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标题: 【求助】蛋白纯化后无吸收峰 [打印本页]

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:47 标题: 【求助】蛋白纯化后无吸收峰

我用了400ml的菌液，超声后，取1ml上清上样，但是洗脱之后，测OD280没有吸收峰，希望哪位大侠给点指引，谢谢!

作者: fsdd817 时间: 2013-12-27 10:48

是不是没有挂上柱啊，我是加完样品后，让样品留到柱子中后，将下端封闭，静止一个小时。

作者: gogo 时间: 2013-12-27 10:48

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条件不明，无法分析。请点击看我的签名档“如何提蛋白质纯化问题”。

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:48

谢谢！
我的上样量少吗？为什么每次测OD280值都在0.1左右？
书上说PMSF半衰期80min，是不是要多加几次啊？
我是新新手，谢谢！

作者: gogo 时间: 2013-12-27 10:49

你很多问题没有说明，如：
胶的种类、柱大小、破菌缓冲液体积、破菌后的处理、柱平衡缓冲、洗脱缓冲、如何收集、纯化仪器等等。
无法分析啊。

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:50

400ML菌液，OD600=0.5-0.6，加IPTG(终浓度0.5mM),22℃诱导12h,超声收集上清，取1ml非变性条件下纯化.
破菌缓冲液:50mM NaH2PO4，300mM NaCl,pH8.0，PMSF6微升
破菌方法：超声400W，4s工作，6s间隙，冰水浴，共300次
洗涤液：PBS
柱平衡液：pH8.0，50mM NaH2PO4，300mM NaCl,pH8.0
柱淋洗液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl,20mM 咪唑,pH8.0,50mM 咪唑
100mM 咪唑250mM 咪唑500mM 咪唑,每个浓度10ml阶段洗脱
载体类型：BL21PlysS,6-His
敬请各位大师指点，再次感谢

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:50

镍离子亲和层析柱，柱子是1ML预装重力柱，破菌缓冲液是按10ml/g加的
破菌后12000rmp,30min收集上清上柱
谢谢热心的老师

作者: gogo 时间: 2013-12-27 10:50

从程序上没有看出有什么问题。上样量确实是偏小了。
一般表达量很好的E.coli.蛋白，Ni柱纯化1g湿菌大约可以达到5-15mg的蛋白。按你的上样量计算，你这个1ml柱最多大约上样了0.5mg-1.5mg的可结合蛋白，如果表达量一般的话，量就更少，可能只有0.1-0.5mg蛋白。几个10ml咪唑浓度的分段洗脱后，洗脱液中的目标蛋白浓度确实很低。OD值低也就可以理解了。
建议：
1、加大上样量10倍。
2、先不做分段洗脱，上样淋洗（用20mM咪唑条件）后，直接用250mM咪唑洗脱，看看峰和电泳的情况，确定能够吸附。
3、多发酵表达一些菌，再做下一步纯化。

作者: wood533 时间: 2013-12-27 10:51

我觉得试验的每个步骤都需要对照。先将你的上清跑个胶看看有没有你的蛋白，一个一个步骤的找原因~

作者: ukonptp 时间: 2013-12-27 10:51

pmsf特点
　　1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；
　　2） 10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；它对异丙醇没有特殊要求，分析纯即可，它也可以用DMSO进行配置，储存浓度同样为100mM
　　3）在室温可保存一年,一般保存在-20度或4度.；
　　4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~1mM），储存液浓度为100或200mM；
　　5）在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h,补加一次。（见水分解，使用前加入）

作者: ukonptp 时间: 2013-12-27 10:52

思路应当是先确定存在，然后寻求位置，最后从该位置/梯度中得到目的产物
期待你的结果！

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:52

电泳证实有目的蛋白。是不是我的目的蛋白上清表达太少啊？我的目的蛋白形成包涵体比较多，但我看好多战友说蛋白复性很困难，于是我就降低温度表达，但今天纯化了一次也没有吸收峰，请各位大侠多多指教

作者: gogo 时间: 2013-12-27 10:53

QUOTE:

原帖由 gemei0115 于 2013-12-27 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

电泳证实有目的蛋白。是不是我的目的蛋白上清表达太少啊？我的目的蛋白形成包涵体比较多，但我看好多战友说蛋白复性很困难，于是我就降低温度表达，但今天纯化了一次也没有吸收峰，请各位大侠多多指教 ...

没有吸收峰是不合情理的。高浓度的咪唑在OD280A处也有一个峰的。
即使你的蛋白完全没有吸附，换用100mM 咪唑250mM 咪唑500mM 咪唑时，都有一个个台阶峰出现。
检查系统连接、检测器是否正常。
我的经验，如果你的蛋白有可溶性表达存在，那么包涵体复性（仅仅指去除变性剂）也不会很困难。当然能用上清纯化到目的蛋白最好，但是绝对不要怕做包涵体。

作者: gemei0115 时间: 2013-12-27 10:53

谢谢各位老师的指点！
我放弃上清纯化，采用纯化包涵体的办法，结果纯化的条带非常好，下一步继续做复性，还请各位老师给点意见，谢谢

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