了！

补充Example 13
可能由于选用旧的上样缓冲液，还原试剂已经挥发，另外缓冲液中SDS的量也应该稍微的补加（可能有析出），样品根本无法进入胶中。只有让分离的蛋白入胶，才能进行良好的分离。

补充Example 14
要么样品盐浓度过高，要么分离胶不均匀。因此应该把部分样品中的盐透洗除去，或者一直采用较小的电流来跑，可能效果会稍微的好一点点。当然，根本的还是应该去盐份（如果重复结果一致的话）。

附一张后来做的好图。

图片附件: 20252765.jpg (2013-11-16 17:24, 15.66 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20471

作者: ALALA    时间: 2013-11-16 17:24


请问最后的这两张图是用什么染的？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:25

十七、请教~电泳图谱分析

本人刚开始SDS——PAGE，对跑出的结果不会分析。在此请教各位，以下跑出的结果可能是什么原因所致：


图片附件: 52375571.snap.jpg (2013-11-16 17:25, 22.88 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20472

作者: lxh031    时间: 2013-11-16 17:26


哪道是 marker 啊？好象有点漂了，上样是否上好了，是不是样品没有沉到孔里啊？左数第三道上样多了。
作者: star#room    时间: 2013-11-16 17:26

上样量不是很合适，另外上样前一定要充分离心，否则就会出现第三道和第七道的样子。
作者: ha111    时间: 2013-11-16 17:26


我刚好做过一个样品和你的一样，你跑的是血清吗？或者你的样品很杂。你第3和底7道出现的情况可能是，1 浓缩胶太少 2 组分里各蛋白的含量差异很大 3 你要确定你要分析的蛋白的分子量多大？浓度多大？ 和干扰成分的差异有多大？如果浓度低、分子量和其他的蛋白差异大的话，可用MILIPORE的滤头分离你所要的蛋白去掉一些干扰组分 4 上样前一定要充分离心 5 减少上样量的话会不会使你的目标蛋白看不到
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:27


跑的是提取的细菌外膜蛋白，上样前煮过，也离心过。
但在加样时发现样品沉到孔里速度很慢。

关于加样量的问题想请教各位：蛋白含量为600~800ug/ml，每孔加样（*5上样缓冲液）15ul，即每孔加样量为90~120ug。这样的量多吗？
作者: cwcwcww    时间: 2013-11-16 17:27


你的样品是溶解在什么溶液里的？如你所说样品是膜蛋白，那么样品中可能还含有其他的去垢剂，这对SDS与蛋白的结合可能会有影响，此外其他的成分也可能对电泳行为有影响。我对膜蛋白没什么经验，你可以多找些有关的文献看看，或许有其他的专用loading buffer。
作者: yonger    时间: 2013-11-16 17:27


样品中可能含有较多的盐，一般如果盐含量过高的话，电泳条带会比较宽，有时有会成微笑状！
作者: 8princess8    时间: 2013-11-16 17:28


我做蛋白质SDS-PAGE 时，最后凝胶脱色底色很重，请教一下染色液和脱色液的配方及时间。我是用考马斯亮蓝R-250染色。
作者: taoshengyijiu    时间: 2013-11-16 17:29


请楼主给出电泳的条件和样品的抽提方法(您应该记录在案了吧?)
感觉可能有盐离子的干扰
另外还有比较重要的一点就是SDS的质量一定要保证
上样缓冲液和凝胶中的SDS以及电泳缓冲液中的SDS最好采用同一个品牌和同一个批号的,这样更放心一些.
建议查阅郭尧君教授的蛋白质电泳技术一书,上面有不错的trouble shooting
作者: qhyu    时间: 2013-11-16 17:29

本人刚开始SDS——PAGE，对跑出的结果不会分析。在此请教各位，以下跑出的结果可能是什么原因所致：

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1 很明显的可能是你的样品没有处理好，太粘稠了。
2 分析结果必须先看marker，你应该按照marker的指示来确定你
逆的目的条带。
3 也有可能是逆的加样孔没处理好，有碎凝胶在孔中，影响电泳的效果
4 可能你的上扬液体的PH太偏离电泳液的PH。
作者: redbutterfly    时间: 2013-11-16 17:29

上样品溶液可能太轻，加点甘油，提高溶液密度，上样轻柔，压好原点。
作者: Ao7    时间: 2013-11-16 17:30

我也遇过与楼主相似的情况，要么跑出的条带很宽，很亮，有的向第3和第7泳道一样，要么没有条带，从头到尾一条竖直的带，我觉得青石兄说的有道理，可能是样品没处理好，太粘稠了。我的样品就是这样，很粘稠，加样非常困难，勉强抽到枪头里加样的时候又飘起来了，甚至溢到外面，可是我也离心了，而且至少是12000rpm，30分钟，又增加extraction buffer 的用量，作了好多次，可还是效果不好！没有什么改善，郁闷！
真想把我的结果也传上去，可是。。。
作者: H2O    时间: 2013-11-16 17:30

染色：450甲醇，450水，100乙酸+2.5g考马
脱色：450甲醇，450水，100乙酸
作者: 小糖块    时间: 2013-11-16 17:30

,还请楼主速速把样品抽提方法和电泳条件贴出来以便判断.
作者: zsxan1990    时间: 2013-11-16 17:31

上样量不是很合适，另外上样前一定要充分离心，否则就会出现第三道和第七道的样子。

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麻烦问一下，上样前离心有什么作用呢？
因为最近才开始做实验，可能是个很基础的问题，还是希望高手能指导一下··
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:32

十八、DS-PAGE染色后出现的这两条带是什么....

电泳时溴酚蓝前一点出现一条红线, 染色后就是下方的那条带形....

还有, 溴酚蓝的地方出染出一条带,就是上面的那条带.....这是怎么回事啊...

样品缓冲液：50mM Tris•Cl 100mM DTT 2%SDS 0.1% 溴酚蓝 10%甘油

样品和样品缓冲液等体积混合后,煮沸3分钟,然后上样的.....

图片附件: 41520676.jpg (2013-11-16 17:32, 17.35 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20473

作者: u234    时间: 2013-11-16 17:33


老兄是否做的是细胞样品，如果是，电泳时溴酚蓝前一点出现一条红线可能就是酚红，至于溴酚蓝的地方出染出一条带，可能是样品缓冲液污染所致！
此结果可否重复一次？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:33


重得过了,还是有这两条线....
作者: H2O    时间: 2013-11-16 17:33

想先确认一下，最边上的那个是marker吧，如果是的话溴酚蓝的位置上的那条带就应该不是污染。因为marker对着的地方也有。看这个颜色像是银染的吧，银染是不是也能把溴酚蓝给染了我不知道，搂主可以去查查，如果是的话就对了。还有我觉得不管怎么样这个对实验结果没什么影响吧，当它没有就是了。
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 17:34



QUOTE:
原帖由 H2O 于 2013-11-16 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想先确认一下，最边上的那个是marker吧，如果是的话溴酚蓝的位置上的那条带就应该不是污染。因为marker对着的地方也有。看这个颜色像是银染的吧，银染是不是也能把溴酚蓝给染了我不知道，搂主可以去查查，如果是的话就对了。还 ...

银染确实可以把溴酚蓝给染出来，因为银离子也可以附着在溴酚蓝上并还原为银在下也认为对实验结果无影响，最下面一条带可能是酚红
作者: qianqin1977    时间: 2013-11-16 17:34


银染为什么没有在样品孔下面看到蛋白条带啊？没做过银染的人求解
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:35

十九、为什么是这样的带形？

最近我诱导表达一种蛋白，44KD 跑SDS-PAGE电泳。但是跑出的结果是分离胶的上端带形还可以，可是在分离胶的下端就没有带形 。同学说这是因为电泳缓冲液离子强度问题，可是我是按照书上的电极缓冲液配置的：
Tris碱12.2克，甘氨酸 57.65克 加去离子蒸馏水至1000ml
电泳缓冲液 电极缓冲液200ml 10 %的SDS 8ml 加水至800ml
请问那位大虾能给我建议，不甚感激。
作者: nn255    时间: 2013-11-16 17:35


10*电泳缓冲液(PH8.3)：Tris碱3.02克，甘氨酸 1808克，10 %的SDS 10ml加ddH2O溶解致100ml，电泳时稀释成1*电泳缓冲液，一般每次稀释后的电泳缓冲液最多使用四次。
分离胶的下端就没有带形 是不是Tris的问题，尤其是PH要准，重新配吧，建议你把图传上分析分析。
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 17:36



QUOTE:
原帖由 nn255 于 2013-11-16 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

10*电泳缓冲液(PH8.3)：Tris碱3.02克，甘氨酸 1808克，10 %的SDS 10ml加ddH2O溶解致100ml，电泳时稀释成1*电泳缓冲液，一般每次稀释后的电泳缓冲液最多使用四次。
分离胶的下端就没有带形 是不是Tris的问题，尤其是PH要准，重新配 ...

甘氨酸的量好大呀,这是什么配方?
作者: tie8    时间: 2013-11-16 17:36


我用的电泳缓冲液

10*

30.3g TRIS BASE

144.0g GLYCINE

10.0g SDS

HCL调 pH 8.3

定容至1L

使用时蒸馏水稀释成1*
作者: 小螺号    时间: 2013-11-16 17:36

电泳缓冲液不用调pH的，分子克隆上也没说要调。
可见以下文章：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/471425')
作者: 30moonriver    时间: 2013-11-16 17:37


我建议你重新配1.5M Tris，有可能是因为没有用pH计调有关。
作者: popo520    时间: 2013-11-16 17:37


我认为又可能是两方面的原因:
1.上样量太大,蛋白量太多.
2. loading buffer和SDS溶液中,SDS含量是否足够, 建议重配
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:38

二十、请问怎么解释我的SDS-PAGE电泳图谱?

我将逐步提纯的酶液做SDS-PAGE电泳,结果出现了一些费解的现象.我用的是考马斯亮兰染色.首先是MARKER条带,出现三条,用DALTON MARK VI ,SDS-6理论上是该出现一条带的,对吗?最费解的是我直接上2X SDS buffer,(我想是不是没有用去离子水配制buffer的原因呢)什么样都没加,结果还出现三条带了,而且buffer还是现配的.而后,到酶纯化得更好的时候,跑的条带却没出现相同的三条带了.而且,已经做过好几次都是这样的.还有就是跑出来的胶的下缘总是弯曲的,一点不平.我用的电泳缓冲液也都是按照书上说的配的.有时还出现电泳条带是弯曲的现象.老师说可能是在装胶电泳的时候下边有气泡是电压不均造成的.请各位给点提示.实验没做几次,结果遇到这么多问题,我都没有信心了.希望大家赐教,谢谢!
作者: orangecake    时间: 2013-11-16 17:39


marker出现多条带的情况，可能有降解的可能，建议你将marker分装，未加样品的道有蛋白条带的出现，可能是加样量太多，溢出到旁道，建议你减少加样量，再则，loading buffer最好也分装，尽量减少污染的可能性。电泳条带弯曲，很有可能是样品中盐浓度偏高。
作者: eric930    时间: 2013-11-16 17:39


我的也遇到类似问题，你用的什么marker，marker理论上应该6条或更多，不可能只有一条吧。关于loading buffer 为何有带，我觉得可能是加样时飘过去的，或是重复吸取buffer时，不小心引入的样品的蛋白，偶还没遇到这种情况
作者: remenb    时间: 2013-11-16 17:40


AP是否新配？电泳槽漏不？loading buf 银染时也会出现浅带，但考染应不会。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:40


对不起,我说错了,以前用的marker是一条带,现在用的是六条的.各位给的原因我都考虑了,今天有做了,开始检测可能的原因,比如是buffer被污染了,电泳液污染了,水有问题,或者SDS有问题.现在可以排除是溢出的可能,至于电泳条带弯曲,我想也可能是盐浓度太高,还有就是胶的底缘弯曲很可能是没有将气泡排除.等实验结果出来了,我会告诉大家的.
作者: hulu呼噜    时间: 2013-11-16 17:40


或者，电泳带向下弯曲，也有可能是凝胶温度过高的原因，或是玻璃板没有清洁干净，再找找着两方面的原因。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:41

通过做实验验证了是电泳缓冲液的原因导致电泳中出现了杂带,我主要是通过设立空白的BUFFER电泳,以及可能的水源污染做对照,发现电泳缓冲液还真不是个可以马虎的问题,都怪自己没有新配,用的以前配好的,经过这几次我开始自己配制所有试剂,至于胶弯曲的现象,在我排空了气泡还出现就十分的不解了,我想下次一定注意玻板是否洗干净,至于产热的影响可能不大,我电泳的电压比较低的,积层胶80伏,分离胶120伏.
作者: 8s5g    时间: 2013-11-16 17:41

胶弯曲可能是，一胶浓度不均匀 二是电泳过程可能散热不均匀导致泳动速度不一致，还有是不是电流不均匀（可能性比较小？），不过你说的电泳缓冲液倒提醒了我
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 17:46

二十一、蛋白拖尾

各位仁友：大家帮帮忙，我的图像在靠近pH4端横纹纵纹特别多，点与点分不开，究竟是怎么回事呢？用什么方法可以减少呢？以前好像比这个要少，大家请帮我 出出主意了。谢谢，急！！

图片附件: 69153087.snap.jpg (2013-11-16 17:46, 49.14 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20474

作者: zzzz    时间: 2013-11-16 17:46

这种原因绝对是由于上样量太大所导致，如果你的样品处理得很好，即盐浓度不高的话。减少上样量，同时聚焦时间延长，问题应该解决。
作者: H2O    时间: 2013-11-16 17:47

可能原因：IEF之前样品没有很好的在水化液里溶解；非蛋白质成分（如盐类，脂类，）过多，干扰IEF；离子型表面活性剂(如SDS)的影响。2：聚焦时间不够。

解决方法：解决办法：用更强的水化液溶解蛋白质，并且上样之前高速离心(12000 rpm)后取上清上样；蛋白质样品上样时的浓度不应该超过10mmol/L（可以使用稀释，透析或者丙酮沉淀的方法）；延长聚焦时间。
作者: am10    时间: 2013-11-16 17:47


那离心的时间为多少呢？上样的浓度不超过10mmol/L又是怎么算的呢
作者: ququer787    时间: 2013-11-16 17:47


胶条的PH范围是多大啊？感觉是样品没有处理好，上样量也有点大了
作者: mickeylin    时间: 2013-11-16 17:48


不知楼上战友这张胶的上样量和以前的是不是一样的,从图中看上样量是大了.如果IEF的时间不变,就会导致蛋白没有完全聚焦产生横纹.
如果是因为蛋白浓度过高上样时所需体积太小导致在加上过程中误差太大,上样量时高时低,可以用裂解液适当的稀释样品.蛋白样品浓度在10ug/ul左右好象比较好一点.
作者: wawa    时间: 2013-11-16 17:48

18cm的胶条上样量不宜超过200ug(pH3~10),若ｐＨ４～７上样量可增至３００～５００ｕｇ．
作者: sunbent    时间: 2013-11-16 17:49


我11cm gel加了10微克样品，效果非常好。Protocol上都说要加100微克以上，我说也不一定。silver staining 那么sensitive, 样品一旦加多，出问题的可能性就更大。大家第一次跑gel的时候，还是少加点的好。以后再根据自己的实验要求多加，或者怎样的。否则第一次自信就是大减呀。

乱说的，别笑哇。
作者: zsxan1990    时间: 2013-11-16 17:49

这个问题其实就是小分子离子(阴离子)的影响,主要是核酸片段.可以用TCA沉淀的办法祛除.
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 19:57

二十二、请教2D上的纵纹原因

请教银染2D上的纵纹原因有哪些呢？

1。SDS-PAGE 的条件是什么，是不是不能跑得太快？温度是20度室温可以吗？

2。第二步平衡碘乙酰胺 是不是一定要250mg/ 10 ml平衡液？

还有其他什么影响因素吗？ 谢谢！
作者: yapuyapu    时间: 2013-11-16 20:00


纵条纹有很多种，引起原因也不同，例如背景上微细的纵条纹可能是由于水中的杂质引起，或容器不干净；与点相连的纵条纹可能是由于蛋白质聚集或未被彻底还原，也可由上样量过大引起，平衡不充分及SDS失效也可以引起；从第一项向第二项转移不好也会引起；另外也和样品制备有关。总之需要你慢慢分析了。小弟也很菜的，刚开始做，前些天还发了一个图上来请教大家，你可以去看看，也许对你有帮助。
其实没有那么精确的，我就不相信加240mg结果就会很差，呵呵。
第二向开始最好要慢点，使蛋白质能够充分转移下来，不过随后染色你要是连胶条一起染的话，还是可以看到上面有聚焦好的蛋白质没有转下来。
作者: NBA    时间: 2013-11-16 20:01


感谢楼上的回答,非常全面.偶补充一点点:1,根据自己的实验经验,如果蛋白质上样量过大的话,应该首先在第一向电泳中体现为粗大的横条纹(多在两侧,感觉蛋白质没有分开似的),不知smartchow老兄的图究竟怎样,不如贴出来大家研讨一下?2,smartchow老兄的用意是不是问Iodoacetamide的量不足引起的多余的DTT产生纵条纹(一般为独立于蛋白质之外的细小条纹,会的,但是如难得清醒兄所说,少一点应该问题不是很大,不过最好还是按标准加,少了不足以烷基化全部的DTT,多了可能影响染色的背景.
一家之言,仅供参考.也不知难得清醒兄上次的电泳有无改善,到底是什么原因所致,不如出来说明一下?
作者: NBA    时间: 2013-11-16 20:01



QUOTE:
原帖由 fqswdzd 于 2013-11-16 19:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
二十二、请教2D上的纵纹原因

请教银染2D上的纵纹原因有哪些呢？

1。SDS-PAGE 的条件是什么，是不是不能跑得太快？温度是20度室温可以吗？

2。第二步平衡碘乙酰胺 是不是一定要250mg/ 10 ml平衡液？

还有其他什么影响因素吗 ...

您用的恒流,恒功率还是恒压模式?
温度我们一般8-10度,室温的话不知玻璃板散热怎么样?
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:02

，现在比以前好多了，我感觉是SDS的问题，以前用的都是师兄的，时间很长了，后来所有的试剂我都重新订购。当初为了省事，结果浪费了宝贵的时间，真是血的教训。建议大家一定要用自己的东西，放心。
amersham推荐恒功率，BIO-RAD都是推荐恒流。我对这方面了解不是很多，但我的一位师兄推荐恒功率，他认为恒功率是电泳的条件比较稳定，产热变化也不大；我是用恒流，这时候会看到电压和功率都会逐渐升高，产热相应也会增加吧。
作者: NBA    时间: 2013-11-16 20:02

当时小弟是用了水货ＳＤＳ造成了纵条纹（在此以前尚不知条纹为何物，不好意思），您还别说，虽然都是进口分装，上海生工的就是不错。我当时为了偷懒，生工的用完之后换了鼎国和博彩的，条纹出现了，当时心里想，应该不应再归咎于ＳＤＳ吧，都换了两家公司的产品了，而且偶师兄使用偶的“问题ＳＤＳ”做ＷＢ一切正常，当时一怒之下把丙烯酰氨和ＴＲＩＳ全部换成了ＡＭＥＲＳＨＡＭ原装，结果条纹还在，特别是当时是正式实验啊，浪费了我１２根２４ＣＭ胶条，后来脑子灵光一闪觉得还是ＳＤＳ是罪魁祸首，重新换回生工的，一切ＯＫ！由此可见，２－Ｄ电泳对于试剂的要求远超过ＷＢ。
当时我看了您的图，第一反应是ＳＤＳ，其次是tris-hcl,记得当时给您的可能原因排首位的也是ＳＤＳ吧，如果上样量过大，第一向的横条纹（很粗的）是很明显的。小弟记得您当时贴出来的图中横条纹不明显。
至于电泳条件，小弟先用ＢＩＯ－ＲＡＤ的protein 2时用恒流（甚至不用先１５ＭＡ／ＧＥＬ直接２５ＭＡ／ＧＥＬ跑到底也跑得很好），现在鸟枪换炮（换成ettan dalt six)，习惯用恒功率了，感觉尤其是跑过夜（时间比较长），恒功率比较好，就是如您所说，电泳的条件比较稳定，产热变化也不大。怎么样，入乡随俗吧，毕竟各公司首先要优化自己产品的电泳条件。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:03


谢谢各位，我用的是BIO-RAD 的PROTEIN 2 恒流 40mA/gel , 由于电泳缓冲液用的是用过一次的， 一共跑了7个半小时， 还有我的IAA按要求要加1g的，我的不够了，就只加了0。6 g， 我再安要求做一次了，谢谢各位的建议了！
作者: tianmei001    时间: 2013-11-16 20:04


手中有一个BIO-RAD的工作手册，关于这部分翻译如下（有一些可能不太准确，请战友指点）：
2．2 纵向条纹 纵向杂纹表明SDS电泳过程的问题，同样可以由很多因素引起，如蛋白在其等电点附近的溶解度降低，杂质污染，复位剂不合适，或者第一向的胶条放置不当。这些问题可以和其他SDS电泳一样进行分析。举个例子，如果蛋白标准没有出现条纹那么说明问题存在于第一向的胶条中，而不是第二向的电泳有问题。
(1)  背景中的纵向条纹 这些大部分是水中的杂质或粒子。纯水剂或者容器应当进行检查。所有配胶的溶液应当在0.45um的纤维素膜中过滤并储存于洁净的容器中。
(2)  与斑点相连的条纹 条纹可以在蛋白点之上或之下。如果蛋白点呈条纹状，那么说明蛋白质形成了聚合体。等电点将很难测定。一些条纹是由不完全复位或者烷基化所造成的。有时，加大复位剂的剂量或者换用TBP可能会有效。少数情况下，增加平衡液SDS浓度或者增加平衡时间可以解决问题。蛋白上样过量也会造成纵向的条纹。
(3)  成对的纵向条纹纵贯全部胶条 这是样品溶液中含有硫脲造成的。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:05

二十三、一个 PAGE 的老问题

我走PAGE时一直遇到一个问题，50微克蛋白（蛋白提取按分子克隆）上样前不煮沸时，走胶较漂亮。上样前煮沸3分钟时走胶就会泄漏，感觉煮沸3分钟后插冰会出现不溶性物质，致使走胶时蛋白向左右、前后挤压而出现泄漏。蛋白提取时应该没问题，超声也足够，问题不知何在？请各位分析一二！
谢谢！
作者: zhihui小新    时间: 2013-11-16 20:07

看来并不是WB的问题，还是PAGE。不知你有没有试过减小上样量。
作者: newway    时间: 2013-11-16 20:07


loading buffer 中SDS量够吗？还有样品里有没有膜蛋白或分子量非常大的蛋白质？你做的比较是同一样品不同处理方法吗？实在不行，煮沸后再离心一下。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:08     标题: 回复 #357 newway 的帖子

我做的比较是同一样品不同处理方法（不煮沸上样-煮沸上样），50微克蛋白应该不算过量，loading buffer 中SDS量也够，只不过我提的蛋白是质粒转染过的细胞。同事提别的蛋白150微克走胶也很漂亮。“煮沸后离心一下再上样”也许是个办法，只是问题的原因难以解释？
作者: zhihui小新    时间: 2013-11-16 20:09


质粒转染的细胞没有问题的。全细胞裂解液吗？可能还是裂的问题。
作者: yysr238    时间: 2013-11-16 20:10

增加破碎的时间，另外可以对菌体稀释一下，稍微减少上样量，可以煮沸的时间长一点，五分钟左右，样品煮完后离心，注意loading buffer的保存，有可能是loading buffer的问题。煮沸后的不溶物，是破碎后的细胞碎片，或者完整的细胞，及其核酸类物质，看样子你跑的是总菌体的电泳，对吧。
作者: greenbee    时间: 2013-11-16 20:11

我想做细菌总蛋白的SDS-PAGE，样品应该如何处理呢，直接加2*上样buffer就行吗，样品还需要其它的处理吗，加热煮沸得到的是细菌的哪些蛋白，与超声后得到的蛋白一致吗？
作者: yysr238    时间: 2013-11-16 20:11

样品浓度如果比较溶，就用样品溶液和等体积的loading buffer混合上样，如果样品比较稀，你可以直接加loading buffer上样。

加热得到的是菌体的总蛋白，而超声后，总蛋白分为可溶上清和沉淀包含体
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:12

二十四、有关溶液的配制问题

电泳一直跑不好,所以想重新配置试剂.请问大家:
1 Tris-HCL:分子克隆上说等室温才能调定PH,是不是23-25度都可以啊.但是PH不是要求很精确吗?
2 配电泳缓冲液的时候是先调PH后加SDS, 还是先加SDS再调PH?另外,调定PH的时候是不是也要等溶液回到室温?
谢谢!
问题比较菜,但是还请大家帮忙!
作者: dreaming    时间: 2013-11-16 20:13


Tris-Cl在上下层胶中的pH和浓度均不相同，我们实验室常用母液：上层胶0.5M pH6.8;下层胶1.5M pH8.8。在配制时，标准液（pH4.0;pH6.86;pH9.18）应该恢复到室温后在调pH计，不过现在的pH计有温度差异调节的功能，应该不会有很大的误差。但是该缓冲液随温度升高，pH也略有升高，因此，在调pH时，缓加HCl，室温混匀一段时间后，再定PH最好。我觉得pH要求应该严格，配制时应严格操作。
我使用的电泳缓冲液未调过pH，Tris-Glycine应该是偏碱的，所用SDS为配好的酸化的10%SDS,使用效果不错。仅供参考！！
作者: veiwu    时间: 2013-11-16 20:14


我用的电泳缓冲液，都没调PH值按分子克隆上的配方即可，SDS用粉剂和Tris一起溶解即可，我配成5*的溶液，使用时稀释5倍。电泳到底跑得怎么不好？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:15



QUOTE:
原帖由 dreaming 于 2013-11-16 20:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Tris-Cl在上下层胶中的pH和浓度均不相同，我们实验室常用母液：上层胶0.5M pH6.8;下层胶1.5M pH8.8。在配制时，标准液（pH4.0;pH6.86;pH9.18）应该恢复到室温后在调pH计，不过现在的pH计有温度差异调节的功能，应该不会有很大的误 ...

我觉得加了盐酸后温度上升的很高，我们的ph计有温度电极的。我可以把溶液放在冰上降温吗？是不是降到23-25度就可以了？我总觉得室温这个概念太含糊了，23度和25度的ph能差好多吧。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:16



QUOTE:
原帖由 veiwu 于 2013-11-16 20:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的电泳缓冲液，都没调PH值按分子克隆上的配方即可，SDS用粉剂和Tris一起溶解即可，我配成5*的溶液，使用时稀释5倍。电泳到底跑得怎么不好？

直接把SDS和Tris放在一块好溶吗？我从来都没有这么试过呢。
我的电泳溴芬兰总是压得不够细，而且条带也比较得宽，看起来像是放了一段时间弥散了一样。该怎么办呢？
作者: gmjghh    时间: 2013-11-16 20:16

我觉得加了盐酸后温度上升的很高，我们的ph计有温度电极的。我可以把溶液放在冰上降温吗？是不是降到23-25度就可以了？我总觉得室温这个概念太含糊了，23度和25度的ph能差好多吧。

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加了多少盐酸呢？一般有不同溶解热的物质溶于水会放出不同的热量，放置到室温后再测pH。而用于调pH的盐一般加入的体积小，不会影响到温度的。23度和25度，对于缓冲液来说似乎不会对pH造成多大的影响吧。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:18


100ml，1.0M，ph6.8的tris，加水80ml溶解Tris后用盐酸调节PH，一般盐酸能加到快20ml，定容的时候基本上不用再加多少水了。而且温度上升到快40度呢。所以等它冷下来时间要很长，实在是很麻烦。我最怕配这个tris了。有时候就把它放在冰上降温了。
作者: gogo    时间: 2013-11-16 20:18

电泳一直跑不好,所以想重新配置试剂.请问大家:
1 Tris-HCL:分子克隆上说等室温才能调定PH,是不是23-25度都可以啊.但是PH不是要求很精确吗?
2 配电泳缓冲液的时候是先调PH后加SDS, 还是先加SDS再调PH?另外,调定PH的时候是不是也要等溶液回到室温?
谢谢!
问题比较菜,但是还请大家帮忙!

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1.Tris-HCl这个缓冲液的pH要求是很高的，至少小数点后面第一位是要保证的，不然对电泳效果影响很大的。

2.电泳缓冲液配的时候要调pH吗？我们做的时候都不调的就是Tris1.515g+Gly7.2g+SDS0.5g然后加500ml水就可以了，效果很好，呵呵

不知道对你有没有帮助。见笑了。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:19

二十五、sds-page中，蛋白条带会跑到溴酚蓝前面吗？

SDS-PAGE中，蛋白条带，无论分子量大小，是否都不应该出现在溴酚蓝的前面？谢谢！
作者: ssonglikihi    时间: 2013-11-16 20:19

应该是这样的

溴酚蓝的分子量很小，跑得最快,因此不会跑到蛋白质的后面去。
作者: PPT    时间: 2013-11-16 20:20


不一定吧，溴酚蓝好象是7kD, 另外可能与上样缓冲液配方也有关，建议用预染蛋白Marker.
作者: ritou1985    时间: 2013-11-16 20:21


溴芬兰的分子量好像只有698的样子，具体记不清了，但是小于700。蛋白条带分子量大于溴酚蓝的应该不会出现在溴酚蓝的前面。但实际上，溴芬兰有时会跑的慢一些，我们的经验是溴芬兰不会慢与1.5kD的蛋白带。
作者: deducte    时间: 2013-11-16 20:21

SDS-PAGE中，蛋白条带，无论分子量大小，是否都不应该出现在溴酚蓝的前面？谢谢！

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溴芬兰的具体分子量669.97，蛋白质是不可能跑到它前面的。
作者: cwcwcww    时间: 2013-11-16 20:22

溴芬兰的具体分子量669.97，蛋白质是不可能跑到它前面的。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:22


谢谢各位热情的回复!
提出这个问题的原因是这样的: 购买上海生化所的蛋白MARKER, 14 , 20, 30多,43,66,97.可是电泳后只有五条带, 有人说, 第一条带消失了, 有的说第六条带消失了.如果不会跑到溴酚兰的前面,那么肯定是最后一条带消失了.
作者: ritou1985    时间: 2013-11-16 20:24

我们是买的Bio-Rad的Low Range Marker,分子量为97.4, 66.2, 45, 31, 21.5,14.4. 有两次明明看到溴酚蓝的前沿还在胶中,可染色后, 只有5条带,不知何故?
作者: finger    时间: 2013-11-16 20:25

带的消失可能与分离胶的浓度有关，比如我用同一个marker跑7％和10％的胶，得出的结果就是一个为五条带而另一个为六条带。决不会是因为跑到溴酚兰前面去了。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:26

我用的是12%的分离胶.
作者: bling    时间: 2013-11-16 20:27

溴芬兰的具体分子量虽然仅为669.97，但它不是蛋白质，只有结合它带的电荷我们才能评估它在SDS-PAGE中的迁移速度。我想总不至于溴芬兰像蛋白质一样，自己所带的电荷与结合的SDS（如果它也结合的话）的电荷相比可以忽略吧。
作者: 987789    时间: 2013-11-16 20:28

每种浓度的胶都对应有最适宜分离的蛋白质分子量，在这个分子量区间内的蛋白会跑在胶的中间部分，这时条带拉得最开，分离效果最好。相应的每种浓度的胶对蛋白的分离也是有一定范围的，太大的蛋白会因为完全走不动而无法分离，即便它们之间的分子量还是有差别。同样的太小的蛋白也无法根据分子量分开，这是因为凝胶对他们完全没有了阻力。所以如果胶的浓度不合适的话，完全有可能marker的最上面两条带或是最下面两条带重叠在一起了。
作者: 101010    时间: 2013-11-16 20:28


但12%的胶应该都分离出来，可能丙烯酰胺浓度不准。
作者: gemei0115    时间: 2013-11-16 20:29

但12%的胶应该都分离出来，可能丙烯酰胺浓度不准。

我同意！
作者: dior    时间: 2013-11-16 20:29

我也同意，我们做同样样品时，有几次原来可以做出来的低分子量蛋白都丢掉了，便是溴酚兰显示还距底部有1cm左右。
我认为最大可能就是丙烯酰胺溶液用到底导致的浓度不准。因为更换后能够解决。
作者: 鸽子不哭    时间: 2013-11-16 20:30


小于670的、可能为6个AA残基的“蛋白质”。
如果该6个AA的多肽“链”成标准的圆球、不是在我们通常的4-15%的凝胶中、其在样本中有足够的含量、研究者又对其特感兴趣等等，得考虑溴芬兰跑的慢的问题了，（但此时也不适宜用SDSPAGE来研究该多肽了）。
不过还得考虑溴芬兰的分子结构、与SDS结合、-NH2基团等
作者: sr9971    时间: 2013-11-16 20:30

这个问题应该有定论了。在SDS-PAGE中，溴酚蓝可以跑到蛋白质的前面，特别是在高浓度的PAGE胶里面。

mcli战友讲：“我们是买的Bio-Rad的Low Range Marker,分子量为97.4, 66.2, 45, 31, 21.5,14.4. 有两次明明看到溴酚蓝的前沿还在胶中,可染色后, 只有5条带,不知何故? ” 本人理解，出现5条带很常见，原因是最小的蛋白带跑得比溴酚蓝快，已经跑到了胶外。解决的办法是提高胶的浓度或缩短电泳时间。

溴酚蓝的分子量约为670道尔顿，在不同浓度凝胶中，迁移率基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。在0.6%,1%,2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb, 0.6kb和0.15kb的双链DNA线性片段大致相同。在不同浓度的PAGE胶中也有类似的现象[参见：卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 第一版，北京：高等教育出版社，1993，p74-75]。
作者: sr9971    时间: 2013-11-16 20:31

更正：
上一贴中，“这个问题应该有定论了。在SDS-PAGE中，溴酚蓝可以跑到蛋白质的前面，特别是在低浓度的PAGE胶里面。”应为“这个问题应该有定论了。在SDS-PAGE中，蛋白质可以跑到溴酚蓝的前面，特别是在高浓度的PAGE胶里面。”余同。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:32

二十六、help:sds-page中的样品浓缩

1.我现在做的sdspage浓度事20％。样品事用100％三氯乙酸浓缩，然后跑胶。条带没什么大问题，基本都出来了。但是在条带下面差不多接近秀芬兰的地方，总是出现黑糊糊的一团东西。请问这是什么原因？我师姐说可能是样品处理问题，也就是三氯乙酸除的不干净。但我有时候处理的很仔细，也还是出现黑团。请问有哪位大侠做过类似实验，如何解决啊。谢谢。

2.有的样品处理过程一样，但宽窄不一，是什么原因哪？
还有一个问题就是：在跑电泳结果中，有的蛋白高分子量部分很浓很清晰，但在小分子部位的浓度还不如同样蛋白但浓度较低的小分子部位浓度高。
作者: guagua    时间: 2013-11-16 20:33


1)我们在做sds-page的时候，样品的浓缩是用1M的三氯乙酸，离心以后再加丙酮进行清洗，把三氯乙酸除去，如果三氯乙酸没有除干净的话，样品加了LOADING BUFFER以后会变成黄色，不知道你有没有出现这种现象？个人认为秀芬兰旁边的黑糊糊的一团东西可能是样品中的一些小分子的物质。
2）有的样品处理过程一样，但宽窄不一，原因可能是样品中的盐浓度不一致，盐浓度过高会显著影响蛋白质的电泳，使蛋白质条带明显变宽，有时还会成微笑状。
作者: mingming0638    时间: 2013-11-16 20:33

1、没碰到过你说的现象，不知你的marker下面是否也有，否则肯定是样品问题了。可考虑将图贴出来，让大家瞧瞧。
2、宽窄不一，应该是上样量的问题。
3、这个问题应该也好理解，高分子量跑的距离短些，而低分子量的蛋白跑的距离相对较长，在浓度低的胶上受阻小也正常的 。
希望有所帮助。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:34

谢谢你们的帮助，等会我去把图照出来让各位分析一下。

三绿乙酸没除干净加了BUFFER后会变黄，不过那只能说明里面存有的三绿乙酸过多。如果不是太多的话，加了BUUFER还会是兰色的，而且有时候跑出来靠近秀芬兰的地方 一团黑糊糊的 。
请问 楼上主任 ，你用丙酮清洗后是否要离心 风干。溶液中存有丙酮是否影响结果。

谢谢
作者: 小螺号    时间: 2013-11-16 20:34


loading buffer里的还原剂用的是beta ME吧，我做过对照实验，加多了，脱色不充分就会在接近秀芬兰的地方有“黑糊糊的一团东西”。不加或正常用量就没有。

可惜我的图帖不上来。
作者: skytree    时间: 2013-11-16 20:35

三绿乙酸没除干净加了BUFFER后会变黄，不过那只能说明里面存有的三绿乙酸过多。如果不是太多的话，加了BUUFER还会是兰色的，而且有时候跑出来靠近秀芬兰的地方 一团黑糊糊的 。
请问 楼上主任 ，你用丙酮清洗后是否要离心 风干。溶液中存有丙酮是否影响结果。

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1)如果样品加了LOADING BUFFER以后变成黄色的话最好用碱把PH调成蓝色，不然有时样品会出现反向迁移；
2）丙酮清洗后要离心和风干，如果溶液中存有丙酮的话TCA肯定也没有去除干净，会使样品呈酸性，也会出现1）的现象。
作者: whitesheep    时间: 2013-11-16 20:35

Take 1mL sample and precipitated with 100 uL TCA, samples were vortexed and incubated at 4oC for 30 min. then centrifuged at 10000rpm for 10 min. the supernatant was decanted , 1mL of acetone (-20oC) was added and vortexed vigorously. centrifuged at 10000rpm for 5 min, the acetone treatment can be repeated. the pellets were dried at RT for 30min and resuspended for SDS-PAGE.
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:36


你说的beta ME是指的10 %β-巯基乙醇吗？我的配方是4×样品缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl pH6.8，10 %β-巯基乙醇，8 % SDS，0.4 %溴酚蓝，40 %甘油。我的应该是正常用量啊。那我下次注意一下，看还有没有这个问题。谢谢
作者: langlang    时间: 2013-11-16 20:36

楼上，能否将蛋白浓缩的具体方法解释一下，偶不明白，而且偶急需蛋白浓缩跑SDS，多谢！
作者: whitesheep    时间: 2013-11-16 20:37

取待浓缩样品 1mL，加入100 uL三氯醋酸，振荡混匀后于 4oC静置 30后离心（10000X10 min), 去除上清,沉淀中加入1mL acetone(-20oC预冷) ，剧烈振荡混匀后. 10000rpm X5 min,此步可以重复一次以保证三氯醋酸可以完全除去，最后将管子在室温放置30分钟干燥后溶解于缓冲液中电泳分析。如果不是预冷的丙酮，可以在低温冰箱中静置10分钟即可。
作者: vera+    时间: 2013-11-16 20:39

1)我们在做sds-page的时候，样品的浓缩是用1M的三氯乙酸，离心以后再加丙酮进行清洗，把三氯乙酸除去，如果三氯乙酸没有除干净的话，样品加了LOADING BUFFER以后会变成黄色，不知道你有没有出现这种现象？个人认为秀芬兰旁边的黑糊糊的一团东西可能是样品中的一些小分子的物质。
2）有的样品处理过程一样，但宽窄不一，原因可能是样品中的盐浓度不一致，盐浓度过高会显著影响蛋白质的电泳，使蛋白质条带明显变宽，有时还会成微笑状。

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我的经验与老兄不同:
1.胶中蛋白条带宽窄不一原因是:因为蛋白结合电荷量不同!即所加样品中蛋白含量不同!
2.盐浓度过高不会显著影响蛋白质的电泳.我用硫酸铵分级沉淀时蛋白未透析.sds-page蛋白条带没有变化!你可做个对照看一下!
OK?
作者: ns5fan    时间: 2013-11-16 20:39


看到大家在论坛上经常讨论这个问题，我也凑凑热闹！
关于TCA沉淀蛋白作为SDS－PAGE上样的准备在本论坛的贴子很多，各种各样的protocols都有，不过总结来说都是含两个方面，一是TCA沉淀，二是用丙酮洗去残留的TCA！也许是大家做上游做的多了，对于这个不太熟悉；也许是大家提供的方案太多，仔细看都不太相同，乱了思绪，我也提提我的看法，希望能理清思绪！
TCA沉淀蛋白的方法据我所知，最早是lowry于1951年发表在JBC上的一篇题为“PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT”上用过的，当然这篇文章也就是著名的lowry法定量蛋白的提出篇！随后在很多文献，包括现今新的处理蛋白的文献中也有采用，可见这个方法如何的被青睐！
具体操作方面，不管你用什么4：1的体积比也好，还是摩尔浓度（1M TCA）也好，一般TCA的终浓度在5％－10％（W/V）都可以！我从书上节选了这么样的一段英文，大家可以看看：
We routinely precipitate samples with trichloroacetic acid (TCA) before SDS-PAGE.
This concentrates the samples, eliminates a great deal of buffer variability, and denatures proteinases and substrates in a rapid step that does not allow time for extensive artifactual proteolysis. Typically, a final concentration of TCA of 5% (w/v) at 4°C for 10 min will be adequate. The precipitated proteins are recovered by brief centrifugation (10,000g for 1 min, in a benchtop microcentrifuge),and the TCA is poured away. Residual TCA, which would otherwise change the pH of the sample buffer, is removed by repeated gentle washing with acetone or diethyl ether,and after three washes, the protein pellet is redissolved in SDS-PAGE sample buffer.

下面的两篇文献可供参考：
I. Polacheck and E. Cabib, Anal. Biochem. 117, 311 (1981).
2. ENRICO CABIB and ITZHACK POLACHECK,methods in enzymology 104卷，415－416
作者: birdfish    时间: 2013-11-16 20:39


丙酮干燥时间一定不能太长，否则pellet很难溶的，这是我的经验。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:40

二十七、求教30%聚丙烯酰胺凝胶电泳配方

本人想做求教30%聚丙烯酰胺凝胶电泳但是查了资料都只有最大到20%，那位知道能否给我个配方比例。还有积层胶的配方。需要详细的，谢谢。



作者: yyaxw84    时间: 2013-11-16 20:41

这是可以计算出来的。30%×所需的毫升数/丙烯酰胺溶液的浓度=所需的丙烯酰胺溶液的量。其他成分就好算了。当然你就不能用30%的丙烯酰胺溶液配制了，浓度应该更高。不知道我说明白没。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:42

能直接写出配方吗？那样最好了。谢谢
作者: she    时间: 2013-11-16 20:42


丙烯酰胺溶液的浓度首先要大于30%，如50%才能配大于30%的胶。以30%的为例配15%胶:

1.5MTris-HCl PH8.8 10ml
Water 9.2ml
Stock acrylamide 20.0ml
10%SDS 0.4ml
AP(10%) 0.4ml
TEMED 16ul

Stock acrylamide%=(20.0mlx30%):40ml=15%
作者: 研究僧112    时间: 2013-11-16 20:43

做蛋白质分析，一般不大于20%
作者: purrr    时间: 2013-11-16 20:43



QUOTE:
原帖由 研究僧112 于 2013-11-16 20:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做蛋白质分析，一般不大于20%

配60%的凝胶储液：58.4% Acr +1.6% Bis + DDH2O
假设配100ML ，30%的分离胶：60%的凝胶储液50ML
分离胶BUFFER 25ML
DDH2O 25ML
AP 268UL TEMEN 54UL
作者: coolcool    时间: 2013-11-16 20:45


30% 聚
30% 聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺150g + 甲叉双丙烯酰胺4g + MilliQ水500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:46

二十八、有谁做过蛋白银染

蛋白银染有没有快点的方法，在十分钟能做完的方法
作者: guagua    时间: 2013-11-16 20:46


有的，记得石家庄和平医院检验科主任曾在《上海检验》杂志上发表过一篇文章，你找找，我以前用过，还行，但具体方法已是找不到了。
作者: @STAR@    时间: 2013-11-16 20:47


偶记得以前用过一种蛋白质和核酸都可以用的银染法，大约半小时吧，找找看。10分钟好象太少了吧，光染色一步10分钟也嫌少了
作者: xevin    时间: 2013-11-16 20:48

这是我在郭尧君编著的《蛋白质电泳实验技术》一书上查到的，这是Krause用考玛斯亮蓝染色并干燥后的凝胶再进行的快速银染，供你参考：
干胶的5分钟快速银染（Krause）
1.配置贮液：
溶液A：25gNa2CO3+500ml ddH2O
溶液B：1.0g硝酸铵＋1.0g硝酸银＋5.0gtungstosilisic acid＋7ml 37%甲醛，加ddH2O至500ml。
2.使用前混合35mlA和65mlB。将凝胶放在摇床上振摇，直到蛋白带显色，用ddH2O淋洗。
3.用0.05mol/L甘油终止。用棉花擦去凝胶表面和支持膜上的银颗粒。

注：如果银染前的凝胶未处理过，则将凝胶放在20％三氯醋酸中。用45％甲醇和10％醋酸混合液洗2次，每次5分钟。再用ddH2O洗4次，每次5分钟。在0.75％甘油中浸泡2分钟，干燥。
作者: @STAR@    时间: 2013-11-16 20:48


实际上考染相当于一个固定步骤,总共加起来也不止10分钟啦
作者: newway    时间: 2013-11-16 20:49

另外一种快速银染法 ：

凝胶浸于固定液(30％乙醇，10％乙酸)中．
50℃固定2次，每次4min。再转移至含0．5％戊二醛，0．1％硫代硫酸钠的30％乙醇
0.4mol/L醋酸钠(pH6.0)溶液中，50℃温育8min。水洗3次，每次3min。加人0．1％硝酸银-0.05％甲醛，40℃避光染色10min。2．5％碳酸钠—0．04％甲醛40℃显色。5％醋
酸，50℃终止反应2min。水洗并于2％醋酸中保存

－－引自“三种蛋白染色方法在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用 陈琳 张亚东 军事医学科学院院刊 2000 ”
作者: kuohao17    时间: 2013-11-16 20:49

10分钟太少了吧。如果没有系统比较的话，简单上一个方法，可能会丢掉银染高灵敏性的。如果用1MM的胶，染色的几步不能很好的完成，比如作用的分子、漂洗的水没有很好地进入胶，结果不会好的。最近用R350热染，若胶在玻璃板上（单侧），就得延长时间（推荐是10分钟）。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 20:50

二十九、胶不凝，怎么办？

我正在做western，用的是分子克隆的配方，12%的分离胶，配好后放置室温下3小时还不凝，我把所有的都重新配置，（丙烯、tris-cl、SDS、TEMED），还是不凝，我这里室温是30度左右，但是温度稍高也不会这么长时间啊，怎么办？
作者: bluelake    时间: 2013-11-16 20:50


APS（过硫酸胺）换过没有？另外确保APS和TEMED的用量是正确的，可以稍微增加一些。如果还不行，干脆放到冰箱里过夜。
作者: fox_79    时间: 2013-11-16 20:51

PAGE胶到底是在37度凝得快，还是4度快？？
我们实验室怎么配完胶，都放在37度孵箱里？？
作者: 喵咪    时间: 2013-11-16 20:51



QUOTE:
原帖由 fqswdzd 于 2013-11-16 20:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
二十九、胶不凝，怎么办？

我正在做western，用的是分子克隆的配方，12%的分离胶，配好后放置室温下3小时还不凝，我把所有的都重新配置，（丙烯、tris-cl、SDS、TEMED），还是不凝，我这里室温是30度左右，但是温度稍高也不会这么长时间啊，怎 ...

12%的胶一般半小时就凝了，温度升高聚合应该加速，凝的更快。之所以不凝，应考虑体系中的各组分出了问题，丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例如何？tris-cl PH值多少？各组分用量多少？
作者: abc816    时间: 2013-11-16 20:52


APS和TEMED质量有问题了。

丙烯和双叉丙烯出问题的时候少。
作者: cwcwcww    时间: 2013-11-16 20:52


APS和TEMED是促凝剂，同意楼上师兄意见。我遇到过类似情况结果发现情况是国产的APS放的过长，变质了。这样的话，你重配aps也没有用。

正常情况下，胶可以在室温下20min左右就凝了，如果过了30min还没凝你就要考虑APS和TEMED的量太少了，再不行就是试剂的问题了。当然温度稍高一点会更好。
作者: nikun230    时间: 2013-11-16 20:53


同意.我觉得以APS的嫌疑最大.往往是用了过期受潮了的.
作者: ROSE李    时间: 2013-11-16 20:53

应该该是过硫酸胺的问题，这东西配的时间长了都不好使。
作者: dhpbj    时间: 2013-11-16 20:54

我也觉得是过硫酸胺的问题，
另外，低温时，胶也不易凝，冬季，实验室不开空调时，凝的慢，我们常加双倍量的TEMED
作者: xueyouzhang    时间: 2013-11-16 20:54

我同意是过硫酸铵的问题，我碰到过几次，这玩意配好放久了就不行，你试试重配吧。
作者: bamboo16    时间: 2013-11-16 20:54


建议更换AP，新配制的AP存放于4度至少用半年
作者: applebook=213    时间: 2013-11-16 20:55

绝对是过硫酸胺失效了.
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2013-11-16 20:55


大伙一致认为APS, TEMED有问题。赞成！

最好，现用现配。可适当增加3~5ul
作者: yyaxw84    时间: 2013-11-16 20:56

同意楼上意见 。建议更换所有试剂后重新配胶。
作者: njkph    时间: 2013-11-16 20:57


应该是过硫酸铵的问题，过硫酸铵最怕受潮，平时粉剂应保存在干燥皿中，一次不要配多，最好现用现配。
作者: 杨过爱大米    时间: 2013-11-16 20:57


AP我们每次只配1ml,最多用10天.
另外Tris的pH也很重要.
作者: chuntian1983    时间: 2013-11-16 20:58


AP用量加倍，TEMED可增加三到四UL。
作者: biabiade    时间: 2013-11-16 20:59

如果你的聚丙烯酰胺配置没有问题的话，可以放置很久，一般不会出问题。所以我也认为，很可能是APS或（和）TEMED失效了。

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PAGE胶到底是在37度凝得快，还是4度快？？？？？
我们实验室怎么配完胶，都放在37度孵箱里？？

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PAGE胶凝聚是化学反应，温度高可以加速聚合；而琼脂糖胶凝胶则是物理反应，所以在4度凝得快。
作者: 莲花白    时间: 2013-11-16 20:59


我们实验室有个新手，丙稀酰胺配好后没避光保存，结果配胶时就没凝。
作者: kewanqi2011    时间: 2013-11-16 21:00

请教各位高手AP配好后4度最多可以放多久！3天？一周？还是半年？
作者: prettygirl@    时间: 2013-11-16 21:00

AP配好后分装，负20度可以存放至少半年以上
作者: zhezhe    时间: 2013-11-16 21:00


TEMed 配好可保存多长时间.
作者: caihong    时间: 2013-11-16 21:01


低浓度AP只能当天使用！
作者: shanzhapia696    时间: 2013-11-16 21:01


一般是AP的问题。
作者: xue258    时间: 2013-11-16 21:02


AP，丙烯酰胺时间存放过长，AP不超过一周，丙烯酰胺可以长一此地。
Tris的PH值也非常重要，我第一次做胶时，做了三次没成功，后来重配所有试剂，就可以了，反过来一查，Tris的PH值搞错了，前面的PH值搞反了，所以一直没干。
AP的浓度可以加大，甚至加倍，TEMED最好加上2ul，那样可以加快，一般来话，十分钟左右不干就重做吧。
作者: tuomu45    时间: 2013-11-16 21:02


我刚刚跑了一块胶，我前面的师姐配胶没凝，我将AP，Tris，丙烯酰胺重配后，叫很快就凝了！
我觉得，Tris pH 很重要，AP要现用现配，丙烯酰胺要避光，总之，只要掌握大原则就一定没问题！！
作者: ero11    时间: 2013-11-16 21:03


when you dissolve AP in water(1.5 EPtube),you should hear a cracking-like sound(a kind of chemical reaction). if not, AP is bad.
after dissolve the AP, you could store the tubes at -20c with volume wanted for at two months or more.
作者: Darcy    时间: 2013-11-16 21:04

有段时间发现胶凝得特别快，可能是Tris的PH值发生变化
后来重配，发现凝集时间在30min左右。
大家说得好，回头我把AP粉剂收好，省得失效都不知怎么回事！
每次AP都是现配现用，到目前为止还没有不凝的现象，只是时间长短不一样！
作者: daod    时间: 2013-11-16 21:05


应该是AP的问题，前几天我刚做了一块胶，其他的溶液几乎半年没用了，AP是新配的，就在室温做，20分钟左右就凝，很好用的。
作者: sr9971    时间: 2013-11-16 21:05


30%丙烯配错了，忘了加.....
作者: 鲇鱼少爷    时间: 2013-11-16 21:06

请教各位高手AP配好后4度最多可以放多久！3天？一周？还是半年？

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我的APS配好后4度一周之内用效果不错，再长的时间我没有试过。
作者: deducte    时间: 2013-11-16 21:06

我们都是现用现配,不值得冒险,也不麻烦!!
作者: sunshine039    时间: 2013-11-16 21:06


AP配好分装置-20度冷冻，每次一管。TMED直接加原液为好，当然计算好比例。
作者: okhaha    时间: 2013-11-16 21:07

我的建议：
1、制胶前，临时配置APS。APS应该保存于干燥皿中，若受潮的话，则胶肯定不凝，我们实验室就出现过这种情况。
2、你的丙烯酰胺是不是时间太长啦，丙烯酰胺应该保存于棕色瓶中，在3个月以内应该没问题。但一般来讲，这只会影响跑胶的质量而不至于胶不凝。
3、建议稍微增加TEMED的量，有一次，我本应该加8微升的TEMED，结果看成了80微升，一加进去，还没有来得及灌胶，就凝啦。
综合来看，APS的可能性最大。
作者: koook5695    时间: 2013-11-16 21:07


10% AP 都是现配现用的。
作者: luoliqiong    时间: 2013-11-16 21:08


是的，楼上各位高见。有两点补充：
1. AP称500mg，加双蒸水5ml，分为200μl每份，-20℃冻存，每次大概用一管，不要反复使用。可用半年质量也不会出问题。
2. 我们实验室的ARC-BIS一直放在外面，没有避光，但是半年来也很好，有个兄弟院校的同学说他们那儿也是如此。看来ARC-BIS避不避光关系不大。
其他东西不容易出问题，操点心，就会一路顺风！
作者: huifeng0516    时间: 2013-11-16 21:09


蛋白质聚丙烯酰胺凝胶----制胶经验总结，盼大家补充：

1. AP最重要！AP提供凝胶交联所必需的自由基，但AP易缓慢降解，且我们通常配制丙烯酰胺溶液时未脱气处理（溶解氧可延缓聚合过程），故应比书上写的适当加大量。至于AP的制备选择每次新鲜配制或分装-20℃冻存均可。
2. TEMED是催化剂，它催化AP形成自由基而加速凝胶的聚合。它的量在一定的范围内与胶的凝结速度成正比。一般保丙烯酰胺溶液于4℃。
3. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在光照和碱性条件下能分别转变为丙烯酸和双丙烯。故它们应被保存在避光、酸性溶液中。丙烯酰胺溶液通常存于4℃。
4. 可根据我们所在实验室内的温度（比如是北方还是南方，是冬天还是夏天）摸索两种AP和TEMED比例的方案，如在冬天室内温度较低的情况下应适当加大AP的量等。
5. 加好分离胶后，应加一层水覆盖，以放空气中的氧进入凝胶而抑制聚合反应。
6. 另外一点经验，可将PH6.8的Tris buffer、30%丙烯酰胺溶液、ddH2O 和10%SDS配成浓缩胶储存液，存于4℃，可节省每次配浓缩胶的时间，多年来我一直这样，效果很好。
作者: 89tongzijun    时间: 2013-11-16 21:10

偶们这里AP就在室温放置，一般可用半月左右也没有问题的
temed也是的，而且我们的丙烯酰胺就在室温放置在棕色瓶中的
我觉得有可能是你所采用的是哪公司的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺
SDS也值得考虑，还有tris-hcl的ph。
作者: 羊咩咩    时间: 2013-11-16 21:11


APS 100mg 溶于1ml去离子水中，现用现配
作者: kewanqi2011    时间: 2013-11-16 21:13


可能是过硫酸氨失效了，不仅过硫酸氨溶液会失效，固体过硫酸氨也会失效，未失效的固体过硫酸氨在溶解时会有响声，你可以听一下。固体加入水后，放在耳边震荡，会听到过硫酸氨溶解的声音，说明有效，否则就是过硫酸氨失效了。
作者: purrr    时间: 2013-11-16 21:13


同意楼上意见 。建议更换所有试剂后重新配胶。
作者: vcve    时间: 2013-11-16 21:14

不建议AP或TEMED加的过多。胶凝的过快会导致电泳结果不是很漂亮，因为上下层会不很均匀。
作者: 大尾巴    时间: 2013-11-16 21:14

你可以将AP和TEMED的量都增加1/3，还可以放在37度环境下促凝。
作者: lixi559    时间: 2013-11-16 21:14


老兄:做试验,别偷懒,勤配试剂,否泽,欲述则不达
作者: laughing妹    时间: 2013-11-16 21:15

过硫酸铵(ammonium)胺(amine) is different, the man who posts should know the difference between them.
作者: standup    时间: 2013-11-16 21:15

如果3小时不凝，那放6个小时或更长时间看看是不是试剂问题；如果还不凝，那是试剂的问题了。AP和TEMED加倍或较高的温度可促凝，但在电泳时，条带可能不齐的，影响实验结果，只是不得已而为之。因此还是室温按正常剂量加，1小时左右可以凝的。
作者: junhun    时间: 2013-11-16 21:17


绝对的ap问题，前一阵我也是这样，换了一瓶化学纯的，很快就凝了，前一瓶ap害的我差不多200ml的胶都完蛋了
作者: nikun230    时间: 2013-11-16 21:17


晕，更换所有试剂后重新配胶，还不是等于没找到问题在哪里。
作者: yapuyapu    时间: 2013-11-16 21:18

我也觉得是过硫酸胺的问题
作者: queen    时间: 2013-11-16 21:18


一般40%-60%的APS可室温放置2天，10%的须当天使用。我一般把配好的APS100ul-150ul分装后-20度保存可用大约一个月。另外，要适当增加APS和TEMED是可以的，但不可加太多
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:19

三十、电泳上样

加样我用微量进样器,可是不好用.改用枪加,老是加不进去,真是急人.我是刚开始做.求各位高手能给我详细指点一下.不胜感激.
作者: ALALA    时间: 2013-11-16 21:20


加大上样BUFFER DE浓度
作者: 49888    时间: 2013-11-16 21:20

用加样吸头配枪，好用。
作者: greenbee    时间: 2013-11-16 21:21


还会出现加不进去的情况?是不是载样液不对,密度太小,样品漂出来了?
电泳前,用小水流将上样孔轻轻冲洗一下(去除没有聚合的液体.可能影响上样)如果将上样孔偏离位置,可利用注射器的针头拨正。
应该没有问题的。
作者: 箭头儿    时间: 2013-11-16 21:21


首先问您跑的什么电泳?如果没有适当的枪头,可以自己土制。使用10ul之枪头在酒精灯火焰上烤，然后用镊子拉得又细又长，土是土了一点，我们都这样干，效果还是不错的。
作者: lagua123    时间: 2013-11-16 21:22


你用的是什么样的微量进样器，你的胶是多厚？是针头伸不进去吗。我用微量进样器加得好好的啊。而且以前用小枪头在也能加进去。
作者: hustwb    时间: 2013-11-16 21:22


是针头伸不进去还是其他原因？
作者: star#room    时间: 2013-11-16 21:22


我觉得你肯定是电泳样品有问题，微量加样器怎么可能加不进去呢？是不是你的样品没有溶解都是沉淀呀？
作者: any333    时间: 2013-11-16 21:23


如果你是应为样品堵住枪头加不进去，可以在上样前将样品先离心一下，然后取上清加入即可。
作者: 二子    时间: 2013-11-16 21:23


加样后样品漂起来有两个原因：
【1】梳孔没有冲洗干净；
【2】样品处理不当，如煮沸时间不够等，使得DNA不能充分断裂
作者: woshiduiyan    时间: 2013-11-16 21:23

我电泳时有时也出现这种情况，主要还是梳孔的原因，里面有未凝的胶，用针尖在每个孔吸一吸，吸出去就好了。还有可能就是插梳子的时候梳子于两个板有空隙，这样胶凝后孔内就有一层胶，加样的时候针尖伸到空隙的胶里去了，也能使样品飘起来。
作者: cocacola    时间: 2013-11-16 21:24

加样我用微量进样器,可是不好用.改用枪加,老是加不进去,真是急人.我是刚开始做.求各位高手能给我详细指点一下.不胜感激.

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哈哈，此问题我早就shoot掉了，当时也是使我苦恼很多，先在共享之。

1 用黄tip加样（黄头最多可加到200ul，但是也可吸取10ul,放心吧）
2 关键是处理加样孔: 待胶刚凝固后,一定要在等20分钟左右拔梳子,此时很容易拔出,
同时,拔梳子是要让加样孔朝下,目的是不要让碎凝胶进入加样孔,拔出后,立刻用棉纱
擦掉玻璃上剩余的碎凝胶,此时,孔已经处理的很干净了
3 直接吸取样品,顶住矮的玻璃板,对准加样孔,ok!你会看到一股蓝线下沉.
4 操作熟练了,感觉非常好,就愿加样!!!最重要的是,不会破坏加样孔的完整性,
因为进样器可能损伤孔的底部!
作者: duoduo    时间: 2013-11-16 21:24


把上样缓冲液里甘油的浓度稍稍增加一点，密度大了，就很容易沉下去了
作者: zhezhe    时间: 2013-11-16 21:25

不可能把？
加样？
我用过很多种方法，但一直加不进好像没见过
加样枪头，10UL TIP加热拉长，还有用静脉注射针头也好用，这都是加样的工具
如果有核酸确实不好加，很容易随着加样枪头一起带出来，那就加热长一点吗！当然甘油浓度也可以大一点

至于怎样加，技术动作好像在《蛋白质技术手册》上有，斜插到胶空的一脚，边加边上提（缓慢），就算有点粘，也没关系
作者: jujuba    时间: 2013-11-16 21:25

加样缓冲液有问题，换一个吧，再者，加样要稳，不要加得太快，还有不要将枪尖插入胶中，枪尖不要由空气，切忌切忌！
作者: kswl870    时间: 2013-11-16 21:26

上样前把样品离心吸取上清

你的样品就不会堵住微量注射器的口
作者: 小荷尖尖    时间: 2013-11-16 21:26

微量加样器一点也不好用
我加样用20微升的枪，也不用加热拉丝，多加几次就会抓住要领的
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:27

三十一、请教上样Buffer等

1 关于上样buffer的配方，本人见过各种版本。关于巯基乙醇的比例实在不知如何是好。想配4X上样Buffer，请教配方。
2 配胶用的Tris需要高压灭菌吗？
3 转移缓冲液和Tris-甘氨酸电泳缓冲液
也要灭菌吗？
4 煮沸制过的样品在-20度下可以再用吗？
作者: ffaa    时间: 2013-11-16 21:28


1. 我做的上样buffer是在3X的里面巯基乙醇是15%，也就是与目的样品配好后巯基乙醇含量为5%，配方：样品缓冲液终浓度：50mmol/L Tris.cl（PH6.8），2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，5%巯基乙醇或100mmol/L DDT（二硫苏糖醇），要配4X的你自己算算就成了。
2.Tris以我的经验是高压一下，否则放久了会长菌
3.转移液和电泳缓冲液不用灭放在4度冰箱里即可，尤其是电泳缓冲液配好后一定要放冰箱里，你可以先配个10X的，现用现稀释
4.煮沸过的样品在-20度可短暂保存，时间太长就不要用了，最好是做之前处理，这样效果好。
作者: jingling845    时间: 2013-11-16 21:29

据我所知，2，3均不用灭菌。4 可以用的
作者: 00无名指00    时间: 2013-11-16 21:29


1-------1*sample buff contains 5%β-ME。
I advice you not add β-ME in the 4*sample buff because it may influence protein assay。Correct way is adding β-ME after protein assay。
2，3-------All the buffer in W-B need not asepsis。
4-------I suggested that you deal with the sample in one month，otherwise store the saple in -70℃
作者: tudou85    时间: 2013-11-16 21:30


要先搞清楚你要reducing or Non-reducing. 两者跑出来的带是不同的。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:30

我做还原性的。NON-reducing 用于什么研究的？
作者: 薄荷侠    时间: 2013-11-16 21:31



QUOTE:
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我做还原性的。NON-reducing 用于什么研究的？

NON-reducing 用于什么研究的?
作者: any333    时间: 2013-11-16 21:31


1.我用的是2×上样缓冲液：1mol/L Tris.cl（PH6.8）:1ml，10%SDS: 4ml，0.1%溴酚蓝:0.5ml，甘油:2ml，巯基乙醇:1ml. 与样品混合后巯基乙醇终浓度为5%。加上样缓冲液时应逐滴加入，边加边混匀，否则容易产生沉淀，。
2.Tris无需高压。
3 转移缓冲液和Tris-甘氨酸电泳缓冲液也无需高压，配好后置室温即可。
4.煮沸制过的样品在-20度下可以再用，防止反复冻融，煮沸后可分装冻存。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:32


1.我用的是2×上样缓冲液：1mol/L Tris.cl（PH6.8）:1ml，10%SDS: 4ml，0.1%溴酚蓝:0.5ml，甘油:2ml，巯基乙醇:1ml. 与样品混合后巯基乙醇终浓度为5%。
你配的0.1%溴酚蓝浓度很低0.005%,why?

2加上样缓冲液时应逐滴加入，边加边混匀，否则容易产生沉淀，。

与样品混合还是加巯基乙醇时？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:32

三十二、关于western blot的上样缓冲液

我在看有关文献时，对于SDS凝胶加样缓冲液的配置，有的说是将溴酚蓝和DTT在应用的时候才加入，但是在我们实验室，都是全加入，不知这样对结果有无影响？
作者: DDD    时间: 2013-11-16 21:33


DTT一般是临用前加.
作者: BUK    时间: 2013-11-16 21:33



QUOTE:
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三十二、关于western blot的上样缓冲液

我在看有关文献时，对于SDS凝胶加样缓冲液的配置，有的说是将溴酚蓝和DTT在应用的时候才加入，但是在我们实验室，都是全加入，不知这样对结果有无影响？ ...


全加入问题也不大，但溶液不要放置时间太久。
作者: ha111    时间: 2013-11-16 21:35


预先加入没问题，但是要低温保存。加入DTT后关键是上样前一定要煮充分，不煮加不加DTT都一样。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:36

三十三、western blot 是否上样量越多越好？

请教各位大侠，做western blot 时是否上样量越多越好，最多能上到多少？
作者: dragonkilly    时间: 2013-11-16 21:38


no, it should dependent on the target protein you want to detect, maybe you can try 50ng, according to the data from BCA assay. If you target is not much enough you can elevate the amount of the sample.
作者: prettygirl@    时间: 2013-11-16 21:38


不。上样量过多会导致转膜效率下降和杂带增多。一般不要超过100ug
作者: iii_ii    时间: 2013-11-16 21:39

不是的！
一般在WB之前可用CB染色，如果谱带理想，在WB时，加样量减半，可以得到较好的BAND.
作者: uaubc    时间: 2013-11-16 21:39


而且上样量过多可以出现拖尾，条带就不PP了
作者: kuaizige    时间: 2013-11-16 21:40


组织中提取的 loading protein <100ug
细胞...................................<200UG NO PROBLEM!
组织中提取的 loading protein <100ug
细胞...................................<200UG NO PROBLEM!
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:42

三十四、关于上样的浓度问题

不同胶浓度是不是样品的浓度不一样，我想知道具体的量是多少？现在我用的是6％分离胶和3％的浓缩胶，几次提高了上样量，但我的带颜色总是很浅。还有，HMW的marker跑出来只能看见两条带，应该是五条的，是浓度问题还是跑没了？
作者: rxcc33    时间: 2013-11-16 21:43


你可以在上样之前测定你的上样浓度，保证你的上样品浓度是一样的。样品浓度太低可以先浓缩，从你的胶浓度看你的蛋白分子量很大，根据你的蛋白分子量选择胶的浓度，颜色很浅也与染色时间有关，脱色不要太长。HMW的marker只能看见两条带，是不是电泳时间太短？
作者: kuaizige    时间: 2013-11-16 21:43

我是想知道有没有标准的上样浓度，我是160KD的蛋白，电泳时间是2小时20分
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 21:44



QUOTE:
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三十四、关于上样的浓度问题

不同胶浓度是不是样品的浓度不一样，我想知道具体的量是多少？现在我用的是6％分离胶和3％的浓缩胶，几次提高了上样量，但我的带颜色总是很浅。还有，HMW的marker跑出来只能看见两条带，应该是五条的，是 ...

1。 我做WESTERN的经验，分离胶浓度不同的目的，是让你所测的特异蛋白或者说是目的蛋白达到最好的分离效果，胶浓度大的测小分子蛋白比较好，浓度小反之，如果有可能的话，用商品梯度胶跑电泳，各种不同分子量的蛋白都能达到非常好的分离效果，有时间经济条件允许的话可以一试，胶浓度跟上样浓度应该没有关系。

2。上样量跟你样品抽提所得的蛋白浓度有关，具体计算我记得以前的帖子里我回过，你可以搜索一下。一般我做，上样量二十微克能有满意的带，但你应该知道你所测的蛋白在组织或者细胞样本里表达的量如何，如果表达很低，总量当然应该相应调高一些，在泳道能承受的前提下，30甚至40也无妨。到底应该上样多少我觉得没有什么明确的规定，你自己调整合适了就好。另外，你一抗，二抗的浓度如何？这对最后带的深浅也会有所影响。

3。MARKER带少的原因我觉得是因为你电泳时间长，胶浓度低，这种条件下小分子MARKER会跑出去，最后你在胶上看见的两条带就是相应的大分子MARKER了，不过这无所谓，MARKER只是个参照，你想测定的蛋白转到膜上就成了。

希望能有所帮助，祝你实验成功。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:44


谢谢uk版主的指导，我再重新浓缩一下，并测一测浓度。
作者: qiangren789    时间: 2013-11-16 21:45



QUOTE:
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三十四、关于上样的浓度问题

不同胶浓度是不是样品的浓度不一样，我想知道具体的量是多少？现在我用的是6％分离胶和3％的浓缩胶，几次提高了上样量，但我的带颜色总是很浅。还有，HMW的marker跑出来只能看见两条带，应该是五条的，是 ...

答:
不同胶浓度与样品浓度无联系,与上样量也无直接关系.你做SDS-PAGE胶的目的是什么?如果是看蛋白是否表达,我想只要看到条带就可以了.如还有其他需要,如做western.那建议如下:
1 测蛋白浓度,如果浓度低想办法将蛋白溶液浓缩后上样,如Dryli所言,每孔上样量达20ug,应该获得比较满意的效果.
2 染色浅可能是染液出现问题了(我所指考马斯亮蓝染色)
另,目的蛋白分子量大情况下,电泳时间不要太长,你的protein marker中小的条带已跑出胶外了.
作者: chengjie79    时间: 2013-11-16 21:46

目的蛋白分子量大情况下,电泳时间不要太长,你的protein marker中小的条带已跑出胶外了.
本人电泳时的目的样品分子量也比较大,450KD.我是依据溴芬兰条带的位置跑到底端时来停止电泳的,但目标产物好象是位于分离胶顶.因为我用的标准蛋白最大的分子量也只有200KD,所以，不知道最顶部的那条带是不是我的目的产物.
要使目的产物跑得更下来些,各位有什么好办法吗?谢谢!
作者: sunnyB    时间: 2013-11-16 21:47

最近想用sds-page来纯化蛋白，小样跑的时候，条带很清晰，分离效果也很好，但是上样量加大后，就无法分开了，不知道是不是因为上样量太大（样品的溶度很高）。昨天做了稀释梯度，但是很奇怪竟然出现纵带，横带都没出现，不知道是什么原因，求帮助！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:48

三十五、上样可真苦

我的细胞裂解之后，也是粘粘糊糊的，与载样缓冲液混合后，加入样品孔内，但是它竟出乎意料的又出来了，哎，郁闷啊！
请各位好心人帮一下，分析分析为什么？
作者: ALALA    时间: 2013-11-16 21:48


什么细胞，是否脂肪等物质含量较高？
”粘粘糊糊“可能由于核酸等存在，延长煮的时间10min。适当加大sample buffer的量。最简单的办法，煮完了之前再离心用上清进样。good luck!
作者: nikun230    时间: 2013-11-16 21:49


在裂解过程中DNA、RNA也被释放出来，使样品粘粘糊糊的。可以放到细胞裂解仪下超声剪切DNA、RNA，使样品不粘糊，我们实验室里的人是这样做的。
作者: bananapeople    时间: 2013-11-16 21:50


有很多战友问这个问题，样品很粘是因为核酸的原因，解决办法是
1，延长煮的时间，减少细胞培养液
2，增加溶菌酶，这点我们用后效果极好，是经验
至于加样后样品又出来一般因为样品中含有其他杂质，不知你的细胞是怎么处理的。
作者: wiwi    时间: 2013-11-16 21:50


1. BACTERIA11 说的对，蛋白样品很粘是核酸的原因。因为我曾经分别提取一种细胞的核蛋白和胞浆蛋白。在加入了reduding sample buffer后，胞浆蛋白的样品没有什么变化，而核蛋白的样品变得特别粘稠，用100μl的tip根本吸不上来，因此我想这也许是由于细胞核内的大片段DNA的缘故。

2. 解决办法：蛋白样品煮完了之后，将样品在冰上用超声剪切DNA。我的方法：100% amplitude, 0.5s cycles作用至样品不粘为止（一般100μl的样品，超声5次左右就可以了，可以说是立杆见影）。

希望对你有借鉴！
作者: vtongli    时间: 2013-11-16 21:51

如果超声不方便的话，可以在煮样品时用一毫升的注射器反复抽吸几次同时vortex，也可以有效的剪切DNA.缺点是会损失一部分样品。
作者: toy    时间: 2013-11-16 21:51


还是煮沸时间延长一些，；然后离心样品，用上清上样．这样简单，方便，我们一直这样做的．
作者: bluelake    时间: 2013-11-16 21:52


可以适量的加大缓冲液的量，煮沸5分钟后离心时间以10分钟为宜，样品跑出孔外可能是loading buffer的比例有问题。
作者: owanaka    时间: 2013-11-16 21:52


同意楼上各位的看法。
样品粘稠主要是核酸的缘故。
我的做法一般是超声裂解后静置30分钟，然后超低温离心30分钟。上样时小心取上清，就可以了。建议你试一试。
作者: xueyouzhang    时间: 2013-11-16 21:53


我也遇到过样品跑出来的问题,后来多加了点loading buffer就好了,你不妨试试!
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 21:54

三十六、关于2d上样量的一点看法

上样量低，分辨率低，有很多含量低的蛋白无法显示。2d的目的不仅仅是分离蛋白，更重要的是ms鉴定。虽说ms灵敏度很高，但经过ms样品处理点样的过程后，肽片段丢失很严重。所以有用硅化ep管和tip以减少肽片段丢失。
作者: ukonptp    时间: 2013-11-16 21:55


讲得不错,补充一点.平时分析差异时为了整个图谱的的清晰和图象分析的方便上样量不能过大,但质谱分析时为了突出某一个低丰度斑点,可以大大提高加样量,以获取足够的蛋白质;同样,也可以把同组内的几块重复胶上的相同蛋白质斑点集中在一起以增加质谱鉴定率.
一分鼓励!
作者: misswu61    时间: 2013-11-16 21:55


您可以用AMERSHAM的银染找出差异的点，再通过改变胶条的Ph的范围细化你要的点，然后您再加大上样量，一般是银染的10倍。然后去做MS。不知道大家是怎么做的？直接做银染好象结果不如考染好。
作者: birdfish    时间: 2013-11-16 21:56



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您可以用AMERSHAM的银染找出差异的点，再通过改变胶条的Ph的范围细化你要的点，然后您再加大上样量，一般是银染的10倍。然后去做MS。不知道大家是怎么做的？直接做银染好象结果不如考染好。 ...

可是，用窄pH范围的胶条上样量很大，这样很费clean up的盒子啊！
请问，您说银染的10倍是指考染上样量还是指窄ph范围的上样量。
作者: 喵咪    时间: 2013-11-16 21:57

上样量低，分辨率低，有很多含量低的蛋白无法显示。2d的目的不仅仅是分离蛋白，更重要的是ms鉴定。虽说ms灵敏度很高，但经过ms样品处理点样的过程后，肽片段丢失很严重。所以有用硅化ep管和tip以减少肽片段丢失。

====================================

请告知生产进口硅化ep管和tip的公司，谢谢！
作者: tieshazhang    时间: 2013-11-16 21:57


银染的10倍是指考染上样量.
作者: dmg    时间: 2013-11-16 22:02

请问热染（R350）、胶体考染（G250）较一般考染(R250)上样量可少多少？即他们敏感性差别到底多多少，R350和G250比较哪一种灵敏？谢谢！！
作者: eric930    时间: 2013-11-16 22:02


*各中染色的方法的灵敏度差异，可在卖试剂盒的公司手册/网站上查。
*要做质谱，银染肯定没有考染的容易出结果。考染上的点的含量已比银染高近100倍了；银染中有干扰质谱的试剂（X醛？）。倒是有用于质谱的银染试剂盒卖（去掉了干扰试剂）
*同意楼上。并且，2D最高可见NG的蛋白质点，细胞中的蛋白质可少到<50分子/细胞，许多这些低丰度的才是重要的功能蛋白质。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:03

三十七、上样缓冲液中的SDS能溶解原核表达的包含体吗？

原核表达后收集菌体，加入2X上样缓冲液煮沸后离心取上清跑SDSPAGE，上清中的蛋白是否是表达出的可溶蛋白，如果不是，那包含体是否可以被上样缓冲液溶解后进入上清？
作者: ilovegaga    时间: 2013-11-16 22:03

上清中有表达出的可溶蛋白，也有包含体中的蛋白，但包含体中的蛋白只能部分进入上清，包含体不能完全被上样缓冲液裂解；如果你只是鉴定目的蛋白是否表达，关系不大。
具体可以参考下帖：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/905904')
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:04


我需要鉴定是否可溶表达
作者: 30moonriver    时间: 2013-11-16 22:04



QUOTE:
原帖由 fqswdzd 于 2013-11-16 22:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
三十七、上样缓冲液中的SDS能溶解原核表达的包含体吗？

原核表达后收集菌体，加入2X上样缓冲液煮沸后离心取上清跑SDSPAGE，上清中的蛋白是否是表达出的可溶蛋白，如果不是，那包含体是否可以被上样缓冲液溶解后进入上清？ ...

总菌体跑出来的是总蛋白，不管包涵体是否溶解，鉴定的是总蛋白的表达量，如果想鉴定可溶表达，应该是将菌体破碎后，离心取上清，通过分析上清中的蛋白组份来进行判断是否目的蛋白以可溶的形式表达。
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:06


我用超声破碎后一直看不到上清中有表达，也尝试了降低诱导温度、转速、iptg浓度等等，郁闷。
作者: mysmdbl    时间: 2013-11-16 22:06

那就是看看沉淀有没有啊？很久不见拉！
换载体咯！
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:07

沉淀有,上清没有.用了3个载体pet28,30,32统统不行.我这个蛋白是植物中的一个酶,定位在细胞膜上,是否可能会在表达后与大肠杆菌的膜结合被沉淀那?
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:09

如果上样缓冲液不能溶解包含体，12000rpm离心后包含体不就会到了沉淀里吗？这样上样后跑的不就是可溶性蛋白了？
作者: fqswdzd    时间: 2013-11-16 22:09


上样缓冲液中的SDS能够溶解包涵体，有关于用SDS进行变性研究的，只是因为SDS与蛋白形成络合物，在复性中不容易去除，所以一般不用。我以前做的几个包涵体用1%的SDS就可以溶解，2乘SDS上样BUFFER中含的SDS为4%。另外上样BUFFER中的DDT或2-巯基乙醇可以打开蛋白的二硫键，使蛋白变性。如果你超声后的上清中不存在目的蛋白，沉淀中有，就证实你表达的蛋白是包涵体，改变条件或摸索复性吧！
作者: gogo    时间: 2013-11-16 22:10

这是我自己干的胶，用扫描仪扫描很好用奥

图片附件: 21835826.jpg (2013-11-16 22:10, 29.33 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=20479

作者: ero11    时间: 2013-11-16 22:10


楼主辛苦了。请问有没有什么软件可以分析每个泳道蛋白含量及纯度？
先谢过了！



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