分析测试百科

标题: 【讨论】融合蛋白片段对于目的蛋白片段的活性影响 [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2013-12-23 15:47 标题: 【讨论】融合蛋白片段对于目的蛋白片段的活性影响

最近做HIV蛋白片段的时候，发现有些蛋白片段对抗原的活性影响很大，有时候会使目的片段失去活性。融合蛋白片段是相对比较惰性的片段，怎么会有这么大的影响呢？蛋白片段对目的片段有怎么样的影响呢？

作者: summerxx 时间: 2013-12-23 15:47

举个例子。
采用PET32a质粒融合表达时，融合片段上有一个cys，很可能与目的片段上的cyc形成二硫键，从而影响到了目的片段的空间结构，目的片段的活性也许会受到影响。其它的如histag等都有影响。
蛋白质的活性是由其空间结构所决定的，加上一段融合蛋白，必然会对原来的结构有影响。而结构影响到功能，所以不能说融合片段是“惰性”的。平常我们说惰性，只是我们用到的某种检测方法对这种结构的变化不敏感而已。例如作为抗原来检测抗体，或许抗体识别的那一段抗原表位结构没有变化。

作者: @STAR@ 时间: 2013-12-23 15:48 标题: 回复 #2 summerxx 的帖子

谢谢。某些蛋白在包被和标记HRP的过程中活性会有损失，所以用在EIA上面重组的抗原一般是要加上一段融合蛋白的，以是保护目的蛋白区段。融合蛋白在其他方面还有什么重要作用呢？

作者: redbutterfly 时间: 2013-12-23 15:48

“重组的抗原一般是要加上一段融合蛋白的，以是保护目的蛋白区段。”恐怕没有这个说法。
其它作用有促溶、增加半衰期、增加免疫反应、利于纯化tag等等。

作者: 阿凡提 时间: 2013-12-23 15:49

“抗原的活性”是个什么东西？

作者: ending 时间: 2013-12-23 15:49

如果说表达的蛋白用于功能实验，其融合蛋白是否对活性有影响？一般来说，好像切掉Histag后，蛋白的功能实验更能说明问题，但如果不切除Histag，能否当做活性蛋白来做功能，其表现的功能有无说服力？疑惑中

作者: summerxx 时间: 2013-12-23 15:49

QUOTE:

原帖由 阿凡提 于 2013-12-23 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

“抗原的活性”是个什么东西？

“抗原的活性”我的理解就是能与抗体结合的活性，或者说Elisa活性。

作者: summerxx 时间: 2013-12-23 15:50

QUOTE:

原帖由 ending 于 2013-12-23 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果说表达的蛋白用于功能实验，其融合蛋白是否对活性有影响？一般来说，好像切掉Histag后，蛋白的功能实验更能说明问题，但如果不切除Histag，能否当做活性蛋白来做功能，其表现的功能有无说服力？疑惑中 ...

功能实验中融合蛋白是否对活性有影响是不能确定的，做了实验才知道。还要看是那方面的功能。
对免疫检测（金标、酶标、WB、光免）来说，histag影响的往往不是其活性，而是假阳性问题。
如果是做多抗，histag也是有影响的，会产生不想要的抗体。

作者: @STAR@ 时间: 2013-12-23 15:50

谢谢summerxx的解答。我说的蛋白活性就是指抗原与抗体的结合能力，主要是用于EIA和金标方面的。
最近我们在用一些植物中的惰性蛋白区段用于做融合蛋白，效果还不错。不知道大家在这个方面有什么好的见解。用植物中的蛋白做融合蛋白的好处就是和动物蛋白尤其是人的差异比较大，可以有效的降低非特异性的反应，也就是说可以有效的降低假阳反应。

作者: summerxx 时间: 2013-12-23 15:51 标题: 回复 #9 @STAR@ 的帖子

用惰性蛋白区段用于做融合蛋白在检测上用的目的可能在于增强其可溶性，提高表达量，另一方面可能在相邻的抗原表位片段中间加上一个间隔，以利于空间构象的形成或抗原表位被抗体的识别。

作者: 喵咪 时间: 2013-12-23 15:51 标题: 回复 #10 summerxx 的帖子

关于融合蛋白tag对本身蛋白的功能影响，我说下自己在实验中遇到的问题：
1，去年接触到一个转录因子，其受刺激后会从胞质转移入核。最开始我用GFP做示踪，发现GFP位于C端与N端的结果是不一样的。后来看文献以及做了一些突变，认为是转录因子C端的ser和thr正常状态下被折叠于蛋白内部，而刺激之后，蛋白会改变折叠，释放出C端，从而得以磷酸化，以激活态形式入核。
因此GFP在C端会影响蛋白正常折叠，导致蛋白一直将ser和thr暴露于外，处于激活态，也就是荧光总是聚集在核内。
2，今年又遇到了个蛋白A，因为没有特异抗体，就选择了N-flag标签作为替代。后来总是做不出来，结果相反而不稳定。终于有一天看文献发现了问题：N-flag位于蛋白A的N端，影响了A的信号肽的作用，使得A不能够准确定位。之后把序列一分析，重新换了载体，结果就好了。
私以为：亚细胞定位比较特殊的蛋白（如膜蛋白，分泌蛋白，入核蛋白。。。。）某些情况下还是会受到tag的影响的。当然，这种蛋白只是少数。
ps：我真是蛮点儿背，才2年不到，就总是遇到这些东西，埃，教训阿。

作者: 喵咪 时间: 2013-12-23 15:51

最近做HIV蛋白片段的时候，发现有些蛋白片段对抗原的活性影响很大，有时候会使目的片段失去活性。融合蛋白片段是相对比较惰性的片段，怎么会有这么大的影响呢？蛋白片段对目的片段有怎么样的影响呢？

=========================================================================

好像做抗体时候，蛋白都会被降解为6--15aa左右的肽段，这些肽段就是抗原。
不过降解好像是发生在特定的地方，
而且融合蛋白会影响目的蛋白的折叠，或许就会遮蔽到一些降解位点，从而影响降解的过程。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)