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标题: 【求助】2-DE：为什么同样的条件跑出不一样的图？ [打印本页]

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:52 标题: 【求助】2-DE：为什么同样的条件跑出不一样的图？

相关疾病：
宫颈癌
宫颈癌组织为什么同样的条件跑出不一样的图？从蛋白提取到电泳全是一起做的，为何差别这么大？也做过蛋白浓度测定的。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:53

相关疾病：
宫颈癌
宫颈癌组织为什么同样的条件跑出不一样的图？从蛋白提取到电泳全是一起做的，为何差别这么大？也做过蛋白浓度测定的。好像图没发上去。重新复制到WORD上发送。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:53

宫颈癌组织为什么同样的条件跑出不一样的图？从蛋白提取到电泳全是一起做的，为何差别这么大？也做过蛋白浓度测定的.不好意思，把图片格式改为JPG,再发一次。

图片附件: 47252312.snap.jpg (2013-12-19 15:53, 20.14 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=21727

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:55

第二张

图片附件: 14015355.snap.jpg (2013-12-19 15:55, 21.53 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=21728

作者: ha111 时间: 2013-12-19 15:55

从上面的信息是很难回答什么啊。
你的这两个样品有没有进行过1D电泳？跑完后用考马斯亮蓝染色看看，是不是样品在制备的过程中出现了这么大的差别？
还有就是胶条有没有问题？
就这么一次的结果是这样子的吗？重复了没有啊？呵呵，2D电泳的步骤比较多，由于操作的原因可能你自己还没有意识到。
2D的重复性不好，但也没有离谱到这个程度啊。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:56

用的考染，样品制备同时做的。上一次同样步骤两幅图略有差异，可惜胶碎了，没拍成像，此次不同处在于放胶条时先用反灌法加了少许琼脂糖，不过两根胶条是一样做的呀！会不会是放置第一根胶条时反复去除气泡，第二根胶条在室温下放太久了？（吸干平衡液后大概10分钟）。

作者: tuuu2 时间: 2013-12-19 15:56

第二份样品的制备过程出了问题
虽然是同时做的但从图中来看的话第二份样品质量明显有问题

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:57

重新做后跑出下面两张图，组织裂解液配方：尿素8M，硫脲2M,chaps4%，Tris40mM，1ml裂解液中加了40微升cooktail，0.09TT,50微升biolyte，孵育1h后200W超1s，停3s，15000r离心30分钟。帮忙再看看有啥问题？

图片附件: 58257086.snap.jpg (2013-12-19 15:57, 19.02 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=21729

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 15:57

同时做的另外一张：

图片附件: 90356881.snap.jpg (2013-12-19 15:57, 19.31 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=21730

作者: yonger 时间: 2013-12-19 15:58

感觉你是某个试剂加错了，请在仔细核实一下！

作者: yonger 时间: 2013-12-19 15:58

另外，后两张图的上样量可以适当增加一些，当然，增加了上样量之后，高压聚焦时间也要适当增加！

作者: yjf1026 时间: 2013-12-19 15:58

第二幅图好象有气泡造成的拖尾现象,另外胶条在平衡完后不立即跑可以放在电泳缓冲液里浸泡,对结果影响不大,或者封胶放置几个小时影响也不大,我曾见过有人封胶完忘记开电泳仪了,放了一中午最后图还是很不错的
感觉你后面的图点太少了所以没法评论别的问题,你先加大上样量,另外在DTT和IAA里面的平衡时间减少到10-15分钟试试

作者: 8princess8 时间: 2013-12-19 15:59

从上面的信息是很难回答什么啊。
你的这两个样品有没有进行过1D电泳？跑完后用考马斯亮蓝染色看看，是不是样品在制备的过程中出现了这么大的差别？
还有就是胶条有没有问题？
就这么一次的结果是这样子的吗？重复了没有啊？呵呵，2D电泳的步骤比较多，由于操作的原因可能你自己还没有意识到。
2D的重复性不好，但也没有离谱到这个程度啊。

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同意你的观点
也有可能楼主换了试剂和药品
也有可能操作问题

作者: dongdongqiang 时间: 2013-12-19 16:00

谢谢各位指点。我以前上样量是1mg，下次打算用2mg。上周又出现了一错误，在水化液中多加了2.5微升biolyte，结果一向聚焦电压到4000伏（17cm胶条）就上不去了，染色后图像如下，考虑酸性短蛋白还跑开一些，后面就集中成一条竖线了。今天用同样的步骤聚焦就很顺利。一滴电解质的影响就这么大呀！非常惭愧！！

图片附件: 32113708.snap.jpg (2013-12-19 16:00, 20.92 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=21731

作者: rxcc33 时间: 2013-12-19 16:00

你是用银染的吗？用什么拍的照片？

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