分析测试百科

标题: 【分享】染色体制备中的关键步骤 [打印本页]

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:23 标题: 【分享】染色体制备中的关键步骤

1. 秋水仙素是防垂体抑制剂.一般最终浓度每瓶0.07Lg,作用时间2.5~3h,一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系.如果秋水仙素的浓度过高或处理的时间过长,结果标本中的分裂细胞虽多,但染色体过于浓缩,以致细胞形态特征模糊,难以进行分析.相反,如果秋水仙素的浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少.

2. 0.075mol/LKCl溶液用于处理中期细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好而便于观察计数，0.075mol/LKCl溶液做低渗液,当低渗处理时间过长时,细胞膜往往过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不佳,难以进行染色体计数分析.低渗时间最好30~50min,经过低渗处理的细胞因已膨胀,容易过早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特别注意不要用力冲吸.

3. 如果固定液不新鲜或甲醇!冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊染色体周围有胞浆背景.所以固定液应现用现配,为分析纯的甲醇和冰醋酸按3：1的比例配制.

4. 如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻4小时以上,既即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融化.

作者: 龙小好汉 时间: 2013-12-20 13:23

不知道楼主的实验材料是什么？结果好吗？分裂相多吗？染色体形态怎么样？

近期也在做染色体，75mM KCl低渗，偶的效果很不好。分裂相不多，看片子时看到的都是没摔破的细胞。

楼主说载玻片经过一系列处理后放入冰箱冷冻4小时以上。能详细说下怎么处理的吗？

作者: zbboom 时间: 2013-12-20 13:24

摔片子时要有一定高度，最好站桌子上瞄准（有点搞笑，但很实用），滴下后迅速吹散并过酒精灯焰两三次即可。这样分散的很开。

作者: shangyi 时间: 2013-12-20 13:25

楼主做过鱼的染色体铺片吗？介绍点经验吧

作者: 尘朵朵 时间: 2013-12-20 13:27 标题: 回复 #3 zbboom 的帖子

不搞笑！小妹每次滴片也是爬上爬下的！不过现在偶改成把片子放在地上，高举双手滴片了～～～

为什么要过酒精灯呢？

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:27 标题: 回复 #2 龙小好汉的帖子

我们主要做羊水、脐血、外周血的染色体，试验材料都差不多，培养基就是1640+血清+PHA、F10+血清，每次做出来结果都还可以，分裂相也不错。G显带后基本上都是高分辨的。我们用的低渗液和你的一样啊，低渗时间37度，20min（脐血和外周血）然后预固定离心。羊水的低渗时间要少些，只需要5min就可以了，低渗液是0.4％的氯化钾和0.4％枸橼酸钠，效果非常的错。一般羊水的成功率在98-99％之间。

玻片主要是要防止上面有油，如果有油，嘀片的时候染色体分散会不好，所以玻片要先加洗洁剂100度煮30min，然后用纱布一张一张的擦，直到上面没有油为止，（虽然繁琐，但是为了得到好的染色体也没有办法了）然后清水冲洗干净，然后泡酸。使用时在取出用蒸馏水冲洗干净，置于干净的蒸馏水中，4度放置4小时左右，然后使用。

嘀片的时候一般嘀3-5嘀就可以了，不能太多，多了就会流出去，染色体就没有了，一般不用吹，让它自己散开，然后酒精灯上来回2-3次就可以了。然后烤片，准备分带。（注意：嘀片的时候不能太高了，要是那样，染色体都打飞了，而且会很分散，计数的时候会不好计数。一般1-3cm就可以了，如果是羊水还有更低）

个人经验，仅供参考。

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:28 标题: 回复 #4 shangyi 的帖子

不好意思，这个我没有做过了，我主要做人的染色体。

作者: zhy平平 时间: 2013-12-20 13:29

楼主能不能贴几张染色体照片呢？我最近显带总是不太理想，我想请问您那里G显带与天气、气候有关吗？

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:31

我们都是当天做了就显带的啊，没有选择什么时间啊！

下图外周血培养72小时后制片G显带，大家多多指教！

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:32

下图是羊水培养11天后制片G显带，多多指教谢谢！

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:33

下图是羊水培养12天后制片G显带，不是很好，但是是个异常染色体核型

（47，XY，+21）

作者: njkph 时间: 2013-12-20 13:36

有没有做绒毛细胞短期培养染色体制备的啊

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:37 标题: 回复 #12 njkph 的帖子

这个我们正在开展，过不了多久就会有了，前期准备都也做好。只要设备到位就可以了

作者: 雎鸠05 时间: 2013-12-20 13:40

带纹显的还不错,请教你们烤片的条件.

作者: 雎鸠05 时间: 2013-12-20 13:41

很漂亮的分带哦！！！！！

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:42

一般烤片时间在70度，3-4小时，

作者: eve_49 时间: 2013-12-20 13:43

滴片其实不用那么高,也一样可以分散

作者: eve_49 时间: 2013-12-20 13:44

能不能把羊水细胞和绒毛细胞培养和制作染色体的具体步骤发给我啊,谢谢!

dutao377@126.com

作者: wzqzy 时间: 2013-12-20 13:45

1.楼主要想在一天内制片、显带。固定的时间应该比较短吧？

2.我发现各地大体操作步骤虽一致，但具体操作却大相径庭啊。我们最近又出现一有趣的问题：在胰酶37度水浴稳定后下片，试片16秒还不算过的片，成批下15秒也过，再下11秒还偏过，再下5秒还能得到漂亮的带纹，有高手能解释吗？

作者: wzqzy 时间: 2013-12-20 13:45

可以的话能给我也发一份吗？很想参考参考。EMAIL：chenxuejiao@tom.com.谢谢。

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:46

我们都是在一天内完成的啊，早上制片，下午分带、看片出结果。时间还比较充足。我们都是用50ml生理盐水加0.5g/ml的胰酶1ml混匀后分带啊，生理盐水先在37度水浴中放置30min。加入胰酶混匀后马上分带，一般从38s开始，分完一次后加2S（40s）又开始分第二次，一般只分三次。完了换新的生理盐水和胰酶混匀后继续分。羊水片子时间要短些，从36S开始。

你所说的是不是胰酶浓度太高了。胰酶浓度不能太高。

羊水细胞和绒毛细胞培养和制作染色体的具体步骤我还没有电子版的，等我有空写好了在发给大家一起分享！

作者: 杨过爱大米 时间: 2013-12-20 13:47

楼主有作过骨髓的染色体制备吗?培养时间及各步骤有什么不同吗?还有想问问楼主可做过姐妹染色单体互换实验,能否介绍一下经验?谢谢

作者: wzqzy 时间: 2013-12-20 13:48

经验介绍太简单了，固定液放久了会生成酯类，影响固定效果，另外在脐带血或新生儿血由于细胞增殖快，常规固定效果常常不好，可以多固定一次用甲醇和冰醋酸按2：1的比例固定。

冰片也不是一定要四个小时，我喜欢上面刚刚有层薄冰时就OK了。

滴片高度无所谓，高分辨的可以高点滴，常规带嘛10-30厘米高足够了。

秋素的浓度看自己的习惯吧，作用时间用过1个小时的，也用过3 个小时的，浓度高的作用时间短点，浓度低的作用时间长点，自己摸好条件。

作者: wzqzy 时间: 2013-12-20 13:48 标题: 回复 #21 yayya 的帖子

个人认为用0。025%的姨酶，效果更好

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:49 标题: 回复 #19 wzqzy 的帖子

不知道你的具体操作过程，想问下你的烤片时间及温度，我觉得要考虑两个方面的问题，1。片子老化不够或回潮，建议75度2个半小时到3个小时，不要超过4个小时，显带时要片子自然冷却后再进行，如果天气潮湿又是隔夜显带建议显带前再烤会儿，效果会好点

2 。姨酶的浓度及水浴箱的温度情况，水浴箱温度控制在37+-0.5，姨酶建议用0.025% 的。

作者: yayya 时间: 2013-12-20 13:49

谢谢大家的回复，这些只是我个人在自己工作中经验的总结。欢迎大家继续分享自己的实验经验，实验中最关键的不是方法，因为方法都是大同小异。经验才是最重要的。你有了一定的实验经验，比你看书不知道要强多少倍。

我们烤片在70度，烤3个小时左右分带。

作者: 12xunmei 时间: 2013-12-20 13:51

我所工作的实验室近半年制的外周血和脐带血片子很差，羊水片子也不好哟～～～～我们寻找了很多原因，结果培养基出了问题，湖南湘雅基因公司和广州拜迪公司的外周血培养基近段时间都不是很好，

希望那位楼住给我推荐一下你们用的培养基，谢谢～～～

作者: 大脑门儿儿 时间: 2013-12-20 13:52

我们的胰酶浓度也是0.025%,烤片方法:37度24-36小时

作者: zhihui小新 时间: 2013-12-20 13:53

是不是可以考虑用75度烤片法，只要3个小时就好了，可以节约很多时间的阿

这是我国夏家辉院士在75年创造的，技术很成熟的

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)