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标题: 【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误 [打印本页]

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:17 标题: 【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：
1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。
2 AP用别人旧的，结果胶不干
3 A液，B液用旧的，不干。
结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。
4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝
5 电泳时长板接负极，反了
6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。
再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)

作者: 2541 时间: 2013-12-12 16:18

我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。

作者: vcve 时间: 2013-12-12 16:18

我对跑PAGE也是深有体会，说出来与大家共享。
1.我们的AP一般分装后放在－20冰柜中，用时拿出融化，这样使用保存时间很长。
2.上样时一定同时在实验记录上记下你的上样顺序，因为如果你跑整块胶一定是不同的样，因此，脱色后可以根据记录大致判断出加样顺序。还有，上面的仁兄说得中间偏向空一个孔，两边加不同数量的样也可；再或者记住marker的位置，同样不会弄错左右面。

作者: ha111 时间: 2013-12-12 16:19

楼主，你老弟真行，别人遇上一个二个问题也就罢了，你竟然全碰上了，真有你的。呵呵。

SDS-PAGE 所用的溶液一般有效期为一个月左右。但是10%SDS溶液的有效期为一周，且常温保存。如4度保存会结晶。AP的有效期也为一周。

我用的电泳仪是BIO-RAD的电泳仪，灌胶时不用封底。

作者: mysmdbl 时间: 2013-12-12 16:20

10%SDS溶液我常温存了半年多还是可以用的

作者: mimili_901 时间: 2013-12-12 16:20

我们溶液除了AP和temed都在室温放着，时间都在一个月以上（AP，三周以上），以前没有出现任何问题！不过最近靠近上边的带没有跑出来，就是缺带了，可能是时间太久了（有半年了），马上重配，再试试！

作者: zranqi_1 时间: 2013-12-12 16:21

我和同学做实验时配了1000ml 10%SDS，结果全科人用了一年多将近两年也没见出什么问题，也就是常温放置。

作者: kuaizige 时间: 2013-12-12 16:21

sds没问题的，但是低浓度ap最好当天使用，半衰期很短

作者: DONT 时间: 2013-12-12 16:22

sds一般可以常温保存不会失效，但AP最好每次都要新配，如果低温保存一般的保存时间是一周，最好不要超过两周，以免失效，反正我们可以少配。剥胶时我们可以一边撬玻璃板一边用流水冲洗，一会就可以完整的剥下来。

作者: gogo 时间: 2013-12-12 16:22

我这里AP在－20度放置，temed在4度放置，其他在室温放置，基本上多半年无问题。我的体会是，电泳缓冲液很重要，最好用数次就弃去，还有上槽液和下槽液要分开，用几次后，可以将上槽液改为下槽液，弃去下槽液。当然这是针对Bio－Rad这种上下槽分开的系统。

作者: glass 时间: 2013-12-12 16:25

我的AP是分装成小管，放－20保存，每次用一管，印象中半年是没问题的。TEMED是放4C。其它常温放置。另外配制顺序最好是TEMED先加，然后再加AP，因为没有TEMED，AP也可以引发聚合反应，只不过速度稍慢一些，对于学过高分子的人这些最清楚。

作者: kuaizige 时间: 2013-12-12 16:26

请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！

作者: zhenxin 时间: 2013-12-12 16:27

琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

作者: H2O 时间: 2013-12-12 16:27

我跑12%的胶，没出现过你说的深带。
我一般是细菌沉淀直接加样品buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，效果还行

作者: kuohao17 时间: 2013-12-12 16:28

1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:28

琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

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你用的琼脂粉是多大浓度的，我用2%都不能好。

作者: xingyi08 时间: 2013-12-12 16:29

我用1%的琼脂封胶效果很好，有时候琼脂的质量不同，用的浓度就不同，我们实验室发现即使是同一厂家不同的批次质量都不同，你的琼脂可能质量不好，你可以加大浓度试试。

作者: ALALA 时间: 2013-12-12 16:30

细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？

作者: utt0989 时间: 2013-12-12 16:30

胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:31

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-12-12 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

我参考的是：汪家镇的＜蛋白质技术手册＞，那本书还是很常用的。

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:31

QUOTE:

原帖由 kuohao17 于 2013-12-12 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的 ...

TEMED可以加倍，只要在10ul以下，AP可以加二到三倍。

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:33

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。

作者: zwsyrt 时间: 2013-12-12 16:33

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原帖由 6327555 于 2013-12-12 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。

有什么用处？怎么跑呀？
pfpf

作者: 6327555 时间: 2013-12-12 16:34 标题: 回复 #23 zwsyrt 的帖子

他是法医的，好象用来做分析吧，具体我也不是很清楚

作者: plaa 时间: 2013-12-12 16:35

QUOTE:

原帖由 6327555 于 2013-12-12 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
他是法医的，好象用来做分析吧，具体我也不是很清楚

弓虽！
请问他是用什么板配的？多厚？是不是要跑双向？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-12-12 16:35

如果有条件，可以用Bio-rad的电泳仪，就不用封了，非常方便。

至于APS可以先配好，放到-20度冰箱冻存。

作者: avi317 时间: 2013-12-12 16:36

请问跑小肽分子，除了加甘油及胶浓度还有哪些好办法？能否具体提供帮助？谢谢了

作者: kuaizige 时间: 2013-12-12 16:36

我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。

作者: kuaizige 时间: 2013-12-12 16:36

另：不好意思，请教AP是什么东西的缩写啊？（汗颜）

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 16:37

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另：不好意思，请教AP是什么东西的缩写啊？（汗颜）

应该是过硫酸铵，但我知道另外有种缓冲液的缩写也是AP。

作者: mimili_901 时间: 2013-12-12 16:37

1%琼脂粉封边很好用

作者: wood533 时间: 2013-12-12 16:39

我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。

我们用一种特殊的枪头，比10ul的长许多，专门用来加样的。

作者: tangxin_80 时间: 2013-12-12 16:39

我可能见过的，也是白色的那种，有点像200微升的那么长是吗？

作者: tangxin_80 时间: 2013-12-12 16:40

每次跑的时候，电压小点，时间长点，带就不会歪了。

作者: huifeng0516 时间: 2013-12-12 16:42

不好意思，请教AP是什么东西的缩写啊？（汗颜）

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Ammonium Persulfate 过硫酸铵

作者: tangxin_80 时间: 2013-12-12 16:43

每次跑的时候，电压小点，时间长点，带就不会歪了。

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那么请教你们一般电压是多少呢？我是在积层胶用8V/CM,分离胶用15V/CM

作者: fei1226com 时间: 2013-12-12 16:44

请问我跑2DE时，横纹有点多，大分子蛋白很少，请问有什么解决方法呢，急！

作者: INK 时间: 2013-12-12 16:44

我做SDS-PAGE时用Bio－Rad的电泳槽，一直都很好用。但是用的时间长了有时会出现漏胶的现象。不过总体来说还是很好用的。很方便，但就是价格也很贵。关于AP我看还是现用现配，每次称100mgAP，加1ml水就行了。很麻烦吗？我觉得比拿出来解冻要省时间。其实SDS-PAGE做的好坏关键在于你的样品好坏。还是在制样上多花点心思比较好。至于加样的问题可以用微量进样器，要注意每次用完后洗干净，否则容易堵。有条件的话也可以买专门上样的枪头，200ul的那种，我们实验室有，很好用。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-12-12 16:45

相关疾病：
头痛
我刚进实验室,近一周做SDS-PAGE时也遇到了头痛的问题:分离胶凝后总是双层,上层大约2mm;跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?

作者: fei1226com 时间: 2013-12-12 16:45

我也遇到同样的问题。我认为这是上层密封液（水或饱和正丁醇）与下层胶的缓冲带，其中也含被稀释的胶液，因此也可聚合，但是因为浓度稀，聚合时间短而无法形成凝胶，只能形成一个折光系数不同的液相。一般我是如此解决，就是当估计下面已经完全聚合时，倒去上层密封用的饱和正丁醇或水，这时，上面那条细带也一起被倒掉了，然后用水冲洗，继续灌制浓缩胶即可。
此处的关键是一定不要聚合过长时间，否则，上面那条细带就也聚合成凝胶，而无法冲洗掉了。
哪位还碰到过这个问题，同时你又是如何解决的，大家一起讨论，看能否找出真正的原因和最佳解决方案。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-12-12 16:46

谢谢您的指教。我又做了一次，速度加快了不少，封水时动作轻些，胶凝得很好。

作者: mimili_901 时间: 2013-12-12 16:46

相关疾病：
头痛

我刚进实验室,近一周做SDS-PAGE时也遇到了头痛的问题:分离胶凝后总是双层,上层大约2mm;跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?

跑胶时在染色带前总出现一条很细的条带,不知是何缘故?
这个问题是怎么回事啊，我在实验中也出现这些细的条带，不知道该当何解释？

作者: PINK 时间: 2013-12-12 16:47

分离胶凝后为双层,我作实验没有遇到过.会不会是gel solution没有配好.

跑胶时出现的细条带是不是小分子条带?

作者: 33号 时间: 2013-12-12 16:48

胶所用的浓度可根据<分子克隆实验指南>中的分子量而定，一般情况尽量将目的条带放在范围中间，这样跑出的带很好，还要注意电压，但我们有时从头到为都用200v效果也很好，可以试试

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 16:49

很奇怪，我同学灌的分离胶就没有分层的情况发生，不过他的胶是0.5mm的，会不会跟胶的厚度还有关系

作者: 2541 时间: 2013-12-12 16:49

上样液好像至少是2倍的，最终使加样时样品向孔内沉降，不大会出来的。

别的感觉就是按照书上的就可以，关键时缓冲液要时新的

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 16:50

我今天灌分离胶之前，将它复温至室温，结果未出现分层的情况，我想大概胶的温度很重要吧

作者: u234 时间: 2013-12-12 16:50

QUOTE:

原帖由 linlinstar 于 2013-12-12 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我今天灌分离胶之前，将它复温至室温，结果未出现分层的情况，我想大概胶的温度很重要吧

灌分离胶之前？？

应该什么分层呀？

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 16:50

将分离胶gel solution 复温至室温后使用可以避免分离胶聚合后出现分层.

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 16:51

遇到一怪事：电洗脱后的蛋白SDS-PAGE，银染后发现蛋白泳道呈金黄色，而其他区域背景是棕色，不知是何原因，各位高手请指教！

作者: 3648755 时间: 2013-12-12 16:52

sds比较稳定，一般可以常温保存不会失效，但AP很容易失效，我的经验是将其干粉定量分装于EP管中，固体状态可以长期保存，临用前加入ddH2O溶解就可以了。

作者: xue258 时间: 2013-12-12 16:52

若使用用了长时间的系统灌胶，又漏的话：可用封口膜在装好的二玻璃板封口，压紧，就少漏了。

作者: 2541 时间: 2013-12-12 16:53

AP确实需要现配现用，不能存在侥幸心理，我开始做的时候就因为不重视吃了亏；另外我的TEMED（4度保存）和SDS（常温保存，温度低了易结晶，可以放到温箱中溶解）一直用了半年都没有问题；电泳液短期使用没有问题，稀释后使用建议不要超过三次！

作者: 00无名指00 时间: 2013-12-12 16:53

现配的AP可以让胶凝的好一点
而且有时AP潮了也会出现胶不凝

我们用微量加样器，就是50ul的注射器，针头是像细铁丝一样的
很方便

作者: vivian4123 时间: 2013-12-12 16:53

我们教研室配的10%SDS100ml刚开始溶得很好，不过在室温放置2~3周就出现灰网状物，刚开始怀疑是瓶子不干净，倒掉重配又是这样，不过倒是还能用。不过用的时候让人提心吊胆，大家有解决的好办法吗

作者: 3648755 时间: 2013-12-12 16:54

我跑SDS－PAGE的时候，会在最两边的加样孔加入等量的纯加样缓冲液。这样可以防止边缘效应使胶比较容易跑齐；而且我加样的时候习惯在MARK后面空一个胶孔，也可以帮助记忆点样的位置的。

作者: qianqin1977 时间: 2013-12-12 16:55

我用2%琼脂封胶，效果不错，关键是槽内要多到点儿，否则易漏胶。

作者: hold住 时间: 2013-12-12 16:55

我们教研室配的10%SDS100ml刚开始溶得很好，不过在室温放置2~3周就出现灰网状物，刚开始怀疑是瓶子不干净，倒掉重配又是这样，不过倒是还能用。不过用的时候让人提心吊胆，大家有解决的好办法吗

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换SDS吧（换个厂家的或者换个经销商的），我也遇到过，后来SDS就永远不和那家经销商做了，问题也再没有出现过。

作者: 98776langtao 时间: 2013-12-12 16:58

蛋白质电泳配的10×TBE母液,使用时用1×TBE时,是不是取一份10×TBE母液,加9份水啊？若用０.5×TBE，是不是取一份母液加１９份水啊？

实在不好意思，太简单的问题

作者: 49888 时间: 2013-12-12 16:59

SDS-PAGE中AP的质量与新旧比较重要，我们一般将其分称于几个EP管中，用时再用ddH2O溶解，一般只用一周左右；

SDS应该不会出现什么问题，放一年左右都没大问题；

电泳缓冲液一般只可用2次，多次重复使用会出现拖尾带

作者: 49888 时间: 2013-12-12 16:59

蛋白质电泳用的缓冲液应是Tris-甘氨酸，TBE是用来电泳核酸的；

10×一般指的是10倍深度，用时稀释成1倍。

作者: 49888 时间: 2013-12-12 17:00

虽然此帖发了快一年了,但我还是和大家分享一下我的经验,希望对后来者有些须帮助:
1.用琼脂糖封胶好象优点奢侈,除了用琼脂粉以外还可以用12.5%的淀粉,煮沸致透明即可.
2,APS配好后可用EP管分装,保存于-20度
3,一般的电泳仪的正负接头都有颜色指示,红色示正极(bio-rad),有的(大板)红色指示的却是负极.
4,marker点了就好分辨点样顺序,可不用切角,但不点marker时却必须点上.
5,剥胶时可把浓缩胶刮掉,一边用流水冲洗一边剥,这样比较保险.

作者: 百分比 时间: 2013-12-12 17:01

10% 的SDS放在室温或4℃都会出现沉淀,加热一下就可以了.

作者: 8s5g 时间: 2013-12-12 17:01

请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com

回答:
1,正常;
2,12%跑20kD没问题的;
3,细菌沉淀我们是加1倍的buffer,沸水煮8-10min,小离心机12000rmp5-10min;煮的时候要小心EP管,没盖严或崩开的话样品就会有特浓的情况发生.
4,这里有很多做过蛋白表达的,本人做过三年.

作者: uuooii 时间: 2013-12-12 17:02

今天做胶,所用凝胶储液,分离胶和浓缩胶BUFFER都是去年11月底的,居然也凝固了,不知这样的胶能否用来电泳?
另外在灌胶时发现分离胶和浓缩胶溶液里都有少量白色絮状沉淀,不知是不是溶液放置太久之故还是本身就有的,因为以前做实验时也发现过类似的现象.
谢谢指点!

作者: 33号 时间: 2013-12-12 17:04

最近一直跑同工酶，不知道大家凝胶时是什么温度？个人认为高温下使凝胶快速聚合比较好，特别是4mm的厚板，根本不用封水，特别平。常温下自然聚合经常会出现锯齿状的边缘，就是不知道对电泳有没有影响。感觉没什么差别

作者: xue258 时间: 2013-12-12 17:04

琼脂是可以封底的，我们实验室一直在用哦，而且效果很不错。凝固几分钟就可以了

作者: INK 时间: 2013-12-12 17:05

我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?

作者: bamboo16 时间: 2013-12-12 17:06

我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?

作者: orangecake 时间: 2013-12-12 17:06

琼脂粉可以用的，我就是用这个，其实没什么影响的，2％的琼脂粉凝结的很慢，我每次用4％啦，从没出现过漏胶的问题。另外SDS我也是常温放着的，TEMED我是常温避光放置，AP 4度保存。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能久置，最好新配。其它的问题也就是熟练而已啦。

作者: popo520 时间: 2013-12-12 17:07

最近我在跑SDS-PAGE时，发现胶上部分条带出现山峰状的高耸，有点象心电图的样子。第二个问题是：肉眼看胶的背景很干净，可是用Amersham的
Image Scanner进行凝胶扫描时，调整对比度后却发现有显色比较深的竖条带贯穿在某个样品的蛋白条带上下。请问各位高手这是什么原因导致的？以前丁香园曾有帖子说这是因为存在不溶性蛋白的缘故，可我的样品全都是可溶性蛋白。
我想把自己的“问题”凝胶上传给大家分析，可是我发现可以上传的那个项目好像消失了，所以我不知道该如何让大家看见我的胶。抱歉，只能口述了。

作者: popo520 时间: 2013-12-12 17:08

对于大家上述谈到的问题，我也说说自己的体会。
（1）AP我们一般是现用现配，配好后未用完的一般在4度保存一周。一周后的必丢弃。
（2）10%SDS在室温保存一年，感觉也没什么问题。气温下降时可能会出现白色絮状物，当时碰到这个问题，我是把旧溶液丢弃，重新配制。后来我们实验室的技师说，加温溶解后应该还可以用。但本人没试过。供大家参考。
（3）1M Tris(pH6.8)和1.5M(pH8.8)我也放在4度保存，理论上说在室温保存即可。可我们室温保存的Tris曾发现絮状物，我不太清楚什么原因，可能是配置时间太长了？但我感觉放4度保存效果很好，已经大半年了，没有出现絮状物的情况。
（4）TEMED我们是4度避光保存，丙烯酰胺棕色瓶4度保存。理论上，TEMED是易吸湿的无色液体，吸水则加速氧化变成黄色，会降低其增速作用，最好不要用。暂不用者最好密封保存在深冻冰箱中。但我们4度保存的TEMED通常都是黄色的，感觉用起来也没什么问题。丙烯酰胺理论上4度可保存一个月，但我们通常都会超过这个时间期限，可能至少也有2、3个月，也没什么问题，但还是建议大家配制溶液时一次少配点，譬如50ml或100ml。

作者: popo520 时间: 2013-12-12 17:08

另外我们实验室用的是Amersham的电泳仪，是用凡士林来封底的。用起来也很方便。

作者: 莲花白 时间: 2013-12-12 17:08

大家有用5*LOADING BUFFER的吗??配方就是分子克隆的浓缩一下是吗???

作者: 831226 时间: 2013-12-12 17:09

为何我跑的胶老是歪的，用的是国产电泳仪

作者: 12xunmei 时间: 2013-12-12 17:09

经验而已,用1.5%的琼脂糖封胶相当好!
当然,其实各实验室都有自己的一套东西,希望大家多交流。俺是新的手啦，不懂的很多。

作者: sunnyB 时间: 2013-12-12 17:10

maker可以放在一测，另外我们做完分离胶后用异丁醇封顶，效果挺好的，不妨试一试

作者: 49888 时间: 2013-12-12 17:10

我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢，分离胶就没有，为什么啊？

而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到，要么变成很细的很近的两条带，是怎么回事呢？换了一管新的也是一样！

作者: orangecake 时间: 2013-12-12 17:10

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原帖由 49888 于 2013-12-12 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢，分离胶就没有，为什么啊？

而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到，要么变成很细的很近的两条带，是怎么回事呢？换了一管新的也是一样！ ...

哈，又见面了
胶凝的慢不用说，肯定是试剂的问题，想解决，那就把temed多加2ul，，aps增加10左右，保证快些，另外你的aps建议重赔，此外凝的时候放在37度也会快点。
你的marker其他带怎么样，而且最大的本来就比较浅，出现两条带可能使你跑胶的问题

作者: 49888 时间: 2013-12-12 17:11

我也有问题想问一下，为什么跑胶中会出现条带的歪斜

作者: 8s5g 时间: 2013-12-12 17:11

如果是试剂的问题的话为什么分离胶可以在30分内就可以凝好呢？我APS是配好后分装，拿了一管新的也是一样啊！我想我现在跑胶是有点问题，可到底是什么问题我还不知道，在注意一下拉！

作者: avi317 时间: 2013-12-12 17:12

问大家一个问题，我最近跑胶时，发现分离胶下边距离边缘1cm的地方经常出现比较大的气泡状的东西，今天更坏的是下边的分离胶竟然裂开了，而我这次配胶是昨天晚上配的，今天早上用，刚开始并没有气泡产生，过了几个钟头之后才开始出现气泡的，而且溴芬兰遇到气泡后就变成了黄色。我今天加了冷凝水，应该不是温度的事情，请问谁知道该解决这个问题，我已经遇到这个问题不下6，7次了，谢谢！！！

作者: 8s5g 时间: 2013-12-12 17:13

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原帖由 avi317 于 2013-12-12 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

问大家一个问题，我最近跑胶时，发现分离胶下边距离边缘1cm的地方经常出现比较大的气泡状的东西，今天更坏的是下边的分离胶竟然裂开了，而我这次配胶是昨天晚上配的，今天早上用，刚开始并没有气泡产生，过了几个钟头之后才开始出 ...

我们曾出现过这种情况，主要因为玻璃板不平或不干净所致，胶凝时会收缩，与玻璃板之间如果结合不紧密的话，那就会出现气泡或者裂开了，你只要换一块板或者好好洗洗，就应该没有问题了

作者: kswl870 时间: 2013-12-12 17:13

我在铬酸中泡过玻璃板，应该挺干净的，至少比我以前的干净，不过，下次再好好洗洗试试。另外，可能的原因我想是不是ap，我的ap用了好久了，今天我重新配了，到现在为止胶还没裂，因为我现在跑14%的胶，可能ap对他影响比较大。

作者: rxcc33 时间: 2013-12-12 17:13

大概没有比不拆封胶边条更让人郁闷的了，尤其有一次已经跑了近一个小时。可别忘

作者: bs4665 时间: 2013-12-12 17:14

我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?

1、当然电压大了，胶跑的快，时间短，分离效果差，所以如果要跑胶的样品蛋白的分子量差别不大的话，要用的电压要小，这样分离效果好；如果分子量差别大的话，就用大电压，可以快速看到结果。
2、菌液样品一般要小电压，因为它的蛋白多，电压大不容易分开

作者: 8princess8 时间: 2013-12-12 17:14

根据我们实验室的经验。一般使用的是恒流。压缩胶15mA,分离胶30mA.

作者: mysmdbl 时间: 2013-12-12 17:15

还是恒压好，100V

作者: yes4 时间: 2013-12-12 17:15

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。好嘿人哦！
如果有条件，可以用Bio-rad的电泳仪，就不用封了，非常方便。

不过我研究了bio-rad的制胶装置，然后自己做了一个同样的，效果不错哦！
我下面用的是一般的软泡膜，不过上面有一层透明胶，然后用我自制的夹子把两个玻板夹在上面，灌胶，效果完全与bio-rad 的媲美，为什么国内就没人搞过这个了，象6.1那个烂厂，就没有想过人性化吗，十多年了还是老产品。

作者: caihong 时间: 2013-12-12 17:16

没有是什么，我要是写下来的错误都可以写好几张纸了

作者: huifeng0516 时间: 2013-12-12 17:16

如要做8%的分离胶，我知道8%是指丙烯酰胺在凝胶中的百分比，但是我不知道它是怎么算得的，请大家帮帮我。谢谢！

作者: pengke1983 时间: 2013-12-12 17:16

请教:细菌粉碎后是用上清还是沉淀来跑电泳?

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:17

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原帖由 pengke1983 于 2013-12-12 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教:细菌粉碎后是用上清还是沉淀来跑电泳?

你若是不知道表达的蛋白究竟是在上清，还是在沉淀，那你就得用“细菌超声粉碎后上清和沉淀”一起跑电泳，通过PAGE胶就晓得究竟是上清，还是沉淀有你所需要的目的蛋白。

沉淀可适当用蒸馏水稀释，和上清一样的方式处理SDS-PAGE模板。

再次推荐以下好的网站，图文并茂地分析了SDS-PAGE常出现的问题。愿对战友有所帮助！
SDS-PAGE: Examples of bad gels
cuturl('http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html')

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:17

我们在蛋白质印迹中发现：APS固体在室温保持的时间不长。有段时间我发现胶始终凝不了，用了师兄的APS（从我这里分装然后保存于－20°c）来配10％的APS后，胶就凝固了，所以我认为过硫酸氨最好是在低温保存。仅供参考。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-12-12 17:18

我用的是分子克隆提供的方法，配制12%的分离胶，水饱和的正丁醇封，但是总有少量的不凝，就是跟正丁醇接触的部分，请问是怎么一回事啊？我倒是一直这样做的，倒也能出来，今天看见大家在这里讨论，还是想问一问。谢谢！

作者: 喜乐lele 时间: 2013-12-12 17:18

我做SDS-PAGE时用Bio－Rad的电泳槽，一直都很好用。但是用的时间长了有时会出现漏胶的现象。

我们试验室也会出现类似的状况，我认为主要是卡口没有卡紧，可以用滤纸垫在卡口处，这样玻璃与低下的皮垫之间的接触会更紧密，那么就基本不会漏胶了

作者: 30moonriver 时间: 2013-12-12 17:19

我想在次问一个问题,为什么我最近加完浓缩胶加好梳子以后,等干了以后浓缩胶却在两端有部分的干裂??
请指教

作者: standbyme 时间: 2013-12-12 17:19

细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？

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有时1×buffer会降低样品浓度，导致条带不清晰

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:20

我也是第一次做，我用的是BIO-RAD0.75mm,想请教大家加样时用什么东西加呢？用微量进样器吗？我把tip头前面加了个6号半针头可以伸到孔底，可是一加样就向两侧的孔溢出去，害得我每加一个样都要洗半天旁边的孔：（（
另外跑出来的条带总是有些歪斜，是什么原因呢？好的电泳跑的时候染料带是什么形状呢？
还有我用的12%的分离胶感觉看胶时很容易卷曲，不知道哪里出了问题。
谢谢各位指教啦。

有专用的上样枪头啊，适合20ul加样枪用的。大的耗材公司都有卖。

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:21

我想在次问一个问题,为什么我最近加完浓缩胶加好梳子以后,等干了以后浓缩胶却在两端有部分的干裂??
请指教

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可能是最近天气干糙的缘故，水分蒸发得快。我是每次把梳子都插到底，不让胶和空气有太多接触。

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:21

我用的是分子克隆提供的方法，配制12%的分离胶，水饱和的正丁醇封，但是总有少量的不凝，就是跟正丁醇接触的部分，请问是怎么一回事啊？我倒是一直这样做的，倒也能出来，今天看见大家在这里讨论，还是想问一问。谢谢！

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其实用双蒸水封闭效果很好，胶的上沿压得很平，只要加水时小心不要冲淡了下面的胶液，凝固后胶很整齐很少不凝的。

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:21

我也遇到同样的问题。我认为这是上层密封液（水或饱和正丁醇）与下层胶的缓冲带，其中也含被稀释的胶液，因此也可聚合，但是因为浓度稀，聚合时间短而无法形成凝胶，只能形成一个折光系数不同的液相。一般我是如此解决，就是当估计下面已经完全聚合时，倒去上层密封用的饱和正丁醇或水，这时，上面那条细带也一起被倒掉了，然后用水冲洗，继续灌制浓缩胶即可。
此处的关键是一定不要聚合过长时间，否则，上面那条细带就也聚合成凝胶，而无法冲洗掉了。
哪位还碰到过这个问题，同时你又是如何解决的，大家一起讨论，看能否找出真正的原因和最佳解决方案。

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加水封闭是，尽量小心轻轻加，不要让水和胶液混在一起冲淡了胶液。这个考手艺了

作者: popo520 时间: 2013-12-12 17:43

SDS-PAGE中，相对于分离胶而言，浓缩胶一般加多少？

蛋白快跑到分离胶底部时，出现严重拖尾现象，会不会因为浓缩胶加得太少，这样，蛋白在浓缩胶里80V的低电压时间就比较短，是因为这个原因吗？

新手成长中，望指教！

作者: u76mp 时间: 2013-12-12 17:44

我要说两点：
1。琼脂粉可以用来封底，不会漏，如果封不住，那是因为琼脂粉用的时间太长了，或者太稀、太浓了，经验上1-2%的最好用，
2。10%SDS室温放置，用半年以上没有问题

作者: c86v 时间: 2013-12-12 17:44

（1）10%SDS本身浓度很高，在4℃时肯定会结晶析出，而且SDS很稳定，配好以后直接放在室温保存即可。
（2）对于电泳的所有试剂而言，包括各种Buffer、gel solution等最好使用三重蒸馏水。原料有条件的尽量选进口的。
我有一次用国产的丙烯酰胺，最后胶稠而不凝，好不容易才找到原因。
（3）对于电泳中分离胶Buffer和浓缩胶Buffer要用pH计调。
（4）分离胶用水封即可，要慢，慢工出细活！

作者: greenbee 时间: 2013-12-12 17:46

我认为有几点是十分重要的：
1，丙烯酰胺和甲叉*的质量十分关键。进口的比较值得信赖，如果用国产的，一定要加上滤纸过滤这一步骤方可放心。
2，ph值调整的十分精确是相当重要的，对于出来漂亮的结果很关键。
3，电泳缓冲液的清洁和ph值正确也是很重要，1*buffer室温不可久置，容易长菌，然后一电泳胶上就十分不干净。
4，样品盐浓度和其他杂质对条带的漂亮不漂亮影响很大，透析一下往往会有好结果。

此外，有说低温长时间聚合对跑胶好的，也有认为让温度高一点快速聚合了对跑胶好的，我的对比是感觉差不多，如果急用，温度高点没有关系。按照我的体会，10％AP在－20度下半年后依然有效。

作者: one 时间: 2013-12-12 17:48

我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？

作者: shenkunjie 时间: 2013-12-12 17:48

浓缩胶中的样品跑了一段时间后，临近两个上样孔之间会出现一丝的泄漏，可是是胶没有凝结好的原因。但是延长凝结时间不能解决这个问题，请问有什么好的办法吗？

作者: remenb 时间: 2013-12-12 17:49

我也是新手，做SDS的时候也犯了好多错误，刚开始的时候胶要好几个小时才凝，后来发现是AP失效了；还有经常出现漏胶的问题，后来发现是我封底的时候封的不好；前两天还犯了一个错误，最近天气热了，我用琼脂糖封的时候晾的时间短，在胶加入的最后一刻一下给漏了，嘿嘿；还好，没有出现正负极接反的情况，因为这一环节是师兄特意给我强调过

作者: duoduo 时间: 2013-12-12 17:50

浓缩胶黏稠但不凝,是AP的问题?

作者: zhenxin 时间: 2013-12-12 17:51

我是新手，觉得这个主题不错，也来说几句，大家不要笑我。我现在最痛恨的是自己的毛手毛脚，前几天配染色液时把甲醇撒身上了，昨天配胶时不但没凝，插梳子时用力过猛居然喷出来到脸上了。搞的我郁闷的不行，估计象我这样的白痴错误没有几个人会犯，还是写出来，希望同样毛手毛脚的人引以为戒，可都是毒物啊

作者: yjf1026 时间: 2013-12-12 17:53

大家共勉吧我觉得做实验应该把要用的东西都事先想好，免得要的时候找不着甚至还要现配很郁闷的个人今天犯的错误就是加一抗封膜的时候没封好，一抗居然露出来了，还好是tubulin的抗体，要不老板要郁闷死

作者: xingyi08 时间: 2013-12-12 17:53

小肽可以用TRICIN-SDS-PAGE
区分正负极电泳缓冲液

作者: DDD 时间: 2013-12-12 17:53

剥胶时，为什麽切角?胶有正反面吗?PVDF膜有正反面吗?请求大虾指点.

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:54

切角主要是让你自己能够知道你加样的顺序，避免自己都不知道什么是什么的。胶和PVDF膜都没有正反面，both OK。

作者: =菓子= 时间: 2013-12-12 17:54

说实在的,我用的AP曾经在4摄氏度放置了两三个月还能正常使用!

作者: PCR 时间: 2013-12-12 17:54

这些问题处在一个人身上真是够牛的，不过，我开始做的时候还真没有遇到这样的错误，我就是犯了一个低级的低级的错误，都不好意思说。这里有很多的经验之谈，开始做的时候就是在这里查了好多经验的整理，还是很有借鉴。

作者: 8s5g 时间: 2013-12-12 17:55

请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com

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离心后，上清点样不会很浓，一般都比较好上样。但沉淀很粘，上样会比较困难，跑出来也不是太好看。不过有时候不能排除目的蛋白是否是包含体，所以沉淀也必须上样。

作者: linlinstar 时间: 2013-12-12 17:55

我刚做时胶老是不凝，后面分析与AP有极大关系，虽然是现配，但配好后一直放在外面，且没有塞子隔绝空气。另外我还发现冬天胶凝得较慢，所以配好后可以适当的加热，可以大大缩短凝胶的时间，但一定要把握好时间，感觉烧杯底部温热即可，否则还没有灌胶就已经凝了。

作者: wmp1234 时间: 2013-12-12 17:56

其实我也犯过很多错误，比如有一次煮溶液的时候没检查，居然进了水，结果有好几个样跑出来都是空白，当时那个悔啊！

作者: 98776langtao 时间: 2013-12-12 17:56

好像根据气温的不同要调整AP和TEMED的剂量，而且我个人认为低浓度的AP还是当时配比较好

作者: ero11 时间: 2013-12-13 15:10

前后Tris 的PH值搞错，胶一般不会出现不凝,除非试剂失效了,主要考虑APS和TEMED，其中APS放置过久最易导致失败。制胶时TEMED可根据季节温度的不同，酌情加多或减少，不至于天热时胶凝的过快天凉时长时间不凝。另外天热时，储液可放在4度，制胶时会延缓凝胶过快。把握一个温度高化学反应速度快，低温速度慢的原则。

经常电泳的，APS -20分装保存，每管装几百微升，可反复冻融至用完或感觉不爽的时候。偶尔做电泳的最好新配。
TEMED可分装几百微升到EP管，4度或室温，室温放时最好避光，找个棕色小瓶能放下EP管即可。

作者: ero11 时间: 2013-12-13 15:10

要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。

列举一些新人犯的错误：
配胶时加错试剂；
电泳时未通电或未及时通电；
先上样后加缓冲液；
正负极搞反；
缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；
样品煮完没离心；
电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；
电泳过程中漏液等

作者: duoduo 时间: 2013-12-13 15:11

Posts: 504
Score: 42
2003-08-04 20:35
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有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。

？？？？？？？？？？
不会吧，我只要多加了一倍，胶就特别粘，连梳子都拔不出来，拔出来胶都变成了丝状，跑不了电泳的

作者: 131415 时间: 2013-12-13 15:12

记得有一本《电泳技术》的书，里面对跑胶写的非常详细，有问题或者刚开始做还是先参考参考！

作者: ero11 时间: 2013-12-13 15:14

SDS一般可以常温保存半年不会失效，但AP最好低温保存，一般的保存时间是一周，TEMED很会受潮，放在四度冰箱一定要密封好，不然TEMED吸水后浓度变低，接着按常量加胶凝不了。

作者: greenbee 时间: 2013-12-13 15:15

我最近跑得胶总是带特别粗，电流也不是很大，是什么原因阿？

作者: bring 时间: 2013-12-13 15:21

我的SDS-PAGE 用了半年却还能用。10%SDS溶液两年了目前号好着呢，他是结晶的用前热水浴溶解即可，常温保存。AP用一个月肯定没有问题。快过期的甲叉试剂会使胶凝固时，梳子的齿处长短不齐。

作者: 98776langtao 时间: 2013-12-13 15:22

teme好像用了10年了，没有问题，不可思意

作者: am10 时间: 2013-12-13 15:22

哪位老师同学能帮我跑个SDS－PAGE，这只是我实验的一小部分，觉得没必要购置整套设备与药品，就做一次实验，太浪费了哦
我在北京哦，谢谢

作者: bamboo16 时间: 2013-12-13 15:23

我们用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做过GFP，也列下错误：
1. 用错了running buffer,跑出来的带呈彩虹弧形，而且跑得非常慢
2. 第一次抗体浓度过高（1/500），跑出来的带看不出浓度差异，第二次一级抗体和耳机抗体的稀释比率分别是（1/1000和1/4000），效果比较理想。
3.目前正在进行中的是一次跑两批蛋白(两张胶），但是出来结果一张有一张白版，不知道是什么原因。。。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-12-13 15:23

10%SDS溶液的有效期为一月，常温保存。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-12-13 15:24

我也是刚进实验室，尽犯些不该犯得小却致命的错误，每次都懊恼得想撞墙，现得一结论，做实验一定到认真，每次都把protocol重写一边，做到哪划到哪，省得出错。

作者: H2O 时间: 2013-12-13 15:25

90－100KDA分子量的蛋白大约用多少浓度的胶啊？

作者: jujuba 时间: 2013-12-13 15:25

我也要做小肽分子，77.5-12.5kd的，请问我的胶要多大浓度为佳。
谢谢指教

作者: abc816 时间: 2013-12-13 15:26

今天第一次灌胶所用设备为BIO-RAD 为防止漏胶先在下层小心铺一层速凝胶
（可在加TEMED之前取0。5ml分离胶液于另一小器皿中然后加入10微升TEMED 然后灌速凝胶）静置3分钟后按常规方法灌分离胶浓缩胶，结果未见漏胶情况发生。另外本人在流水冲洗下拔梳子结果未见梳孔歪斜情况发生。第一次灌胶即比较成功。

作者: BOSS2011 时间: 2013-12-13 15:26

在做胶完成后放入4度冰箱过夜后，第二天胶与固定板接触的下缘会出现一小段空的和少量液体，像是没有固化好，为什么？

作者: wmp1234 时间: 2013-12-13 15:28

速凝胶封底时出现一现象就是剥胶时发现凝胶底部出现胶皱褶现象不知如何排除望高手指教！

作者: 3648755 时间: 2013-12-13 15:28

我的错误才搞笑，刚进实验室时做胶，
分离胶的配方和浓缩都弄成一样的了．
还和别人讨论错误在哪里？怎么总是在分离胶就有带
狂晕ing～～

作者: xyw5 时间: 2013-12-13 15:28

一次有个师弟过来告诉我,他的SDS-PAGE上不了样
我有些奇怪,过去看究竟,果然,他把样品加入点样孔之后,样品不是沉到底部,而是象兰色烟雾一样从孔内飘起来,很快飘散干净
感觉是样品忽然变轻了,或者----电泳缓冲液变重了
后来发现原因是后者,原来他倒错了电泳缓冲液,把10倍的缓冲液倒进了电泳槽,换回来就行了

作者: fei1226com 时间: 2013-12-13 15:29

我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？

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胶凝固后体积会缩小。你可以加少许缓冲液后把槽倾斜，将气泡赶掉。

作者: fei1226com 时间: 2013-12-13 15:33

我所犯的错误也不少。
没加BUFFER就煮蛋白样品，结果全沉淀了，样品只能扔掉。
转膜忘了冰浴。不过，作出来的结果没有受到影响。
膜上面忘了标记号，做完了不知道是什么样品了。建议用铅笔在MARKER的位置标个记号。
胶冬天气温低时不容易凝固，可以将AP，TEMED加倍，放在37度里。
AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最长可能用了2个月没问题，SDS放在室温，1年了，好像没什么影响。
不要迷信进口抗体，进口抗体也会有时候做不出来。

作者: 66+77 时间: 2013-12-13 15:33

我们也是加大AP浓度来加快凝胶速度的，不过有一次加大太多，凝得太快跑出来条带有点歪歪扭扭的，不好看，建议30min左右聚合就可以了，太快也不好。
另外我们图便宜，用了国产的槽。还不错，跟借来的Bio-rad差不多，不用封，也不漏胶，只是没有那个塑料剥胶板，便宜啊！这样已经不错了！

作者: 66+77 时间: 2013-12-13 15:34

对了最近做试验出了点新问题，新买的mark跑的时候溴酚兰居然比我的样品溶解液中的溴酚兰跑的快，老mark同时跑就没有这样的问题，不知道怎么回事，请高人指点！
PS：新mark是预染mark，是不是跟这个有关啊？！

作者: plaa 时间: 2013-12-13 15:35

我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。

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我就是这样干的，个人有点懒，就经常用这个方法

作者: birdfish 时间: 2013-12-13 15:35

前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：
1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。
2 AP用别人旧的，结果胶不干
3 A液，B液用旧的，不干。
结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。
4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝
5 电泳时长板接负极，反了
6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。
再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)

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我们也是biorad的不用封底，对于APS个人觉得每个实验室应该形成一种规则，就是所有配置的溶液都写上日期和标签，并注明操作的人名，这样是一种负责的态度，除了问题很溶液找到来源，另外日期可以很明白判断是否过期，APS一般一个星期4度下，浪费也是可耻的，不要把实验室的东西不挡自己的。另外配置母液的时候最好用超纯水，这样配置的缓冲液放一年都没有什么问题。

作者: yychen 时间: 2013-12-13 15:36

要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。

列举一些新人犯的错误：
配胶时加错试剂；
电泳时未通电或未及时通电；
先上样后加缓冲液；
正负极搞反；
缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；
样品煮完没离心；
电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；
电泳过程中漏液等

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我弱弱的问一句
样品煮完离心的目的是什么？是不是怕盐分太高
除去盐分？
我做原核表达，样品是裂解的菌液，也有这个问题吗

我不怕你们笑话
我做SDSPAGE时犯的错误几乎可以让你们喷饭：
我上样前都没有煮变性！

作者: zzzz 时间: 2013-12-13 15:37

离心是为了去除不溶性颗粒，不然会影响电泳。
菌液电泳时，
我感觉更应离心的彻底一些以除去细胞碎片。

作者: 00无名指00 时间: 2013-12-13 15:38

哦
我煮之前和上样buf结合时已经用的是上清

作者: flower-201 时间: 2013-12-13 15:38

希望我们的战友们不要犯这样的错误，同样如果在做事前把会出的问题考虑清楚就不会犯这样一些低级的错误了，最关键是不要盲目。多考虑毕竟不会错的。

作者: orangecake 时间: 2013-12-13 15:40

请问sds-page和双向电泳有何区别阿？见笑！！！

作者: ii077345 时间: 2013-12-13 15:40

看完大家的讨论受益匪浅啊
我也说一下自己遇到的问题
1.胶凝时放入37度温箱，谁知温度比设置的高了一两度，胶凝后发现边缘不平整，所以后来我一直将温度调在34度，没出过问题，呵呵
2.配好分离胶后，液面用异丙醇封闭，用枪加异丙醇时太猛了，使胶边缘凝聚的不平整。所以以后加异丙醇时要轻轻的。

作者: superboy 时间: 2013-12-13 15:41

我用bio-rad的剥胶用的塑料板照样弄碎胶，大家说操作胶的时候，这么办，才不容易把胶弄碎？

作者: greenbee 时间: 2013-12-13 15:44

我原来跑DNA分子标记的，80ml的那种大胶板，除了TEMED和AP其它的都是混一起放在4度，后来我开始做SDS－PAGE，都是和跑DNA的大板子用一套TEMED和AP的，直接从4度冰箱捞出来的，大家说的AP，我们都是用50ml的大管子配一管子，放在4度慢慢使的，没有出过什么问题！没有必要搞到－20度，用前还要解冻多麻烦！

作者: hold住 时间: 2013-12-13 15:44

还有做DNA大板子的心得，如果还是有朋友觉得很难从板子上剥下来可以买硅化剂涂玻璃板，很好使，0。5平米的板子都分得巨好的，蛋白质胶简直就是小case！：）

作者: 9900 时间: 2013-12-13 15:54

我们的AP也是配置好后分小管放在-20度的，用时取出溶解，用完后再放回-20，一般一个月都是没有问题的，TEMED也放室温，现在已有2个多月，好像也没有出现什么问题。

作者: uuooii 时间: 2013-12-13 15:57

我们的AP也是配置好后分小管放在-20度的，用时取出溶解，用完后再放回-20，一般一个月都是没有问题的，TEMED也放室温，现在已有2个多月，好像也没有出现什么问题。

作者: guagua 时间: 2013-12-13 15:58

缓冲液混浊，电泳图像波浪

作者: yes4 时间: 2013-12-13 15:58

Bio-rad的电泳仪，Marker 带在分离胶的下半段才出现，而且模糊，蛋白带很清楚，哪位高手帮我分析一下原因。

作者: Ao7 时间: 2013-12-13 15:59

封底这个......到现在也没有想出来好办法。我们实验室用的Bio-Rad的，不用封，但是有的时候还是会漏。
AP一定要新鲜，最好每次用1.5mL EP管配，4度放置两周之内用完。
Tris，10%SDS我们都是放在室温的，可以放很长时间。其它几种成分都在4度。
等胶凝的时候，如果室温太低，尤其是冬天的时候，可以放在烘箱或者培养箱，不过要注意防止丙烯酰胺污染。浓缩胶这个时候尤其凝结的很快，不容易因为胶缩而产生坏道。
剥胶时，可以将胶连着板（一边）一起在染色液里面浸一下，然后用剥胶的板子（一定要湿的，可以先用染色液沾沾）沿着纵向的方向划两下（“口”型的胶版，上面为加样孔，底边在染色液里面浸泡一下，左右用剥胶的板子划一划），很容易就弄下来了。
切角倒不是必需的吧，在不同的位置加Marker就行了。第一块在第一道加Marker，第二块在第二道加Marker，以此类推。但是我曾经犯过很愚蠢的错误，第二块在最后一道加的Marker，结果染色之后，发现这两块胶完全是分不出来的......呵呵。
我犯的错误没有老兄你多哈哈，最常见的就是分离胶缩水（或者说漏胶）的问题，有的时候真是好心情被破坏干净了。

作者: Ao7 时间: 2013-12-13 16:00

Bio-rad的电泳仪，Marker 带在分离胶的下半段才出现，而且模糊，蛋白带很清楚，哪位高手帮我分析一下原因。

前两天作银染的时候和你一样的问题......试试新的Marker吧，可能Marker被污染或者降解了。

作者: 831226 时间: 2013-12-13 16:31

最近一段时间做的时候，跑的时候总是会出现电泳条带分为两层现象，不知道什么原因，就把所用的各种溶液重新配，可是还是一样分层。我都纳闷，以前没出现这样的情况的？

作者: 987789 时间: 2013-12-13 16:35

最近一段时间做的时候，跑的时候总是会出现电泳条带分为两层现象，不知道什么原因，就把所用的各种溶液重新配，可是还是一样分层。我都纳闷，以前没出现这样的情况的？

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我也有出现过，用silver staining,会有两层的感觉。。。不知道是什么原因？而且两层的迁移率又不同哦,好像一个蛋白都能跑出两条条带出来。。。

作者: 49888 时间: 2013-12-13 16:35

封底胶的作用是什么啊？是在分离胶上边加的那个东西么？还是在哪封底

作者: 68943512yao 时间: 2013-12-13 16:36

QUOTE:

原帖由 49888 于 2013-12-13 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

封底胶的作用是什么啊？是在分离胶上边加的那个东西么？还是在哪封底

是为了防止在制胶的时候漏胶，在玻璃板的外底部热封的琼脂胶。

这主要是针对那些比较老型的电泳制胶设备。

现在的电泳一般不会有漏胶现象，有的话换一根底部的密封胶条就可以了。

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