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标题: 分离几个氨基酸衍生物，希望大家能多给建议 [打印本页]

作者: slightshiner 时间: 2010-7-12 11:57 标题: 分离几个氨基酸衍生物，希望大家能多给建议

本人正在分离几个氨基酸衍生物，遇到大麻烦了，看能不能在这获得有价值的信息。
1. 化合物描述：一个小分子的pyrrolinzine和一个氨基酸结合，分子量250，最大吸收在220nm，推测有四个异构体（小量分析图谱可看到有三四个峰）；
2.性质描述：对酸不稳定，易分解，化合物易与甲醇，氨类反应。
3. 尝试过的条件：用C18柱(Prodigy, Luna, from Phenomenex Company),流动相用的是乙氰/水，梯度洗脱，45分钟内ACN从2%到8%。在这种情况下，偶尔可得到好的图谱，看到有3/4个不同于原料的峰，重复性差。但如果加大上样量，整个图谱变得稀奇古怪，峰强并不随上样量增加而升高，每个峰都变宽，强度没有升多少，本来几个峰retention time就差不多，这样根本峰不开了。
4.试过缓冲剂体系，乙酸铵不行，溶剂在220吸收，这样连个好的基线都得不到；50 mM磷酸盐体系也试过，重复性差；没试过甲酸铵体系，不知他的cut-off波长多少；pH值当然都是在中性偏碱。

希望大家能多给建议。

[ 本帖最后由 miracle 于 2010-7-14 17:53 编辑 ]

作者: hplcangel 时间: 2010-7-12 16:53

“但如果加大上样量，整个图谱变得稀奇古怪”可能是上样量超过柱常量引起。在一般反相柱上，流域相中也没有加入手性拆分试剂的情况下，无法分离异构体，所以你看到的几个峰可能是主成分峰与杂质。

作者: ksyan 时间: 2010-7-12 18:31

可以试试用三氟乙酸调PH=2.0流动相比例为三氟乙酸水溶液：乙腈=85:15 波长220nm 流速=0.5ml\min

作者: unknow 时间: 2010-7-12 18:57 标题: 回复 #1 slightshiner 的帖子

四氢吡咯与某一氨基酸结合成酰胺是吗？这种结构怎么可能会对酸不稳定？怎么可能结合出四种异构体？即使是和谷氨酸或天冬化合反应，也只可能存在两种异构体啊！

假设楼主的物性前提都成立
1、“峰强并不随上样量增加而升高，每个峰都变宽，”说明原有的上样量已经“够”了，再上柱已超载。
2、“对酸不稳定，易分解，化合物易与甲醇，氨类反应。”这就是水/乙腈体系重复性差的原因！既然在甲醇中都不稳定，在水中就更不稳定了（水的酸性比甲醇强）。

建议：用正向体系分析。

作者: chunhuawan 时间: 2010-7-13 09:36

会不会是乙腈比例不够还有峰没完全洗脱下来？加大乙腈比例，梯度走完多平衡几分钟再进样，不管出几个峰至少每次进样要能重现，再根据出峰情况调整梯度到满意的分离效果。

作者: gebz 时间: 2010-7-13 09:41

液相色谱是个很有效的手段，但，目标物一定是化学稳定的。建议你先做富集预处理，同时把握其相对存在状态。

作者: dingxiaojing 时间: 2010-7-13 09:46

最大吸收在220nm，则不能用甲酸
、乙酸、柠檬酸缓冲体系，用磷酸盐缓冲体系还有可能，因为磷酸盐的紫外吸收背景低。
但不知为何未能成功？用的磷酸盐缓冲体系的pH是多少？用pH6.5试试！

作者: uwku58h 时间: 2010-7-13 09:51

楼主，看一下要不要加一些缓冲液来改良

作者: swchen 时间: 2010-7-13 09:52

这个问题需要具有的混合物及其分离条件和峰图才能进一步分析，或试探解决办法。

作者: zzl 时间: 2010-7-13 10:07

刘慧老师的回答：
可以选用手性柱分离效果可能会好很多。

作者: liujx 时间: 2010-7-13 10:31

1.柱子的填料问题

可考虑换成氨基柱或氰基柱

2.流动相的问题，可能在8％乙腈中的溶解度有问题，可加大有机项比例

作者: grc7636 时间: 2010-7-13 10:36

1.    短吸收波长（220nm）处，具有吸收的干扰物质较多，所以干扰峰较多

2.    乙腈/水梯度洗脱时，重现性差，可考虑通过延长时间进行考察是否存在蓄积。

3.    可考虑增大流动相梯度提高分离效果。流动相的组成，可考虑添加 0.1%三乙胺改善峰形。

4.    是不是柱子由于使用时间太长，导致柱效降低，可考虑更换新色谱柱或其他品牌的色谱柱，考察一下粒径、柱长等方面的影响。

5.    大进样量可能会导致系统饱和，从而出现鬼峰。

6.    可尝试采用LC-MS，选择离子对色谱，以及高效毛细管电泳等方法进行分离。

作者: tangxp 时间: 2010-7-13 11:17

可换根柱子试试，此外，不知具体进样量有多大，如果进样量太大，饱和了，当然峰变宽而不是变高。具体情况不清楚，不好说。

作者: qh-zhang 时间: 2010-7-13 11:19

建议尝试将AB两相分别配制成2%和8%的乙腈水溶液之后进行梯度分离，保证流动相条件的重复性之后再优化。

作者: ge_er_ning 时间: 2010-7-13 11:36

把从柱子到检测器的管路口径换小试试，换高灵敏度检测器试试。进样量不要太多。以免拥堵。

作者: sunny712712 时间: 2010-7-13 11:41

分离该类化合物是否应该选用极性强一点的色谱柱

作者: cjmcjn2471 时间: 2010-7-13 13:39

建议
1，采用正相色谱。
2，若分离效果不好，选择性不强也可衍生化后再色谱分离。
3，杂质峰太多的话，可考虑样品的前处理是否有问题。

作者: hyzhang 时间: 2010-7-13 13:46

问题叙述不太清楚。

1、建议使用Phenyl-hexyl(Phenomenex)的柱子试一试。

2、重现性差，请检查是否与样品中含有其他大分子有关，是否有蛋白等存在？另外，由于采用了梯度程序，所以两次分离过程间，应定要有至少20分钟的柱平衡时间，用0时刻的流动相组成来平衡柱子，然后才可以进行下一次的分析。

但愿这些会有所帮助。

作者: zzl 时间: 2010-7-13 14:10

楼主：HPLC分析没有化合物结构，即便是懂这方面分析的专家都无法给出全面建设性意见，望尽量将问题的条件表述完整，以便大家更快的帮您解决问题！

作者: liuyongsuo 时间: 2010-7-13 16:46

采用普通反相HPLC分量氨基酸的难度比较大，建议采用毛细管电泳或离子色谱。

作者: aa_tang 时间: 2010-7-13 19:12 标题: 回复 #1 slightshiner 的帖子

楼主是用HPLC做反应监测或者是纯度分析吧？楼主的情况是这样的吗？
1. pyrrolinzine与氨基酸缩合，该反应在什么条件下生成的？酸性、碱性或者中性体系中？是如何确认目标化合物对酸不稳定易分解的、化合物易醇解、氨解？
2. 待分析物极性大，HPLC分析时，溶解样品的溶剂对分离会有比较大的影响。
3. 加大进样量，峰展宽拖尾更严重，未能基线分离的几个峰包在一起。
4. 尝试过缓冲液体系，因背景噪音，认为乙酸铵体系不可用。

基于上述的几个情形，个人建议如下：
1. 若反应是在某pH值条件下做的，在接近该pH值条件下HPLC分析，该化合物通常也不会变坏。
2. 既然遇酸不稳定，易醇解、氨解，那么流动相体系就不能用甲醇，同时溶解样品也避免用甲醇等，考虑到化合物极性大，有一定的水溶性，建议直接用水或者水相流动相溶解样品。
3. 峰形不好，说明没有选择好合适的流动相体系或者是梯度洗脱条件没有优化好，主要考虑调整流动相的pH。
4. 乙酸铵体系因为噪音过大，UV 220nm检测有干扰，若条件许可的话，建议用ELSD检测或者加大进样量（高浓度小体积进样）

根据个人以往的经历，pyrrolinzine与氨基酸缩合后，pyrrolinzine部分对色谱分离的影响更大，楼主可考虑在碱性流动相体系下分析，比如用0.1%氨水作为水相与乙腈搭配，20min内从5%乙腈梯度洗脱到35%乙腈，220nm检测，当然，这个是在该化合物不柱上氨解的前提下才行，不过可以试试，以确定是否真的可行或不行。另外，也可试试20 mM乙酸铵体系，把样品浓度配大些，将噪音压下去，毕竟只是反应监测，或者目标化合物分离。

多试试吧，总会有解决的办法的。

作者: ganguop 时间: 2010-7-14 09:21

我建议用氨基柱、反相色谱试试

作者: wangyingfour 时间: 2010-7-14 16:45

氨基酸类的物质我习惯用乙腈和三乙胺及磷酸水溶液做为流动相

作者: sunzw673 时间: 2010-7-16 09:22

我认为应该是分离度和色谱条件的问题，可以试试用氨基酸分析柱及其色谱条件。

作者: luxuanbu 时间: 2010-7-18 10:18

还用原来的乙氰和水，把梯度改为30分钟内90%的水-100%的乙氰试试

作者: lcx19870625 时间: 2010-7-19 09:29

是否可以衍生后再测，我们遇到这类产品都是这样解决的，给你看哈我们的方法。
仪器设备
Agilent 1100或相当的仪器，紫外检测器
抽滤装置（微孔滤膜为0.45um）超声波清洗器电子天平（十万分之一）
试药和试剂
水：超纯水乙腈：色谱纯磷酸二氢钠：分析纯磷酸：色谱纯
氯甲酸苄酯：分析纯 X对照品 X对应异构体对照品
溶剂
乙腈
流动相A的配制（20mMNaH2PO4（PH=3.0）：乙腈=830：170）
准确称取2.40g±0.01g磷酸二氢钠至装有1000ml水的1000ml试剂瓶中，溶解摇匀，用
磷酸调节PH=3.0±0.1g，再量取该溶液830ml与170ml乙腈混匀，抽滤，超声15min，即
得。
流动相B的配制
乙腈
色谱柱预处理：
用20%乙腈水溶液冲洗柱子15min-20min，然后再使用流动相冲洗色谱柱至基线平衡方可
使用。
系统适用性溶液：
准确称取X对照品25mg±5mg和2mg±1mgX对应异构体对照品至50ml具塞锥
形瓶中，再加入乙腈，使之配成1.0mg/ml的溶液。
按照下式计算所需加入的氯甲酸苄酯的量
V=(ms+mr)×1.4
V ——应量取的氯甲酸苄酯的量(μL)
ms——称取的X对照品的重量(mg)
mr——称取的X对映异构体对照品的重量(mg)
使用100uL注射器加入上式计算所需的氯甲酸苄酯，盖上瓶塞，常温下搅拌20min后，作
为系统适用性溶S。
供试品溶液的配制
准确称取供试品25mg5mg至50ml具塞锥形瓶中，再加入乙腈，使之配成1.0mg/ml的
溶液。
按照下式计算所需加入的氯甲酸苄酯的量
V=m×1.4
V ——应取的氯甲酸苄酯的量(μL)
m——称取的供试品的重量(mg)
使用100uL注射器加入上式计算所需的氯甲酸苄酯，盖上瓶塞，常温下搅拌20min后，作
为供试品溶液A1，同法在配制供试品溶液A2。
注意：量取过氯甲酸苄酯的注射器需立即用甲醇清洗。
色谱条件
色谱柱：Chiralcel OJ-RH 4.6mm×150mm，5μm
检测器：紫外检测器检测波长： 210nm
柱温：40.0℃ 流速：1.0mL/min 进样量：10μL
采集时间：72min
流动相梯度：
时间（min）流动相A（%）流动相B（%）
0.0 100 0
50.0 100 0
51.0 25 75
61.0 25 75
62.0 100 0
72.0 100 0
按进样序列表进样
进样溶液进样针数目的
空白（稀释液）不小于1 确定无影响主峰及杂质峰存在
系统适用性溶液S 2 确定K108峰保留时间，2针峰面积的RSD
不得大于2.0%，K108主峰与对映异构体峰
之间最小分离度应不小于1.5
供试品溶液A1 1 测试样品中X的光学含量
供试品溶液A2 1 测试样品中X的光学含量

作者: tianyingxuan 时间: 2010-7-21 14:20

被测物质和氨类有反应，因此使用乙腈作为流动相时会有反应，乙腈属于氨类，有暴露的氨基。建议改用正相色谱试试或者用气相色谱。

作者: aalabs01 时间: 2010-7-30 15:56 标题: 方法的问题

可以这么说，异构体用氨基酸分析仪和HPLC都是徒劳，假如真要做起来要花费很多精力的，我给出的建议是LC-MS/MS，同位素内标，三重四级杆，结果你绝对会满意，做过很多了，北京艾米诺 010-57108591 丁先生

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