Western bloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上,通常有两种方法:毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上,在凝胶上放一片NC膜,再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好,缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上,NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低,通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质(10%-20%)。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状,而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳,选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法,将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢,需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移,用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比,这种方法要快(15-45 分钟)。
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes,NC)和PVDF膜,此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。选择的根据主要有:a.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小);b.不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法,信噪比好);c.如果后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质,对蛋白有很强的结合能力,而且适用于各种显色方法,包括同位素,化学发光(Luminol类)、常规显色、染色和荧光显色;背景低,信噪比高。NC膜的使用也很简便,比如不需要甲醛预处理,只要在无离子水面浸润排出膜内气泡,再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了;比如NC膜很容易封闭,也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间,不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆,又容易卷,操作要小心,不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜,小于20KD的话建议选择0.2um的,如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维(CM)的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句:由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替,因此在封闭时最好使用较温和的 Tween20,而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果最好)。一般而言,NC膜越纯,其蛋白结合能力就越高,所以要增加WB的灵敏度和分辨率,提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到,会影响蛋白质结合。Protran由于是纯NC膜,比较脆,机械耐受力欠佳,需要小心操作,如果担心自己“粗手粗脚”,那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是最实惠的选择,只不过要自己动手裁剪——切记,必须带手套操作。