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标题: 【求助】如何进行蛋白浓缩又不破坏空间结构？ [打印本页]

作者: popo520 时间: 2013-11-21 17:22 标题: 【求助】如何进行蛋白浓缩又不破坏空间结构？

请问各位大侠，我做Far WB,由于要保持蛋白空间结构，所以不能用TCA沉淀蛋白，但如果直接用透析后的蛋白上样，浓度又太低，跑SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色根本就看不见条带了，不知有什么好方法能把蛋白溶液浓缩一些呢？听说超滤膜可以，不知如何选择超滤膜呢？

作者: any333 时间: 2013-11-21 17:23

试试用PEG直接对透析带进行浓缩

作者: dog002 时间: 2013-11-21 17:23

蛋白浓缩方法基本有：
丙酮沉淀法；免疫沉淀法；三氯醋酸沉淀法；硫酸铵沉淀法；（低温）有机溶剂沉淀法；聚乙二醇沉淀法；超滤法；透析法；离子交换层析和冷冻干燥法……
1，丙酮沉淀法；三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。
2，免疫沉淀法：得有特异性抗体
3，硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析）
选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济，大多数的蛋白都可以用资格方法
4，（低温）有机溶剂沉淀法：强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg2+离子，pH值
5，聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀！
6，超滤法：主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法不易引起变性，不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的
7，透析法：主要用于更换蛋白质的缓冲液，得有透析袋。不需要特殊的仪器。一般用得是PEG20000进行实验，简单，快速，对蛋白没什么影响
8，离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩
9，冷冻干燥法：在冷冻状态下让样品中的液体升华，需要冷冻干燥机，该方法对蛋白活性保存最好。纯物理方法

作者: bring 时间: 2013-11-21 17:23

有条件的话，可以用浓缩管离心浓缩，比较快捷方便，millpore就有各种型号的浓缩管。补充一句，要低温离心

作者: popo520 时间: 2013-11-21 17:24

多谢各位朋友指教。请问PGE透析时怎么配这个透析液呢？好像蔗糖也可以用来透析。另外PGE20000 其中的20000是不是截留分子量的意思呢？也就是说PGE20000可以保留住 60KD以上的蛋白咯？我的目的蛋白是50KD左右啊

作者: popo520 时间: 2013-11-21 17:24

我试过超滤器，但是有个问题就是用超滤膜的话蛋白可能会附着在膜上，这样要损失一些蛋白啊

作者: any333 时间: 2013-11-21 17:24

PEG20000的20000不是指截留分子量，它是指PEG的平均分子量，截留分子量只与你所用的透析袋有关。

作者: popo520 时间: 2013-11-21 17:25

请问PEG的透析液怎么配呢？是直接把PEG加入蒸馏水配成30%-40%浓度么？还需不需要加别的东西和调PH呢？

作者: tangxin_80 时间: 2013-11-21 17:25

PEG20000，直接将透析袋放入PEG干粉中，量要少，PEG的吸水能力还是比较强的

作者: popo520 时间: 2013-11-21 17:26

还有一个问题想请教一下，不同分子量的PEG有什么区别呢？例如PEG8000与PEG20000，我该如何根据蛋白大小来选择不同分子量的PEG呢？

作者: tangxin_80 时间: 2013-11-21 17:26

就选PEG20000，选这个是应为它的分子量足够大，无法通过透析袋的膜相结构，如果选了小的分子量的，PEG就可能进入透析袋内部。你不想你的蛋白溶液里面再多一种杂质吧

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