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标题: 【求助】50mg组织量能否做western？ [打印本页]

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:34 标题: 【求助】50mg组织量能否做western？

相关疾病：
肿瘤
我要做肝脏组织。看了一下western方法介绍，大部分是100mg起裂解提蛋白，但我的是肿瘤治疗组，大体标本也就是0.5-0.11g，切除了一半做免疫组化，余下的1/3之间做PCR，只剩0.04-0.15g的组织做western。不知够不够？目前也不知道组织中蛋白含量怎么样。标本已在-70度冰箱放了近半年。血清ELISA测相同蛋白，有的结果还行，有的没结果，疑似降解。
请教！谢谢！

作者: bamboo16 时间: 2013-12-14 16:34

做几个蛋白？
50mg足够你做n多个蛋白

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:35 标题: 回复 #2 bamboo16 的帖子

我做3个蛋白，分子量分别为18KDa，43KDa，120KDa。
我是听实验室师兄师姐讲的，说50mg基本不可能。急！
多谢指教！

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:36

QUOTE:

原帖由 chenshuanhe 于 2013-12-14 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做3个蛋白，分子量分别为18KDa，43KDa，120KDa。
我是听实验室师兄师姐讲的，说50mg基本不可能。急！
多谢指教！

此外，这是不是基于组织中蛋白含量高的前提下？
谢谢！

作者: bamboo16 时间: 2013-12-14 16:36

50mg足够你用的了
你做什么蛋白？

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:37

QUOTE:

原帖由 bamboo16 于 2013-12-14 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

50mg足够你用的了
你做什么蛋白？

谢谢！做的是VEGF、bFGF、HIF-1alpha

还有一个问题：我在园内搜索时发现：在2009-1月时你曾回答到RIPA强配方可以提核内蛋白，但在2009-9月时提到HIF-1alpha需要用胞浆-胞核蛋白抽提液。我搜索到碧云天的胞浆-胞核蛋白抽提液只适用于新鲜组织，我的是冻存过的组织，有哪些公司可以推荐的？希望价廉物美型的。
此外，还有一个问题，如果我用碧云天的RIPA强裂解液的话，包含EDTA、leupeptin，另加PMSF，蛋白酶抑制剂是否足够？还需另外买蛋白酶抑制剂混合物吗？
谢谢！

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:37

准备液氮研磨、手动匀浆、超声都用上，这样提的蛋白会不会多点？

作者: bamboo16 时间: 2013-12-14 16:38

QUOTE:

原帖由 chenshuanhe 于 2013-12-14 16:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！做的是VEGF、bFGF、HIF-1alpha

还有一个问题：我在园内搜索时发现：在2009-1月时你曾回答到RIPA强配方可以提核内蛋白，但在2009-9月时提到HIF-1alpha需要用胞浆-胞核蛋白抽提液。我搜索到碧云天的胞浆-胞核蛋白抽提 ...

呵呵
你还挺用心的
1、HIF可以用着两种裂解液进行蛋白抽提。RIPA提取出来的核蛋白浓度相对于胞浆、胞核抽提试剂提取出来的核蛋白浓度要低一些。胞浆、胞核抽提试剂对核蛋白是一个浓缩过程。如果是用WB检测的话建议你用RIPA提取总蛋白即可
2、你这几个蛋白中VEGF不太好做
3、碧云天的裂解液中我不知道还有没有其它的蛋白酶抑制剂

作者: bamboo16 时间: 2013-12-14 16:38

QUOTE:

原帖由 chenshuanhe 于 2013-12-14 16:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

准备液氮研磨、手动匀浆、超声都用上，这样提的蛋白会不会多点？

你可以采用液氮研磨加手动匀浆（玻璃匀浆器还是电动匀浆？）
不建议用超声！

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:39

QUOTE:

原帖由 bamboo16 于 2013-12-14 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你可以采用液氮研磨加手动匀浆（玻璃匀浆器还是电动匀浆？）
不建议用超声！

谢谢！玻璃匀浆器！
为何不建议用超声呢？请多指教！

作者: chenshuanhe 时间: 2013-12-14 16:39

再问一个问题，50mg会不会液氮一磨就没了？或者因为裂解液加的少全滞留在匀浆器里倒不出来啊？

作者: bamboo16 时间: 2013-12-14 16:40

QUOTE:

原帖由 chenshuanhe 于 2013-12-14 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
再问一个问题，50mg会不会液氮一磨就没了？或者因为裂解液加的少全滞留在匀浆器里倒不出来啊？

有这个可能啊
液氮研磨的时候不用加裂解液进去

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